Étude comparative de l'expression de biomarqueurs inflammatoires dans 7 lignées cellulaires dérivées de glioblastomes : impact des molécules phytochimiques

ÉTUDE COMPARATIVE DE L'EXPRESSION DE BIOMARQUEURS

INFLAMMATOIRES DANS 7 LIGNÉES CELLULAIRES DÉRIVÉES DE

GLIOBLASTOMES:

IMPACT DES MOLÉCULES PHYTOCHIMIQUES

MÉMOIRE

PRÉSENTÉ

COMME EXIGENCE PARTIELLE

DE LA MAÎTRISE EN BIOCHIMIE

PAR

CLÉMENCE BENSIALI HADAUD

Avertissement

La diffusion de ce mémoire se fait dans le respect des droits de son auteur, qui a signé le formulaire Autorisation de reproduire et de diffuser un travail de recherche de cycles supérieurs (SDU-522 - Rév.0?-2011 ). Cette autorisation stipule que «conformément à l'article 11 du Règlement no 8 des études de cycles supérieurs, [l'auteur] concède

à

l'Université du Québec

à

Montréal une licence non exclusive d'utilisation et de publication de la totalité ou d'une partie importante de [son] travail de recherche pour des fins pédagogiques et non commerciales. Plus précisément, [l'auteur] autorise l'Université du Québec à Montréal à reproduire, diffuser, prêter, distribuer ou vendre des copies de [son] travail de recherche

à

des fins non commerciales sur quelque support que ce soit, y compris l'Internet. Cette licence et cette autorisation n'entraînent pas une renonciation de [la] part [de l'auteur]

à

[ses] droits moraux ni

à

[ses] droits de propriété intellectuelle. Sauf entente contraire, [l'auteur] conserve la liberté de diffuser et de commercialiser ou non ce travail dont [il] possède un exemplaire.»

Je tiens

à

remercier mon directeur de recherche, le Professeur Borhane Annabi, pour avoir cru en mes capacités et qui m'a ouvert les portes de son laboratoire, pour la confiance qu'il m'a accordée et l'accueil chaleureux au sein de son équipe. Je remercie également le Dr Sylvie Lamy pour son aide précieuse et ses conseils, pour m'avoir guidée et épaulée tout au long de ma maîtrise. Je leur adresse toute ma reconnaissance pour leur disponibilité.

Mes chaleureux remerciements

à

Annie Levert, Alain Zgheib et Julie Poirier, pour leur support technique et moral. Je tiens également à témoigner toute mon amitié et ma reconnaissance aux membres du Laboratoire d'Oncologie Moléculaire, notamment Amélie Vézina qui m'a formée, conseillée et soutenue tout au long de mon parcours. Merci également

à

Evelyne Muhire pour son soutien, sa présence, son amitié et pour tous les fou rire et confidences que nous avons partagé depuis notre rencontre au laboratoire. Je tiens à remercier mes amis et collègues Samuel Sheehy, Samuel Burke-Nanni, Pascale Gagné, Djahida Djerir, Cynthia Charfi, Mustapha ldir, Amira Ouanouki, Hana Benenemissi, Jonathan Pratt, Nicolas Heddebaut, Bayader Annabi, pour les conseils et les bons moments passés ensemble, ce fut très agréable de travailler avec vous.

Je ne saurais manquer de remercier tout particulièrement les membres de ma famille pour leur soutien et leur amour. Christelle (maman) et Richard, vous avez toujours été présents pour moi. C'est vous qui m'avez permis de devenir ce que je suis. Merci pour votre écoute et vos conseils, vous m'avez donné la force de mener à terme ce projet d'étude. Merci

à mes petites sœurs Célia, Mélissa et Joëlle qui n'ont

iv

cessé et ne cessent encore de m'encourager dans tout ce que j'entreprend merci pour tout ce que vous m'apportez.

Je voudrais aussi remercier mes amis Maude Desjardins et Jaouad Chabli d'avoir été là pour moi dans les moments de doutes et qui ont toujours trouvé les mots justes pour me donner du courage et à ma deuxième famille de cœur rencontré

à

mon arrivée

à

I'UQAM Clara Lafortune, Audrey Glory, Florian Pierre et Carole-Anne De Carufel pour leur soutien et conseils tout au long de ma maitrise.

Enfin, j'adresse des remerciements

à

la Fondation UQAM et

à

la Chaire en Prévention et Traitement du Cancer pour le support financier.

REMERCIEMENTS .•..••...•..••.•...•...•..•....•..•.•...•....•...••...••... iii

TABLE DES MATIÈRES ...

v

LISTE DES FIGURES •.••••.•...•...•.••••••••••••••••..•••.••.•.••••...•...•.... ix

LISTE DES TABLEAUX •.••....•..••.••...•..•..•••••••.•...•...•....•.... xi

LISTE DES ABRÉVIATIONS ... xii

RÉSUMÉ .••..•..•...

xvi

CHAPITRE 1

INTRODUCTION ...•...•...•...•...•...•..•••... 1

1.1 le cancer ... l

1.1.1 Généralités ... ! 1.1.2 Statistiques ... 3

1.2 Le cancer du cerveau

...

4

1.2.1 Épidémiologie des tumeurs cérébrales ... 4

1.2.2 Classification des gliomes ... 5

1.2.3 Les glioblastomes ... 6

1.3 Inflammation et cancer ... 8

1.3.1 Généralités ... 8

1.3.2 Biomarqueurs de l'inflammation liés à la cancérogenèse ... 11

1.4 Les voies de signalisation intracellulaire impliquées dans le cancer

16

1.4.1 La voie de signalisation des MAP kinases ... 16

1.4.3 La voie de signalisation JNK ... 18

1.4.4 La voie de signalisation p38 ... 20

1.5 Quelques biomarqueurs de l'angiogenèse, de l'invasion, de la

migration et des métastases ... 20

1.5.1 VEGF ... 20

1.5.2 Matrice extracellulaire et métalloprotéases ... 21

1.5.3 Rôle de la périostine dans la cancérogénèse ... 23

1.6 La saine alimentation, une forme de prévention contre le cancer

...

~~ 1.6.1 Chimioprévention par des molécules issues de la diète ... 24

1.6.2 Les flavonoïdes, la sous-classe la plus abondante des polyphénols ... 26

1.6.3 l'épigallocatéchine-3-gallate (EGCG), un polyphénol du thé vert ... 30

1.6.4 L'hydroxytyrosol un composé bénéfique pour la santé dans l'huile d'olive ... 32

1.6.5 La quercétine ... 34

1.6.6 la delphinidine ... 36

1.6.7 Le curcuma et curcumine ... 37

1. 7 Prévenir le cancer ... 39

CHAPITRE Il OBJECTIFS DE RECHERCHE ET PROBLÉMATIQUE ... 43

CHAPITRE Ill MATERIELS ET METHODES ... 45

3.1 Matériels ... 45

3.2 Les 7 lignées cellulaires dérivées de glioblastomes ... 46

3.3 Méthodes ... 47

3.3.1 Culture cellulaire ... 47

3.3.2 Extraction de I'ARN total ... 48

3.3.4 lyse cellulaire et récolte du milieu de culture conditionné ... 50

3.3.5 Dosage des protéines ... 51

3.3.6 Électrophorèse sur gel de polyacrylamide {SOS-PAGE) ... 51

3.3.7 lmmunodétection des protéines d'intérêt ... 52

3.3.8 Migration cellulaire en temps réel ... 52

3.3.9 Zymographie ... , ... 53

CHAPITRE IV

RÉSULTATS ... 54

4.1

Comparaison des boimarqueurs d'intérêt des 7 lignées de

glioblastome stimulées par le TNF-a ... 54

4.1.1 Comparaison génique ... 54

4.1.2 Comparaison de l'expression des métalloprotéases ... 56

4.1.3 Etude comparative du pouvoir invasif de 7 lignées de glioblastomes ... 58

4.1.4 Expression des protéines d'intérêt dans une sélection de 4 lignées dérivées de glioblastomes ... 60

4.2 Impact des phytochimiques sur l'inflammation ... 62

4.2.1 U-118 ... 62 4.2.2 U-138 ... 69 4.2.3 U-87 ... 77 4.2.4 HS-683 ... 83

CHAPITRE V

DISCUSSION ... 89

5.1 Similarités et différences d'expression observées dans les 7

lignées de glioblastomes face

à

l'inflammation ... 91

5.2 Potentiel anti-inflammatoire des cinq molécules phytochimiques

dans la progression des glioblastomes ... 94

CHAPITRE VI

CONCLUSION ET PERSPECTIVES ... 98

ANNEXES ... 101

BIBLIOGRAPHIE ... 113

Figure 1.1. Étapes de la cancérogenèse ... 3

Figure 1.2. IRM d'un Glioblastome temporal gauche ... 7

Figure 1.3. Inflammation protumorale ... 11

Figure 1.4. Implication de la liaison du TNF-a

à

son récepteur TNF-R1 dans toutes les phases de la cancérogénèse ... 13

Figure 1.5. Les voies de signalisation des MAP kinases ... 17

Figure 1.6. Structure de base des flavonoïdes ... 27

Figure 1.7. Schéma général de la voie de biosynthèse des flavonoïdes ... 29

Figure 1.8. Structure chimique de I'EGCG ... 31

Figure 1.9. Structure chimique de l'hydroxytyrosol ... 33

Figure 1.10. Structure chimique de la quércétine ... 35

Figure 1.11. Structure chimique de la delphinidine ... 37

Figure 1.12. Structure moléculaire de la curcumine ... 38

Figure 1.13. Une taille unique ne convient pas

à

tous ... 41

Figure 4.1. Expression des métalloprotéases MMP-9 et MMP-2 en en présence de TNF-a dans les 7 lignées cancéreuses de glioblastomes (n=1) ... 57

Figure 4.2. Étude de la capacité migratoire des différentes lignées cancéreuses en présence ou non de TNF-a ... 59

Figure 4.3. Effet de la stimulation des 7 lignées cancéreuses au TNF-a durant 5 min et 24h sur l'expression des différentes protéines d'intérêt (n=1) ... 61

Figure 4.4. Impact des molécules phytochimiques sur la migration des cellules U -118 ... 65

Figure 4.5. Action des molécules phytochimiques sur l'expression des MMPs des U -118 stimulées au TNF-a (n=1) ... 66

Figure 4.6. Impact des molécules phytochimiques sur l'expression des protéines de signalisations de la lignée U-118 stimulée au TNF-a pendant 5 min et 24h (n=1) .... 68

Figure 4.7. Impact des molécules phytochimiques sur la migration des cellules U -138 ... 72

Figure 4.8. Action des molécules phytochimiques sur l'expression des MMPs des U-138 stimulées au TNF-a (n=l) ... 73 Figure 4.9. Impact des molécules phytochimiques sur l'expression des protéines de signalisations de la lignée U-138 stimulée au TNF-a pendant 5 min et 24h (n=l) .... 76 Figure 4.10. Impact des molécules phytochimiques sur la migration des cellules U -87 ... 79 Figure 4.11. Action des molécules phytochimiques sur l'expression des MMPs des U -87 stimulées au TNF-a (n=l) ... 80 Figure 4.12. Impact des molécules phytochimiques sur l'expression des protéines de signalisations de la lignée U-87 stimulée au TNF-a pendant 5 min et 24h (n=l) ... 82 Figure 4.13. Impact des molécules phytochimiques sur la migration des cellules Hs -683 ... 85 Figure 4.14. Action des molécules phytochimiques sur l'expression des MMPs des Hs-683 stimulées au TNF-a (n=l) ... 86 Figure 4.15. Impact des molécules phytochimiques sur l'expression des protéines de signalisations de la lignée Hs-683 stimulée au TNF-a pendant 5 min et 24h (n=l) ... 88

Tableau 3.1. Informations sur les lignées cellulaires utilisées dans notre travail (ATCC = American Type Culture Collection) ... 47 Tableau 4.1. Expression génique des biomarqueurs d'intérêt chez les 7 lignées cancéreuses. Les résultats expriment s'il y a eu une hausse, une baisse ou aucune différence de l'expression génique par rapport au contrôle (sans TNF-a) ... 55 Tableau 4.2. Effet des molécules phytochimiques sur l'expression des biomarqueurs d'intérêt de la lignée cellulaire U-118 stimulée au TNF-a ... 63 Tableau 4.3. Effet des molécules phytochimiques sur l'expression des biomarqueurs d'intérêt de la lignée cellulaire U-138 stimulée au TNF-a ... 70 Tableau 4.4. Effet des molécules phytochimiques sur l'expression des biomarqueurs d'intérêt de la lignée cellulaire U-87 stimulée au TNF-a ... 77 Tableau 4.5. Effet des molécules phytochimiques sur l'expression des biomarqueurs d'intérêt de la lignée cellulaire Hs-683 stimulée au TNF-a ... 83

-67LR ADN A kt AP-l Apaf-1 ARE ARN BHE COX-2 CSF Cytc DAG DMSO Dp EC (-) ECG (-) EGC (-) EGCG (-) EGF

Récepteur

à

la laminine de 67 kDa Acide désoxyribonucléique Protéine kinase B

Protéine activatrice

Facteur d'activation de peptidase apoptotique Élément de réponse antioxydant

Acide ribonucléique

Barrière hémato encéphalique Cyclooxygénase-2

Facteur de stimulation des colonies,« colony-stimulating factor » Cytochrome c Diacylglycérol Diméthylsu lfoxide Delphinidine -épicatéchine -épicatéchine-3-gallate -épigallocatéchine -épigallocatéchine-3-gallate

EGFR ERK ERN ERO FGF GBM HT IKB IKK IL-l IL-6 iN OS IRM JNK kDa MAPK MEC MMP MMP-2 MMP-9 MP MT-MMP

Récepteur du facteur de croissance épidermique

Kinases de la régulation des signaux extracellulaires

Espèces réactives nytrosylées Espèces réactives oxygénées

Facteur de croissance des fibroblastes

Glioblastome multiforme Hydroxytyrosol Inhibiteur de NF-KB IKB kinase Interleukine 1 Interleukine 6

Oxyde nitrique synthétase inductible

Imagerie par résonance magnétique

Kinase c-Jun N-terminal

Kilos Dalton

Protéine kinase activée par signal mitogène

Matrice extracellulaire

Métalloprotéase matricielle

Collagenase type IV /gelatinase A

Collagenase type IV /gelatinase B

Médecine personnalisée

NF-KB

NK

OMS P38 P53 PDGF PG PGE2 PKC PMA POSTN Quer STAT3 SLN SNC TAM TGF-~ TIMP TLR TNF TNF-R TPA

Facteur nucléaire de transcription kappa-B Cellule «natural killer»

Organisation mondiale de la santé

Mitogen-activated protein kinase

Protéine suppresseur de tumeur

Facteur de croissance dérivé des plaquettes Prostaglandine

Prostaglandine E2

Protéine kinase C

Phorbol 12-myristate 13-acétate Périostine

Quercétine

Transducteur de signal et activateur de la transcription 3 Signal de localisation nucléaire

Système nerveux central

Macrophages associés aux tumeurs Facteur de croissance tumorale beta Inhibiteur tissulaire de MMP

Récepteur «toll-like»

Facteur de nécrose tumorale Récepteur au TNF

VEGF VEGFR

- -- - -

-Facteur de croissance de l'endothélium vasculaire Récepteur du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire

Le glioblastome est la tumeur cérébrale la plus fréquente et la plus agressive. Ce cancer est associé à une mortalité élevée. Il est caractérisé par des cellules cancéreuses instables, et aboutit souvent

à

des métastases locales dont la spécificité génétique varie considérablement d'un patient à l'autre limitant l'efficacité des traitements actuels. La médecine personnalisée consiste à traiter chaque patient en fonction des spécificités génétiques et biologiques de la tumeur, mais également en tenant compte de son mode de vie et de son alimentation. L'ensemble de ces facteurs influence l'évolution de la maladie et l'efficacité du traitement. Les principaux objectifs de notre étude sont de comparer l'expression génique de divers biomarqueurs de l'inflammation, de l'angiogenèse et du phénotype invasif induite par des facteurs pro-inflammatoires en présence ou en absence de composés phytochimiques présents dans les aliments d'origine végétale et que nous consommons et cela, dans 7 lignées cellulaires de gliomes (87 MG, 138 MG, U-118 MG, U-251, A-172, T-98G et Hs-683). Les résultats obtenus nous permettent de dresser un profil d'expression des biomarqueurs inflammatoires et angiogéniques pour chacune des lignées. Les niveaux d'expression varient en fonction du TNF-a, du PMA ou des composés naturels dérivés du thé vert, des épices, des bleuets ou de l'huile d'olive. Dans l'ensemble, nos résultats permettront de mieux cibler les biomarqueurs tumoraux cérébraux afin d'optimiser le traitement et prévenir la croissance des glioblastomes.

Mots-clés :Cancer du cerveau, Prévention, Phytochimiques, Biomarqueurs, Inflammation, Angiogenèse.

INTRODUCTION

1.1

Le cancer

1.1.1 Généralités

Véritable fléau du XXIème siècle, le cancer est une pathologie caractérisée par la présence d'une, ou de plusieurs, tumeur maligne formée à partir de la mutation d'une cellule initialement normale, pouvant affecter différentes parties de l'organisme (Organisation Mondiale De La Santé. 2016). Cela résulte essentiellement en une prolifération cellulaire anormalement élevée, puis en l'activation de plusieurs voies de signalisation favorisant le maintien et la survie de ces nouvelles cellules tumorales (Neergheen et al., 2010).

Le développement tumoral se déroule durant une période de temps plus ou moins étendue pouvant aller de 1

à

40 ans, en transitant via trois principales étapes qui sont: la phase d'initiation, de promotion et de progression (Neergheen et al., 2010).

L'évolution se fait d'abord localement, puis peut s'étendre via le sang et la lymphe à d'autres endroits du corps où se forment les métastases colonisant ainsi les autres tissus (figure 1.1) (Hanahan et Weinberg, 2000).

La phase d'initiation correspond

à

la période où se produit une lésion majeure au niveau de l'ADN d'une cellule. Cela peut être conséquent

à

différents évènements externes, tels que le tabac, les produits chimiques et rayons ionisants, les organismes infectieux, ou bien par des évènements internes comme les mutations héréditaires, les hormones, les conjonctures immunitaires et les inflammations chroniques (Luqman et Pezzuto, 2010). Tous ces facteurs peuvent agir ensemble ou de façon individuelle pour initier le développement du cancer. La phase de promotion commence lorsque la cellule mutée échappe au processus de réparation de l'ADN et consiste au développement et à la prolifération de la cellule transformée, formant ainsi un groupe de cellules transformées identiques. Enfin, la phase de progression s'établit après une période de temps plus ou moins longue. Durant ces phases, la tumeur acquière des propriétés qui lui permettent de proliférer de façon anarchique, de survivre et de s'alimenter. En effet, les cellules cancéreuses échappent au contrôle de mort cellulaire programmée et prolifèrent de manière illimitée (Hanahan et Weinberg, 2000}. Elles deviennent aussi insensibles aux signaux d'arrêt de croissance provenant du milieu extracellulaire (Hanahan et Weinberg, 2000)

PROMOTION PROGRESSION CANCER

•

1-40 années

T 1',' 1~ 1 ' , , T LESION DE l'ADN IICTIVIITION DES ONCOG(N[S/INI\CTIVII Tl ON G[N[S SUPPRESSEURS T~1 T. -< •

Figure 1.1. Étapes de la cancérogenèse.

Des agents nocifs affectent une cellule normale et l'initient à la cancérogenèse. La cellule subit des lésions au niveau de l'ADN et cela déclenche une prolifération incontrôlée. Des oncogènes sont activés et des gènes suppresseurs sont inactivés pour amener les cellules en phase de progression qui peut durer des années. Finalement, le cancer s'établit et peut être diagnostiqué. [Adapté de : Béliveau et Gingras, 2007]

1.1.2 Statistiques

Le cancer est la principale cause de décès au Canada depuis 2005. Selon les

Statistiques Canadiennes sur le cancer de 2015 ,196 900 Canadiens ont développé

un cancer et 78 000 décès ont été estimés pour cette même année au Canada (Statistiques canadiennes sur le cancer, 2015).

Il a été rapporté également qu'environ 2 Canadiens sur 5 développeront un cancer

au cours de leur vie, et qu'environ 1 Canadien sur 4 en mourra (Statistiques

canadiennes sur le cancer, 2015). Le cancer du poumon, le cancer du sein, le cancer colorectal et le cancer de la prostate représentent plus de la moitié des nouveaux cas de cancer (51%).

1.2

Le cancer du cerveau

1.2.1 Épidémiologie des tumeurs cérébrales

Toujours selon les statistiques de la Société canadienne du cancer de 2015, 2 660 canadiens ont reçu un diagnostic de cancer de l'encéphale. Actuellement, les tumeurs intracrâniennes constituent 2% de l'ensemble des cancers chez l'adulte. Bien que les cancers du système nerveux central (SNC) soient dix fois moins fréquents que le cancer du poumon, ils se placent au gème rang dans les causes de décès par cancer au Canada (Statistiques canadiennes sur le cancer, 2015).

Au Canada, on consigne les statistiques de survie relative après 5 ans pour le cancer du cerveau. La survie relative après 5 ans pour le cancer du cerveau est de 25 %. Ce qui veut dire qu'une personne diagnostiquée d'un cancer du cerveau aurait, en moyenne, 25 % de chances de vivre 5 ans à la suite de son diagnostic comparativement

à

une personne dans la population générale (Organisation Mondiale De La Santé. 2016). De plus, ce type de cancer est la première cause de mortalité chez les enfants de 0 à 14 ans.

Actuellement, il n'existe aucun moyen permettant d'anticiper ou d'empêcher l'apparition des tumeurs intracrâniennes. De plus, un pronostic défavorable leur est souvent associé. Il devient donc impératif de trouver de nouveaux agents ayant une toxicité minimale et un effet thérapeutique durable afin de prévenir et/ou traiter ce type de cancer.

1.2.2 Classification des gliomes

Les tumeurs cérébrales se répartissent en deux catégories : les tumeurs primaires et les métastases. La première catégorie correspond aux néoplasies se développant au sein même du SNC (Kesari, 2011). Les métastases, quand à elles, correspondent aux

tumeurs issues d'une migration au SNC de cellules cancéreuses initialement présente dans un autre tissu (Brasileiro de Aguiar

et al

.,

2014).

Parmi les tumeurs du cerveau, les plus fréquentes sont indéniablement les gliomes qui représentent environ 70% de toutes les tumeurs cérébrales primaires, et qui regroupent les astrocytomes, les épendymomes et les oligodendrogliomes (Dolecek

et al.

,

2012). L'OMS a réalisé un classement histologique des glioblastomes selon leur degré de malignité, les subdivisant en différents grades de 1

à

IV (Organisation Mondiale De La Santé. 2016). Le grade 1 correspond aux tumeurs bénignes, non

cancéreuses et englobe les astrocytomes pilocytiques, qui sont des tumeurs qui se caractérisent par un faible degré d'invasion tissulaire et par une masse tumorale circonscrite (Chintala

et al

.

,

1999), et les astrocytomes sous-épendymaires à cellules géantes. Ce stade atteint le plus souvent les enfants, et est curable par chirurgie. Le grade Il regroupe les astrocytomes diffus qui sont des tumeurs semi-bégnines. Les cellules cancéreuses de ce stade sont plus invasives, diffusent légèrement mais restent dans le groupe des tumeurs malignes à bas grade. S'en suivent les tumeurs de grade Ill qui regroupent les astrocytomes anaplasiques considérés comme des cancers semi-malins et présentant un caractère assez invasif et un degré de diffusion modéré (Chintala et

al

.

,

1999}. Enfin, nous retrouvons les glioblastomes multiformes (GBM) qui forment le grade IV et qui correspondent

à

des cancers malins. Ce sont des tumeurs qui se démarquent par un niveau de diffusion et d'invasion élevé (Chintala et al., 1999; Louis et al., 2007; Ricard et al., 2012). Les gliomes malins sont

très vascularisés, et possèdent la capacité d'envahir les tissus environnants du cerveau. Malgré les progrès réalisés dans les traitements chirurgicaux et médicaux, ce type de cancer a conservé son mauvais pronostic (Shakur et al., 2013).

1.2.3 Les glioblastomes

Les glioblastomes, aussi appelés glioblastomes multiformes (GBM), sont des

tumeurs astrocytaires malignes de grade IV (Organisation Mondiale De La Santé.

2016) qui se développent

à

partir des cellules gliales de forme étoilée du cerveau

connues sous le nom d'astrocytes (figure 1.2).

Le GBM peut survenir

à

la suite de la transformation d'un astrocytome de grade Il ou Ill. On le qualifie alors de GBM secondaire (Ricard et al., 2012; Wen et Kesari, 2008). Il peut aussi apparaitre directement du grade IV; et il s'agit dans ce cas de GBM primaires. Ils surviennent

à

tout âge mais dans 70% des cas entre 45 et 70 ans (Baldi et al., 2010; Figarella-Branger et al., 2010; Tachamo et al., 2016). Ils siègent le plus souvent au niveau des hémisphères cérébraux mais peuvent être localisés partout dans le SNC. L'évolution est souvent rapide (en 2-3 mois) sauf si le glioblastome provient de la transformation maligne d'un astrocytome de bas grade (glioblastome secondaire)(Figarella-Branger et al., 2010).

Les symptômes diffèrent en fonction de la localisation de la tumeur, mais un certain nombre de signes sont suggestifs. Ils traduisent une hyperpression intracrânienne

(céphalées, nausées et vomissements) qui s'associe souvent

à

des changements du

comportement ou

à

des déficits neurologiques focaux tel que des troubles de la vision, perte de la mémoire et crises d'épilepsies (Tachamo et al., 2016).

Figure 1.2. IRM d'un Glioblastome temporal gauche.

[Image adaptée de lmaging consult]

7

Les glioblastomes sont parmi les tumeurs les plus meurtrières avec une survie moyenne des patients d'environ 16 mois {Niyazi

et al.,

2011). Ils sont connus pour leur grande agressivité due

à

leur niveau élevé de prolifération, leur rapidité

à

l'angiogenèse et leur pouvoir infiltrant dans les tissus sains. Les traitements actuels sont tout d'abord l'opération chirurgicale d'exérèse qui a pour but de retirer toute la

tumeur. Malheureusement, ce but est rarement atteint car les cellules cancéreuses

s'infiltrent dans le parenchyme cérébral normal {Baldi

et al

.

,

2010). La seconde étape de traitement est la radiothérapie qui a pour objectif d'administrer une dose suffisante de radiation pour détruire toutes les cellules cancéreuses, mais pas trop élevée non plus afin de permettre aux cellules saines de se rétablir. Cette méthode

8

est souvent associée

à

de la chimiothérapie qui consiste en l'administration de médicaments nitrosurés et de témozolomide dont la finalité est d'arrêter ou de

ralentir la croissance des cellules cancéreuses (Parsons

et al

.

,

2008).

Malgré les progrès réalisés dans les traitements chirurgicaux et médicaux, ce type de

cancer a conservé son mauvais pronostic (Shakur

et al

.,

2013). La faible efficacité de la chimiothérapie actuellement, disponible pour les traitements de tumeurs

cérébrales, est en partie due

à

la présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui sépare le sang du parenchyme cérébral et qui limite la pénétration de la

plupart des médicaments dans le système nerveux central (Regina

et al.,

2008). En effet, la barrière hémato-encéphalique protège le cerveau des agents pathogènes,

des toxines et des hormones circulant dans le sang. C'est un filtre sélectif,

à

travers lequel les aliments nécessaires au cerveau sont transmis, et les déchets sont

éliminés. Seules les molécules de masses molaire supérieure

à

500 Da, car la taille de ces molécules ne leur permet plus de traverser ce barrage par diffusion (Regina

et

al

.

,

2008).

1.3

Inflammation et cancer

1.3.1 Généralités

L'inflammation correspond à une réponse de défense de la part des tissus de

l'organisme, suite

à

une blessure locale provoquée par des agents physiques,

chimiques ou des germes pathogènes. Elle est souvent décrite par une rougeur, une

C'est un processus immunitaire généralement bénéfique, puisqu'il permet d'éliminer un agent néfaste. L'un de ses rôles est de favoriser la reconstruction des tissus lésés (Pujol, 1988). Malencontreusement, cet aspect de l'inflammation est détourné au bénéfice de la tumeur pour l'aider

à

évoluer vers un stade plus avancé.

En effet, il est largement connu qu'une inflammation chronique contribue à la fois au développement et à la prédisposition des différents tissus au cancer ou à d'autres maladies (Andrew et al., 2009).

En situation physiologique, l'inflammation est déclenchée par des cellules présentes dans la région endommagée, comme par exemple les plaquettes dans un caillot sanguin, qui sécrètent des facteurs inflammatoires tels le PDGF (Piatelet-Derived Growth Factor: Facteur de croissance plaquettaire) (Mannaioni et al., 1997). Les facteurs inflammatoires permettent alors le recrutement de cellules de l'inflammation comme les macrophages au site altéré. Ceux ci ont pour fonction de défendre notre organisme et de favoriser la reconstruction de la zone tissulaire abimée en sécrétant des enzymes, telles que les métalloprotéases (MMP) pour réorganiser la matrice extracellulaire (MEC) et permettre ainsi l'infiltration des cellules pouvant reconstruire le tissu (Caussens et Werb, 2002). Ces cellules sont les cellules endothéliales qui créent de nouveaux vaisseaux sanguins, les cellules épithéliales qui reconstruisent l'épithélium et les cellules du système immunitaire qui défendent le tissu. De plus le mécanisme d'angiogenèse, qui consiste au développement de nouveaux vaisseaux sanguins par bourgeonnement

à

partir de vaisseaux existants, est stimulé afin de revasculariser le tissu endommagé. La prolifération des cellules au site de l'inflammation est induite par des facteurs de croissance tels que I'EGF (Epithelial Growth Factor: Facteur de croissance épidermique), sécrétés par les macrophages afin de réparer le plus rapidement

possible la zone lésée (Aggarwal et Gehlot, 2009). Une fois la réparation effectuée, le processus inflammatoire cesse et l'équilibre biologique du tissu est rétablit.

Au cours des 20 dernières années, de nombreuses recherches ont montré qu'au niveau moléculaire, la majorité des maladies chroniques, dont le cancer, sont engendrées par une réaction inflammatoire dérégulée et chronique (Gupta, S. C.

et

al.,

2010}. Lors d'un cancer, l'inflammation présente un réel avantage pour la tumeur car une part importante du processus inflammatoire est consacrée à la reconstruction du tissu ce qui sollicite des mécanismes intervenant également dans la tumorigenèse. Les cellules tumorales sécrètent des facteurs inflammatoires tel que PDGF et induisent l'inflammation tumorale. PDGF recrute les macrophages au sein de la tumeur (figure 1.3) (Tecchio et Cassatella, 2016). L'inflammation se comporte comme un puissant promoteur tumoral et permet la progression rapide de l'oncogenèse. Le développement et la survie, qui sont déjà suractivés dans les cellules tumorales, sont encore plus stimulés par l'inflammation (Lu

et al

.

,

2006}. L'angiogenèse, qui est importante pour la croissance de la tumeur est induite par l'inflammation. Lorsque les macrophages dégradent la MEC, ils favorisent en même temps l'infiltration des cellules cancéreuses dans le tissu sain, cela a pour conséquence d'accélérer l'oncogenèse vers un stade invasif (Cross et Claesson-Welsh, 2001). Un microenvironnement complexe et dynamique composé de cellules inflammatoires et immunitaires est crée autour de la tumeur. La sécrétion subséquente de cytokines, chimiokines et facteurs de croissance affectent le développement cancéreux dès l'initiation jusqu'à l'invasion (Sgambato et Cittadini, 2010).

Tumeur

Macrophage

Figure 1.3. Inflammation protumorale.

•liir.'l~~

pro-tumorale

Prolifération

q

EGF : Prolifération et survie c::>MMP : Invasion

. . VEGF : Angiogenése

Lorsqu'une tumeur sécrète des facteurs inflammatoires, comme le PDGF, elle recrute des macrophages. Les propriétés du macrophage dans la reconstruction des tissus sont alors utilisées au profit de la tumeur. Il y a stimulation de la prolifération des cellules cancéreuses, de l'angiogenèse tumorale et de l'invasion tumorale. Abréviations : PDGF: Facteur de croissance plaquettaire. EGF : Facteur de croissance épidermique. MMP : métalloprotéases. VEGF: Facteur de croissance de l'endothélium vasculaire. [Adaptée de futura-sciences Grégory Ségala].

1.3.2 Biomarqueurs de l'inflammation liés

à

la cancérogenèse

Plusieurs biomarqueurs caractérisent le processus inflammatoire dans le cancer dont certains facteurs de transcription et certains les facteurs de croissance. Ces protéines de faible poids moléculaire (< 30000 daltons) stimulent la multiplication cellulaire et ont effet sur la croissance des vaisseaux sanguins et les neurones. Les chimiokines et les cytokines sont également des biomarqueurs qui régissent le

développement tumoral (Andrew

et al.

,

2009}. Enfin ,les voies de signalisation tel que NF-KB, p38, MAPK, ERK, JNK et Wnt promouvaient la cancérogénèse (Béliveau et Gingras, 2006).

1.3.2.1 Les facteurs de nécrose tumorale TNF-a et TNF-P.

Le facteur de nécrose tumorale (TNF) est une importante cytokine activatrice du processus inflammatoire. Cette cytokine est sécrétée par les macrophages et agit en synergie avec les interleukines IL-l et IL-6, d'autres cytokines messagères et régulatrices du système immunitaire (Aggarwal, B. B.

et al.

,

2012; Aggarwal, Bharat B.

et al.,

2012). Le TNF possède deux isoformes: le TNF-a et le TNF-P (van Horssen

et al.,

2006). Le TNF-P est secrété exclusivement par les lymphocytes, par contre le TNF-a est produit par de nombreuses cellules : macrophages, monocytes, lymphocytes T et B, kératinocytes, cellules mésangiales, épithéliales, endothéliales,

basophiles et mastocytes, polynucléaires neutrophiles, et éosinophiles, fibroblastes. Il intervient de façon prépondérante dans l'inflammation et le cancer (Takada

et al.,

2008}. Il agit par l'intermédiaire d'un récepteur membranaire spécifique dont il existe deux formes: TNF-Rl et TNF-R2 (figure 4). La présence d'une forme soluble du TNF-R constitue un système de régulation important, la synthèse du TNF-R étant sous le contrôle du TNF lui-même.

Lors de l'angiogenèse tumorale, plusieurs facteurs de croissance aident la migration des cellules endothéliales dont le TNF-a. En effet, le TNF-a y contribue indirectement en stimulant la production des gènes codant pour une famille de récepteurs tyrosine-kinases dans l'endothélium, les éphrines-AI

à

travers ses récepteurs TNF-Rl et TNF-R2 et est induit par la voie SAPK/JNK. La voie p38/MAPK participe aussi

à

la migration induite par cette cytokine (Cheng, X.

et al.

,

2001). Les

actions du TNF dans les mécanismes de l'immunité et de l'inflammation s'exercent

sur de nombreux types cellulaires et sont diverses (figure 1.4). Dans notre étude,

l'utilisation du TNF-a sera

à

des fins de promotion de l'inflammation dans le milieu de culture des glioblastomes (Takada

et al.,

2008).

JNmATION PS3 supression ROS production Beta-catenin nuclur migration

TNF

TNFR1

CARCINOGENESIS

VEGF upreguiation HiF-1 alfa upregulatlon

EMT promotion MMP's expression

CXCR4 UJm9uiation

Figure 1.4. Implication de la liaison du TNF-a à son récepteur TNF-R1 dans toutes les phases de la cancérogénèse.

Cette liaison permet le recrutement de la protéine kinase IKK. Une protéine inhibitrice, IKB-a, qui se lie normalement

à

NF-KB et inhibe sa translocation, est phosphorylée par IKK et ensuite dégradée, libérant NF-KB qui migre au noyau. Cette liaison du TNF-a

à

son récepteur permet également une forte activation du groupe JNK lié au stress, JNK est activé et se translate au noyau. Cela permet la transcription d'une vaste gamme de protéines impliquées dans la survie et la prolifération cellulaires, la réponse inflammatoire et les facteurs anti-apoptotiques. Durant la

cancérogénèse, l'activation de ces voies de signalisation par le TNF-a aide au processus de cancérogénèse dans toutes ses phases de progression

1.3.2.2 La cyclooxygénase-2

La cyclooxygénase-2 (COX-2) est une enzyme inductible par des médiateurs

inflammatoires et des cytokines telles IL-l, IL-6 et TNF-a, participe à la production de prostaglandines dans les sites d'inflammation (Cheng

et al.,

2007). En effet, COX-2,

les prostaglandines synthétases et le cytochrome SA jouent un rôle important dans

la production de cinq prostanoïdes majeurs, la prostaglandine D2, la prostaglandine

E2, la prostaglandine F2a, la prostaglandine 12 et la thromboxane A2, qui participent

de façons importantes dans divers processus biologiques (Cheng

et al.,

2007; Dixon

et al.,

2013; Kalinski, 2012). De plus COX-2 est hautement exprimée dans les cellules

inflammatoires de l'environnement tumoral (Kalinski, 2012; Sgambato et Cittadini,

2010). La régulation de son expression s'effectue de façon transcriptionnelle et

traductionnelle (Cerella

et al.

,

2010). Son activité est exprimée dans les cellules

endothéliales vasculaires, rénales et au niveau du SNC. Son ciblage thérapeutique et

préventif est de plus en plus populaire, car COX-2 constitue un biomarqueur

important de l'inflammation reliée au développement carcinogénique (Cerella

et al

.

,

2010; Yao, M.

et al.,

2003).

1.3.2.3 La voie de signalisation NF-KB

Les protéines de la famille de facteurs de transcription NF-KB comprennent cinq

sous-unités qui fonctionnent en homo ou hétérodimères : p65 (Rel A), Rel B, c-Rel,

classique, la plus étudiée, de NF-KB (Gupta, S.

Cet al

.

,

2010). Ces cinq protéines ont

toutes un domaine N-terminal d'environ 300 acides aminés, désigné le

Rel

-homologie-domaine

(RHD), qui permet leur liaison

à

l'ADN, leur dimérisation et leur translocation nucléaire (Israël, 1991). La voie de signalisation par NF-KB relie les

phénomènes d'inflammation et de développement tumoral (Karin, 2009). Des gènes

inflammatoires, immunorégulateurs, antiapoptotiques et régulateurs du cycle

cellulaire sont induits par NF-KB. Effectivement, NF-KB est un facteur de

transcription ubiquitaire qui régule l'expression des gènes impliqués dans la transformation, la survie, la prolifération, l'invasion, l'angiogenèse et la métastase des cellules tumorales (Helbig

et al

.,

2003). De plus, NF-KB contrôle l'expression des gènes impliqués dans un certain nombre de réactions physiologiques, y compris les

réponses immunitaires inflammatoires, les réactions inflammatoires de la phase

aiguë, les réponses au stress oxydatif, l'adhésion cellulaire, la différenciation et

l'apoptose (Gupta, S. C.

et al

.

,

2010).

Lorsqu'il n'y a aucune stimulation chez les cellules, les protéines NF-KB (pSO et p65) sont localisées dans le cytoplasme et sont reliées aux protéines inhibitrices IKB présentes sous quatre isomères : IKB-a, IKB-~,IKB-y et IKB-E (Espinosa

et al

.

,

2010;

Gutsche

et al.

,

2016). La phosphorylation et la dégradation d'IKB-a permettent la

libération de l'hétérodimère p50/p65 et permet alors sa translocation au noyau.

Lors de l'inflammation, la voie de signalisation NF-KB est activée et régule la

transcription de gènes essentiels

à

la survie des cellules et

à

la formation

métastasique (Zheng

et al

.,

2011). Ces gènes activés par NF-KB incluent les cytokines tel que« Colony Stimulating Factors» (CSF), le TNF-a ainsi que IL-l et IL-6 (Helbig

et

al.

,

2003). Comprennent également les chimiokines tels que IL-8, les molécules

d'adhésion cellulaires et l'enzyme COX-2 (Espinosa

et al.,

2010). Plusieurs de ces

boucle autorégulatrice positive pouvant amplifier et augmenter la durée de la réponse inflammatoire (Yamamoto et Gaynor, 2001}.

1.4

Les voies de signalisation intracellulaire impliquées

dans le cancer

1.4.1

La voie de signalisation des MAP kinases

Les protéines MAP (mitogen activated proteins) kinases sont des enzymes essentielles appartenant à la superfamille des sérines/thréonine kinases (Davis, 1994}. Elles sont impliquées dans 7 voies de signalisation distinctes qui permettent à la cellule de répondre de manière appropriée aux différents stimuli extracellulaires

(Cobb et Goldsmith, 1995; Dhillon et al., 2007}. Les MAP kinases les plus

documentées et caractérisées sont ERKl/2, JNK, p38 et ERKS (figure 1.5). Ces enzymes jouent un rôle primordial dans l'embryogenèse, la prolifération et la différenciation cellulaire, et également dans la réponse au stress (Dhillon et al.,

2007}. Les MAP kinases s'activent les unes les autres en cascade : la MAP-kinase est activée par une kinase, elle-même activée par d'autres: MAP-kinase-kinase, MAP-kinase-kinase-kinase. Ces cascades sont mises en branle en aval des récepteurs de la membrane cellulaire et des autres protéines de signalisation cytoplasmique. Dans le cas du cancer, les fonctions de ces voies de signalisation sont dérégulées (Roberts et Der, 2007}.

1 Stimulus

t

1 G-protein

t

1 MAPKKK 1

t

1 MAPKK 1

t

Growth factors. mitogens 1 Rat, Tpl2 1 1 MEK1,21

t

1 MEKS I

t

1 Rac, Cdc42 Rho

t

1Tpl2, MEKK, MLK, TAK, ASK, TAO 1

t

+

t

1 MEK7 11 MEK4 1 ~~ M-E-K-3,6---,1

t /

t

Figure 1.5. Les voies de signalisation des MAP kinases.

Les MAP kinases sont organisées en une cascade de signalisation, où elles sont activées par une kinase MAPKK et qui sont elles-mêmes activées par la suite par un type de kinases, MAPKKK, très diversifié. Les classes les plus importantes des MAPKs y sont représentées dans la figure: les voies d'ERK, p38 et JNK. [Adaptée de Dhillon

et al.

,

2007].

1.4.2

La voie de signalisation ERK

La voie ERK est une voie de signalisation intracellulaire qui joue un rôle majeur dans la prolifération cellulaire, la survie, la différenciation, la migration cellulaire ainsi que l'angiogenèse et l'apoptose (Buscà

et al.

,

2016). ERK est activée suite à une lésion de l'organisme ou à l'inflammation. Dans ces conditions d'alerte, le taux d'ERK phosphorylé augmente de façon séquentielle dans les cellules (Wang, L. N.

et al

.,

18

2011). La signalisation de la voie ERK est anormalement activée lors d'un cancer. Cela est la conséquence de l'activation en amont de récepteurs membranaires tels que les récepteurs épidermiques de facteur de croissance (EGFR) et les protéines RAS ou RAF, aidant ainsi

à

la survie et

à

la prolifération cellulaire et favorisant le processus métastasique (Roberts et Der, 2007).

La protéine kinase ERK dispose de deux isoformes sous les noms de ERK-1 d'un poids moléculaire de 43 kDa et ERK-2 de 41 kDa. Quand ces protéines sont phosphorylées,

elles acquièrent respectivement un poids moléculaire de 44 kDa et 42 kDa (Yao, Z. et Seger, 2009). Ces deux isoformes possèdent un degré d'homologie de séquence de 84% et ont des fonctions redondantes (Mendoza

et al.,

2015). La littérature nous apprend qu'une modification de leur niveau d'expression pourrait expliquer la plupart des divergences fonctionnelles constatées lors de leur suppression spécifique (Frémin

et al. ;

Mendoza

et al

.,

2015). Le niveau d'activation total de ces kinases ERK-1 et ERK-2 se manifeste donc comme étant un paramètre déterminant pour spécifier différentes réponses cellulaires suite

à

l'activation de la voie ERK (Mendoza

et al.,

2015). Pour des raisons de simplicité, l'appellation ERK sous-entendra les deux isoformes dans ce mémoire.

1.4.3 La voie de signalisation JNK

Les protéines JNK appartiennent à la famille des SAP (Stress Activated Protein) kinases et sont présentes sous trois isoformes : JNK-1 (SAPK-y), JNK-2 (SAPK-a) et JNK-3 (SAPK-~). JNK-1 et JNK-2 sont exprimées de façon ubiquitaires chez les mammifères (Auladell

et al.,

2017). JNK-3 semble être plus limité et n'est localisé qu'au niveau du cerveau, du cœur et des testicules. Leur appellation JNK (c-jun

NH2-terminal kinases) est due

à

leur moyen d'activation qui est associé

à

la phosphorylation du domaine NH2-terminal du gène proto oncogène c-jun. Comme leur nom l'indique, elles sont impliquées dans la réponse au stress cellulaire, mais aussi dans l'apoptose et la transformation maligne (Davis, 2000).

Les JNK sont activées par des cytokines, les radiations UV, la privation de certains facteurs de croissance et les agents néfastes pour l'ADN (Kyriakis et Avruch, 2001). Elles sont également activées mais plus faiblement par les récepteurs couplés aux petites protéines G, le sérum et d'autres facteurs de croissance (Kyriakis et Avruch, 2001). Comme pour les autres MAP kinases, l'activation de JNK nécessite une cascade de phosphorylation des résidus Tyrosine et Thréonine au niveau de leur motif conservé Thr-ProTyr (Davis, 1994). Lorsque les cellules ne sont pas stressées, l'activité kinase de JNK est inhibée par la protéine JIP-1 (JNK interacting protein 1). Celle-ci se lie

à

JNK et la bloque au niveau du cytoplasme empêchant ainsi l'induction des gènes par cette voie de signalisation (Fuchs

et al.,

1998).

JNK est un médiateur de l'apoptose induite par le stress et est aussi associé

à

la suppression de tumeurs en réponse

à

des stress, d'inflammation ou d'hypoxie (Biau

et al.,

2015; Dhanasekaran et Reddy, 2008; Liu et Lin, 2007, 2015). Toutefois, d'autres observations évoquent que la protéine JNK-1 joue un rôle dans le processus de cancérogénèse des cellules. En effet, l'activation de JNK-1 est nécessaire dans la tumorigenèse induite par les UV (Ramaswamy

et al.,

1998). De plus, des certaines études ont rapporté que JNK-1 aurait des fonctions pro-prolifératives alors que JNK -2 serait plutôt pro-apoptotique (Durbin, Hannigan,

et al.,

2009; DurbinSomers,

et al

.,

2009).

1.4.4 la voie de signalisation p38

Comme les protéines JNK, la protéine p38 est un membre de la famille des SAP

kinases et possède quatre isoformes connues sous : p38-a, p38-~, p38-y et p38-ù.

Ces protéines sont aussi activées par un stress cellulaire physique et chimique tel

que le stress oxydatif, les UV, l'hypoxie, des cytokines comme IL-l et le TNF-a

(ZARUBIN et HAN, 2005). Les protéines kinases p38 sont impliquées dans plusieurs

réponses intracellulaires. En effet, l'activation de cette voie de signalisation a un rôle

primordial dans la synthèse de cytokines proinflammatoires (ILl~, TNF-a et IL-6)

(Guan

et al.

,

1998), dans l'induction d'enzymes telles que COX-2 (Badger

et al

.

,

1998), dans l'expression d'enzymes intracellulaires tel que iNOS, un régulateur de

l'oxydation (Craxton

et al

.

,

1998; Da Silva

et al

.

,

1997), et d'autres molécules de l'inflammation (Pietersma

et al

.,

1997). Son implication dans l'apoptose n'est plus a vérifier non plus (Fernandes-Ainemri

et al

.

,

1996; Henkart et Grinstein, 1996; Xia

et

al.,

1995), son rôle est reconnu dans l'inflammation, la régulation du cycle cellulaire,

la mort cellulaire, le développement, la différenciation et la tumorigenèse

(Coulthard

et al

.

,

2009). Son activation résulte de la phosphorylation d'un motif conservé Thr-Giy-Tyr (TGV) présent au niveau de sa boucle d'activation (Raingeaud

et al

.,

1995; Whitmarsh et Davis, 1996) ce qui entraîne la migration de la protéine

dans le noyau.

1.5

Quelques biomarqueurs de l'angiogenèse, de l'invasion,

de la migration et des métastases

1.5.1 VEGF

possédant cinq isoformes (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D et PIGFL exprimés dans plusieurs tissus comme le cerveau, le foie, les reins, le cœur, les ovaires et la peau (Belgore

et al

.

,

2004). Ces protéines ont un rôle prédominant dans la croissance vasculaire (Holmes

et al

.,

2007). En effet, le VEGF stimule la prolifération, inhibe l'apoptose, augmente la perméabilité vasculaire et l'angiogenèse en se liant

à

ses

récepteurs membranaires VEGFR-1, VEGFR-2 et VEGFR-3 (Byrne

et al

.

,

2005). Cette

protéine est secrétée par la majorité des cellules inflammatoires du système

immunitaire tels que les lymphocytes, macrophages, neutrophiles et éosinophiles,

mais également dans les cellules musculaires lisses et les cellules endothéliales

(Carmeliet et Jain, 2011). Les propriétés de cette protéine lui permettent de jouer un

rôle important dans la progression tumorale. En effet, les tumeurs ont besoin de

nouveaux vaisseaux sanguins afin de satisfaire leur besoin en nutriments et en oxygène et pour cela elles font appel au phénomène d'angiogenèse que favorise le

VEGF (Carmeliet et Jain, 2011). Celui-ci est sécrété en réponse au manque

d'oxygénation locale (hypoxie) dans le microenvironnement de la tumeur et

également en réponse aux facteurs de croissance FGF, EGF, PDGF et TGF-~; les

chimiokines tel que IL-6, la protéine tumorale p53 et l'estrogène (Carmeliet et Jain,

2011). L'inhibition de VEGF favoriserait l'arrêt de la croissance tumorale dans le sens

ou cela bloquerait l'angiogenèse et donc une incapacité des cellules tumorales

à

satisfaire leurs besoins en nutriments et oxygène.

1.5.2 Matrice extracellulaire et métalloprotéases

La matrice extracellulaire (MEC) représente tout le matériel dont les cellules ont besoin pour vivre dans de bonnes conditions et sert de soutient aux tissus

protéines fibreuses, de protéines de structure (collagène, élastine) et de protéines d'adhésion (fibronectine, laminine) jouant un rôle important dans l'interaction cellule-cellule ou cellule-MEC (Weber et Kuo, 2012). Elle est constamment en remodelage par des protéases, notamment la famille des métalloprotéases matricielles (MMPs).

Les MMPs sont des endopeptidases capables de dégrader tous les types de composants protéiques de la MEC (Gialeli

et al

.,

2011). Elles sont aussi impliquées dans le remodelage tissulaire, le développement embryonnaire, la croissance et la cicatrisation. Jusqu'à présent, il existe plus d'une vingtaine de MMPs, dont la gélatinase A (MMP-2) et la gélatinase B (MMP-9), qui ont un rôle dans la cancérogénèse et qui nous intéressent tout particulièrement dans le cadre de ce projet (Belkaid

et al.,

2007). En effet, une fois ces deux MMPs activées, elles dégradent le collagène de type IV, la gélatine et l'élastine. Il y a alors une augmentation des niveaux d'expression des gélatinases lors de la cancérogenèse. Celles-ci sont spécifiquement impliquées dans les processus métastasiques et inflammatoires (Annabi

et al

.,

2007; Klein

et al.

,

2004; Weber et Kuo, 2012). De plus, les cellules cancéreuses expriment fortement les MMPs tout en réduisant la transcription de leurs inhibiteurs, les inhibiteurs tissulaires des métalloprotéinases (TIMPs) (Weber et Kuo, 2012).

MMP-9 peut être régulée selon de nombreux mécanismes :transcription, sécrétion, activation, inhibition et glycosylation (Van den Steen

et al

.

,

2002). Dans la plupart des cellules, sa transcription est induite par des cytokines, des facteurs de croissance, des esters de phorbol tels que le 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate (PMA), et des hormones se liant à des sites transcriptionnels spécifiques sur le promoteur de la MMP-9. Cette métalloprotéase est également impliquée dans le développement tumoral et dans l'angiogenèse (Gupta, A.

et al.,

2013). La perte de

contrôle des mécanismes de régulation de la MMP-9 est également observée dans les maladies inflammatoires (blessures chroniques, inflammation de la peau, des

tractus pulmonaires, gastro-intestinal et rénal, des articulations, des vaisseaux

sanguins et du système nerveux), infectieuses, vasculaires, dégénératives et

malignes comme dans le cas du cancer justement (Van den Steen

et al

.,

2002}.

1.5.3 Rôle de la périostine dans la cancérogénèse

La périostine est une protéine d'adhésion sécrétée par les ostéoblastes et exprimée préférentiellement dans le périoste des os et dans le ligament péridontal des dents

(Hwang

et al

.,

2014}. La masse moléculaire du précurseur de la périostine est

d'environ 93kDa. Plusieurs études ont montré la présence de facteurs modifiant

l'expression de la périostine dans la cancérogenèse. En effet, l'expression de la

périostine est modulée par le TGF-~ (Horiuchi

et al.

,

1999}, BMP-2 (Hwang

et al.

,

2014} et le facteur de transcription Twist (Oshima

et al

.,

2002}. Il a été également

démontré que la sécrétion de la périostine peut être modifiée par le PDGF et le FGF (Michaylira

et al

.,

2010}.

Plusieurs études ont confirmé l'importance de la liaison de la périostine avec

plusieurs protéines matricielles (Ruan

et al

.

,

2009}. Entre autres, la périostine

interagirait avec certaines intégrines aV~3, aV~S, a6~4 (Ruan

e

t al

.,

2009}, jouant

ainsi un rôle dans la cancérogenèse. Au niveau du cancer des ovaires, les

hétérodimères aV~3 et aV~S seraient à l'origine de la régulation de la migration et

de l'adhésion cellulaire (Gillan

et al.

,

2002). De plus, l'activité proangiogénique de la

périostine est liée

à

l'activation de la voie aV~3/FAK (Focal Adhesion Kinase) (Shao

av~3 et l'induction de la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) et cela suite à l'interaction entre ces intégrines et le récepteur EGFR/HERI/ErBI, activant ainsi l'invasion et finalement la métastase

in

vivo

(Zhou, W.

et al

.,

2015).

Enfin, tout comme les protéines de la MEC, la périostine semble aussi jouer un rôle important dans certaines pathologies et, plus précisément, dans le remodelage tissulaire. À ce jour, plusieurs équipes ont caractérisé son interaction avec les intégrines modulant ainsi plusieurs processus cellulaires telles que les interactions cellule-matrice, l'adhésion et la prolifération, et finalement dans les processus de différenciation, de survie et de motilité cellulaire (Kudo

et al

.,

2007; Sirica

et al.,

2014). L'implication de la périostine dans les processus tumoraux a été prouvée dans plusieurs recherches, notamment au niveau de l'instabilité génomique, l'immortalisation, la survie cellulaire, l'invasion et enfin l'angiogenèse et la métastase (Zhou, W.

et al.,

2015)

1.6

La saine alimentation, une forme de prévention contre

le cancer

1.6.1 Chimioprévention par des molécules issues de la diète

La lutte contre le cancer est devenu un des défis les plus importants de notre époque. Selon une estimation réalisée par le Fonds Mondial de la Recherche contre le Cancer en 2007, 30% de tous les cancers sont directement rattachés au régime alimentaire des individus, et dans certains types de cancers comme celui du système gastro-intestinal, ce pourcentage peut atteindre les 70%. Il a été également rapporté qu'environ 30% des tumeurs peuvent être évitées avec une bonne alimentation et

une activité physique régulière (Wiseman

et al

.

,

2008). De plus, de nombreuses études épidémiologiques ont montré que la consommation de fruits et légumes était associée

à

une baisse importante du risque de développer cette maladie (Béliveau et Gingras, 2014). C'est pour cela que les molécules issues d'aliments ont

fait l'objet de nombreuses recherches et sont utilisées pour prévenir les cancers (Béliveau et Gingras, 2014). En effet les fruits, légumes et épices sont connus pour leurs excellentes sources en fibres, vitamines, minéraux et acides gras insaturés. Plusieurs d'entre eux contiennent des composés phytochimiques bienfaisants pour la santé tels que les polyphénols, les alcaloïdes et les terpènes et ont été corrélés pour inhiber l'initiation

à

la cancérogénèse et d'éviter le stade de l'invasion métastasique (Aggarwal et Shishodia, 2006). Ces molécules phytochimiques font

partie intégrante de la chimioprévention qui correspond

à

l'utilisation d'agents naturels ou synthétiques dans le but de prévenir, supprimer ou inverser la progression tumorale (Aggarwal et Shishodia, 2006; Brenner et Hearing, 2008;

Svatek

et al

.

,

2008; Tan

et al

.,

2011).

Les cibles des molécules chimiopréventives sont principalement les facteurs de transcription (tel que NF-KB, P53, STAT3), les facteurs de croissance (TNF, PDGF,

VEGF,CSF), les protéines kinases (Akt, JNK, IKK, ERK, MAPK) et des protéines

impliquées dans l'apoptose, les métastases, l'adhésion et le cycle cellulaire (Bel- 2, caspase-3, COX-2, MMP-9, VCAM-1, cyclin Dl) (Aggarwal et Shishodia, 2006;

Beliveau et Gingras, 2007). En conséquence, prévenir le cancer en arrêtant le

développement des cellules précancéreuses est essentiel car même les personnes en bonne santé ont un certain nombre de tumeurs dormantes. De nos jours, la

notion de prévention du développement des microtumeurs dormantes par la nutrition est clairement établie (Béliveau et Gingras, 2014).

1.6.2 les flavonoïdes, la sous-classe la plus abondante des

polyphénols

Les polyphénols sont les phytochimiques les plus abondants des agents alimentaires végétaux, possédant divers avantages bénéfiques pour la santé, dont des effets neuroprotecteurs, cardioprotecteurs et chimiopréventifs (Vauzour

et al

.,

2010). Un tiers de l'apport total en polyphénols est représenté par les acides phénoliques, et les deux tiers restants sont des flavonoïdes. Les flavonoïdes (de flavus, «jaune » en latin) sont des molécules aromatiques polysubstituées abondamment présentes dans la majorité des plantes alimentaires car elles constituent les métabolites secondaires des plantes (Asif, 2012). Ces molécules ne participent pas de manière directe au développement de celles-ci mais elles sont primordiales dans la défense des cellules des plantes envers les microorganismes, les insectes, et les radiations UV (Harborne et Williams, 2000).

Les flavonoïdes comprennent plus de quatre mille cinq cents membres et possèdent des propriétés antivirales, antimicrobiennes, anti-inflammatoires, antiallergènes, antithrombotiques, antimutagènes, antinéoplasiques (Pietta, 2000). De plus, elles ont des effets cytoprotecteurs sur différents types de cellules. Des études épidémiologiques ont montré que la consommation de flavonoïdes peut être associée

à une diminution du risque de plusieurs types de cancer (Birt

et al

.,

2001).

Un flavonoïde a une composition basée sur un squelette à 15 carbones et sa structure s'organise toujours autour d'un squelette 1,3- diphénylpropane C6-C3-C6

(Figure 1.6), décrit par une nomenclature spécifique. Les deux cycles benzéniques sont nommés cycle A et cycle B. Le chaînon propyle C3 peut être complété par une fonction éther formant ainsi un cycle central, appelé cycle C (Uchimiya

et al.

,

2016).

3' 2' 4' 8 1' 7 5' 6' 6 5 4

Figure 1.6. Structure de base des flavonoïdes

Les flavonoïdes sont divisés en 6 sous-classes principales (figure 1.7):

• Les flavones : abondantes chez les plantes supérieures sous forme aglycones

ou glycosylées. Certaines, comme la lutéoline sont en partie responsables de

l'aspect blanc ou ivoire de certaines fleurs, comme les roses et les œillets.

Exemple : Apigénine, lutéoline.

• Les flavanones : abondantes chez les agrumes, mais peu rencontrées chez les

autres fruits interviennent dans la relation structure-degré d'amertume.

Exemple : Aringénine, hespéridine.

• Les flavonols : très répandus dans le règne végétal. De ce fait, ils sont

abondants dans l'alimentation. Ils peuvent participer

à

la couleur jaune de

certaines fleurs (primevère, chrysanthème jaune, fleur du cotonnier). On les

retrouve principalement sous forme glycosylée dans les fruits et les légumes.

Exemple : Quercétine, myricétine kaempférol.

• Les catéchines : Initialement découverts dans les fruits de l'acacia a cachou,

présentes dans les fève de cacao, plantes et racines.

• Les anthoc anidines : les anthocyanidines ont un squelette flavylium qui a la particularité d'être un chromophore. Ces flavonoïdes sont des pigments naturels très fréquemment rencontrés chez les végétaux. Ils sont en partie responsables des nuances de couleur rouge (À= 490-500 nm), violet (À= 560-580 nm) et bleu (À= 560-580-595 nm) des fruits et des fleurs.

Exemple : Cyanidine, pélargonidine, delphinidine.

• Les isoflavones : sont présentes chez toutes les plantes mais seules les plantes de la famille des fabaceae ( « légumineuses ») contiennent des quantités significatives d'isoflavones, connues pour leur propriété oestrogénique. On peut les retrouver dans le soja et les haricots verts.

Exemple : Génistéine, daidzéine.

La plupart des flavonoïdes présents dans les plantes sont attachés

à

des sucres (glucosides), mais peuvent se trouver sous forme d'aglycones (Asif, 2012). L'intérêt envers les bénéfices des flavonoïdes sur la santé a augmenté en raison de leur puissante propriété antioxydante et de leur capacité à capter les radicaux libres observés in vitro (Ross et Kasum, 2002).

HO Flavan-4-ol ANS

f

OH 3-Déoxy-anthocyanidines

p-coumaroyl OJA + 3 acétyl CoA

CHS 1 • OH HO OH 0 C_HI

~ ~OH

... 1

How.,

·

V

FNR ~ ...-- OH 0 Flavanones OH FJH

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h'OH H O W O

,

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... 1 ~ OH OH 0 _HO FLS

~OHJ

!

Dihydroflavonols ___.. DFR ANS ou Flavane-3 ,4-diols (Leucoanthocyanes) LDOX HO

,

.

v

?_ ~-OH n _{FDR 1} ~OH

f

h'OH

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,

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_?

_Ho'Ç(X,.0

_{' ...} 1 OH ~ OH OH OH

Tannins condensés _Aavan-3-ols (Catéchines)

HO

OH

OH

Anthocyanines