Études de la propagation de la protéine huntingtine
mutée
Mémoire
Philippe Gosset
Maîtrise en médecine moléculaire - avec mémoire
Maître ès sciences (M. Sc.)
Etudes de la propagation de la protéine huntingtine
mutée
Mémoire
Philippe Gosset
Sous la direction de :
Résumé
La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative d’origine génétique entrainant la mutation de la protéine huntingtine (HTT). Cette protéine essentielle, sous sa forme mutée (mHTT) s’agrège, lui conférant ainsi sa toxicité. Au niveau cérébral, la MH se caractérise par une mort neuronale accrue entrainant des troubles
moteurs, cognitifs et psychiatriques.
Notre projet de recherche porte sur la caractérisation de certaines particularités de la MH, en particulier sur les facultés de cette pathologie à se propager entre espèces. Cette particularité s’inscrit dans une hypothèse proposant que la MH soit incluse dans la catégorie des maladies à prions, bien que cette théorie ne fasse pas encore l’unanimité au
sein de la communauté scientifique.A travers celui-ci, nous avons cherché à déterminer si
la mHTT présente dans les homogénats cérébraux des patients MH, peut induire une pathologie chez différents modèles animaux. Pour cela, nous avons effectué trois protocoles distincts où des homogénats ont été injectés dans le cerveau de souris adultes a) de type sauvage et b) de type BACHD ou c) de primates non-humains.
Les résultats obtenus de cette étude semblent indiquer que la mHTT dérivée du cerveau humain a une capacité limitée à se propager entre les cellules et ne représente pas des caractéristiques de type prion. Ces observations contrastent avec de précédents travaux démontrant que d'autres formes de mHTT (fibrilles, fibroblastes ou cellules souches pluripotentes induites dérivées de cas de MH) peuvent en effet disséminer la maladie dans le cerveau à la manière d'un prion.
Abstract
Huntington's disease (HD) is a neurodegenerative disease caused by a mutation of
the gene coding for the huntingtin protein (HTT). In its mutated form (mHTT), this essential protein forms into cellular aggregates, conferring toxicity to the new entity. HD is also characterized by marked neuronal death which underlies the motor, cognitive and psychiatric symptoms known to the pathology.
The research project presented herein focused on investigating the ability of the mHTT to spread between cellular elements. This is part of a larger research program which proposes that HD may be, as other neurodegenerative diseases, a prion-like disorder. We therefore sought to determine whether the mHTT found in homogenates derived from post-mortem brain tissue of HD patients can induce pathology after injection in different animal models. For this, we carried out three separate protocols: homogenates were injected into the brains of adult a) wild type and b) BACHD mice or c) non-human primates.
The results of this study indicate that mHTT derived from post-mortem brain tissue of HD patients has a limited ability to spread between cells and does not represent prion-like characteristics. These observations contrast with previous work demonstrating that other forms of mHTT (fibrils, fibroblasts or induced pluripotent stem cells derived from HD cases) can indeed disseminate disease in a prion-like fashion as shown in various in
Table des matières
Résumé ... ii
Abstract ... iii
Table des matières ... iv
Liste des figures ... vi
Liste des abréviations, sigles, acronymes ... vii
Remerciements ... ix Avant-propos ... x Introduction ... 1 La maladie de Huntington ... 1 Historique ... 1 Epidémiologie ... 1 Symptômes ... 2 Etiologie ... 3 Atteinte physiologique ... 4
Traitements disponibles et envisagés ... 5
Modèles animaux ... 6 La protéine Huntingtine ... 7 Caractéristiques ... 7 Généralités ... 7 Rôle de la HTT ... 9 La HTT mutée ... 11 La protéine prion ... 13 Propagation de la mHTT ... 14 In vitro ... 14 In vivo ... 17
Modèles animaux à homogénats ... 19
Projet de recherche ... 20
Chapitre 1 Evidence for the spread of human-derived mutant huntingtin protein in mice and non-human primates ... 21
1.1 Résumé ... 23
1.2 Abstract ... 24
1.4 Material and Methods ... 27 1.5 Results ... 35 1.6 Discussion ... 40 1.7 Competing interests ... 44 1.8 Acknowledgments ... 44 1.9 Author contributions ... 44 1.10 Figure legends ... 45 1.11 References ... 50 Conclusion ... 53
Démonstrations des capacités de propagation de la mHTT ... 53
Améliorations possibles de l’étude ... 58
Perspectives ... 59
Perspectives futures d’étude de la mHTT extracellulaire dans le système nerveux central et la circulation générale ... 59
Liste des figures
Figure 0.1 : Coupes coronales de télencéphales humains. Figure 0.2 : Structure du gène de la huntingtine humaine. Figure 0.3 : Structure et transformation de la HTT.
Figure 0.4: Modèle schématique illustrant le mauvais repliement et l'agrégation de protéines contenant une queue polyQ étendue.
Figure 0.5: Marquages illustrant les propriétés d’interaction de la mHTT avec la HTT endogène.
Figure 0.6: Immunomarquages démontrant la présence de mHTT dans les greffons chez un patient huntingtonien – 12 ans après transplantation.
Figure 1.1. Cortical injection of human mHTT homogenates in WT mice. Figure 1.2. Cortical injection of human mHTT homogenates in BACHD mice.
Figure 1.3. Striatal injection of human mHTT homogenates in non-human primates. Figure 0.7 : Schéma récapitulatif et comparatif de différentes études portant sur la propagation de la mHTT.
Liste des abréviations, sigles, acronymes
APP amyloid precursor protein / protéine précurseur de l’amyloide ARN acide ribonucléiqueARNm acide ribonucléique messager
BDNF Brain-Derived Neurotrophic Factor / facteur neurotrophique dérivé du cerveau CAG Cytosine Adénosine Guanine
CSPi cellules souches pluripotentes induites DRP domaine enrichi en proline
GPe globus pallidus externe GPi globus pallidus interne HTT protéine huntingtine
HTT gène de la protéine huntingtine LCR Liquide céphalo-rachidien
LRP1 protéine associée aux récepteurs des lipoprotéines 1 MA Maladie d’Alzheimer
MH Maladie de Huntington mHTT protéine huntingtine mutée MP Maladie de Parkinson
NF-kB nuclear factor-kB P53 protéine 53
polyQ polyglutamine
PrPc protéine prion cytoplasmique PrPsc PrP scrapie
PSN polymorphismes d’un seul nucléotide SN substantia nigra
SNC système nerveux central STN noyau subthalamique WT Wild-Type / sauvage
Remerciements
Je tiens à remercier la Dre Francesca Cicchetti de m’avoir accepté dans son laboratoire. Elle m’a permis de mener des travaux de recherche au sein de son laboratoire et je la remercie plus particulièrement pour ses conseils, son écoute et son temps consacré à la réalisation de ce travail expérimental et de l’article figurant dans ce mémoire.
Je remercie également l’ensemble de l’équipe Cicchetti : à savoir les étudiants et notre professionnelle de recherche pour leur accueil au sein du laboratoire, leur bonne humeur ainsi que leurs conseils.
Avant-propos
Au cours de ma maitrise dans le laboratoire de la Dre Francesca Cicchetti, j’ai eu la
chance de participer à plusieurs projets de recherche sur la propagation de la protéine huntingtine mutée (mHTT) dans la maladie de Huntington. Cependant, j’ai principalement axé mon temps sur un de ceux-ci : projet qui est présenté dans le chapitre 1 puisqu’il fait l’objet d’une publication où je suis premier auteur. Par ailleurs, j’ai traité les données comportementales et préparé le plan expérimental d’analyse post-mortem d’une étude que j’avais commencé à mener: cette étude porte sur l’injection de fibroblastes humains contenant des protéines pathologiques (mHTT) dans le cerveau de singes adultes et bébés. Aussi, j’ai contribué à un projet sur la propagation de la mHTT entre deux souris couplées en parabiose dont l’une est traitée par irradiation. Enfin, j’ai effectué les analyses de génotypes chez des souris résultants de croisements génétiques pour observer la propagation de la mHTT chez un nouveau modèle de souris transgéniques zQ175/LRP1.
L’article « Evidence for the spread of human-derived mutant huntingtin protein in mice and non-human primates » présenté au chapitre 1 a été accepté pour publication en 2020 dans le journal Neurobiology of Disease. Cet article a été réalisé en collaboration avec
Erwan Bézard en France (Université de Bordeaux, Institut des maladies
neurodégénératives, UMR 5293, Bordeaux, France, CNRS UMR 5293) et son équipe en Chine (Institute of Laboratory Animal Sciences, China Academy of Medical Sciences, Beijing, China).
Je suis premier auteur de cet article pour avoir réalisé les analyses des données comportementales de tous les animaux, les analyses post-mortem de chaque groupe et pour avoir réalisé les différentes figures et la première version du manuscrit.
La liste complète des auteurs est : *1Philippe Gosset, *1Alexander Maxan, *1Melanie
Alpaugh, 2Ludivine Breger, 2Benjamin Dehay, 4Giulia Cisbani, 1Nadia Fortin, 3Zhu Tao,
3Zhang Ling, 3Chuan Qin, 4Jean Paul G. Vonsattel, 1,5Steve Lacroix, 1,5Abid Oueslati,
Affiliations :
1Centre de Recherche du CHU de Québec - Université Laval, Axe Neurosciences, Québec,
QC, Canada, G1V 4G2; 2Université de Bordeaux,Institut des maladies neurodégénératives,
UMR 5293, Bordeaux, France, CNRS UMR 5293; 3Institute of Laboratory Animal
Sciences, China Academy of Medical Sciences, Beijing, China; 4University of Toronto,
Department of Nutritional Sciences, Toronto, ON, Canada, M5S 1A8; 5New-York Brain
Bank, Columbia University, New York, NY, United States, 10032; 6Département de
Médicine Moléculaire, Université Laval, Québec, QC, Canada, G1K 0A6; 7Département de
Psychiatrie & Neurosciences, Université Laval, Québec, QC, Canada, G1K 0A6
Introduction
La maladie de Huntington
HistoriqueEn 1872, le médecin américain Georges Huntington publie pour la première fois dans le journal scientifique Medical and Surgical Reporter, la description de la maladie de Huntington (MH) (Huntington 1872). Dans cet article, on peut noter que la caractéristique majeure de la pathologie se présente sous forme de mouvements involontaires ; ceux-ci évoquant une sorte de danse effectuée par les malades : « la chorée ». Le terme de « chorée », provenant du latin choreus qui signifie une danse dans l’Antiquité, a alors été choisi pour définir la maladie. A travers son observation, le docteur Huntington suppose la nature héréditaire et dominante de la MH: en effet, lorsqu’un parent présente la pathologie, un ou plusieurs enfants, avec une probabilité de 50%, la développe à son tour ; et lorsqu’un de ces enfants qui n’a pas hérité de la maladie a à son tour des enfants, ceux-ci ne présentent pas la MH. En 1883, Westphal décrit des symptômes juvéniles ressemblant à ceux observés dans la MH mais les a attribués à une cause autre que la MH. En effet, les patients présentaient une prédominance d'hypokinésie et de rigidité ainsi, le terme « variante de Westphal » était souvent utilisé pour décrire le tableau clinique de la MH juvénile. Bien qu'il y ait eu plusieurs rapports sur la neuropathologie de la MH, ce n'est que dans les années 1920 qu'il y a eu un accord que dans la MH, les changements dans le cerveau sont principalement dégénératifs et atrophiques, et que la structure du noyau caudé
est la plus affectée(G. Bates, Harper, and Jones 2002). Enfin, c’est seulement en 1993 que
le Huntington’s Disease Collaborative Research Group identifie le gène responsable de la maladie (HDCRG, 1993). Ce gène est d’abord appelé IT15 (Interesting Gene 15) puis renommé « huntingtine » (MacDonald et al. 1993).
Epidémiologie
La prévalence de la MH semble être très variable sur le globe ; c’est pourquoi des revues de la littérature et des méta-analyses ont été établies. Ainsi, dans une méta-analyse rassemblant 8 articles originaux étudiant l’incidence et 17 examinant la prévalence, il nous est rapporté que l’incidence est de 0.38 nouveaux cas pour 100 000 personnes chaque année et que la prévalence mondiale de la MH serait de 2.71 cas pour 100 000 individus.
Cependant, on peut noter une forte hétérogénéité dans les chiffres publiés concernant la prévalence à travers les différentes études entre les populations asiatiques, européennes et nord-américaines par exemple. En effet, la prévalence en Europe, Amérique du Nord et Australie est de 5.7 cas pour 100 000 individus mais seulement de 0.4 en Asie (Pringsheim et al. 2012). Néanmoins, si on ne s’intéresse qu’à la prévalence de la MH au Canada, on remarque qu’elle est beaucoup plus élevée que la moyenne avec 13.7 cas pour 100 000 canadiens (Fisher and Hayden 2014). Les différences observées pourraient être dues à des différences génétiques au sein des différentes populations mondiales, portant sur le gène impliqué dans la MH (voir plus bas dans le paragraphe « Etiologie »).
Symptômes
La MH, dans la plupart des cas, se déclare autour de 50ans ; cependant, on peut noter quelques cas de formes juvéniles ou tardives (Flier et al. 1986; Phillips, Shannon, and Barker 2008; Papp, Kaplan, and Snyder 2011). Elle comporte plusieurs phases : une phase présymptomatique, qui précède l’apparition des symptômes ; une phase prodromique, qui dure environ 15ans au cours desquels les patients présentent de légères altérations des fonctions cognitives et motrices ; puis la phase déclarative de la maladie, qui permet le diagnostic définitif puisqu’elle est marquée par l’apparition des symptômes moteurs spécifiques et d’un test génétique et/ou de l’évaluation des antécédents familiaux du patient (Reilmann, Leavitt, and Ross 2014). Dans cette dernière phase, on observe une accentuation des symptômes cognitifs, moteurs et psychiatriques entrainant le décès du patient. Les malades souffrent alors de mouvements involontaires (chorée), de bradykinésie (ralentissement et perte de finesse dans le mouvement) et de l’altération de la coordination. On observe des troubles de l’équilibre et de la posture ajoutés à des défauts d’articulation et de déglutition. Sur le plan cognitif, on retrouve des troubles de l’attention, des pertes de mémoire, un défaut d’orientation puis à un stade plus avancé, la démence privant alors le patient de son autonomie (Peavy et al. 2010). Des troubles psychiatriques sont également observables chez les patients atteints de le MH : les plus courant étant la dépression,
Etiologie
La MH est considérée comme étant une maladie neurodégénérative mais c’est la seule qui est d’origine purement génétique. Elle est causée par une mutation du gène localisée dans la région 4p16.3 de l’exon 1 du chromosome 4 codant pour la protéine huntingtine (HTT). En effet, la HTT possède une queue polyglutamine (polyQ) ; répétition du triplet nucléotidique CAG (C : cytosine ; A : adénosine ; G : guanine) en N-terminal, et sa longueur détermine la conformation de la HTT : donc de sa pathogénicité (Duyao et al. 1993; Gusella et al. 1983; Labbadia and Morimoto 2013). Ainsi, une queue polyQ comprenant entre 6 et 36 triplets CAG permettra une fonction normale de la HTT. Au-delà de 36 répétitions CAG, la protéine change de conformation et s’agrège : c’est la protéine huntingtine mutée (mHTT). La pénétrance de la maladie est limitée dans le cas de 36 à 40 répétitions CAG, mais est complète une fois passé ce nombre (Kay et al. 2016). Nota bene, un nombre de répétitions CAG supérieur à 60 est appelé « forme juvénile » du fait de l’apparition précoce de la pathologie et de sa sévérité. L’allèle muté dans la MH est dit « dominant », c’est-à-dire que sa présence en un seul exemplaire est suffisante pour déclarer la pathologie (Conneally 1984). Ainsi, un enfant issu d’un couple où l’un des parents est porteur de l’allèle muté présente une probabilité de 50% d’être porteur de la mutation et donc de déclarer la MH à son tour. Malgré l’origine génétique, environ 10% des cas de la MH sont sporadiques : c’est-à-dire que la cause n’est pas due à une mutation héritée mais due à une mutation de novo (Falush et al. 2001; Sunwoo, Lee, and Kim 2010).
Cette origine génétique explique en partie l’épidémiologie variable de la MH à travers le monde. Plusieurs théories sont avancées pour expliquer les différences observées. Premièrement, la probabilité de développer la mutation de novo est directement corrélée à la taille de la répétition CAG dans le gène huntingtine (HTT). Ainsi, il a été montré que celle-ci n’était pas la même entre les populations européennes (18.4 triplets CAG en moyenne) comparée aux populations asiatiques et africaines (16.4 triplets CAG) (Squitieri et al. 1994). Deuxièmement, il existe des polymorphismes d’un seul nucléotide (PSN) caractéristiques de différentes versions du gène HTT concordant avec la présence d’expansion de CAG ; ceux-ci sont retrouvés, le plus souvent, dans les populations européennes (Warby et al. 2009). Enfin, la troisième explication porterait sur une région riche en CCG adjacente aux répétitions CAG. En effet, cette région est variable selon
l’expression de certains allèles associés à l’apparition de la mutation de novo ; allèles retrouvés dans les populations d’origine européenne (Pêcheux et al. 1995). Au contraire, dans les populations asiatiques, on observe l’existence d’allèles ayant un effet protecteur envers l’apparition de la mutation (Warby et al. 2011; Baine et al. 2013).
Atteinte physiologique
Sur le plan anatomique, la MH se caractérise par l’atteinte du striatum, une atrophie grandissant tout au long de la maladie. Au sein des différentes populations de neurones que l’on peut retrouver dans le striatum, ce sont les neurones de projections GABAergiques ; les neurones épineux moyens (MSN), qui sont les plus touchés entrainant alors une altération irréversible des réseaux neuronaux (Han et al. 2010; Tepper, Koós, and Wilson 2004). Le striatum est une structure cérébrale sous-corticale appartenant aux ganglions de la base. Il comprend le noyau caudé, le putamen, le pallidum et le noyau accumbens, et est impliqué dans de nombreuses fonctions dont l’initiation ou l’inhibition du mouvement volontaire et involontaire ; ceci expliquant les symptômes moteurs caractéristiques de la MH (Kravitz and Kreitzer 2012). D’autres zones sont également touchées par la neurodégénérescence telles que le cortex, le cervelet, l’hippocampe, la substance noire ou encore les noyaux du tronc cérébral (Paulson and Albin 2011). Bien que la MH soit considérée comme une maladie neurodégénérative, elle ne touche pas seulement le système nerveux central (SNC). En effet, le gène muté codant pour la protéine huntingtine (mHTT) étant exprimé de façon ubiquitaire dans les cellules de l’organisme, cette mutation occasionne des atteintes de différents organes périphériques.
Sur le plan cellulaire, l’expression de la mHTT entraine la formation d’agrégats protéiques au sein du corps cellulaire, du noyau mais également dans le milieu extracellulaire (Gutekunst et al. 1999). L’impact de ces agrégats sur les neurones et sur la mort cellulaire n’est pas encore clairement établi. D’après la littérature, les agrégats pourraient adopter différentes conformations dont certaines seraient toxiques ; ainsi, ils ne seraient pas systématiquement nocifs pour la cellule hôte. D’ailleurs, on ne retrouve que
Figure 0.1 : Coupes coronales de télencéphales humains. A droite, on observe le cerveau
d’un sujet sain et à gauche, celui d’un patient avec une atteinte avancée de la MH. Une atrophie du cortex ainsi que du noyau caudé résultant en un élargissement du ventricule sont notables sur le télencéphale du patient MH. D’après (Anton Reiner, Dragatsis, and Dietrich 2011).
Traitements disponibles et envisagés
Il existe actuellement plusieurs traitements médicamenteux disponibles pour les patients atteints de la MH cependant, il est important de noter que de ceux-ci, aucun n’est curatif. De plus, seul un médicament est propre à la MH : il s’agit de la tétrabénazine qui a été développé pour contrôler la chorée (Frank 2014). Les autres traitements disponibles actuellement, sont des antidépresseurs et anxiolytiques utilisés pour soigner les troubles psychiatriques observés dans la pathologie. Il est également possible de mettre en place des plannings ou de la rééducation pour les patients afin d’améliorer leur quotidien et de les accompagner. Face à ce manque de thérapie ciblant efficacement la MH, de nombreuses
molécules et traitements non médicamenteux font actuellement l’objet d’essais cliniques. C’est le cas par exemple de médicaments testés pour traiter l’inflammation chronique observée dans la pathologie (Denis, Lauruol, and Cicchetti 2019). Cependant, ces études connaissent des résultats mitigés expliquant ainsi la poursuite des études précliniques dans ce domaine. Par ailleurs, la stimulation cérébrale profonde, procédure chirurgicale consistant à l’implantation d’un stimulateur électrique dans le cerveau dans le principal but de contrôler les troubles moteurs, a été utilisée chez certains patients atteints de la MH (Wojtecki et al. 2016). Les résultats observés chez ces patients sont plutôt positifs sur le plan des symptômes moteurs, mais il ne s’agit pas encore d’une procédure couramment utilisée dans le cadre de la prise en charge de la pathologie. Enfin, étant donné que la MH résulte d’une mutation génétique, il a été envisagé d’agir directement sur la mutation par l’utilisation dans un premier temps d’ARN (acide ribonucléique) interférent. Ainsi, un essai clinique, IONIS-HTTRx (NCT02519036), a été mené chez 46 patients en phase 2a de 2015 à 2019. Les résultats observés indiquent une diminution de la présence de mHTT dans le liquide céphalorachidien des patients ayant reçu le traitement (Tabrizi et al. 2018). Depuis quelques années, une technique d’édition génomique, CRISPR/cas9 a été développée afin de corriger de façon permanente une mutation. Des études précliniques utilisant cette méthode sont en cours, et une équipe a déjà pu montrer qu’en corrigeant la mutation dans le striatum, la thérapie permettait l’amélioration des symptômes moteurs et une diminution significative du nombre d’agrégats dans la région traitée (S. Yang et al. 2017). Cependant, l’effet n’a pas eu d’incidence sur la longévité des animaux.
Modèles animaux
Les souris sont de loin les animaux les plus couramment utilisés pour la modélisation de la MH et ce depuis longtemps. Avant toutes les connaissances permettant la création de modèles animaux transgéniques, les modèles animaux étaient crées par des lésions induites par des neurotoxines de la région striatale dans le but de reproduire la perte de neurones GABAergiques caractéristique de la MH (McGeer and McGeer 1976; Beal et al. 1986;
de cette maladie ont été générés, dépendants de plusieurs approches à savoir : l’utilisation de l’exon 1 uniquement ou de la totalité du gène HTT (knock-in) ; la longueur de la répétition CAG, contenant ou non des codons CAA, incorporée dans la construction génétique ; ou encore les différents types de promoteurs pour conduire l’expression de la protéine mutée (Pouladi, Morton, and Hayden 2013). Ces différentes approches permettent le développement de modèles qui miment plus ou moins bien la pathologie et de manière plus ou moins rapide. Parmi ceux-ci, on peut prendre pour exemple le modèle R6/2. Cette souris exprime l’exon 1 de la HTT humaine contenant une répétition instable de 144 CAG, guidé par son promoteur humain. Ce modèle est très agressif ; en effet, la souris R6/2 développe la pathologie à partir de 8 semaines et présente de forts symptômes cognitifs et moteurs (Mangiarini et al. 1996). Au contraire, il existe des modèles de souris chez lesquels la pathologie sera plus lente et progressive (au delà de 6mois) ; c’est le cas des souris zQ175 qui expriment tous les exons de la HTT humaine contenant une répétition d’environ 188 CAG ou encore des souris BACHD, qui expriment elles aussi tous les exons de la HTT humaine contenant une répétition de 97 CAG stabilisé par la présence de codons CAA ; le modèle BACHD est utilisé pour l’étude présentée au Chapitre 1 (Menalled et al. 2012; Gray et al. 2008).
La protéine Huntingtine
CaractéristiquesGénéralités
Le gène HTT, codant pour la HTT, contient 67 exons cependant, il peut subir un épissage alternatif donnant alors différents variants de la protéine. Si on se place dans le cas où la queue polyQ comporte 23 résidus glutamines, la HTT se compose de 3 144 acides aminés et a un poids moléculaires de 348 kDa (Tartari et al. 2008). Dans le cas de la MH, la mutation porte sur le nombre de répétition du triplet CAG, localisée dans l’exon 1 de HTT. Il est important de souligner que le gène HTT est très conservé au cours de l’évolution ; c’est à dire qu’on le retrouve chez les vertébrés comme chez les insectes. Cependant, l’exon 1 est la seule partie du gène à avoir varié. En effet, la présence d’une longue queue polyQ
est spécifique aux mammifères, mais c’est chez l’humain que le nombre de CAG est le plus important (Saudou and Humbert 2016).
L’exon 1 du gène HTT est divisé en trois domaines. Un premier domaine N-terminal composé de 17 acides aminés très conservés chez les vertébrés (Tartari et al. 2008). Ce domaine consiste en une hélice α amphipathique importante pour la rétention dans le réticulum endoplasmique (Atwal et al. 2007). Il agit comme un signal d’export nucléaire et est sujet à des modifications post-traductionnelles influant sur la dégradation et/ou la localisation des protéines (acétylation, sumoylation, ubiquitination et phosphorylation) (Atwal et al. 2007; L. M. Thompson et al. 2009; Maiuri et al. 2013; J. S. Steffan et al. 2004). Un deuxième, très polymorphique chez l’humain correspondant à la queue polyQ entièrement composée de glutamines. Bien que ce domaine soit responsable de la MH, son rôle reste inconnu. D’après la littérature, il pourrait être impliqué dans l’autophagie. En effet, il a été montré que la suppression de ce domaine chez la Souris entraine une augmentation de l’autophagie et de la longévité (Zheng et al. 2010). Enfin, un troisième domaine composé de 50 acides aminés et enrichi en prolines (DRP), est retrouvé uniquement chez les mammifères. Le DRP est lui aussi sujet à des polymorphismes dans la population générale et est impliqué dans les interactions protéine-protéine. Malgré cette fonction démontrée, sa délétion ne semble pas avoir d’effet néfaste chez la Souris (Neveklovska et al. 2012). Pris ensemble, les domaines N-terminal et DRP sembleraient jouer un rôle dans la capacité d’agrégation de la protéine HTT. Ainsi, ceci pourrait expliquer les différences symptomatologiques observées chez des patients ayant le même nombre de répétition CAG (Kuiper et al. 2017).
Le reste de la protéine est mal caractérisé. En effet, les 66 autres exons codant les 97.8% de la HTT sont très peu étudiés ; cela semble se justifier par le fait que la mutation se situe dans l’exon 1. Dans cette partie, il est retrouvé de nombreuses répétitions HEAT (protéine tandem repeat structural motif) : impliquées dans les interactions protéine-protéine et retrouvées dans la HTT, la protéine-protéine phosphatase 2A, le facteur d’élongation 3 et TOR1 (Palidwor et al. 2009). Les répétitions HEAT ont également un rôle dans les
Par ailleurs, on peut noter que dans l’exon 18, on retrouve une séquence d’exportation nucléaire pouvant réguler la fonction ou la localisation de la HTT (Xia et al. 2003).
Figure 0.2 : Structure du gène de la huntingtine humaine. Abréviations : PolyGln :
queue polyglutamine; polyPro : domaine riche en proline ; HEAT : région de clivage protéique ; NES : signal d’export nucléaire; NLS : signal de localisation nucléaire. D’après (Déglon 2017).
Rôle de la HTT
La HTT est une protéine ubiquitaire retrouvée à différents niveaux à travers l’organisme mais son expression est plus forte au sein du SNC (Marques Sousa and Humbert 2013). Il s’agit d’une protéine essentielle ; en effet, son inhibition pendant le développement embryonnaire est létal au jour 7.5 (Nasir et al. 1995; Duyao et al. 1995; Zeitlin et al. 1995). De plus, des études axées sur l’embryogénèse ont montré qu’elle était indispensable à la différentiation des neuroblastes dans le striatum, le cortex et le thalamus (White et al. 1997; Reiner et al. 2001). Elle est aussi impliquée dans la migration des neurones corticaux allant de la zone ventriculaire à la plaque corticale, dans l’homéostasie cérébrale et la circulation du liquide cérébrospinal en agissant sur la biogénèse des cils des épendymocytes, entrainant alors de possibles hydrocéphalies ou la fermeture de l’aqueduc de Sylvius (Keryer et al. 2011; Dietrich et al. 2009). A contrario, il est important de noter que son inhibition chez la Souris adulte entraine peu ou pas d’effets sur les fonctions motrices ou cognitives et sur la longévité (Wang et al. 2016).
La HTT est impliquée dans divers mécanismes physiologiques. Elle est retrouvée en grande partie dans le cytoplasme mais également dans le noyau. Son action intranucléaire
est multiple : elle est impliquée dans la régulation de la transcription de nombreux facteurs de transcription comme le NeuroD, le nuclear factor-kB (NF-kB) et la protéine 53 suppresseur de tumeur (p53). Elle agit également avec des activateurs ou répresseurs de la transcription tels que le co-activateur TAFII130 ou le co-répresseur nucléaire (NCOR). Enfin, elle interagit avec les récepteurs nucléaires incluant PPAR-γ, ou le récepteur à la vitamine D et a une action sur la survie cellulaire à travers le blocage de l’activation des caspases 3 et 9 prévenant ainsi l’apoptose (Rigamonti et al. 2001; Zhang et al. 2003), ou bien en favorisant la transcription et le transport du BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor : facteur neurotrophique dérivé du cerveau)(Zuccato et al. 2001; Gauthier et al. 2004).
Dans le cytoplasme, elle agit sur le transport vésiculaire antérograde et rétrograde par son interaction directe avec des protéines telles que la dynéine ou indirecte avec la protéine associée à la huntingtine 1 via la dynactine et la kinésine (Caviston et al. 2007; Gunawardena et al. 2003; S. H. Li et al. 1998; McGuire et al. 2006; Strehlow, Li, and Myers 2019). Ainsi, la HTT régule le transport d’organelles incluant des vésicules contenant la protéine VAMP7 v-SNARE (Colin et al. 2008), le BDNF (Gauthier et al. 2004), des vésicules précurseurs synaptiques (Zala, Hinckelmann, and Saudou 2013), ou encore l’APP (amyloid precursor protein : protéine précurseur de l’amyloid)(Colin et al. 2008; Her and Goldstein 2008). De plus, à travers son action sur le transport antérograde, elle joue un rôle important dans l’autophagie au niveau des axones ainsi que dans le transport des protéines ubiquitinylées de l’autophagosome (Martin et al. 2014; Joan S. Steffan 2010; Wong and Holzbaur 2014). On peut également noter son rôle dans la division cellulaire en assurant l’orientation du fuseau mitotique (Elias et al. 2014; Godin et al. 2010; Gutekunst et al. 1995), dans la ciliogenèse (Haremaki, Deglincerti, and Brivanlou 2015; Keryer et al. 2011), dans l’endocytose (Engqvist-Goldstein et al. 2001; Legendre-Guillemin et al. 2002; Waelter et al. 2001), le recyclage vésiculaire (Modregger et al. 2003) ou encore le traffic endosomal (Pal et al. 2006).
Figure 0.3 : Structure et transformation de la HTT. L'expression de HTT génère un
transcrit d'ARN initial qui est normalement transformé en un ARNm codant pour la HTT (1), mais peut également être transformé de manière aberrante en un ARNm codant uniquement l’exon 1 si le gène contient une expansion CAG (2). La traduction génère soit la HTT (3), soit la protéine mHTT (4). Le clivage protéolytique médié par des séquences de reconnaissance situées dans les segments désordonnés génère une série de produits, y compris des fragments de type mHTT (5). Ces fragments contenant des queues polyQ étendues jouent un rôle important dans le déclenchement de la MH. D’après (Bates et al. 2015)
La HTT mutée
Comme explicité précédemment, la MH résulte d’une répétition anormalement longue de CAG. Celle-ci entraine alors la formation d’un ARN messager aberrant codant seulement pour l’exon 1 du gène ce qui conduit alors à la synthèse de la partie N-terminal de la protéine contenant la queue polyQ, considérée comme étant la principale forme toxique de la mHTT (Sathasivam et al. 2019; Ross and Tabrizi 2011). D’autres formes de HTT peuvent être également retrouvées par protéolyse de la protéine entière. En effet, la HTT possède divers sites de clivages protéolytiques incluant des caspases, des cathépsines,
des calpaines, ou encore des métalloprotéinases (Kim et al. 2001; Gafni and Ellerby 2002; Hermel et al. 2004; Lunkes et al. 2002; Tebbenkamp et al. 2012). Ces observations concernant la protéolyse ont été réalisées in vitro mais n’ont jamais été rapportées in vivo (Y.P. Goldberg et al. 1996).
Cependant, c’est sous forme agrégée que l’on retrouve principalement la mHTT dans la MH. En effet, en s’autoassemblant, elle donne de nombreuses conformations plus ou moins toxiques. Ainsi, de nombreuses études ont été menées afin de déterminer la pathogénicité des différentes formes et il semblerait que la mHTT sous forme fibrillaire serait la plus toxique comparée à la forme agrégée (Drombosky et al. 2018; Hoop et al. 2016). L’agrégation de la mHTT est très semblable à l’agrégation protéique retrouvée dans les maladies neurodégénératives comme la Maladie de Parkinson (MP) et la Maladie d’Alzheimer (MA)(Fernàndez-Busquets 2013). Ainsi, dans ces pathologies on observe la présence d’agrégats protéiques dans les tissus : l’α-synucléine pour la MP et la β-amyloïde pour la MA. Ces protéines précurseurs de fibrilles ont une propension à former des feuillets β hautement importants pour les interactions protéines-protéines. Dans le cas de la mHTT, c’est la formation d’épingles à cheveux β qui initie l’agrégation (Hoop et al. 2016). Nota
bene, il y a une corrélation positive directe entre la taille de la queue polyQ et la formation
de ces structures entrainant l’agrégation (Kar et al. 2011).
Tout comme la HTT, la mHTT est elle aussi sujet à des clivages par des protéases formant ainsi des fragments N-terminaux contenant la queue polyQ anormale ; fragment le plus toxique de la HTT (Ross and Tabrizi 2011). Une corrélation inverse est établie entre la taille de ce fragment et sa toxicité : plus le fragment est court et plus sa toxicité est forte. Son pouvoir pathogène résulterait de sa capacité à transloquer dans le noyau et à perturber la transcription induisant alors la mort cellulaire (Saudou et al. 1998). De plus, pour compliquer quelque peu la situation, la mHTT peut inhiber le protéasome et l’autophagie, entrainer des dysfonctionnements mitochondriaux et du transport microtubulaire ou encore altérer l’endocytose, l’activité synaptique et promouvoir l’excitotoxicité (Ross and Tabrizi 2011).
Figure 0.4: Modèle schématique illustrant le mauvais repliement et l'agrégation de protéines contenant une queue polyQ étendue. D’après (Adegbuyiro et al. 2017)
La protéine prion
Etant donné que les études in vitro et in vivo qui vont être présentées ensuite évoqueront la théorie dite du « prion » concernant la pathogénicité de la mHTT, il est d’abord nécessaire de présenter la théorie des maladies à prion établie sur la protéine pathogénique prion.
Les maladies à prions sont des encéphalopathies spongiformes transmissibles considérées également comme des maladies neurodégénératives infectieuses. On retrouve parmi celles-ci la tremblante du mouton, l’encéphalopathie spongiforme bovine (« vache folle ») ou encore la maladie de Creutzfeldt-Jakob chez l’Homme. En 1982, Prusiner découvre la protéine prion cytoplasmique (PrPc), une protéine ubiquitaire chez l’Homme, responsable de la pathologie de Creutzfeldt-Jakob (Prusiner 1982). Après infection, cette
protéine va adopter une conformation riche en feuillets β (PrP scrapie : PrPsc) la rendant
pathologique. Le changement de conformation évolue alors vers une forme amyloïde à
l’origine de vacuolisation neuronale entrainant la mort cellulaire. La protéine PrPsc acquiert
également des propriétés de propagation, lui conférant la capacité d’infecter de nouvelles cellules en transmettant l’information pathogénique à la protéine saine contenu par un
transmission inter-individu, comme ceci a été montré par le phénomène des contaminations par injections d’hormones de croissance provenant de l’hypophyse de patients atteints de la maladie de Creutzfeldt-Jakob ; mais également inter-espèce, comme l’a expressément montré l’épidémie de la « vache folle » dans les années 1960 par la contamination chez l’Homme après ingestion de viandes bovines contaminées (Colby and Prusiner 2011). Ainsi, la définition de prion pour une protéine requiert quatre caractéristiques : 1) le changement conformationnel de la protéine native vers une forme pathogénique riche en feuillets β capable de s’agréger, 2) la propagation intercellulaire capable d’infecter de nouvelles cellules et de nouvelles structures, 3) la transmission de l’information pathogénique à la forme native de la cellule hôte nouvellement infectée par transconformation et enfin 4) la transmission inter-individuelle intra- ou inter-espèce.
Propagation de la mHTT
In vitro
Les premières études montrant les capacités de propagation de la mHTT ont été réalisées in vitro. Ainsi, c’est en 2002 qu’une équipe a pu mettre en évidence que des cellules (Cos-7 et PC12) étaient capables d’internaliser des agrégats de mHTT constitués de peptides polyQ42, depuis l’espace extracellulaire (W. Yang et al. 2002). La toxicité des peptides polyQ42 a été montrée lors de l’ajout d’une séquence de localisation nucléaire. Une autre étude s’est intéressée à des fibrilles synthétiques polyQ44 de mHTT et a ainsi montré leur capacité à s’incorporer dans le milieu intracellulaire en culture avec différents types de cellules (Cos-7, HEK293, neuro2A, CHO et HeLa). Il semblerait que les fibrilles traversent la membrane plasmique via un passage passif pour se retrouver dans le cytoplasme, colocalisées parfois avec différentes protéines (Hsp70, ubiquitine, etc…). Par ailleurs, il a été montré, en taguant la HTT avec une queue polyQ25 non pathologique dans des cellules HEK293, que les fibrilles étaient capables d’entrainer l’agrégation de la HTT endogène (Ren et al. 2009). De plus, ils ont montré que des cellules exprimant des fibrilles
transmission via les nanotubes et les voies transsynaptiques (Herrera et al. 2011; Costanzo et al. 2013; Pecho-Vrieseling et al. 2014). Dans le but de mieux comprendre les mécanismes mis en œuvre, une étude a montré que la mHTT intracellulaire peut être sécrétée dans le milieu extracellulaire via les exosomes (Jeon et al. 2016). En effet, dans cette étude, les exosomes relâchés par des cellules SH-SY5Y transfectées exprimant la mHTT ont été isolés dans le milieu extracellulaire, et il a été mis en évidence la présence de mHTT à l’intérieur. Cette observation a ensuite été confirmée par l’étude inverse : à savoir la propagation de mHTT contenue dans des exosomes de fibroblastes d’un patient huntingtonien vers des neurones de souris sauvages mis en co-culture.
Enfin, une dernière étude a montré dans 3 modèles cellulaires distincts (des cellules neuronales GABA dérivées de cellules souches pluripotentes induites humaines (iGABA), des cellules SH-SY5Y et des macrophages humains dérivés THP-1), qu’après incubation avec des fibrilles recombinants de mHTT-Q48, on pouvait retrouver ces fibrilles dans le compartiment intracellulaire indiquant alors leur capacité à être absorbé (Masnata et al. 2019). De plus, il a été mis en évidence à travers les différents protocoles, que cette absorption entrainait des changements morphologiques, des variations dans l’agrégation de la HTT et la mort cellulaire. Ces mécanismes mis en évidence in vitro, semblent alors indiquer que la mHTT possèderait des capacités prioniques.
Figure 0.5: Marquages illustrant les propriétés d’interaction de la mHTT avec la HTT endogène. Observation par immunofluorescence de cellules THP1 (macrophages humains
dérivés) mise en culture avec de la BSA (Sérum d’albumine bovine), des fibrilles mHTT-Q25 (non-pathogéniques) ou mHTT-Q48 (pathogéniques). Des marquages de HTT, mHTT et phaloidine ont été réalisés afin de mettre en évidence une colocalisation entre la HTT endogène et la mHTT ; démontrant ainsi les capacités de la mHTT à interagir avec la HTT endogène. D’après (Masnata et al. 2019)
In vivo
En 2014, une étude publie pour la première fois les résultats d’analyses effectuées sur 3 cerveaux de patients huntingtoniens décédés ayant reçu une greffe de tissus fœtaux de striatum 10ans avant. Les observations réalisées par immunohistochimie ont montré la présence d’agrégats de mHTT dans les tissus cérébraux des patients mais aussi dans le greffon (Cicchetti et al. 2014). Étant donné que les cellules du greffon n’étaient pas porteuses de la mutation du gène HTT, l’explication la plus probable à cette observation est la propagation de la mHTT présente dans les cellules hôtes ou l’espace extracellulaire des patients vers les cellules greffées. Cette étude suggéra alors, que les observations sur la capacité de propagation de la mHTT in vitro pouvaient également être transposées à l’humain.
Des études chez l’animal ont ensuite été publiées dans le but de déterminer quels sont les mécanismes de propagation de la mHTT et quelles sont les implications de cette machinerie dans la MH. Les premières études publiées ont tout d’abord été réalisées chez la Drosophile (Babcock and Ganetzky 2015; Pearce et al. 2015). Ainsi, il a été montré que les agrégats de mHTT contenus dans des neurones sont capables d’être transmis à d’autres neurones par mécanisme d’endocytose en suivant un circuit bien défini, causant alors la mort neuronale (Babcock and Ganetzky 2015). De plus, ces résultats ont été supportés par une étude montrant les capacités de propagation d’agrégats de mHTT dans les neurones et dans la glie, mais également que la mHTT était capable de s’agréger avec de la HTT apportant la première démonstration in vivo des capacités de la mHTT au recrutement et à la corruption de la protéine non mutée (Pearce et al. 2015). Ont suivis des études chez les modèles murins (Jeon et al. 2016; Masnata et al. 2019). Dans des travaux chez les souris nouveaux-nés, des injections intraventriculaires de fibroblastes ou de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) issues de patients huntingtoniens ont été réalisées. Dans ces expérimentations, il a été montré qu’après injections, les animaux développaient un phénotype de la MH, incluant des troubles moteurs, des pertes de neurones striataux et la présence d’agrégats dans le striatum (Jeon et al. 2016). De plus, chez les souris R6/2 (modèle transgénique de phénotype MH) et sauvages nouveaux-nés, et chez des souris sauvages adultes, des injections de fibrilles mHTT-Q48 intraventriculaires bilatérales chez les nouveaux-nés et intracorticale unilatérale chez les adultes ont été réalisés. Ces injections
ont entrainé des troubles cognitifs et une anxiété accrue chez les animaux et les analyses
post-mortem ont montré la présence de quelques fibrilles 14 mois après injection ainsi
qu’une modification du profil de la HTT endogène (Masnata et al. 2019). Par ailleurs, on peut noter que d’autres études ont été menées chez des modèles plus « simplifiés » comme chez le C.elegans dans lequel il a été mis en évidence que la mHTT était capable de se propager via de grosses vésicules (exophers)(Melentijevic et al. 2017). Ces mécanismes mis en évidence in vivo, semblent alors indiquer que la mHTT possèderait toutes les caractéristiques requises par la théorie du « prion ».
Figure 0.6: Immunomarquages démontrant la présence de mHTT dans les greffons chez un patient huntingtonien – 12 ans après transplantation. Immunohistochimie sur
coupe de cerveau d’un patient huntingtonien décédé (53 répétitions CAG, stade 4) greffé à partir de cellules souches embryonnaires dans le striatum. Les agrégats de mHTT sont détectés par EM48 et les neurones par NeuN. F : tissus greffé dans le striatum avec deux
mHTT dans la p-zone (indiqués par les flèches). I : présence d’agrégats de mHTT dans la non p-zone. J : présence d’agrégats de mHTT dans le cortex. D’après (Cicchetti et al. 2014)
Modèles animaux à homogénats
De récentes publications provenant de différents groupes appuyant l’hypothèse du prion ont indiqué qu’il était possible de transmettre une maladie prionique d’un animal à un autre à partir d’homogénats de cerveaux contenant des agrégats de protéines mutées ou mal repliées. En effet, cela a été montré pour la MA par une équipe qui a injecté chez la souris, dans l’hippocampe, des homogénats de cerveaux de patients atteints de la pathologie et décédés. A travers cette étude, ils ont montré que les homogénats étaient capable d’induire une β-amylose cérébrale chez les animaux injectés de manière temps et concentration dépendante (Meyer-Luehmann et al. 2006). Concernant la MP, il a été mis en évidence que des homogénats contenant de l’α-synucléine provenant de cerveaux de souris transgéniques étaient capables de se propager à tout le SNC, montrant alors les capacités de transmission cellules-cellules de la protéine pathologique (Luk et al. 2012). Enfin, une autre étude a mis en évidence dans la MP, qu’il était possible de propager la pathologie chez des souris et chez des primates en injectant, dans la substance noire ou dans le striatum, des homogénats contenant des fractions de corps de Lewy provenant de cerveaux de patients parkinsoniens décédés. Les animaux présentaient une neurodégénérescence nigrostriatale des neurones dopaminergiques indiquant la capacité des homogénats à induire le processus pathologique
Projet de recherche
Notre projet de recherche s’inscrit dans le champ des études ayant pour but de mieux caractériser les mécanismes impliqués dans la propagation de la mHTT. Comme expliqué précédemment, il semblerait que la mHTT ait les caractéristiques permettant d’inclure la MH dans les maladies à prion mais ce point ne fait pas encore l’unanimité au sein de la communauté scientifique. Parmi ces caractéristiques, il y a la capacité de propagation inter-espèce. Il a été montré par le biais d’injection de fibrilles et de cellules souches pluripotentes mHTT-positives que la propagation inter-espèce était possible cependant, comme cela a pu être mis en évidence dans d’autres pathologies neurodégénératives comme la MA ou la MP, il n’a jamais été montré la possibilité de transmission inter-espèce par le biais d’homogénats de patients décédés atteints de la MH. C’est donc ce que nous avons voulu éclaircir pour mon projet de maitrise. En effet, nous avons voulu évaluer la robustesse de la théorie du « prion » pour la mHTT en injectant des homogénats de cerveaux de patients huntingtoniens décédés dans différents protocoles réalisés chez l’animal : chez 1) les souris sauvages (WT), 2) un modèle de la MH de souris transgénique BACHD et 3) des primates non-humains; ceci dans le but d’induire une pathologie liée à la MH chez ces modèles animaux. Dans ces différents protocoles, nous nous sommes intéressés dans un premier temps à l’analyse comportementale des animaux afin de détecter si l’injection d’homogénats entrainait un phénotype de la MH chez les animaux. Puis, dans les travaux post-mortem, nous avons mis l’emphase sur la détection des homogénats injectés au niveau du site d’injection et dans les autres structures cérébrales au sein des milieux extra- et intra-cellulaire, neuronaux et gliaux. Enfin, nous nous sommes intéressés à la conformation soluble versus agrégée de la HTT.
Chapitre 1
Evidence for the spread of human-derived mutant
huntingtin protein in mice and non-human primates
*1Philippe Gosset, *1Alexander Maxan, *1Melanie Alpaugh, 2Ludivine Breger, 2Benjamin
Dehay, 3Zhu Tao, 3Zhang Ling, 3Chuan Qin, 4Giulia Cisbani, 1Nadia Fortin, 5Jean-Paul G.
Vonsattel, 1,6 Steve Lacroix, 1,6Abid Oueslati, 2Erwan Bezardand 1,7Francesca Cicchetti
1Centre de Recherche du CHU de Québec - Université Laval, Axe Neurosciences, Québec,
QC, Canada, G1V 4G2; 2Université de Bordeaux,Institut des maladies neurodégénératives,
UMR 5293, Bordeaux, France, CNRS UMR 5293; 3Institute of Laboratory Animal
Sciences, China Academy of Medical Sciences, Beijing, China; 4University of Toronto,
Department of Nutritional Sciences, Toronto, ON, Canada, M5S 1A8; 5New-York Brain
Bank, Columbia University, New York, NY, United States, 10032; 6Département de
Médicine Moléculaire, Université Laval, Québec, QC, Canada, G1K 0A6; 7Département de
Psychiatrie & Neurosciences, Université Laval, Québec, QC, Canada, G1K 0A6
* Equal contribution
Correspondence
Francesca Cicchetti, Ph.D.
Centre de Recherche du CHU de Québec - Université Laval (CRCHUQ) Axe Neuroscience T2-50
2705, Boulevard Laurier
Québec, QC, G1V 4G2, Canada Tel #: (418) 525-4444 ext. 48853
Highlights
• Injection of homogenates derived from post-mortem brain tissue of HD patients does not induce behavioural changes but mHTT propagates within the central nervous system up to 3 months post-surgery in WT mice.
• Injection of homogenates derived from post-mortem brain tissue of HD patients exacerbates cognitive deficits in BACHD mice with detectable mHTT aggregates in the vicinity of the injection site 12 months post-surgery.
• Injection of homogenates derived from post-mortem brain tissue of HD patients does not induce behavioural changes in non-human primates but mHTT aggregates are detectable in the vicinity of the the injection site 8 months post-surgery.
• Injection of homogenates derived from post-mortem brain tissue of HD patients does not change the pattern nor the intensity of endogenous HTT staining in any of the tested conditions.
1.1 Résumé
Ces dernières années, des preuves substantielles ont émergé pour suggérer que la propagation des protéines pathologiques contribue à la pathologie dans de nombreuses maladies neurodégénératives. Les travaux de notre laboratoire et d’autres ont montré que, malgré sa nature strictement génétique, la maladie de Huntington (MH) peut être une autre condition dans laquelle ce mécanisme participe à la pathologie. Dans cette étude, nous avons cherché à déterminer si la protéine de huntingtine mutée (mHTT) présente dans les tissus de cerveaux post-mortem dérivés de patients MH, peut induire une pathologie chez la souris et/ou les primates non-humains. Pour cela, nous avons effectué trois séries distinctes d'expériences où des homogénats ont été injectés dans le cerveau de souris adultes a) de type sauvage (WT) et b) de type BACHD ou c) de primates non-humains. Les évaluations neuropathologiques ont révélé que, bien que les changements dans la protéine huntingtine endogène n'étaient pas apparents, la protéine pouvait se propager entre les cellules et les structures cérébrales. De plus, des différences de comportement ne se sont produites que dans le modèle animal de la MH, qui surexprimait déjà le mHTT. Pris ensemble, nos résultats indiquent que le mHTT dérivé du cerveau humain a une capacité limitée à se propager entre les cellules et ne représente pas des caractéristiques de type prion. Cela contraste avec des travaux récents démontrant que d'autres formes de mHTT - telles que les fibrilles d'une longueur polyQ pathologique ou les fibroblastes et les cellules souches pluripotentes induites dérivées de cas de MH - peuvent en effet disséminer la maladie dans le cerveau à la manière d'un prion.
1.2 Abstract
In recent years, substantial evidence has emerged to suggest that spreading of pathological proteins contributes to disease pathology in numerous neurodegenerative disorders. Work from our laboratory and others have shown that, despite its strictly genetic nature, Huntington’s disease (HD) may be another condition in which this mechanism participates to the pathology. In this study, we set out to determine if the mutant huntingtin protein (mHTT) present in post-mortem brain tissue derived form HD patients can induce pathology in mice and/or non-human primates. For this, we performed three distinct sets of experiments where homogenates were injected into the brains of adult a) Wild-type (WT) and b) BACHD mice or c) non-human primates. Neuropathological assessments revealed that, while changes in the endogenous huntingtin protein were not apparent, the protein could spread between cellular elements and brain structures,. Furthermore, behavioural differences only occurred in the animal model of HD which already overexpressed mHTT. Taken together, our results indicate that mHTT derived from human brains has only a limited capacity to spread between cellular elements and does not depict prion-like characteristics. This contrasts with recent work demonstrating that other forms of mHTT - such as fibrils of a pathological polyQ length or fibroblasts and induced pluripotent stem cells derived from HD cases - can indeed disseminate disease throughout the brain in a
1.3 Introduction
Huntington’s disease (HD) is a neurodegenerative disorder that progresses to death 10 to 30 years following clinical onset (Tang and Feigin 2012). During the premanifest phase, subtle changes in personality, cognition and motor control emerge and continue to progress to overt motor abnormalities and consequent diagnosis of manifest HD. The main neuropathological hallmarks relate to extensive cell loss in the striatum as well as a host of other brain structures, including a particular vulnerability of the cerebral cortex (Reiner, Dragatsis, and Dietrich 2011; Vonsattel 2008). Disease is driven by an autosomal dominant pattern of inheritance and is caused by an expansion of the CAG repeat in Exon 1 of the
huntingtin gene, which encodes for the ubiquitously expressed huntingtin (HTT) protein
(Venkatraman et al. 2004). This CAG elongation leads to the production of the mutant huntingtin protein (mHTT), which is characterized by an extended polyglutamine (polyQ) stretch (Jana et al. 2001; Davies et al. 1997).
While mHTT is classically described to drive pathology from within cellular elements, there is now compelling evidence supporting the capacity of the protein to spread between cells and seed pathology; a phenomenon which has been demonstrated for a number of other proteins associated with various neurodegenerative disorders (Prusiner 1982; Jucker and Walker 2013; Olanow and Prusiner 2009). Thus far, the in vivo evidence for the capacity of mHTT to propagate and seed pathology has come from studies utilizing fibroblasts and induced pluripotent stem cells (IPSCs) derived from HD patients (Jeon et al. 2016) as well as synthetic fibrils harbouring a pathological polyQ length (Masnata et al. 2019). However, in other disease contexts, much of the original evidence for the prion-like properties of various proteins stems from the injection of homogenates prepared from patient brains. For example, injection of brain homogenates from individuals diagnosed with Alzheimer’s disease (AD) into the hippocampus of transgenic mice has shown a time and concentration-dependent induction of cerebral β-amyloidosis (Meyer-Luehmann et al. 2006). In Parkinson’s disease (PD), intracerebral injection of homogenates prepared from the brains of transgenic mice into pre-symptomatic animals of the same genotype (Luk et al. 2012) or Lewy body homogenates derived from human brains into either the substantia nigra or the striatum of WT mice and non-human primates induces or exacerbates
pathology. In these paradigms, mice exhibited nigrostriatal dopaminergic degeneration confirming the ability of such homogenates to induce PD-related pathological features (Recasens et al. 2014; Dehay and Bezard 2019).
In our current study, we set out to determine if mHTT containing lysates, derived from the brains of HD patients, could similarly propagate between cells, seed changes in the endogenous protein and alter behavioural outcomes. Our findings confirmed the capacity of mHTT-derived from human homogenates to spread to regions remote from the injection site in adult WT mice. However, this form of the protein depicted limited propagation efficiency in other models and only exacerbated cognitive deficits in BACHD mice with no tangible impact on endogenous WT HTT in any of the conducted protocols. Taken together, these findings indicate that protein form is an important factor influencing the consequent degree of toxicity.
1.4 Material and Methods
Preparation of human mHTT homogenates
WT mice
Homogenates were prepared from 0.14 g frozen post-mortem brain sample from an HD patient with 53 CAG repeats (Male, 44 years of age at death with a post-mortem delay of 30 hours (hrs); provided by the Cambridge brain bank, UK) or a control patient (Female, 63 years of age at death with a post-mortem delay of 72 hrs; provided by the Cambridge brain bank, UK). Tissue from both brain samples was manually homogenized in phosphate buffer saline (PBS) (10-fold weight/vol) and centrifuged at 9000 RPM (Beckman Optima Max Ultracentrifuge, Rotor: TLA 120.2) for 20 minutes (min) at room temperature (RT) to remove cellular debris. The resultant supernatant was used for injection. Control and HD homogenates had final protein concentrations of 14.3 µg/µL and 10.8 µg/µL respectively.
BACHD mice
The injected homogenates were also derived from the aforementioned HD case with 53 CAG repeats (detailed above) but preparation was conducted in a slightly different manner. Tissue was manually homogenized in 650 µL of homogenization buffer composed of 10 mM Tris HCL pH 7.5 Aldrich, Oakville, ON, Canada), 0.8 M NaCl (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada), 1 mM ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) (Sigma-Aldrich) and 1 mM dithiothreitol (DTT) (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada). Sarkosyl (Sigma-Aldrich) (final concentration 1%) was then added and samples were incubated at 37°C for 30 min. After a centrifugation at 12,000 x g for 10 min at RT, the supernatant was collected and centrifuged at 100,000 x g for 10 min at RT. The resultant pellet was suspended in 520 µL of 1X PBS by sonication and then lysates were divided into four tubes (each 500 mL) and centrifuged at 100,000 x g for 20 min at RT. The supernatants were collected and stored at -80°C after processing. Control and HD homogenates had final protein concentrations of 17.4 µg/µL and 15.1 µg/µL respectively.
Non-human primates
Homogenates were generated from a juvenile HD case expressing 105 CAG repeats (Female, 9 years of age at death with a post-mortem delay of 2 hrs and 20 min; provided by
New York brain bank/Columbia university, USA). The obtained sample also weighed approximately 0.14 g. Prior to injection, soluble and insoluble fractions of the protein were separated by sucrose gradient. Briefly, 140 µL of the brain homogenate resulting from the protocol described for WT mice was mixed with 60 µL of 2.2 M sucrose (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada) and carefully layered over a sucrose gradient composed of 175 µL of 2.2 M sucrose, 400 µL of 1.4 M sucrose and 400 µL of 1.2 M sucrose. The sucrose gradient containing the protein homogenate underwent ultracentrifugation at 56,000 x g for 3 hrs at RT. The top layers (soluble fraction) were used for injection in non-human primates. All samples were recovered and stored at -80°C until use. The HD homogenate had final protein concentration of 15.7 µg/µL.
Confirmations of homogenate protein content by western blot or dot blot
All reagents and chemicals used for immunoblotting were purchased from Sigma-Aldrich, unless otherwise specified. To confirm the presence of mHTT within homogenates, 10 µg of protein was prepared in laemli buffer (60 mM Trizma-hydrochloride, 6% glycerol, 2.5% β-Mercaptoethanol, 2% Sodium dodecyl sulfate, 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, Thermo Fisher Scientific, Mississauga) and 0.02% bromophenol blue) and heated for 5 min at 95°C. The proteins were then separated for 1 hr and 20 min at 100 V on a polyacrylamide gel (8-14%) (37.5:1 acrylamide: bisacrylamide solution (Thermo Fisher Scientific) in 0.2 M Tris-acetate buffer, pH 7.4) using a midi electrophoresis system (15 x 15 cm) in electrophoresis buffer (50 mM Tricine, 50 mM Trizma-HCL, 0.1% SDS, 1.3 mM sodium bisulfite, pH 8.2), as previously described (Jeon et al., 2016). Proteins were
electroblotted at 15V onto 0.45 µm AmershamTM HybondTM Polyvinylidene fluoride
(PVDF) membranes (VWR, Mississauga, ON, Canada) overnight at 4°C in transfer buffer (20% methanol (Thermo Fisher Scientific), 25 mM Bicine, 25 mM Bis-Tris, 1 mM EDTA (Thermo Fisher Scientific), 1.3 mM sodium bisulfite, pH 7.2). After blocking in a solution of 5% skimmed milk (Bioshop Canada Inc, Burlington, ON, Canada), 0.5% bovine serum albumin (Bioshop Canada Inc) in PBS with 0.1% Tween-20 (Thermo Fisher Scientific), the
conjugated goat anti-rabbit or anti-mouse antibody (1:25,000, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA) and detection was completed by the addition of chemiluminescence reagents (Immobilon Forte, MilliporeSigma). Images of the membranes were acquired using myECL Imager (Thermo Fisher Scientific). To confirm the presence of mHTT within the homogenates to injection into non-human primates, 1 µL of the final homogenate sample was blotted directly onto a PVDF membrane, alongside the control homogenate. This membrane was blocked as described for western blot detection of mHTT, and incubated with a primary antibody against anti-expanded polyglutamine stretch clone 5TF1-1C2 (1:1,000, MilliporeSigma) overnight, and donkey anti-mouse secondary antibody (1:25,000, Jackson Immunoresearch) the following day. Images of the membranes were acquired using myECL Imager.
Animal husbandry
Mice
Sixteen 4-7 lonth old male adult WT C57BL/6NCrl mice (Charles River, Senneville, QC, Canada) and fifteen 8-week old male adult BACHD mice (The Jackson Laboratory, Sacramento, CA, USA) were subjected to single stereotaxic injection of homogenates. All mice were housed in a temperature (22°C) and light-controlled environment (12 hrs light/12 hrs dark cycles) at the animal facility of the Centre de Recherche du CHU de Québec - Université Laval with ad libitum access to food and water. Animal handling, surgeries and all other procedures were completed in accordance with the guidelines of the Canadian Council on Animal Care and were approved by the Comité de Protection des Animaux du CHU de Québec – Université Laval.
Non-human primates
Seven captive-bred male macaques (Macaca mulatta, Xierxin, Beijing, PR of China; mean age = 7 years (± 0.6)) (n=3 mHTT homogenate injected, 3 uninjected for behaviour and 1 uninjected for post-mortem analysis) were individually housed, but with the possibility to interact with adjacent macaques, under controlled environmental conditions of humidity (50 ± 5%), temperature (24 ± 1°C) and light (12 hrs light/12 hrs dark cycles). Food and water were available ad libitum with the exception of the behavioral testing days when
animals were food-restricted the morning of the object retrieval task in order to increase motivation. Animal care was supervised daily by trained veterinarians. The study design was approved by the Institute of Lab Animal Science IACUC (Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, China) and all experimental procedures were conducted in accordance with European Communities Council Directive (2010/63/EU) for care of laboratory animals in an AAALAC-accredited facility.
Stereotaxic injections
For the protocol conducted in WT animals, mice ranged from 4 and 7 months of age at the start of the experiment, while for the protocol performed in BACHD animals, all mice were 8 weeks of age at surgery. Before surgery, lidocaine-bupivacaine (7-3.5 mg/kg) and slow-release buprenorphine (0.5 mg/kg) were administered subcutaneously. Animals were deeply anaesthetized by administration of 5% isoflurane, maintained at surgical plane with a dose of 1.5% isoflurane in oxygen and kept warm with a heating pad. The head was firmly fixed to a stereotaxic frame and the skin was disinfected by swabbing with 70% ethanol (Commercial Alcohols, Brampton, ON, Canada) and chlorhexidine. After identification of the bregma, all mice received a single unilaterally 2 µl injection of human brain homogenate, from either Control or HD patients, into layer V of the left cortex (AP: +1.60, ML: +1.40, DV: -0.75) (Franklin and Paxinos 2013). A glass Hamilton syringe (Thermo Fisher Scientific) equipped with a 25 mm long 31GA needle and a bevel of 30° (Thermo Fisher Scientific) was used to perform injections. Following injection, the skin was sewn with Vicryl sutures (Ethicon, Somerville, NJ, USA), the flux of isoflurane was interrupted, and mice were placed into recovery before being returned to their home cage. All non-human primates were deprived of food and water the night before surgery. Anaesthetised animals (ketamine HCl at 10 mg/kg (intramuscular injection)) were intubated and maintained under anaesthesia with isoflurane. Heart rate, temperature and oxygen saturation were monitored and recorded during the entire procedure. Theoretical targets
