Cartographie des sites de liaison entre l'angiotensine II et les récepteurs AT [indice] 1 humain et AT [indice] 2 de RAT

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Figure 5. Propriétés de liaison de l'analogue "^-[SarSBpa^]Angn aux récepteurs

ATi humain et AT2 de rat. Dans la partie A, les membranes de cellules COS-7 (70 pg de protéines) préalablement transfectées à l'aide du cDNA encodant pour le récepteur hATi, furent incubées dans 500 pL de milieu de liaison en présence de concentrations

croissantes de '^^I-[Sar^Bpa^]Angn (0.0625-8.0 nM)

pour une période de 45 min à la

température de la pièce. Dans la partie B, les membranes de cellules PC-12 (5 pg de protéines) exprimant de façon endogène le récepteur rAT2, furent incubées dans 500 pL

de milieu de liaison en présence de concentrations croissantes de ^^^I-[Sar\Bpa^]Angn

(0.0625-8.0 nM)

pour une période de 180 min à 37°C. Les incubations furent terminées

par filtration sous pression réduite à travers des filtres de fibre de verre (Whatman). La

radioactivité associée aux membranes (retenue sur le filtre) fut déterminée au moyen d'im compteur gamma. L'affinité (Kd) du composé pour les récepteurs hATi et rAT2 fut déterminées par analyse de scatchard en médaillon. Ces résultats sont représentatifs de trois expériences ayant donné des résultats similaires.

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Figure 14. Hydrolyse au CNBr du récepteur mutant hATiI177M photomarqué

avec l'analogue ^^-[Sar^^pa^AngH. Dans la partie A, le récepteur hATiI177M

photomarqué (60 000 cpm) et partiellement purifié a été soumis à une hydrolyse au

CNBr. Les récepteurs hATi et hATiI177M photomarqués ont été incubés à la

température de la pièce pendant 18 h en présence de CNBr

(100 mg/ml) dans du TFA 70

% à l'obscurité. Les réactions fiirent arrêtées par l'ajout de 2 ml d'eau suivi d'une série de trois lyophilisations. Les fragments des récepteurs hATi et hATiI177M issus du

clivage au CNBr fiirent ensuite incubés en présence de PNGase-F (2 unités) pendant 16

h à la température de la pièce. Les échantillons furent ensuite solubilisés dans un volume

égal de Laemmli 2X puis mis sur gels SDS-PAGE tris-Tricine 16.5%. Les gels furent

séchés pendant 2h30 à 68°C puis exposés sous films BIOMAX à -80°C. Les standards de

poids moléculaire sont indiqués. Les chiffres de droite (143-243 et 143-177)

représentent la région photomarquée en terme de résidus selon la bande obtenue. Cette expérience est représentative d'au moins 3 expériences ayant donné des résultats

similaires. La partie B montre une représentation bidimensionnelle du récepteur hATi.

Les cercles noirs indiquent la région du récepteur identifiée après clivage au CNBr du

mutant hATiI177M (résidus 143 à 177).

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