Identification du mécanisme de régulation de la protéine β-caténine par la protéine Fanconi-C

Identification du mécanisme de

régulation de la protéine

β-caténine

par la protéine Fanconi-C

Thèse

Delphine MASI

Doctorat en Biologie cellulaire et moléculaire

Philosophiae Doctor (Ph.D.)

Québec, Canada

II

Résumé

L’Anémie de Fanconi est une pathologie génétique rare qui se caractérise par une anémie aplasique, des malformations congénitales de sévérité variable et un risque accrue au développement de cancers. En particulier, les patients atteints d’Anémie de Fanconi développent des carcinomes squameux de la tête et du coup. La protéine FANCC est l’une des 21 protéines Fanconi connues à ce jour. Il a déjà été montré que FANCC possède de nombreux rôles en dehors de celui de la réparation de l’ADN. Ici, nous nous sommes intéressés au rôle de FANCC dans la régulation de la voie Wnt/β-caténine. Cette voie de signalisation est souvent dérégulée dans les cancers.

Nous avons pu montrer que des formes mutantes de FANCC régulent la quantité de caténine libre via son interaction avec le complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine. En effet, en interagissant avec l’une des protéines du complexe, la protéine APC, les formes mutantes de FANCC permettent d’augmenter la quantité de cette protéine, ainsi que de la protéine d’assemblage du complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine, Axin-1. On observe ainsi une diminution importante de la quantité de caténine libre, ainsi que de caténine au noyau, entrainant une perte d’activation des cibles transcriptionnelles de la β-caténine. Parmi ces cibles, l’oncogène c-Myc, codant pour un facteur de transcription connu pour réprimer la transcription de DKK1. Or, il a été montré que le niveau d’expression de DKK1 est plus élevé dans les cellules mutantes pur FANCC. Nous avons, effectivement, pu confirmer que l’expression de DKK1 est inverse de celle de la protéine c-Myc dans les fibroblastes de peau dérivés de patients Fanconi. De manière intéressante, si l’expression de la protéine c-Myc est diminué dans les fibroblastes mutants pour FANCC, en comparaison aux fibroblastes exprimant un FANCC sauvage, nous n’avons pas observé de variation dans l’expression de c-Myc dans des cellules de carcinomes squameux dérivées de patient mutant pour FANCC et complémentées en FANCC. Ainsi, la surexpression des protéines Axin-1 et APC dans les cellules mutantes pour FANCC induit un défaut d’accumulation de la β-caténine dans ces cellules, conduisant à une perte d’activation des cibles transcriptionnelles de cette protéine.

De plus, la réexpression de la protéine c-Myc dans les cellules de carcinomes squameux dérivées de patient, mutées pour FANCC, permet d’envisager de nouvelles cibles thérapeutiques, comme la protéine CT120. Cette dernière est une protéine membranaire, régulée par c-Myc qui est impliquée dans 2 voies de signalisation fréquemment dérégulées dans des cancers, et en particulier dans les carcinomes squameux de la tête et du coup. Ce type

III de cancers est particulièrement problématique à la fois chez les patients Fanconi, mais également dans la population générale. En effet, les carcinomes squameux de la tête et du coup représentent la 5ième _{cause de mortalité causée par le cancer dans le monde.}

IV

Abstract

Fanconi Anemia (FA) is a rare genetic disorder characterized by bone marrow failure, physicals abnormalities and a high risk of cancers. Specifically, the FA patients develop head and neck squamous cell carcinoma. The FANCC protein is one of the 21 FA proteins. It was already shown that FANCC have numerous functions in addition of the DNA repair. We investigate about the role of FANCC in the Wnt/β-catenin regulation. The signaling pathway is known for its involvement in carcinogenesis.

We show that mutants of FANCC regulate the free β-catenin level, interacting with APC, a protein of the β-catenin degradation/neutralization complex. Indeed, this interaction leads to an increasing of the levels of APC and Axin-1, the scaffold protein of the β-catenin degradation/neutralization complex. The decreasing of free β-catenin leads to the loss of the transcriptional activation of the β-catenin targets, including Myc. The protein coded by

c-Myc is a transcriptional factor known for repressing DKK1 expression. It was previously shown

that there is an increase expression of DKK1 in FA mutant cells. And we show that the expression of DKK1 is opposite of the expression of c-Myc in FA patient derived fibroblasts. Interestingly, the expression of c-Myc is decreased in FANCC mutant patient derived fibroblasts, compare to the complemented cells, but there is no difference in the c-Myc level between patient derived squamous cell carcinoma cells mutant for FANCC and complemented cells. We hypothesize that the increased levels of APC and Axin-1, leading the decreased level of activated β-catenin and the loss of the transcriptional activation of the β-catenin targets in FANCC mutant cells is a protecting mechanism against the cells transformation.

Furthermore, this expression of c-Myc in patient derived squamous cell carcinoma cells, open to new therapeutic targets, as CT120. This protein is a membranous protein, regulate by c-Myc, involved in 2 signalization pathways deregulated in cancers, including head and neck squamous cell carcinoma. This kind of cancer is a health care issue; indeed, this cancer is the 5th _{death cause related to cancer in the general population.}

V

Table des Matières

Résumé ... II Abstract ... IV Table des Matières ... V Liste des figures ... VIII Liste des tableaux ... IX Liste des abréviations ... X Remerciements ... XV Avant-propos... XVII

1. Chapitre 1 : Introduction ... 1

1.1. L’Anémie de Fanconi ... 1

1.1.1. Origine et contexte actuel ... 1

1.1.2. Caractéristiques cliniques de l’Anémie de Fanconi ... 2

1.1.2.1. Les malformations congénitales de l’Anémie de Fanconi. ... 2

1.1.2.2. Les défauts hématologiques de l’Anémie de Fanconi. ... 5

1.1.2.3. Les cancers de l’Anémie de Fanconi. ... 7

1.1.2.4. Diagnostic et prise en charge des patients atteints de l’Anémie de Fanconi ... 8

1.1.3. Caractéristiques moléculaires de l’Anémie de Fanconi ... 10

1.1.3.1. Les gènes Fanconi ... 10

1.1.3.2. Les protéines Fanconi ... 13

1.1.3.3. La voie de signalisation Fanconi ... 15

1.1.4. La protéine Fanconi-C ... 17

1.2 La voie de signalisation Wnt/β-caténine ... 19

1.2.1. Présentation générale de la voie Wnt/β-caténine ... 19

1.2.2. La protéine β-caténine : structure et fonction ... 23

1.2.3. Le complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine ... 25

1.2.3.1. Composition et fonctionnement du complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine…. ... 25

1.2.3.2. Les protéines du complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine ... 27

1.2.4. Le rôle de la voie de Wnt/β-caténine dans la cancérogenèse ... 29

1.2.4.1. La β-caténine dans le cancer ... 30

1.2.4.2. Adenomatous polyposis coli dans le cancer ... 30

1.2.4.3. Les protéines Axines dans le cancer ... 31

1.2.4.4. DKK1 dans le cancer ... 31

2. Chapitre 2 : Les dérégulations de la voie Wnt/β-caténine dans les cellules AF 33 2.1 Introduction ... 33

VI

2.2.1 Lignées cellulaires et conditions de culture ... 35

2.2.2 Les constructions plasmidiques ... 35

2.2.3 Essais de gènes rapporteurs en luciférase ... 36

2.2.4 Séparation des protéines en gel de polyacrylamide et immunobuvardage… ... 37 2.2.5 Anticorps ... 37 2.2.6 Extraction Cytoplasme-noyau ... 38 2.2.7 Immunoprécipitation ... 38 2.2.8 Analyses statistiques ... 39 2.3 Résultats ... 39

2.3.1. Activation transcriptionnelle des cibles de la voie de Wnt/β-caténine par la voie Fanconi ... 39

2.3.1.1. FANCD2 est un activateur transcriptionnel des cibles de la β-caténine ... 39

2.3.1.2. FANCC est un activateur des cibles de la β-caténine ... 42

2.3.1.3. La régulation transcriptionnelle de DKK1 ... 45

2.3.2. La régulation de la β-caténine par FANCC... 48

2.3.2.1. FANCC permet l’enrichissement au noyau de la forme active de la β-caténine en tout temps. ... 48

2.3.2.2. La forme active de la β-caténine ne s’accumule pas dans les cellules déficientes en FANCC…. ... 52

2.3.2.3. La régulation du complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine par FANCC…. ... 54

2.3.2.4. Les mutants de FANCC interagissent avec APC pour stabiliser le complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine ... 56

2.4. Discussion ... 59

3. Chapitre 3 : Régulation transcriptionnelle de c-Myc par la voie Fanconi ...64

3.1 Introduction... 64

3.2 Matériel et Méthode... 64

3.2.1 Les lignées cellulaires ... 64

3.2.2 Les constructions plasmidiques ... 65

3.2.3 Essais de gènes rapporteurs en luciférase ... 65

3.2.4 Analyses statistiques ... 66

3.3 Résultats ... 66

3.3.1 La voie Fanconi active le promoteur c-Myc pleine longueur ... 66

3.3.2 La restauration de la voie Fanconi dans les cellules mutantes pour FANCC ne permet pas de restaurer l’activation du promoteur c-Myc ... 70

3.3.3 Une voie Fanconi fonctionnelle ne permet pas l’activation de fragments du promoteur c-Myc ... 73

3.4 Discussion ... 76

Chapitre 4 : Conclusion et perspectives ...77

VII

• Introduction ... 82

• Matériel et Méthode ... 84

• Les lignées cellulaires ... 84

• Les constructions plasmidiques ... 84

• Essais de gènes rapporteurs en luciférase ... 85

• Analyses statistiques ... 85

• Résultats ... 86

• Identification des motifs NR putatifs de FANCC ... 86

• Les motifs LXXLL de FANCC sont-ils des motifs NR ? ... 88

• Discussion ... 91

VIII

Liste des figures

Chapitre 1 : Introduction

Figure 1.1: Malformations caractéristiques de l’Anémie de Fanconi ... 4

Figure 1.2: Atteintes hématologiques chez les patients AF ... 6

Figure 1.3 : Représentation des protéines FANC ... 14

Figure 1.4 : Voie canonique Fanconi ... 16

Figure 1.5 : Spectre des mutations de FANCC retrouvé chez des patients Fanconi. ... 18

Figure 1.6 : la voie de signalisation Wnt/β-caténine. ... 22

Figure 1.7: Modélisation de la structure de la β-caténine ... 24

Figure 1.8: Neutralisation de la β-caténine par le complexe de dégradation/neutralisation de la β -caténine. ... 26

Chapitre 2 : Les dérégulations de la voie Wnt/

β-caténine dans les

cellules AF

Figure 2.2: FANCC un répresseur de DKK1 mais un activateur des cibles de la β-caténine ... 44

Figure 2.3: Myc un répresseur transcriptionnel de DKK1... 47

Figure 2.4 : FANCC induit un enrichissement au noyau de la β-caténine activée ... 49

Figure 2.5: Enrichissement de la β-caténine totale et active au noyau des cellules mutante pour FANCC en comparaison aux cellules contrôles traitées au LiCl. ... 51

Figure 2.6: La β-caténine activée n’accumule pas dans les cellules mutantes pour FANCC en comparaison aux cellules contrôles. ... 53

Figure 2.7: Dérégulation des protéines du complexe de dégradation de la β-caténine dans les cellules mutantes pour FANCC en comparaison aux contrôles ... 55

Figure 2.8: FANCC mutant interagit avec APC ... 58

Figure 2.9: Schéma proposant un mécanisme de régulation de la β-caténine par FANCC ... 62

Chapitre 3 : Régulation transcriptionnelle de c-Myc par la voie

Fanconi

Figure 3.2: La surexpression de FANCD2 dans des cellules mutantes pour FANCC ne rétablit pas l’activation du promoteur c-Myc ... 72

Figure 3.3: FANCC ne régule pas les fragments du promoteur c-Myc ... 75

Annexe : Les domaines de liaison aux récepteurs nucléaires de

FANCC

IX

Liste des tableaux

X

Liste des abréviations

ADN AF APC ARM ATM ATP ATR BARD1 BRCA1/2 BRG1 BTB/POZ CDC CDK Chk1/2 CK1 CRM1 CSH CtBP1 CYP2E1 DEB DKK1 Dsh DSP ERCC FAAP100 FAAP24 FANC FAP FAZF GPR124 GSK3β GST HDACs HEF1 HN-SCC Hsp70 ICAT ICL INF Acide DésoxyriboNucléique Anémie de Fanconi

Adenomatous Poliposis Coli ARMadillo

Ataxia Telangiectasia Mutated protein Adénosine Tri-Phosphate

Ataxia Telangiectasia ADP-Ribose polymerase BRCA1 Associated RING Domain 1

BReast CAncer susceptibility protein 1/2 Brahma-Related Gene 1

BR-C, Ttk and Bab/Pox virus and Zinc finger Cell Division Cycle

Cycilne Dépendantes des Kinases Checkpoint kinase-1/2

Casein Kinase 1

Chromosome Region Maintenance 1 Cellule Souche Hématopoïétique C-terminal Binding Protein 1 CYtochrome P450 2E1 DiEpoxyButane DicKKopf-1 Dishvelled

Dithiobis Succinimidyl Propionate

Excision Repair Cross-Complementing group FancA Assoxiated Protein of 100kDa

FancA Associated Protein of 24kDa

FANConi anemia protein (groupe de ocmplémentation A à V) Familial Adenomatous Polyposis coli

FA Zinc Fingers

G Protein coupled Receptor 124 Glycogene Synthase Kinase 3β Glutathione S-Transferase Histone DeACetylase

Human Enhancer of Filamentation 1 Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Heat shock protein 70

Inhibitor of β-CAtenin and TCF4 Interstrand CrossLink

XI Int KEAP1 LDL LGR LMA LRP MAD2L2 MHF MMC NAPDH NER NES NLS NRF2 OB-FOLD ORL PALB2 PARP PCP PHD PP2A PRDX RAD51 ROS RPA SAC sFRP SLX SOST STAT1 SWI/SNF TCF TLE TNF TRP UAF UNC5A Integration

Kelch-like ECH-Associated Protein 1 Low Density Protein

Leucine-rich repeat containing G protein coupled Receptor Leucémie Myéloïde Aigue

Low density protein Related Protein Mitotic Arrest Deficient-Like 2 M interacting Histone Fold protein MitoMicine C

Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Nucleotide Excision Repair

Nuclear Exportation Signal Nuclear Localization Signal

Nuclear factor erythroid 2-Related Factor Oligonucleotide/oligosaccharide-Binding FOLD Otto-Rhino-Laryngologique

Partner And Localizer of BRCA2 Poly ADP-ribose Polymerase Planar Cell Ploarity

Plant Homeo Domain Protein Phosphatase A2

PéroxiReDoXine mitochondriale RADiation sensitive 51

Reactive Oxygene Species Replication Protein A

Spindle Assembly Checkpoint Secreted Frizzled related protein

Synthetic Lethal of unknown (X) function SclerOSTin

Signal Transducer and Activator of Transcription 1 SWItch/Sucrose Non Fermentable

T-Cell specific transcription Factor Transducing-Like Enhancer

Tumor Necrosis Factor TetRatricoPeptide repeat

Ubiquitine specific peptidase 1 Associated Factor UNCoordinate-5A

XII USP1 Wg WNT XPF XRCC2 β-TrCP

Ubiquitine Specific Peptidase 1 Wingless

Wingless iNTegration

Xeroderma Pigmentosum group F X-ray Repair Cross Complementing 2

XIII Unités de mesure kDa ng µg mg µL mL nM µM mM Kilo Dalton Nanogramme Microgramme Miligramme Microliter Mililitre Nanomolaire Micromolaire Milimolaire Divers α β γ δ alpha beta gamma delta

XIV

À Alain Larroque, parce que sans lui je n’aurais jamais eu la folie de croire en moi.

« J’ai toujours préféré la folie des passions à la sagesse de l’indifférence »

Anatole France

« Cela paraît toujours impossible, jusqu’à ce que ce soit fait. » Nelson Mandela

XV

Remerciements

Pour commencer, je souhaite remercier Madeleine Carreau pour m’avoir offert l’opportunité d’effectuer mon doctorat au sein de son laboratoire de recherche. Je souhaite également remercier les équipes du Dr Carreau et du Dr Lévesque, chacun à votre manière vous m’avez permis de me rendre compte de ma force.

En particulier, merci à Caroline Huard, à Caroline Tendron et à Audrey Magron de m’avoir accompagné dans mes débuts de thèse et pour m’avoir soutenu dans les moments de doute, et ce même après vos dépars a toutes. Merci à Chantal Godin, déesse du clonage, pour ses connaissances et son soutien, merci aussi à Jacinthe Julien pour son aide. Un merci aussi à Christian Lessard de m’avoir fait sourire quand je trouvais un manchon de café caché dans mes affaires.

Je remercie aussi les enseignants, qui tout au long de mon parcours ont su partager leur passion avec moi. Merci à Valérie Malotier (enseignante en primaire) pour votre patience à mon égard et surtout pour ne pas m’avoir oublié, merci à Mmes Loyen et Geaugey (enseignantes en sciences de la vie et de la terre au secondaire) pour avoir su me transmettre leur amour des sciences de la vie, et merci à M. Serre (enseignant en génétique à l’université), pour m’avoir fait aimé la recherche. On ne le dit pas assez mais ce sont vous les enseignants qui construisez notre avenir, donc merci d’avoir construit le mien.

J’adresse aussi un merci particulier à mes amis pour ces trois dernières années pleines de soirées, de chocolat favori, de randonnées, de voyages inoubliables. Merci Audrey Magron, Éric Poulin, Audrey Hubert, Marine Lambert, Jouda Gamara, Julien Vitry, Aurélie Louit, Maxime Savard et Anne-Claire Duchez. Un merci tout particulier aux Audrey, pour leur écoute de tous les instants, pour leur présence dans les bons et les mauvais moments, pour leur soutien indéfectible contre vents et marées (euh enfin ici c’est plutôt des blizzards et des tempêtes de neige!). Merci pour ces moments de pleurs, de rire, de joie. Vous avoir rencontré au cours de mon doctorat est probablement une des meilleures choses que j’en retirerais.

J’aimerais à présent remercier ma famille (attention ils sont nombreux!). Merci à ma tante Catherine Larroque et à ses enfants Mickeal, Ludovic et Jessica, leur conjoints Solène, Émilie et Arnaud et leurs enfants Zoé, Mylan, Ethan, Olivia et Nathan, merci à mon autre tante Nathalie Casasus et à ses enfants Romain, Emma et Lola. Votre folie me rappelle

XVI chaque fois d’où je viens et me ramène à l’insouciance de l’enfance. Merci à mon grand-père, Crawford Casasus, Daddy, tu m’as fait aimer le Québec avant même de le connaître. Ton soutien indéfectible m’a porté jusqu’ici. Je voudrais aussi remercier mes grand-mères Christiane Casasus et Janine Masi, je sais que vous avez toujours cru en moi et que vous seriez heureuses et fières de voir ce que j’ai accompli. Un énorme merci aussi à mon oncle Alain Larroque, toi plus que les autres aurais voulu lire cette thèse, c’est pour cette raison que je te la dédie. Enfin merci à mes parents Laurent et Caroline Masi, ainsi qu’à ma sœur, Marine Masi, son conjoint Lewis Balabanian-Lévi et leur merveilleuse petit fille Ida, la force qui m’a permis de partir loin de tout ce que j’avais connu, cette force qui m’a permis de tenir quoi qu’il arrive, elle vient de vous. Votre amour, votre foie en moi est ce qui me fait avancer. Merci de m’avoir laissé m’envoler pour m’épanouir.

Merci également à la famille Garon-Vincent d’être présente et pour ces repas en famille. Je tiens aussi à te remercier ma BFF. Cette thèse est aussi la tienne. Tu me manques. Pour finir, j’aimerais remercie Olivier Vincent. Merci mon amour pour ton aide, même si tu ne comprends rien à ce que je fais, ton soutien sans faille, ta gentillesse, ta patience. Ta présence illumine mes jours, même les plus sombres, merci de me faire rire quand j’ai envie de pleurer, merci de m’offrir ton épaule quand je ne peux pas retenir mes larmes, et par-dessus tout, merci de m’offrir tant de bonheur et d’amour. T’avoir à mes côtés me rend invincible.

XVII

Avant-propos

Cette thèse présente l’ensemble des analyses et des résultats obtenus au cours de mon doctorat portant sur la régulation de la β-caténine par la protéine Fanconi-C. Ce projet de recherche a été développé suite à l’identification de FANCC comme étant un régulateur transcriptionnel du gène Dickkopf-1 (DKK1) par des études de régulation de gènes en micro-puce d’ADN et des essais de gènes rapporteur en luciférase. Le gène DKK1 est connu pour être régulé par la voie de Wnt/β-caténine, et il ait été montré que FANCC interagit avec des protéines impliquées dans la régulation transcriptionnelle de cette voie, comme la protéine β-caténine ou encore la protéine C-terminal binding protein 1. Mes travaux ont ensuite permis d’établir que l’expression d’une protéine FANCC sauvage permet une régulation de la stabilité de la β-caténine et qu’une mutation dans la protéine FANCC induit un défaut dans la régulation de la stabilité de cette protéine. Or, la β-caténine est la protéine effectrice de la voie Wnt/β-caténine et il est connu que la bonne régulation de cette voie est essentielle à la fois pour le maintien et la différenciation des cellules souches, mais également pour prévenir le développement de cancers. En effet, des dérégulations de la voie de Wnt/β-caténine ou des protéines de cette voie sont impliquées dans la cancérogenèse. L’ensemble des résultats obtenus permet de mieux comprendre le risque accru au développement de cancers des patients atteints de l’Anémie de Fanconi. Cette thèse représente 3 ans de travail et apporte de nouvelles connaissances permettant le développement d’outils thérapeutiques dans le traitement du cancer chez les patients Fanconi.

Dans l’ensemble, ce mémoire est composé de 5 chapitres et une annexe : une introduction (Chapitre 1), les résultats sont présentés dans les chapitres 2 et 3, la conclusion et les perspectives apportées par les résultats de ce projet sont traités dans le chapitre 4. L’annexe rapporte des résultats préliminaires. Les références bibliographiques sont présentées dans le chapitre 5.

1

1.

Chapitre 1 : Introduction

1.1.

L’Anémie de Fanconi

1.1.1. Origine et contexte actuel

L’anémie de Fanconi (AF) est une maladie génétique rare à transmission autosomique récessive. Cette pathologie appartient au groupe des maladies cassantes, qui tiennent leur nom à l’observation de cassures chromosomiques dans les cellules de patients atteints par ces maladies et qui seraient dues à une instabilité génétique. L’AF a été décrite pour la première fois en 1927 par un pédiatre suisse du nom de Guido Fanconi, suite à l’observation d’une séries d’anomalies somatiques retrouvées au sein d’une fratrie de trois enfants originaires d’une vallée alpine 1. Ces trois enfants présentaient une anémie progressive et diverses malformations congénitales, incluant une petite stature, un hypogonadisme et une hyperpigmentation de la peau. Depuis cette première caractérisation de cette pathologie, plus de 2000 cas ont été rapportés 2–4.

La fréquence de l’AF est de 3 naissances sur un million par an et touche toutes les ethnies et tous les continents 5. La fréquence d’apparition d’hétérozygotes en Amérique du nord et en Europe est d’une personne sur trois-cent 6. Si cette pathologie touche les hommes comme les femmes, il existe un léger déséquilibre de la fréquence d’apparition de l’AF selon le sexe, en effet, le rapport homme : femme est de 1,2 : 1 7. De plus, la fréquence de survenue de l’AF est plus importante dans un contexte de consanguinité 8,910–1213.

L’âge du patient lors du diagnostic est très variable, cela peut aller de la naissance à l’âge adulte (de 0 à 50 ans), mais en moyenne, les enfants atteints de l’AF sont diagnostiqués à l’âge de 6,5 ans. Le premier signe qui mène vers un diagnostic de l’AF est une pancytopénie associé à une augmentation du volume des globules rouges et une augmentation de l’hémoglobine fœtale observées lors d’un hémogramme 14,15_{. La pancytopénie observée est}

causée par une perte de l’auto-renouvellement de l’ensemble des cellules de la lignée hématopoïétique et un épuisement des cellules souches hématopoïétiques (CSH) de la moelle osseuse 14, aussi appelé insuffisance médullaire. Chez les patients AF, l’insuffisance

2 médullaire apparaît dans les 10 à 20 premières années de vie 16_{. En plus de ces anomalies}

d’ordre hématologique, sept patients sur dix présentent des malformations congénitales de sévérité variable, dans 2/3 des cas, ces malformations sont de type squelettique. Une combinaison de ces malformations avec des défauts hématologiques suggère un diagnostic d’AF. Ce diagnostic, posé par le médecin, est essentiel pour la prise en charge et le suivi du patient, plus développée dans la partie « 1.1.2.4. Diagnostics et prise en charge des patients atteints de l’Anémie de Fanconi » de cette thèse.

1.1.2. Caractéristiques cliniques de l’Anémie de Fanconi

Les patients présentent une grande variabilité de caractéristiques cliniques, chacune de ces caractéristiques ayant une pénétrance incomplète. Ces caractéristiques cliniques peuvent être classées en trois catégories : les malformations congénitales, les défauts hématologiques et les cancers.

1.1.2.1. Les malformations congénitales de l’Anémie de Fanconi.

Une grande partie des patients AF présentent des malformations congénitales, soit 60 à 70% d’entre eux 7. Ces malformations sont diverses et de sévérité variable. Parmi les plus fréquentes, on retrouve des malformations de type squelettiques, avec en premier lieu un retard statural pré et post-natal 17 , des malformations des membres supérieurs, avec une absence ou une duplication du pouce (figure 1.1 C), une absence de radius (figure 1.1 A), mais également des scolioses et des malformations vertébrales 16. Environ 40% des patients AF présentent également des dyschromies (hyper ou hypo-pigmentation de la peau), appelées aussi « tâches café-au-lait » (figure 1.1 B-D) et environ 25% des patients ont une dysmorphie faciale, reconnaissable par une forme triangulaire du visage, une microcéphalie, qui induit un retard mental, et une microphtalmie.

Dans 20% des cas, on retrouve également des malformations du rein et de l’appareil urinaire 18 et dans 10% des cas des anomalies oto-rhino-laryngologiques (ORL) 18. De nombreuses malformations de l’appareil digestif sont observées chez 7% des patients 18. Par ailleurs, des malformations du système génital sont également identifiées et seraient responsables d’une diminution importante de la fertilité chez les patients AF. Plus particulièrement, les femmes présentent une infertilité due à des cycles menstruels

3 irréguliers, au cours desquels aucun ovocyte n’est libéré par les ovaires. Chez les hommes, l’infertilité provient d’un défaut de l’appareil reproducteur, causé par un hypogonadisme et à une spermatogénèse anormale 19,20. Les patients AF présentent également un retard de croissance, lié à une déficience en hormones de croissance ou à un hypothyroïdisme 21. Ce retard de croissance peut également entrainer un retard dans le développement mental 19. Il est à noter que d’autres désordres hormonaux sont reportés chez les patients AF, notamment un déséquilibre du métabolisme du glucose et de l’insuline, ou diabète, un taux de lipides dans le sang anormal, ou dyslipidémie et des syndromes métaboliques 17,21.

Si les défauts développementaux peuvent présenter un handicap important, le principal problème des patients atteints de l’AF sont des troubles hématologiques.

4 Figure 1.1: Malformations caractéristiques de l’Anémie de Fanconi

(A) photographie corps complet d’un patient atteint de l’AF montrant une malformation niveau de son avant-bras droit, une absence de sa main gauche, une petite taille et un faible poids pour son âge. (B) photo rapprochée de son visage montrant l’hyper et hypo pigmentation caractéristique de Fanconi. (C) photo d’un pouce bifide. (D) tache café-au-lait dans le dos d’un nouveau-né. D’Après 22,23

5 1.1.2.2. Les défauts hématologiques de l’Anémie de Fanconi.

La principale caractéristique de l’AF est une anémie aplasique, causée par une perte de la capacité d’auto-renouvellement des cellules souches hématopoïétiques (CSH), menant à une perte de prolifération des différentes lignées sanguines dérivées de celles-ci 16_{. La}

pancytopénie apparaît en moyenne entre 5 et 10 ans chez les patients AF, avec un âge médian de 7 ans 10,24,25_.

La détection d’une anémie aplasique est réalisée grâce à une coloration d’une coupe d’os par deux colorants l’hématéine et l’éosine. Cette coloration permet d’observer une hypocellularité pouvant être causée par une perte de l’auto-renouvèlement des CSH (figure 1.2 A), en comparaison à un tissus sain (figure 1.2 B).

Plus de 85% des patients AF présentent une aplasie médullaire avant l’âge de 20 ans

26_{. Environ 12% des décès des patients AF seraient dus à des complications associées à une}

défaillance de moelle osseuse, et cette fréquence augmente jusqu’à 38% quand les patients atteignent l’âge de 45 ans 10,27. Actuellement, le seul traitement connu pour l’aplasie médullaire est une greffe allogénique. De plus, les patients Fanconi ont une très forte probabilité de développer différents types de cancers tels que des syndromes myélodysplasiques, des leucémies aigues, ou même des tumeurs solides, comme les carcinomes squameux de la tête et du coup (SCC)28–31.

6 Figure 1.2: Atteintes hématologiques chez les patients AF

Coupe d’os d’une personne présentant une anémie aplasique (A) qui se caractérise par une diminution importante du nombre de cellules de la moelle osseuse, en comparaison d’un patient sein (B). Ces coupes de tissus ont été colorées à l’hématéine et à l’éosine. Myélogramme (C) d’un individu développant une leucémie aigüe, les cellules sont tassées les unes contre les autres, (D) en comparaison d’un patient sain avec une richesse cellulaire normale .D’après 32,33

7 1.1.2.3. Les cancers de l’Anémie de Fanconi.

Bien que les principales causes de mortalité des patients AF soient associées à un déficit du système hématopoïétique et à diverses malformations congénitales, le risque accru de développement de cancers participe grandement à la faible espérance de vie des patients AF. En effet, pour un patient AF, le risque de développer un cancer avant 45 ans est de 76%

34_{. Ce risque augmenté se traduit par un âge moyen au développement d’une leucémie de 11}

ans et un âge moyen au développement de cancers solides de 26 ans 35. En effet, les patients AF montrent un risque accru au développement de leucémies myéloïdes aigües (LMA) 31 de 30% à 40 ans 24,25,27,36, et de syndromes myélodysplasiques, qui se caractérisant par un développement clonal et malin d’une ou plusieurs lignées cellulaires myéloïdes. Ces cellules sont bloquées à un stade de différenciation précoce et sont incapables d’achever leur maturation 15. Après avoir envahi la moelle osseuse, la ou les populations clonales envahissent le système sanguin et perturbent le fonctionnement des progéniteurs hématologiques normaux. Cet envahissement induit une insuffisance médullaire et une LMA. Le risque de développer un syndrome myélodysplasique pour un patient AF est de 5%, à tout âge 34. De plus, en ce qui concerne les LMA, on observe que le risque d’un patient Fanconi est 500 fois plus élevé qu’un individu de la population générale, ce qui montre bien la prédisposition de ces patients aux développement de tumeurs malignes 34. Le diagnostic de leucémies est posé suite à un test appelé myélogramme qui montrera une richesse anormale de cellule en cas de leucémie aigüe (figure 1.2 C) en comparaison à un myélogramme sain (figure 1.2 D).

Les patients AF montrent également un risque accru au développement de cancers solides 28. En effet, les patients AF ont un risque augmenté de 50 fois de développer un cancer, en comparaison à un individu de la population générale 27. Les tumeurs solides les plus développées par les patients AF, sont des carcinomes squameux de la tête et du cou (SCC), des cancers du pancréas, des voies aériennes, des voies digestives supérieures et de la zone uro-génitale 27,34,36,37. Par ailleurs, il est important de noter que suite à une transplantation de moelle osseuse, on observe une augmentation du risque de développement de cancers solides pouvant aller jusqu’à 42% à 12 ans 34. Cette augmentation pourrait être due aux traitements d’irradiation et cytotoxiques préalables à la transplantation. De même, il

8 existe une association entre le risque augmenté de développer des cancers et des complications associées à la transplantation, en particulier la réaction du greffon contre l’hôte

34_.

Si les patients AF montrent un risque plus élevé de développer des carcinomes squameux de la tête et du cou que la population générale, les caractéristiques de ces tumeurs sont similaires chez les patients AF et dans la population générale 14. Ces carcinomes se développent principalement dans la cavité orale chez les patients AF 14. Les carcinomes squameux de la tête et du coup (HNSCC) sont un problème de santé mondiale, puisqu’ils sont la 5ième cause de mortalité due au cancer 38. Dans la majorité des cas, les HNSCC se développent suite à l’exposition à des agents cancérigènes comme le tabac, l’alcool 39,40 ou suite à une exposition au papillomavirus humain (HPV) 41. Il est important de noter que chez les patients Fanconi, il n’y a pas de corrélation entre une exposition au HPV et le développement de HNSCC 42. L’autre différence majeure entre la population générale et les patients AF est l’âge de développement de ce cancer, chez la population générale, la moyenne d’âge est compris entre 50 et 60 ans alors que chez les patients AF l’âge est de 20-40 ans 14. De plus, le risque de rechute chez les patients AF est deux fois plus important que dans la population générale 14. Il existe aujourd’hui peu de traitements efficaces pour les HNSCC, il est donc particulièrement important, pour les patients AF, d’avoir une prise en charge particulière, permettant le dépistage précoce de cancers 14_.

1.1.2.4. Diagnostic et prise en charge des patients atteints de l’Anémie de Fanconi Compte tenu de la grande diversité phénotypique, il est difficile de définir un tableau clinique clair permettant de poser un diagnostic d’AF. Le diagnostic définitif de la maladie est donc basé sur un test cytologique montrant des cassures chromosomiques dans les cellules de patients AF suite à un traitement avec un agent pontant l’ADN, tel que la Mitomycine C (MMC) ou le Diépoxybutane (DEB). Lorsque les cellules AF sont traitées avec ces agents pontant de l’ADN, on observe une fréquence anormalement élevée de cassures chromatiniennes aléatoires, en comparaison aux cellules contrôles. Ces bris chromosomiques induisent des fusions chromosomiques et produisent des chromosomes quadrilatéraux qui sont quantifiés par microscopie lors de la métaphase 37,43,44_.

9 Pour que les traitements soient optimaux pour les différents patients AF, il est très important d’étudier le génome du patient suite à son diagnostic d’AF, en effet, il existe de nombreux gènes dont la mutation peut causer l’AF. Chacun de ces gènes est représenté par une groupe de complémentation. Il existe aujourd’hui plusieurs méthodes pour déterminer le gène muté chez le patient AF, tel que la méthode d’hétérocaryons, la méthode d’hybridation in situ ou encore le séquençage de l’ADN. Aujourd’hui, la méthode la plus utilisée est celle du séquençage d’exon 14. De nombreuses études ont été menées afin de trouver une corrélation claire entre les groupes de complémentation et la sévérité des phénotypes des patients Fanconi 45,46. Ces analyses sont très complexes du fait de la rareté de patients dans certains groupes de complémentation, ou encore par les multiples mutations possibles sur le même gène 47,48. Toutefois des études de concordances ont pu être réalisées entre des jumeaux monozygotes et au sein de familles consanguines avec plusieurs individus atteints. Ces études ont montré qu’une même mutation, dans un même gène Fanconi, montre une pénétrance incomplète au regard du phénotype 49–51. Il existe donc peu de corrélation entre le génotype et le phénotype des patients AF, bien que certaines mutations de gènes Fanconi soient associées à un phénotype plus sévère 16.

Suite au diagnostic, les patients AF subissent chaque année un myélogramme dans le but de détecter d’éventuelles anomalies cytogénétiques caractéristiques de syndromes myélodysplasiques. Lorsqu’une anémie aplasique est détectée, on observe la mise en place d’un traitement similaire à celui des anémies aplasiques acquises : des transfusions sanguines associée à une antibiothérapie 14_{. Les patients AF développant une anémie, sont également}

traités avec des thérapies hormonales, par exemple un traitement aux androgènes ou aux facteurs de croissances synthétiques 14. Cependant, ces thérapies hormonales ne préviennent pas le développement des pathologies sanguines clonales, de plus, cette stratégie n’est pas efficace à long terme 14_{. En effet, lorsque l’insuffisance médullaire s’aggrave, ou lors du}

développement d’une leucémie, les médecins préconisent une transplantation allogénique avec du sang de cordon ou des CSH 14. Actuellement, la greffe de moelle osseuse ou de sang de cordon est le seul traitement à long terme pour les anomalies hématologiques de l’AF, il existe pourtant un point de discorde quant au moment optimal pour cette greffe. En effet, des études ont montré une meilleure réponse de la greffe lorsque celle-ci est effectuée avant le début des complications, toutefois elle ne corrige que les défauts hématologiques des

10 patients, et non les autres anomalies. La greffe de cordon et de CSH pose un problème, en lien avec la sensibilité aux patients AF aux agents chimiothérapeutiques conventionnels utilisés dans le cadre du protocole de préparation à la greffe. Il est donc recommandé d’utiliser un traitement immunosuppresseur moins toxique, comme le fludarabine 14. Actuellement, les dernières données indiquent que le moment le plus propice à la greffe pour un patient AF est avant l’âge de 10 ans et avant que le patient ait reçu 20 transfusions sanguines 18.

Le meilleur traitement des cancers solides chez les patients AF tel que HNSCC, est l’ablation de la tumeur par chirurgie, du fait de l’hyper-sensibilité des cellules saines aux agents chimiothérapeutiques et aux irradiations. En effet, un traitement aux irradiations entraine la mort d’environ 50% des patients et pour ceux qui survivent, il y a de très nombreux effets secondaires 14. Dans les cas où les patients AF sont traités par radiothérapie, il est nécessaire d’avoir la mise en place d’un suivi très proche du patient. Au niveau de la chimiothérapie, il est recommandé pour les patients AF ayant subits une résection chirurgicale d’une tumeur HNSCC d’être traités au cis platine (100mg/m2 en intraveineuse tous les 21 jours) en association avec de la radiothérapie post-opératoire 52,53.

Une étude très récente a montré que la technique d’embolisation artérielle par transcathéter pour le traitement d’un hépatocarcinome chez une patient AF montre des résultats prometteurs 54_{. Cette technique, peu invasive, consiste à bloquer l’apport sanguin}

du fragment tumoral du foie par l’obstruction artificiel d’une artère du foie.

1.1.3. Caractéristiques moléculaires de l’Anémie de Fanconi

1.1.3.1. Les gènes Fanconi

Aujourd’hui, 21 gènes ont été identifiés pour causer l’AF, lorsqu’ils sont mutés. Ces gènes, appelés gènes FANC se répartissent sur l’ensemble du génome humain et portent les noms suivant : FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1/BRCA2, FRANCD2, FANCE, FANCF,

FANCG/XRCC9, FANCI, FANCJ/BRIP1/BACH1, FANCL/PHF9, FANCM/HEF, FANCN/PALB2, FANCO/Rad51c, FANCP/SLX4, FANCQ/ERCC4, FANCR/RAD51, FANCS/BRCA1, FANCT/UBE2T, FANCU/XRCC2 et FANCV/REV7/MAD2L2 55–77 (Tableau

11 1). Ces 21 gènes codent pour 21 protéines, connues pour participer à la voie de signalisation de l’Anémie de Fanconi.

Les gènes FANC ne présentent pas d’homologie de séquence, et ne possèdent pas ou peu de motifs similaires qui indiqueraient une fonction commune à l’ensemble de ces gènes. La majorité de ces gènes sont localisés sur des chromosomes autosomes ou homologues, possédant la même taille et forme et renfermant le même contenu génétique. En opposition à ces chromosomes, les chromosomes hétérologue ou sexuel sont différents. Seul le gène

FANCB est localisé sur le chromosome sexuel X.

Les gènes FANCA, FANCC et FANCG sont retrouvés mutés chez plus de 85% des patients Fanconi, avec une répartition de 60 à 70% des patients mutés pour le gène FANCA, 10% pour FANCC et 10% pour FANCG. Une mutation dans un autre gène Fanconi est beaucoup plus rare (moins de 5% par gènes) 78.

12

Tableau 1: Gènes impliqués dans l’AF

Le nom des gènes responsables de la pathologie et indiqués dans la première colonne codent pour des protéines ayant des fonctions moléculaires distinctes, indiquées dans la troisième colonne. La localisation chromosomique (locus) de ces gènes est représentée dans la deuxième colonne. Données provenant de l’IFAR (International Fanconi Anemia Registry) et de 56,77_.

Gène FA Locus Fonction moléculaire des protéines Références FANCA FANCB FANCC FANCD1/BRCA2 FANCD2 FANCE FANCF FANCG FANCI FANCJ FANCL FANCM FANCN/PALB2 FANCO/RAD51C FANCP/SLX4 FANCQ/ERCC4 FANCR/RAD51 FANCS/BRCA1 FANCT/UBE2T FANCU/XRCC2 FANCV/Rev7/MAD2L2 16q24.3 Xp22.2 9q22.32 13q13.1 3p25.3 6p21.31 11p14.3 9p13.3 15q26.1 F17q23.2 2p16.1 16p12.2 14q21.2 17q22 16p13.3 16q13.12 15q15.1 17q21.31 1q32.1 7q36.1 1p36.22 Complexe nucléaire Complexe nucléaire Complexe nucléaire Recombinaison Homologue

Substrat du complexe nucléaire, activité endonucléase

Interaction avec FANCD2 Complexe nucléaire Complexe nucléaire

Substrat du complexe nucléaire

Résolution des formations quadruplexe G Ligase ubiquitine E3

Recombinaison homologue Hélicase/Translocase Recombinaison homologue

Résolution des jonctions de Holliday Réparation ADN par excision de nucléotides Recombinaison homologue

Recombinaison homologue Ligase ubiquitine E2 Recombinaison homologue

Composante du spindle assembly checkpoint (SAC) 79–81 59 60 57,82 68 69 62 72 67,83 74,84 64 65 85 86 61,63,87,88 66 89 55 75 77 56

13 1.1.3.2. Les protéines Fanconi

Tout comme les gènes Fanconi, les protéines Fanconi sont de tailles différentes, ne présentant que peu d’homologie entre elles. L’identification de leur fonction précise est très complexe, d’autant plus que certaines protéines Fanconi présentent des motifs non répertoriés. Toutefois certains domaines sont retrouvés conservés sur plusieurs protéines, ce qui a permis la mise en place d’hypothèses quant à leurs rôles fonctionnels (Figure 1.3). Notamment, la littérature montre que les protéines Fanconi sont impliquées dans la réparation et la réplication de l’ADN 90, le développement hématopoïétique 91, la régulation du cycle cellulaire 92–94_{, la détoxification des radicaux oxygénés} 95,96_{, l’apoptose} 97_{, l’immunité} 96_{, la}

mitophagie 96 et la régulation transcriptionnelle 98,99. Cependant, les rôles précis des protéines Fanconi dans certains de ces mécanismes cellulaires restent peu connus à ce jour.

La majorité des protéines Fanconi agissent ensemble au niveau nucléaire, or, la relocalisation de certaines protéines Fanconi, majoritairement cytoplasmiques, au noyau est donc une étape essentielle au fonctionnement de la voie Fanconi 100,101

Les protéines Fanconi peuvent être regroupées en trois complexes : le complexe I ou FA core complex ou complexe nucléaire, le complexe II ou complexe D2/I et le complexe III. Le complexe I est composé des protéines FANCA, FANCG, FANCB, FANCL, FAAP100, FANCE, FANCC, FANCF, FANCM et FAAP24. Le complexe II ou complexe D2/I est composé des protéine FANCD2 et FANCI. Enfin, le complexe III est composé des protéines FANCD1/BRCA2, FANCO/Rad51c, FANCR/Rad51, FANCS/BRCA1, FANCN/PALB2, FANCJ/BRIP1, FANCP/SLX4, FANCQ/ERCC4, FANCT/UBE2T, FANCU/XRCC2 et FANCV/REV7.

14 Figure 1.3 : Représentation des protéines FANC

Les protéines FANC sont connues pour former trois complexes : le complexe I composé de FANCA, FANCG, FANCB, FANCL, FANCE, FANCF, FANCM et des protéines FAAP100 et FAAP24, ce complexe a un rôle dans la mono-ubiquitination du complexe II, composé de FANCD2 et de FANCI, suite à son activation, le complexe II va permettre le recrutement des protéines du complexe III, composé de FANCD1/BRCA2, FANCN/PAB2, FANCJ, FANCP1SLX4, FANCO/RAD51C, FANCQ/ERCC4, FANCR/Rad51, AFNCS/BRCA1, FANCT/UBE2T, FANCU/XRCC2 et FANCV/REV7/MAD2L2. Les protéines FANC possèdent des motifs d’interaction protéine-protéine, comme les motifs TPR (several tetradicopeptides repeat), le motif BRC, les répétitions WD40 (Tryptophan-Aspartic ace dipeptide), ARM (Armadillo), des domaines BTB/POZ (BR-C thk and Bad/Pox virus and Znc finger) et PHD/ring finger (plant homeo domain), mais également un domaine d’attachement à l’ADN OB-fold (oligonucleotide/oligosaccharide-binding fold) et des motifs Coiled-coil qui sont impliqués dans la régulation transcriptionnelle. De plus, les protéines FANCM et FANCJ possèdent un domaine hélicase et FANCO et FANCR possèdent une activité recombinase. Tiré et modifié de 102.

15 1.1.3.3. La voie de signalisation Fanconi

La plupart des protéines Fanconi s’accumulent au noyau, pour former les 3 complexes décrits précédemment, afin de former la voie Fanconi. Lorsqu’elle est activée, suite à un dommage de l’ADN, ou à une fourche de réplication bloquée, cette voie Fanconi permet la réparation par recombinaison homologue. En effet, lors d’un dommage à l’ADN, il va y avoir formation du complexe I, qui va induire la mono-ubiquitination des protéines du complexe II et enfin du recrutement à la chromatine de protéines de la réparation de de l’ADN composant le complexe III (figure 1.4).

Chaque protéine Fanconi a une fonction dans cette voie de signalisation complexe, mais il est important de noter que plusieurs protéines Fanconi ont également des rôles indépendamment de cette voie. Nous nous sommes particulièrement intéressés à la protéine FANCC puisque celle-ci est connues pour avoir un rôle de régulateur transcriptionnel et que cette thèse a pour objectif l’étude des dérégulations d’une voie de signalisation qui aboutissent à la modulation de l’expression de gènes. De plus, FANCC est la seule protéine du complexe I à avoir une localisation principalement cytoplasmique. Cela suggère que cette protéine a un ou plusieurs rôles dans ce compartiment cellulaire.

16 Figure 1.4 : Voie canonique Fanconi

1-Après un dommage à l’ADN, les hétérodimères FANCA /FANCG et FANCC/FANCE sont stabilisées par leur interaction avec la protéine FANCF. 2-Le sous-complexe FANCA/FANCG/FANCC/FANCE/FANCF s’associe aux protéines FANCB et FANCL. 3-Le complexe I s’associe à la chromatine après sa liaison à FANCM. 4-3-Le complexe I mono-ubiquitine le complexe II via l’enzyme de conjugaison UBE2T et l’mono-ubiquitine ligase FANCL. 5-Les protéines du complexe II ubiquitinilées lient alors les protéines du complexe III, à la chromatine. 6-Enfin le complexe II est reconnu par USP1, permettant la dé-ubiquitination des protéines le composant et le relargage de ces protéines, le rendant à nouveau disponible pour une activation par le complexe I.

17

1.1.4. La protéine Fanconi-C

FANCC est une protéine du complexe I de la voie Fanconi, mais contrairement aux autres protéines de ce complexe, elle n’a pas de signal de localisation nucléaire. Il a pourtant été montré que sa localisation au noyau est nécessaire pour son activité, puisque le remplacement de la proline 554 en leucine ne permet plus ni sa migration au noyau, ni son activité 100,103_{. Aujourd’hui, les mécanismes permettant la migration de FANCC au noyau ne}

sont toujours pas élucidés. Cependant, même si les mécanismes précis ne sont pas connus la migration de FANCC au noyau est dépendante de son association avec la protéine FANCE

104_.

À ce jour, 10 mutations ont été identifiées pour causer l’AF sur le gène FANCC 105–

108_{. Le gène FANCC est organisé en 14 exons et 13 introns. Les mutations causant l’AF sont}

retrouvées dans les exons 1109,110, 5111, 6 112, 13 108 et 1460,113,114 et dans l’intron 4115 (figure 1.5). La protéine codée par ce gène est composée de 558 acides aminés. Les mutations sont nommées d’après la modification de la séquence protéique.

18 Figure 1.5 : Spectre des mutations de FANCC retrouvé chez des patients Fanconi.

Les exons 1 et 14 regroupent plusieurs mutations. Les mutations R175X et R185X conduisent au saut de l’exon 6 dans certains ou tous les transcrits. La mutation IVS4+4A>T conduit soit au saut de l’exon 4, soit à la production d’un transcrit de 40pb plus petit. Tiré de 116

19 La protéine FANCC possède de nombreux rôles tant au niveau de la voie Fanconi, mais également dans d’autres voies indépendantes. En plus de son rôle dans la voie de réparation à l’ADN, FANCC est connu pour jouer un rôle dans la réponse à l’interféron γ (INFγ) 120–122_{, dans la détoxification des radicaux oxygénés et l’apoptose} 123,124_{. FANCC a}

aussi été montré pour être impliqué dans le cycle cellulaire 94,125_{. Plusieurs études démontrent} également le rôle de FANCC dans la régulation transcriptionnelle, notamment par son interaction avec les facteurs de transcription HES1 (hairy and enhancer of the Split 1) , CtBP1 (C-terminal Binding Protein1) et β-caténine 99,100,127_{. Or, ces deux derniers font partis d’une}

voie de signalisation complexe qu’est la voie Wnt/β-caténine.

1.2 La voie de signalisation Wnt/

β-caténine

1.2.1. Présentation générale de la voie Wnt/

β-caténine

La voie de Wnt tient son nom de la protéine sécrétée du même nom qui lorsqu’elle se lie à ses corécepteurs active une voie de signalisation aboutissant à la régulation transcriptionnelle de nombreux gènes. Wnt provient de la contraction de wg (Wingless) et de int (Integration). En premier lieu la voie de Wnt a été découverte chez la drosophile suite l’identification d’une mutation dans le gène wg-1 qui entraine un défaut développemental chez l’animal 128_{. Le gène int-1 a lui été identifié chez la souris comme étant activé lors de}

l’insertion de virus oncogène 129_.

Il existe plusieurs voies de signalisation Wnt, la voie de signalisation Wnt dépendante de la β-caténine aussi appelée voie canonique, mais également la voie de Wnt non canonique et calcium dépendante (Wnt/Ca2+). Ces deux voies sont connues pour être impliquées dans la régulation transcriptionnelle de groupes de gènes cibles 130. Une autre voie de Wnt non canonique appelé voie PCP (planar cell polarity) a été également identifiée et est connue pour être impliquée dans la régulation de protéines du cytosquelette comme l’actine ou les microtubules 130. Pour une meilleure compréhension, nous ne présenterons dans cette thèse que la voie de Wnt canonique, centre de notre sujet de recherche.

20 La voie de Wnt/β-caténine est une cascade de signalisation complexe qui fait intervenir plus de 19 protéines différentes dont 10 récepteurs, 2 corécepteurs de ligands Wnt et plusieurs protéines intermédiaires.

En absence d’activation de la voie par la liaison du ligand Wnt sur ses corécepteurs, la β-caténine libre est constitutivement phosphorylée par deux kinases, la Casein Kinase 1 (CK1), sur le résidu thréonine 45, et la Glycogène synthase kinase 3 β (GSK3β) sur les résidus sérines 33, 37 et thréonine 41. Ces deux protéines font parties du complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine avec Axin-1 et APC. Lors de l’inactivation de la voie de Wnt, la protéine β-caténine phosphorylée est reconnue par une ubiquitine ligase pour être poly-ubiquitinilée puis envoyé vers le protéasome pour dégradation. Les niveaux cytoplasmiques de la β-caténine sont ainsi maintenus bas et les gènes cibles de la voie de Wnt/β-caténine sont réprimés par les facteurs de transcription Transcription Factor/Lymphoïde enhancer-binding Factor (TCF/LEF) , les corépresseurs Transducin-like enhancer of split (TLE), ainsi que les protéines C-terminal Binding Proteins (CtBPs) et les Histones Déacétylases (HDACs) participent également à la répression transcriptionnelle des gènes 131–133. Par ailleurs, si une partie de la β-caténine libre migre du cytoplasme au noyau, celle-ci sera alors séquestrée par la petite protéine Inhibitor of β-catenin and TCF (ICAT) 134_.

Il est également possible d’inhiber la voie de Wnt/β-caténine et ce malgré la présence du ligand Wnt. En effet, au niveau extracellulaire, le complexe de récepteurs Frizzled et LRP5/6 peut être inhibé par la liaison de la molécule inhibitrice Dickkopf-1 (DKK1) au corécepteur LRP5/6 135. Une autre voie d’inhibition de la voie de Wnt/β-caténine se fait par la séquestration des ligands par les protéines sFRP (secreted Frizzled Related Proteins) et WIF (figure 1.6 a) 136–138.

La voie de Wnt/β-caténine est activée lorsque le ligand Wnt se fixe sur ses corécepteurs LRP5/6 et Frizzled, il y a alors activation de la cascade signalétique 139,140. Cette activation va engendrer une modification de la conformation du récepteur Frizzled, une relocalisation de son partenaire intracellulaire Dishvelled, et une phosphorylation du corécepteur LRP par les kinase GSK3β et CK1, relocalisant ainsi le complexe de

21 dégradation/neutralisation de la β-caténine à la membrane plasmique, et conduisant à une perte de la stabilité de ce complexe 141,142. La β-caténine libre stabilisée au cytoplasme 143 va migrer au noyau. Une fois dans ce compartiment cellulaire, elle va pouvoir déloger le complexe protéique répresseur de la transcription, constitué de TCF/LEF, TLE et CtBPs. Une fois ce complexe répresseur délogé, la β-caténine s’associe avec des activateurs de la transcription comme B-Cell lymphoma protein 9 (BCL9) et p300 afin d’activer la transcription des gènes cibles de la voie Wnt/β-caténine 144 _{(figure 1.6 b)}

La voie de Wnt/β-caténine est une voie de signalisation très complexe faisant intervenir de nombreuses protéines. Une étude réalisée dans notre laboratoire a montré que FANCC interagit avec la β-caténine dans un contexte de voie Fanconi fonctionnelle et que cette interaction est nécessaire à la bonne relocalisation de la β-caténine au noyau. Dans la suite de cette thèse, nous nous sommes concentrés sur l’étude de la β-caténine et plus précisément de sa régulation par le complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine dans un contexte d’Anémie de Fanconi.

22 Figure 1.6 : la voie de signalisation Wnt/β-caténine.

(a) En absence d’activation de la voie par la liaison du ligand Wnt sur ses corécepteurs, la β-caténine libre est constitutivement phosphorylée par les kinases CK1 et GSK3β. La protéine β-caténine phosphorylée est ensuite envoyée vers le protéasome pour dégradation. Les gènes cibles de la vie de Wnt/β-caténine sont réprimés par les répresseurs TCF/LEF, les corépresseurs TLE, les protéines CtBPs et HDACs. Au niveau extracellulaire, le complexe de récepteurs Frizzled et LRP5/6 peut être inhibé par la liaison de la molécule inhibitrice DKK1. L’inhibition de la voie de Wnt/β-caténine peut aussi se faire par la séquestration des ligands par les protéines sFRP et WIF. (b) Lorsque le ligand Wnt se fixe sur ses corécepteurs LRP5/6 et Frizzled, il y a activation de la voie de signalisation, ce qui induit une modification de la conformation du récepteur Frizzled puis une relocalisation de son partenaire intracellulaire Dishvelled. Le corécepteur LRP est alors phosphorylé par les kinase GSK3β et CK1, ce qui permet l’interaction avec le complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine à la membrane plasmique. La β-β-caténine libre s’accumule au cytoplasme et migre au noyau afin de former un complexe activateur de transcription avec BCL9 et p300 et d’activer la transcription de ses gènes cibles. Tirée et modifiée de 145.

23

1.2.2. La protéine

β-caténine : structure et fonction

La β-caténine est une protéine avec une structure hautement conservée de la drosophile aux mammifères 145_{, suggérant un rôle extrêmement important de cette protéine}

148_{. La} β-caténine est composée de 12 répétitions de domaines armadillo, des domaines

souvent retrouvés dans des protéines impliquées dans la transduction de signaux, comme, par exemple, la plakoglobine 149, l’importine α 150 ou encore la protéine APC 151 et de nombreuses autres protéines.

La structure tridimensionnelle de la β-caténine montre que les structures en hélice des domaines armadillo forment une structure en superhélice constituée de 3 hélices α par unité, sauf pour la répétition 7 (figure 1.7). Le sillon chargé positivement de la superhélice sert à l’interaction de la β-caténine avec ses partenaires protéiques148_{. En particulier, c’est au}

niveau des répétitions armadillo que se lient les cadhérines, pour la formation des jonctions, mais également la protéine APC, qui prend en charge la β-caténine en vue de sa dégradation, mais aussi les facteurs de transcriptions de la famille des TCF 148. Par ailleurs, le domaine formé par l’hélice C en C-terminal joue un rôle majeur dans l’interaction de la β-caténine avec certains de ses partenaires, comme la protéines ICAT, qui permet la séquestration de la β-caténine nucléaire lorsque la voie de Wnt/β-caténine n’est pas activée 146_{. Une autre région}

particulièrement importante de cette protéine est la région N-terminale, qui est le siège des phosphorylations séquentielles de la β-caténine par les kinases CK1 et GSK3β. Cette région est donc celle qui permet le contrôle de la stabilité de la β-caténine 148_.

24 Figure 1.7: Modélisation de la structure de la β-caténine

Modélisation de la structure cristallographique de la β-caténine. Chacun des domaine armadillo, en dehors du domaine 7, est composé de 3 hélices : hélice 1 représenté par un cylindre bleu, hélice 2 représenté par un cylindre vert et hélice 3 représenté par un cylindre jaune. Le domaine C-terminal est composé d’une hélice α appelée hélice C (représenté par un cylindre rouge). Tirée et adaptée de 146.

25 Si dans un premier temps, la β-caténine a été décrite comme faisant partie du complexe d’adhésion 152_{, il a rapidement été montré que cette protéine a également un rôle}

crucial au niveau de la signalisation cellulaire, du fait de son fort taux d’identité avec la séquence du gène de la drosophile Armadillo, alors identifié comme faisant partie des gènes de polarité wingless 152. Les protéines codées par les gènes Armadillo et β-caténine présentent les mêmes caractéristiques avec un rôle dans l’adhésion cellulaire et sont toutes deux des composantes structurelles des jonctions adhérentes. Mais elles sont également impliquées dans une voie de signalisation catalytique qui est impliquée dans la différenciation, la division, la migration cellulaire et la survie cellulaire 137. La stabilité de la β-caténine est régulée par le complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine.

1.2.3. Le complexe de dégradation/neutralisation de la

β-caténine

1.2.3.1. Composition et fonctionnement du complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine

Le complexe de dégradation de la β-caténine est composé des protéines d’échafaudage Axin-1 et APC ainsi que des kinases CK1 et GSK3β. En condition de non-activation de la voie de Wnt/β-caténine, le complexe protéique de dégradation/neutralisation de la β-caténine prend en charge la β-caténine libre, pour être phosphorylée par les kinases CK1 et GSK3β. La kinase GSK3β phosphoryle ensuite APC, ce qui induit une modification de sa conformation, permettant à la β-caténine phosphorylée d’être prise en charge par une ubiquitine ligase E3. Enfin la déphosphorylation d’APC permet un retour à la conformation initiale du complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine, permettant à celui-ci de prendre en charge une nouvelle molécule de β-caténine libre (figure 1.8) 153.

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Figure 1.8: Neutralisation de la β-caténine par le complexe de

dégradation/neutralisation de la β-caténine.

(1) Assemblage du complexe de neutralisation/dégradation de la β-caténine composé de Axin-1, APC, GSK3β et CK1 avec la β-caténine. (2) les kinases GSK3β et CK1 phosphorylent la β-caténine. (3) Phosphorylation d’APC au niveau de la région de 20 acides aminés 2 et de la région conservée B. (4) La phosphorylation d’APC induit un changement de conformation d’APC, libérant l’interaction entre Axin-1 et les domaines armadillo d’APC. (5) le changement de conformation d’APC permet le transfert de la β-caténine vers l’ubiquitine ligase E3. (6) la déphosphorylation d’APC permet un retour à la conformation initiale du complexe et la prise en change d’une nouvelle molécule de β-caténine à phosphoryler. Tirée et adaptée de 153.

27 1.2.3.2. Les protéines du complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine

C’est en 1987 que 2 équipes de recherche identifient la région chromosomique responsable d’une pathologie familial d’adenomatous polyposis coli (APC) 154,155. Cette pathologie se caractérise par la formation de polypes au niveau du colon ainsi qu’une prédisposition importante au développement de cancers du côlon pour les patients atteints de cette maladie. Il existe alors 3 gènes candidats se trouvant dans cette région génique. En 1991, Groden at al. identifient le gène responsable de la pathologie APC, qui sera nommé d’après le nom de la maladie 156. Ce n’est pourtant qu’en 1997 que le rôle de la protéine APC dans la voie de Wnt/β-caténine et surtout son rôle sur l’inhibition de la stabilisation de la β -caténine a été découvert par Korinek at al. 157 et Morin at al. 158. Dans un premier temps, il est considéré que APC joue un rôle de protéine d’échafaudage sur le complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine, mais depuis d’autres travaux ont montré que ce rôle est celui de la protéine Axin-1 159,160_{. Il est depuis montré qu’APC a deux autres rôles.}

Le premier rôle d’APC est de permettre à l’Axin-1 de s’assembler de manière efficace afin de former une plateforme de liaison pour les protéines du complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine. Le second rôle d’APC est de permettre le transfert de la β-caténine nouvellement phosphorylée vers les enzymes ubiquitine ligases pour permettre une dégradation efficace de cette protéine 153_{. En effet, lorsque la protéine}

APC est phosphorylée par la kinase GSK3β et potentiellement par la kinase CK1, il y a un changement de conformation de la protéine, qui va rendre la β-caténine phosphorylée disponible pour son transfert vers l’ubiquitine ligase pour être poly-ubiquitinilée, formant ainsi un signal d’adressage au protéasome pour que cette protéine soit dégradée (figure 1.8).

La protéine Axin-1 est la protéine qui permet l’assemblage du complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine. En effet, il est montré que celle-ci possède des domaines de liaison pour les protéines APC, β-caténine, CK1, GSK3β et pour la phosphatase Protein Phosphatase 2A (PP2A), ainsi que des domaines permettant sa polymérisation. En servant de protéine d’assemblage du complexe, Axin-1 permet d’augmenter la concentration locale des protéines permettant la phosphorylation et donc l’inactivation de la β-caténine 161– 164_{. La protéine Axin-1 fait également partie d’un complexe constitué des protéines Tumor}

28 impliqué dans la régulation de la voie du Tumor growth factor β (TGFβ). Tout comme la voie de Wnt/β-caténine, cette voie de signalisation est impliquée dans le développement, la croissance cellulaire et l’apoptose 165–167. La protéine Axin-1 fait partie de la famille des protéines Axines, qui compte un autre membre, Axin-2. La protéine Axin-2 est codée par un gène régulé par la voie de Wnt/β-caténine. Il est supposé que le rôle d’Axin-2 est redondant à celui d’Axin-1 dans la dégradation de la β-caténine 168_{. La stabilité des protéines Axines}

est régulée par les Tankyrases, des protéines appartenant à la famille des PARP, des enzymes de poly-ADP-ribosylation. Ces molécules déstabilisent les protéines Axines, ce qui conduit à une activation de la voie Wnt/β-caténine 169_{. En effet, les Tankyrases 1 et 2 montrent une}

forte affinité pour les protéines Axine 1 et 2 et une inhibition de cette interaction par mutation des sites de liaison de ces protéines conduit à une stabilisation des protéines Axines 170.

CK1 est une sérine/thréonine kinase extrêmement conservée dans les organismes eucaryotes de la levure à l’homme 339. Il existe 7 isoformes de la protéine CK1 chez l’homme α, β, γ1, γ2, γ3, ε et δ 172_{. Les rôles de ces protéines semblent très divers, elles joueraient}

notamment un rôle dans le trafic des récepteurs membranaires, dans la maintenance du cytosquelette, dans la division cellulaire, dans la réponse et la réparation des dommages de l’ADN et dans la relocalisation de protéines au noyau 173,174_{. Les CK1 sont également très}

impliquées dans le développement du fait de leur action dans les voies de signalisation Wnt/β-caténine et SonicHedgog 175,176. Au niveau de la voie de Wnt/β-caténine, c’est

l’isoforme α qui est impliquée dans la phosphorylation de la β-caténine 176_{. En effet, lorsque}

la voie Wnt/β-caténine est inactive, CK1α agit au niveau du complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine en phosphorylant celle-ci sur le résidu thréonine 45 176. La première phosphorylation de la β-caténine sur son résidu thréonine 45 par CK1α est primordiale pour permettre ensuite la phosphorylation de la β-caténine par la kinase GSK3β.

La GSK3 est une sérine/thréonine kinase, identifiée en 1980 pour son rôle dans la phosphorylation inactivatrice de la glycogène synthase 177. Il existe 2 isoformes de cette protéine la GSK3α et la GSK3β. L’isoforme GSK3β est impliquée dans le métabolisme énergétique, le développement des cellules neuronales et dans l’embryogénèse, du fait de son