Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Gerin, Y. (1975). Etude ultrastructurale, cytochimique et autoradiographique des oocytes et des jeunes embryons de ilyanassa obsoleta stimpson (mollusque gastéropode) (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/214471/3/ab30b016-a967-4e94-a515-943560a5d81b.txt
(English version below)
Cette thèse de doctorat a été numérisée par l’Université libre de Bruxelles. L’auteur qui s’opposerait à sa mise en ligne dans DI-fusion est invité à prendre contact avec l’Université ([email protected]).
Dans le cas où une version électronique native de la thèse existe, l’Université ne peut garantir que la présente version numérisée soit identique à la version électronique native, ni qu’elle soit la version officielle définitive de la thèse.
DI-fusion, le Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles, recueille la production scientifique de l’Université, mise à disposition en libre accès autant que possible. Les œuvres accessibles dans DI-fusion sont protégées par la législation belge relative aux droits d'auteur et aux droits voisins. Toute personne peut, sans avoir à demander l’autorisation de l’auteur ou de l’ayant-droit, à des fins d’usage privé ou à des fins d’illustration de l’enseignement ou de recherche scientifique, dans la mesure justifiée par le but non lucratif poursuivi, lire, télécharger ou reproduire sur papier ou sur tout autre support, les articles ou des fragments d’autres œuvres, disponibles dans DI-fusion, pour autant que :
Le nom des auteurs, le titre et la référence bibliographique complète soient cités; L’identifiant unique attribué aux métadonnées dans DI-fusion (permalink) soit indiqué; Le contenu ne soit pas modifié.
L’œuvre ne peut être stockée dans une autre base de données dans le but d’y donner accès ; l’identifiant unique (permalink) indiqué ci-dessus doit toujours être utilisé pour donner accès à l’œuvre. Toute autre utilisation non mentionnée ci-dessus nécessite l’autorisation de l’auteur de l’œuvre ou de l’ayant droit.
--- English Version ---
This Ph.D. thesis has been digitized by Université libre de Bruxelles. The author who would disagree on its online availability in DI-fusion is invited to contact the University ([email protected]).
If a native electronic version of the thesis exists, the University can guarantee neither that the present digitized version is identical to the native electronic version, nor that it is the definitive official version of the thesis.
DI-fusion is the Institutional Repository of Université libre de Bruxelles; it collects the research output of the University, available on open access as much as possible. The works included in DI-fusion are protected by the Belgian legislation relating to authors’ rights and neighbouring rights. Any user may, without prior permission from the authors or copyright owners, for private usage or for educational or scientific research purposes, to the extent justified by the non-profit activity, read, download or reproduce on paper or on any other media, the articles or fragments of other works, available in DI-fusion, provided:
The authors, title and full bibliographic details are credited in any copy;
The unique identifier (permalink) for the original metadata page in DI-fusion is indicated; The content is not changed in any way.
It is not permitted to store the work in another database in order to provide access to it; the unique identifier (permalink) indicated above must always be used to provide access to the work. Any other use not mentioned above requires the authors’ or copyright owners’ permission.
U N IV R H S rr A S BR UX EL LE NS K»
Laboratoire de Cytologie et d'Embryologie Moléculaires Dir . : Prof. J . BRACHET
UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences
ÉTUDE ULTRASTRUCTURALE,CYTOCHIMIQUE ET
AUTORADIOGRAPHIQUE DES OOCYTES ET DES
JEUNES EMBRYONS DE
ILYANASSA OBSOLETA STIMPSON (Mollusque Gastéropode)
Thèse présentée en vue de l'obtention du grade légal de Docteur en
Sciences Zoologiques
par
Yves GERIN
Laboratoire de Cytologie et d’Embryologie Moléculaires Dir . : Prof. J . BRACHET
Faculté des Sciences
REÇU le
1 2 DEC. 1974
Hép:...
ÉTUDE ULTRASTRUCTURALE,CYTOCHIMIQUE ET
AUTORADIOGRAPHIQUE DES OOCYTES ET DES
JEUNES EMBRYONS DE
ILYANASSA OBSOLETA STIMPSON (Mollusque Gastéropode)
'1
Gr } \'C
cq. ,2
Thèse présentée en vue de l obtention du grade légal de Docteur en
Sciences Zoologiques
par
Nous tenons à exprimer notre plus profonde
reconnaissance à *'onsieur le Professeur Jean Brachet,
pour nous avoir permis d'effectuer ce travail dans
son laboratoire.
Notre très sincère reconnaissance s'adresse
à Madame le Professeur Paulette Van Hansen, qui nous
a initié à la microscopie électronique, et pour les
nombreux conseils qu'elle nous a prodigués.
Nous remercions tous les membres du
laboratoire de cj’tolociie et embr;’’ologie moléculaires,
pour l'entraide efficace qu'ils nous ont apprtée tout
au long de ce travail.
Nous remercions également Monsieur Adrien
Weber pour son aide technique si souvent précieuse.
Ce travail a pu être accompli grâce au soutien
financier de l'Institut pour l'encouragement de la
Recherche Scientifique dans l'Industrie et l'Agriculture
( I.R.S.I.A. ), que nous remercions vivement.
I . INTRODUCTION ^ ^'
1. La segmentation spirale ^
2. Localisations germinales dans l'oeùf non segmenté
3. Théorie du lignage cellulaire 0
4 . Pouvoir morphogène du lobe polaire ^
4.1, Rôle du lobe polaire dans la détermination du modèle de division 9 4.2, Rôle du lobe polaire dans l'établissement du pôle postérieur^Q
de l'embryon
4.3, Les structures dépendantes du lobe
5. Influence des micromères s\ir le développement embryonnaire l6
6. Formation du lobe polaire 19
7. Effets des agents chimiques sur le développement . 23
8. Constitution chimique des oeufs d'Ilyanassa 2ô
8.1. Enzymes protéolytiques 26
8.2. Synthèse des protéines chez Ilyanassa 27
8.3. Acides nucléiques ■ iO
8.3.1. Acides ribonucléiques 30
8.3.2, Acide désoxyribonucléique 3J
II. BUT DU TRAVAIL 3b
III. MATERIEL ET METHODES
page
3.1.2. Inclusion
3.1.3. Coupes et coloration 3.2. Cytochimie u 1 tr<is truc tura le
3.2.1. f'ixation 3.2.2. Inclusion
3.2.3. Traitement des coupes 3.3. Autoradiographie
4. "Coloration à 1'actinomycine D tritiée IV. OBSERVATIONS 1. Morphologie générale 1.1. L'ovaire 1.2. Oocytes en prévitellogénèse 1.2.1. Le noyau 1.2.2. Le cytoplasme 1.3. Oocytes en vitellogénèse 1.3.1. Le noyau 1.3.2. Le cytoplasme
1.4. Oocytes en fin de croissance 1.4.1. Le noyau
1.4,2 Le cytoplasme 1.5. Les oeufs indivis
1.5.1. Le noyau
1.5.2. Le cytoplasme
1.6. Les embryons au stade en trèfle 1.6.1. Les blastomères
1.6.2. Le lobe polaire 1.7. Le stade 4
2. Digestions (?nzyma t Lques bG
2.1. Les corpuscules périnucléaires GG
2.2 Les vésicules à double* membrane G7
2.3. Le nucléole 58
2.4, Les plaquettes vitellines 58
3. Autoradiographie 59
3.1. Incorporation d'acides aminés tritiés 59
3.2. Incorporation d'uridine tritiée 60
3.3. Incorporation de thymidine tritiée 60
3.4. Coloration à 1'actinomycine D tritiée 61
4. Coloration aux fluorochromes 62
V. DISCUSSION
1. Les corpuscules périnucléaires 63
2. Morphogénèse des vésicules a double membrane 68
2.1. Filiation hypothétique 68
2.2. Origine des deux membranes 69
2.3. Nature chimique et rôle des vésicules à double membrane 72
3. Formation des plaquettes vitellines 76
3.1. Etude morphologique 76
3.2. Etudes cytochimique et autoradiographique 79
4. Le noyau vitellin et les lipochondries 82
5. Evolution nucléole cours de l'oogénèse d'Ilyanassa 85
5.1. Etude morphologique 85
5.2. Etude cytochimique 89
5.3. Etude autoradiographique 91
5.3.1. Acide ribonucléique et protéines nucléolaires 91
5.3.2, Acide désoxyribonucléique nucléolaire 93
5.4. Amplification des cistrons 28S et 18S chex Ilyanassa 94
VI. CONCLUSION 98
Ilyanassa obsoleta est un Mollusque last<^ropode Prosobranche ( Ordre des N<^ogastropodes, Super-famille des Buccinacae, famille
des Nassariidae ), qui possède, de même que d'autres animaxix de différents phylums( Némertiens, Annélides, Ascidiens et Mollusques autres que Céphalopodes ), la caractéristique de présenter une
segmentation embryonnaire spirale. Les embryologistes ont donné le nom de Spiralia à l'ensemble des organismes dont la segmentation est
spirale. Cette segmentation spirale est due à l'orientation des fuseaux lors des divisions des blastomères; elle est toujours oblique par rapport à l'axe vertical ( animal-végétâtif ).
Des fuseaux de division, dirigés dans le sens des aiguilles d'vuae
montre ( dexiotropiques ) alternent avec des fuseaux laeotropiques,
dirigés en sens inverse et perpendiculaires les uns aux autres.
C'est au cours de la segmentation spirale que les feuillets germinatifs et les ébauches des organes qu'ils engendreront sont
déterminés.
Afin de préciser le moment de l'apparition d'une ébauche donnée, il a été nécessaire de suivre, pas à pas, l'évolution de chaque blastomère, sa "généalogie" ( le "cell lineage" des auteurs américains ),
Afin de pouvoir comparer les résultats de ces observations, chaque blastomère est conventionnellement désigné par une lettre, un
2.
lettres A, B, C et D. A partir de ce moment, l’embryon comprend d^^jà quatre quadrants, ('.es quatre blastomères se divisent tous en même temps et l'on passe alors au stade 8, composé de 4 macromères ( 1A, IB, IC, 1D ) et de quatre micromères ( la, 1b, 1c, 1d ). L'ensemble de ces derniers constitue ce qu'on appelle le premier quartette ou tétrade de micromères. IA, IB, IG, 1D se divisent simultanément, donnant un second quartette de micromères 2a, 2b, 2c, 2d et quatre gros blastomères 2A, 2B, 2C et 2D. Les macromères 2A,,..2D se
divisent encore une fois pour donner un troisième quartette de micromères: 3a, 3b, 3c, 3d, puis un quatrième et parfois même un cinquième, les macromères étant devenus 3A, 3B, 3C, 3D puis 4A,...4D et enfin 5A,...5D.
Pendant ce temps, le premier et second quartette de micromères se sont divisés donnant chacun huit micromères.
Le phénomène se poursuit au niveau des autres quartettes.
Lors du stade 64, l'ébauche est faite des 4 macromères 4A,...4D, du quatrième quartette qui vient de se former, de 8 micromères appartenant au troisième quartette, de 16, provenant du second et enfin de 32, nés du premier ( cfr, schéma 1 ).
Il va sans dire que le coefficient symbolique du blastomère ne change pas lors de chaque nouvelle division et sert toujours à désigner le quartette. Mais, pour faire connaître le rang et l'emplacement des nouveaux blastomères, il faut introduire, dans leur notation, les exposants.
Considérons, par exemple, le blastomère 1d: il donne naissance à
1 2
2 cellules-filles qu'on désignera par les symboles 1d et 1d . 1 1112
Le blastomère 1d donnera à son tour: 1d et 1d
s C H E M \ 1
L'ensemble de tous les blastomères formas par chacune des initiales A, B, C, Ü constitue un quadrant de l'embryon.
Après cette brève description des principaux aspects que revêt la segmentation spirale, passons à la question, bien plus
fondamentale,de la ségrégation des plasmas formatifs ( localisations germinales '), autrement dit, de la distribution des potentialités de l'oeuf parmi les différents produits de la segmentation.
Dans certains cas, les blastomères pr'^sentent des différences
morphologiques visibles. Leur étude est alors du ressort de la simple observation, et il suffit de suivre le plus soigneusement possible, élément par élément, la marche de la segmentation.
Mais il est rare que les blastomères présentent de telles différences et ce n'est que très tard au cours de l'ontogenèse qu'apparaît la différenciation. C'est ainsi que, à un moment donné, tel blastomère se trouve déjà déterminé, alors qu'il ne présente aucune différencia tion extérieurement visible; seules des expériences permettent de fixer le moment où il hérite, de son générateur, lui stock de
potentialités différent de celui que reçoit le blastomère frère. On peut répartir les oeufs en deux catégories; ce\ix qui produisent des blastomères dont les descendants restent, pendant toute la p'^riode de segmentation, totipotents. Dans ce cas, chaque blastomère est capable d'évoluer en une ébauche qualitativement parfaite. Quantitativement, cette ébauche est déficiente et elle l'est d'autant plus que le blastomère qui lui donna naissance était d'un rang de génération plus élevé. Ce sont des oeufs à segmentation indéterminée.
Dans d'autres oeufs, au contraire, la détermination apparaît très tôt, parfois même au début de la segmentation. C'est ce qu'on désigne sous le nom de segmentation déterminée ou segmentation en mosaïque.
2, Localisations germinales dans l'oeuf non segmenta?
L'existence d'une segmentation déterminée conduit
naturellement à poser comme hypothèse que l'oeuf lui-même n'est pas homogène dans toutes ses parties, mais constitué d'une mosaïque de plasmes différents: ce sont les localisations germinales.
Les travaux des pionniers de l'embryologie expérimentale sur les embryons de Mollusques ( Crampton 1896, Conklin 1897,
Wilson 1904a,b ) les ont conduit à la conclusion que chaque blastomère résultant des premières divisions de l'oeuf fécondé possède un
potentiel morphogène déterminé, que l'on peut suivre dans la lignée cellulaire qu'il produit au cours du temps. En d'autres termes, le type de différenciation qui s'exprime dans chaque lignée dépendrait de la région particulière du cytoplasme de l'oeuf où le blastomère initial s'est formé.
D'une manière générale, on sait maintenant que le cytoplasme des oeufs est hétérogène, et que les différences initiales, déjà
présentes dans les oocytes, s'accusent à mesure que progresse la segmentation , Rien n'interdit d'imaginer, comme l'a fait Morgan ( 1936a ), que des différences initiales dans ces régions cytoplasmi ques affectent l'activité des gènes; ceux-ci, à leur tour, affecteraien le cytoplasme; il en résulterait une nouvelle suite de réactions
réciproques.
6
3. Théorie du lignage cellulaire
Les travaux de ces mêmes auteurs ( Crampton, Conklin et Wilson ) illustrent bien la thf^orie du lignage cellulaire.
L'ectoderme embryonnaire est dérivé des 3 premières tétrades de micromères, 1'ectomésoderme ou mésenchyme larvaire dérive de la
troisième tétrade de micromères et la région qui formera l'endoderme est représentée par les macromères 4A, 4B, 4C, 4D et les micromères correspondants. Dans le quadrant D, les micromères 2d ( somatoblaste ) et 4d ( mésentoblaste ) sont particulièrement importants; ils sont
respectivement à l'origine de l'ectoderme et du mésoderme de l'embryon. Les oeufs des Spiralias sont aussi caractérisés par l'apparition de régions cytoplasmiques distinctes au pôle animal et végétatif.
Ces plasmes polaires qui produisent, dans certains cas, des protrusions momentanées ("lobes polaires”) sont transmis aux somatoblastes
dérivés du quadrant D. Les animaux produisant des lobes polaires sont notamment Dentalium ( Scaphopode )( Wilson 1904, Verdonk 1968 ),
l'Annélide Sabellafià ( Hatt 1932; Novikoff 1938 ), le Polychète Chaetopterus ( Tyler 1930 ), le Bivalve Mytilus ( Rattenbxiry et Berg
1954 ) et les Prosobranches Ilyanassa et Bithynia ( Crampton I896 ). Chez Ilyanassa, plusieurs lobes polaires se forment
successivement au pôle végétatif depuis la première division de maturation Jusqu'au stade 8 blastomères. Le troisième lobe polaire
-1. l'ouvoir morpho/T^ne du üobe polaire.
Au début de l'embryologie expérimentale, Crampton ( I896 ) découvrit que l'ablation du lobe polaire ("délobation”) d'Ilyanassa, au stade en trèfle, empêche l'apparition d'une cellule caractéristi que au pôle mésoblastique et la formation des bandes mésoblastiques. Après délobation, les blastomères des stades 2 et 4 sont de taille
égale. Les quartettes successifs de micromères se forment, mais la cellule 4d n'a plus les caractéristiques de la cellule mésoblastique initiale: elle ressemble plutôt aux cellules entoblastiques 4a, 4b et 4c des autres quadrants. Les embryons délobés vivent assez longtemps pour former des cils et nager en rond, mais ils montrent peu de
différenciations dans les conditions de culture employées par Crampton ( 1896 ). Les résultats de Crampton ont établi l'importance des
facteiirs cytoplasmiques dans la différenciation,bien qu'il ait eu la prudence de ne pas affirmer que le lobe polaire contiendrait du
mat-^riel méso blastique prélocalisé; il a suggéré, au contraire, que la présence de la masse vitelline dans le macromère D pourrait être le facteur qui rend la cellule différente des 3 autres macromères. Nous verrons plus loin que la masse vitelline ne peut pas être considérée comme un facteur morphogène significatif.
En 1904, Wilson a effectu»^ l'opération d'ablation du lobe polaire sur le Dentale et il a obtenu des larves sans touffe apicale et sans région posttrochale. Si l'excision du lobe polaire a lieu lors de la seconde division, la région posttrochale ne se forme pas, mais la touffe apicale est présente.
Si on coupe l'oeuf en deux, perpendiculairement à l'axe primaire, la moitié végétative de l'oeuf produit un embryon normal, mais la
8.
En outre, quand l'oeuf est coupé obliquement par rapport à l'axe primaire, le développement est d'autant plus normal que la quantité de cytoplasme v<^gétatif est plus grande, Wilson en a conclu qu'il y avait une prélocalisation de matériaux cytoplasmiques différents dans l'oeuf indivis, matériaux qui sont ségrégés dans les divers blastomères au cours de la segmentation.
Le fait que le matériel indispensable à la formation de la région posttrochale est ségrégé dans le premier et le second lobe polaire, tandis que le matériel n'^cessaire à la formation de la touffe apicale est seulement localisé dans le premier lobe polaire montre l'existence de changements progressifs dans la distribution du matériel
cytoplasmique,
Hatt ( 1932 ) et Novikoff ( 1938 ) ont obtenu les mêmes résultats chez Sabellàriâ ( Annélide ),
Des expériences plus récentes de Verdonk ( 1968a ) ont montré que la centrifugation ne modifie pas les effets produits par l'excision du lobe polaire. Les facteurs morphogènes seraient, selon lui, localisés dans le cortex plutôt que dans le cytoplasme.
Des granules Peulgen positifs ont été trouvés dans la région corticale de l'oeuf indivis de Dentalium ( Timmermans et al, 1970; Geilenkirchen et al, 1970; Verdonk et al, 1971 ) et on a pensé qu'ils pourraient être importants pour la formation de la région posttrochale ou des structures adultes. Il semble, toutefois, s'agir de bactéries endosymbiotiques, qui ne jouent probablement pas de rôle dans la morphogénèse.
dans le pouvoir morphogène du lobe polaire.
Des expériences d'excision du lobe polaire ont été également faites chez le Prosobranche Bithynia ( Cather et Verdonk 1974 ); les
résultats sont semblables à ceux obtenus chez Ilyanassa.
On note la présence d'un”corps végétatif", formé de petites vésicules, dans le lobe polaire de Bithyhià; Dohmen et Verdonk ( 1974 ) ont
suggéré que ce "corps végétatif" serait responsable du pouvoir morphogène du lobe polaire.
En ce qui concerne Ilyanassa, ce ne fut que longtemps après Wilson que la valeur morphogène du lobe polaire fut analysée plus complètement ( Clement 1952 ), Employant de l'eau de mer
pasteurisée comme milieu de culture, il lui fut possible de faire vivre les embryons pendant 10 à 12 jours en laboratoire. Cinq à six jours de cultxire suffisent poiir obtenir des larves véligères.
Il est donc devenu possible de rechercher quelles sont les structures larvaires qui sont dépendantes du lobe polaire et quelles sont celles qui sont capables de se développer en son absence,
4,1, Rôle du lobe polaire dans la détermination du modèle de division Avant de discuter les stades ultérieurs du développement, il est à noter que le lobe polaire joue un rôle plus important dans la détermination du mode de division que Crampton ne l'avait pensé. Une comparaison attentive, étape par étape, de la segmentation des embryons normaux et des embryons délobés a révélé une différence qui se manifeste déjà lors de l'émission du premier quartette de micromères ( Clement 1952 ), Dans l'embryon normal, le premier
10.
Donc, la prt^sence du mat(<riel du lobe polaire dans le blastomère D provoque, d'une manière inconnue, l'apparition d'un micromère plus petit. Dans bon nombre d'autres cas, la présence de matériel du lobe modifie le modèle de division du quadrant D. Clement trouva, par
exemple, que le taux de division de la lignée 1d est retardée, dans l'oeuf normal quand on le compare avec les lignées de cellules
analogues dans les autres quadrants; de plus, la celltile 2d^^ est beaucoup plus grande que les cellules correspondantes ( 2a , 2b , 2c ) des autres quadrants.
Toutes ces caractéristiques du quadrant D disparaissent dans l'embryon délobé, et les 4 quadrants se divisent de la même manière.
Dans l'oeuf normal, la cellule 4d ( mésentoblaste ) du quatrième quartette se distingue des autres cellules ( 4a, 4b et 4c ) par sa grande richesse en mitochondries et lipides ( Clement et Lehman 1956 ) De plus, elle apparaît environ 3 heures avant les cellules
entoblastiques ( 4a, 4b, 4c ). Au contraire, dans l'embryon délobé, toutes les cellules du quatrième quartette sont riches en vitellus et semblables en apparence ( comme l'avait déjà observé Crampton ) et elles apparaissent de manière synchrone.
Il est donc évident que la présence du matériel du lobe polaire confère à la cellule 4d des caractéristiques particulières,
4.2. Rôle du lobe polaire dans l'établissement du pôle postérieur de l'embryon,
La cellule mésentoblastique 4d marque normalement le pôle postérieur du futur embryon. Puisque cette cellule caractéristique n'est pas produite dans les embryons délobés et que l'embryon ne
Il serait particiilièrement intéressant de savoir si ce pôle postérieur est prédéterminé avant la première division ou pendant celle-ci.
Dans le premier cas, le lobe polaire fusionnerait nécessairement avec un blastomère déterminé dès la fin du premier clivage; dans le second cas, ce pôle postérieur serait établi par le hasard de la fusioi du lobe polaire avec l'un ou l'autre blastomère.
Morgan ( 1936b ) a essayé de répondre à cette question en enlevant l'un des blastomères au stade en trèfle chez Ilyanàssà. Si le lobe polaire se fusionne avec un blastomère détermin»^, on devrait
s'attendre à ce que le lobe polaire et le blastomère intact le fassent dans 50^ des cas. Malheureusement, dans ces exipériences, les embryons opérés se cytolisaient presque toujours. Sur quelques centaines d'oeufs, seuls 6 survécurent au traitement, dont 4
présentèrent une fusion du lobe polaire. Cette expérience était donc peu concluante.
Verdonk ( 1968b ) a refait les mêmes expériences d'ablation de l'un des 2 blastomères sur Déntaliùm et il a trouvé que le lobe polaire
se trouve incorporé dans le blastomère restant dans 50?^ des cas. Les structures dépendantes du lobe polaire ne se développent qu'en cas d'incorporation du lobe dans un blastomère. Verdonk en a conclu que la dorsoventralité et la symétrie bilatérale sont prédéterminées dans l'oeuf insegmenté et qu'elles sont liées à matériel
morphogène présent dans le lobe polaire de Dentalium. 4.3. Les structures d»^pendantes du lobe
Dans certaines conditions favorables, l'embryon délobé donne naissance à certaines parties et tissus larvaires, mais
12.
les yeux, le pied, les statocystes, l'opercule, la coquille externe, le coeur et l'intestin. Les structures pr<^sentes dans les larves délobées sont les cils vélaires, les petits cils, une structure
stomodéale retournée, une certaine différenciation du tissu endodermique, du pigment et des fibres musculaires contractiles. On trouve fréquemment aussi une ou plusieurs masses biréfringentes de mat'^riel coquillier. Quand du tissu secrétant la coquille se développe, il ne se forme pas tine coquille externe typique.
Par son apparence générale, la larve délobée montre peu de ressemblanct avec la larve véligère. Le tissu vélaire se distribue en plusieurs masses, mais il ne possède pas l'organisation qu'il présente dans la larve véligère normale. L'évagination stomodéale semble marquer le pôle végétatif originel de l'oeuf. Il semblerait donc que, tant les mouvements morphogènes que la différenciation des parties qui servent à délimiter l'axe antério-postérieur de la larve normale, ne se
produisent pas.
Etant donné que les larves délobées se développent à la même vitesse que les contrôles, qu'elles atteignent un modèle structural assez uniforme et qu'elles restent vivantes et vigoureuses plusieurs jours après que les contrôles se sont développés en véligères, il est clair que le manque du matériel du lobe polaire résulte en une déficience spécifique de certains processus du développement.
Le développement de blastomères isolés aux stades 2 et 4 blastomères démontre que l'influence morphogène du lobe polaire est localisée dans le blastomère CD à la première division et au blastomère D à la seconde division ( Clement 1956 ).
que des larves partielles ne possédant pas les structures dépendantes du lobe. Seul le blastomère D au stade ^ donne naissance aux
structures dépendantes du lobe. Bien que les blastomères D se développent mal, on observe, dans quelques rares cas, la différen ciation d'un oeil et d*\me petite coquille externe.
Tous les blastomères, au stade 4, donnent naissance à des cils vélaires, du pigment et de l'endoderme. L'apparence générale des larves partielles des blastomères A, B et C est semblable.
Le développement de blastomères isolés indique que l'influence morphogène du lobe polaire accompagne cette structure dans le macromère D au second clivage.
Clement, en i960, a démontré que le pouvoir morphogène du lobe polaire ne se transmet pas seulement au mésentoblaste ( 4d ).
En effet, après excision de ce micromère, ni le coeur, ni l'intestin ne se forment; par contre, la larve présente im développement
presque normal du vélum, des yeux, du ganglion cérébral, du pied, de l'opercule, des statocystes, du stomodeum, de l'oesophage et de la
coquille. En 1962, ce même auteur a suivi le développement d'embryons dont on a enlevé, à différents stades, le macromère D,
Si le macromère 4D, qui contient la masse vitelline présente à
l'origine dans le lobe polaire, est excisé de l'embryon juste après la formation du micromère 4d, il y a formation d'une larve petite, mais bien différenciée. A ce stade, le macromère 4D ne joue plus qu'un rôle nutritif.
Ces expériences montrent que les structures dépendantes du lobe
sont surtout déterminées pendant la période d'apparition du troisième quartette de micromères et de la cellule mésentoblastique 4d.
14.
Quand le blastomère D est détruit au stade 4, les embryons ABC produisent des larves partiellement di^ficientes, mais il y a dans certains cas, différenciation d'un oeil. Des larves du même type se développent à partir d'embryons ABC + 1d ( le macromère 1D étant
enlevé ); dans un cas, l'identification d'une cornée rend la présence d'un oeil probable, La plupart des larves dérivant de ABC + 1d + 2d
( le macromère 2D ayant été détruit ) ressemblent à celles des 2 autres groupes; mais un certain nombre d'entre elles forment une petite coquille externe. Dans de tels cas, il doit y avoir une
détermination faible ou partielle du matériel produisant la coquille externe, les embryons ABC + 1d + 2d + 3d ( le macromère 3D ayant été ôté ) forment des larves qui, dans les meilleurs des cas, possèdent une bonne organisation bilatérale du vélum, un pied, un ou deux statocystes, tine paire d'yeux et ime coquille bien formée. Il est donc clair qu'un certain nombre de traits larvaires importants sont déterminés pendant, ou juste après, la formation du troisième quartette, mais avant l'apparition de 4d, La différenciation est d'autant meilleure que le macromère 3D est détruit plus tard. Ceci suggère la possibilité que, le gain en différenciation des
embryons ABC + 1d + 2d + 3d, comparés à ceinc du type ABC + 1d + 2d, est moins le fait de la présence d'une cellule en plus que de
l'association, pour une p'^riode plus ou moins longue, des autres cellules avec le macromère 3D. C'est-à-dire que la détermination des yeux, du vélum, du pied et de la coquille pourrait résulter d'action inductive du macromère D. Cette idée est renforcée par les
Une déficience comparable, mais affectant le statocyste droit et la partie droite du pied, se produit en ôtant le micromère 3c.
Les meilleurs embryons ABC + 1d + 2d + 3d ne forment pas de coeur et d’intestin. Ces structures semblent requérir la présence du
16.
5. Influence des micromères sur le développement embryonnaire
Les expériences de délétion ont prouvé que la plupart des micromères ont une certaine influence sur le développement embryonnaire
( Clement 1963, 1967 ).
Chacxin des micromères du premier, du second et du troisième quartette, ainsi que le blastomère 4d ont été détruits avec une épingle de verre. Dans le cas du prefnier quartette, la délétion de la entraîne l'absence de l'oeil gauche et une légère réduction du lobe vélaire gauche; la délétion de 1c entraîne les mêmes déficiences, mais du côté droit, La délétion de 1b tend à réduire la distance entre les yeux, ce qui prouverait que ce micromère donne normalement l'ectoderme qui unit les dexix yeijx, La délétion de 1d n'entraîne aucune déficience,
La délétion de chacim des 4 micromères du second quartette entraîne des résultats différents, La délétion de 2a affecte le développement du lobe vélaire gauche et du statocyste gauche, La délétion de 2b n'entraîne pas de déficience notable. La délétion de 2c entraîne de
sévères déficiences, notamment une atrophie de la coquille, l'absence de coe^ir et l'évagination du stomodeum. L'absence de 2d provoque
l'atrophie de la coquille ou son absence,
Cather ( 196? ) a montré, par des expériences de marquage au que
les dérivés du raacromère 2d forment la glande coquillère et que les dérivf^s de 2c sont incorporais dans le manteau. La délétion de 2d ou de 2c interfère avec le développement de la coquille et la délétion de ces 2 micromères entraîne son absence.
Dans le cas du troisième quartette de micromères, l'ablation de 3a
dans le développement des statocystes et du pied.
La délétion de la cellule mésentoblastique 4d provoque des anomalies viscérales, notamment l'absence d'intestin et de coeur ( Clement I960 ), Cependant, le vélum, le pied, les statocystes, le stomodeum, les yeux, l’oesophage et la coquille montrent un développement normal ou presque. Ces résultats semblent montrer que les bandes mésoblastiques, dérivées de 4d, ne joue pas de rôle inducteiir ou organisateur des dérivés
ectodermiques.
L'absence du coeur, après délétion de 2c ou de 4d, indique que ces 2 cellules doivent jouer un rôle important dans la formation du coeur. Les résultats d'isolement de blastomères et de délétion de minromères indiquent une spécificité précoce des valeurs cellulaires, avec une capacité limitée de régulation.
Il est certain que l'oeil gauche, par exemple, est normalement dérivé du quadrant A et l'oeil droit du quadrant C. Cependant, des blastomères D isolés peuvent former un oeil, et des blastomères CD isolés forment parfois une paire d'yeux. Isolées, ces cellules semblent donc capables d'outrepasser leur destinée. Bien que les yeux dérivent normalement des quadrants A et C, une combinaison ABC ne donne généralement pas naissance à des yeux. Pour qu'im embryon forme des yeux, la cellule D, avec son composant provenant du lobe polaire, doit être présente
jusqu'au moment de l'apparition du troisième quartette de micromères. Nous avons vu, cependant, que la délétion de 1d, 2d ou 3d n'empêche pas le d<^veloppement des yeux.
Ces observations suggèrent un rôle inducteur du lobe polaire pour le développement des yeux. Cela signifie que le lobe polaire, quoique
ségrégé dans le quadrant D au second clivage, fournirait un facteur essentiel à la différenciation des yeux, même si ces structures
18
apparaissent dans d'autres quadrants.
Des cas occasionnels de différenciation d'im oeil dans des larves ABC, ABC + 1d ou ABC + 1d + 2d pourraient indiquer un effet précoce
inducteur et inhabituel du quadrant D dans ces cas-là,
La différenciation de la coquille, chez Ilyahàssà, comporte des rela tions complexes, La délobation au premier clivage empêche la formation d'ime coquille externe; cependant, des masses atypiques internes de matériel biréfringent de coquille peuvent être secrétées par les embryons délobés. Ces masses ont été observées également dans des
blastomères AB isolés et A, B et C. Pour rappel, le blastomêre D isolé peut produire xme coquille externe: par conséquent, chaque quadrant a la capacité de secréter du matériel coquillier.
Cependant, les expériences de Cather ( 1967 ) indiquent que la coquille provient normalement de 2d et 2c, Donc, dans des conditions normales, les quadrants A et B sont sans doute inhibés et incapables de
différencier du matériel coquillier.
Dans d'autres expériences, Cather ( 1966 ) a trouvé que le composant ectoblastique isolé d'un embryon ne différencie pas de matériel
coquillier; mais, si l'un des macromères 3A, 3B, 3C ou 3D est laissé en combinaison avec 1'ectoblaste, il y a formation de ce matériel. De même, si lobe polaire isolé est maintenu en contact avec
l'intérieur d'tm ectoblaste isolé pendant 6 à 7 jours, l'ectoblaste peut développer du matériel coquillier. La nature de l'influence exercée sur l'ectoblaste par des macromères ou le lobe polaire maintenu en contact avec lui, est inconnue. Le résumé de tous ces
STRUCTURES NE DEPENDANT PAS DU LOBE
Cils vélaires, petits cils, structure s tomodcé=> le retournée, tissu
endodermique, pigment, fibres musculaires actives, masse biréfringente de matériel coquillier.
STRUCTURES DEPENDANTES DU LOBE
Yeux, pied, statocystes, opercule, coquille externe, coeur et intestin.
19 6, Formation du lobe polaire.
Un lobe polaire isolé au stade en trèfle ne se divise pas ( il n'a d'ailleurs pas de noyau ), mais il change rythmiquement de forme ( Korgan 1933, 1935c ). Ces changements de forme, pendant lesquels le lobe se rétrécit, ont lieu trois fois ou plus, avec une phase sphérique intermédiaire. Ils ont lieu plus lentement que les divisions dans les oeufs contrôles,
Morgan ( 1935b ) a noté également que des fragments végétatifs d'oeufs centrifugés, ne contenant pas de noyau, ou contenant seulement le
pronucleus femelle, forment un lobe polaire, mais qu'ils ne se
divisent pas. Par contre, des fragments de l'hémisphère animal, même en présence d'ian noyau, ne forment pas de lobe polaire; mais ils se divisent. Donc, la formation du lobe polaire est une caractéristique de la région végétative et ne requiert pas la présence d'im noyau ou d'une figure mitotique. Si la formation du lobe se produit normalement lors de certaines divisions cellulaires, il semble
toutefois que sa formation soit, à certains points de vue, un phénomène indépendant.
En empêchant les oeufs de s'orienter normalement par centrifugation, Morgan ( 1933, 1935a ) a pu obtenir des fragments végétatifs
dépoiirvus de vitellus. Le lobe polaire se formait néanmoins au pôle végétatif, malgré une composition différente de l'endoplasme,
Morgan a proposé que la cause de la formation du lobe polaire doit
être recherchée dans les couches périphériques ( cortex ) non affectées par le centrifugation plutôt que dans l'endoplasme,
nucléaire, une coiffe d'huile et une zone cytoplasmique, mais très peu de vitellus. Les oeufs partiellement inversés contenaient
seulement une partie de la masse polaire végétative.
Les fragments légers d'oeufs inversés formaient un lobe polaire de taille à peu près normale; ils se divisaient inégalement et, quand on les laissait se développer, ils produisaient dans 48^ des cas, des
structures dépendantes du lobe; environ 17^ d'entre eux se développaient en larves véligères reconnaissables.
Quand les oeufs sont brisés en fragments par centrifugation dans
du raffinose sans inversion, les fragments légers nucléés contiennent l'hémisphère animal de l'oeuf, puisque les oeufs d' IlySiiassà s'orientent lors de la centrifugation avec le pôle animal en direction de
l'extrémité centripète. Ces fragments animaux nucléés ont à peu près la même constitution microscopiquement visible ( lipides, vitellus, etc que les moitiés nucléées des oeufs inversés; mais, en règle générale, elles se divisent d'une manière égale, sans former de lobe polaire; environ 95''’ des larves formées ne possédaient pas de structures dépendantes du lobe. Les cas exceptionnels auraient pu contenir une
portion de l'hémisphère végétatif.
En raison de ces résultats, il devient très incertain que les plaquettes vitellines, qui normalement occupent le plus grand volume du lobe polaire, aient un rapport avec le pouvoir morphogène de celui-ci. Ce pouvoir doit dépendre d'\m matériel présent dans la masse polaire végétative, capable de résister à une force centrifuge
suffisante pour déplacer les inclusions cytoplasmiques plus volumineuses il réside probablerent dans la région corticale.
Si des oeufs d *Ilyanassà sont comprimés avant la première division,
21
Styron ( 19^'7 ) a comprim»^ des oeufs pôle à pôle au moyen d'un appareil spécial. Il a exercé cette compression avant l'apparition du lobe qui précède la première division, et l'a poursuivie jusqu'au début de la résorption du lobe polaire par le blastomère CD.
Dans ces expériences, on peut reconnaître 3 classes d'oeufs comprimés; (i) ceux qui forment un lobe polaire et se divisent inégalement,
(ii) ceux qui se divisent inégalement sans former de lobe polaire et (iii) ceux qui se divisent d'une manière égale sans former de lobe. Les deux premières classes se développent normalement. Dans la
troisième classe, au moment de la seconde division, un lobe polaire s'observe dans chaque blastomère: il se forme 2 grands et 2 petits
blastomères. Il est probable que, dans ces cas, chacune des 2 premières cellules se comportent en fait comme un blastomère CD au second
clivage. Le développement ultérieur de tels oeufs est fortement inhibé; en général, les embryons formés ressemblent aux larves délobées, mais ils sont encore moins bien développés.
Il semble, d'après ces expériences, que le fait de diviser le mat(^riel du lobe entre les deux premiers blastomères détermine de
plus grandes anomalies de développement que l'ablation du lobe entier. Styron a suggéré que l'inhibition du développement résultant d'une première division égale serait due à un dérangement du modèle
cortical de l'oeuf et/ou d'une ségrégation ooplasmique.
Conrad ( 1973 ) et Conrad et al, ( 1973 ) ont découvert des
microfi-0
laments de 30 à 50 A de diamètre, arrangés, dans un plan équatorial, dans le cytoplasme cortical de l'hémisphère végétatif des oeufs où débute la mitose de maturation.
Tout récemment, Conrad et Williams ( 1974a ) ont également observé des microtubules dans la région non corticale du lobe polaire, et constaté qu'ils disparaissent après action de la colchicine.
L'addition de la colchicine très tôt dans le développement du lobe inhibe sa formation et empêche également la cytokinèse.
Le traitement par la colchicine d'embryons plus âgés, bien qu'elle continue à inhiber la cytokinèse, n'empêche pas la constriction du lobe polaire et sa résorption.
Ces résultats suggèrent que des étapes sensibles à la colchicine sont requises pour la constriction complète du lobe polaire et pour l'initiation de la cytokinèse. Comme pour celle-ci, la formation du lobe polaire pourrait résulter de la contraction d'un anneau de microfilaments, dont la polymérisation ou l'activité serait contrôlée par les microtubules.
Les mêmes auteiirs ( Conrad et Williams 1974b ) ont aussi émis
23 7. Effets des agents chimiques sur le développement.
Les effets des agents chimiques sxir le développement d'Ilynnàssà n'ont fait l'ohjet que d'un petit nombre de rapports préliminaires.
Morrill ( 1961 a ) a traité des oeufs et des embryons avec du chlorirre de Cobalt et obtenu des malformations d'yeux et d'autres défauts. Le même auteur ( I96lb ) a induit des anomalies d'yeux par des traitements au chlorure de Lithium: absence d'un oeil ou présence d'yeux surnuméraires sur l'im ou l'autre côté de la larve. Les yeux
surnuméraires se trouvaient 2 fois plus fréquemment à droite qu'à gaucht Feigenbaum et Goldberg ( 1965 ) ont constaté que l'actinomycine D,
agissant pendant les stades précoces du développement, n'empêche pas la segmentattion et la formation d'un embryon cilié, mais inhibe le développement ultérieur. Les noyaux des embryons traités présentaient une distribution irrégulière de la chromatine et des nucléoles atypiques
Collier ( 1966 ), cherchant à lier la transcription génétique à la différenciation de structures particulières chez Ilyàhàssà, a étudié, les effets de traitements d'embryons de différents âges par l'actino mycine D. Mais, seuls des résultats préliminaires de ce travail ont été publiés. Des traitements à tous les stades Jusqu'au troisième Jour bloquent la formation des organes. Si des embryons plus âgés sont
complète des yeux; mais certaines structures comme l'estomac, la glande digestive et le coeur n'apparaissent pas.
Siu: la base de ces résultats, Collier a (établi un "programme-temps" pour la transcription génétique chez IlyëhàBsà.
Dans le cas des yeixx, par exemple, un traitement à 1 'actinomycine D au 4ème jour supprime virtuellement le développement de l'oeil, tandis que des embryons trait^^s au 5ème jour forment une paire d'yeux; les yeux n'apparaissent cependant qu'à la fin du 6ème jour.
Il n'est pas aisé de relier ces résultats à ceux de Clement ( 1952, 1962 qui a trouvé que la plupart des organes principaux de la larve véligère( y compris les yeux ) sont dépendants de la présence
du lobe polaire, mais seulement à certains stades relativement précoces. Nous avons peut-être là, un exemple d'un processus "pas à pas" de
détermination embryonnaire: action, de nature inconnue, du lobe polaire pendant les premiers jours et synthèse de RNAs le jour précédant l'apparition de l'organe en question.
La concentration d'actinomycine employée par Collier fait décroître la synthèse du DNA et des protéines, mais moins fortement que celle des RNAs. Cependant, xme concentration qui affecte la synthèse des RNAs, mais non celle du DNA et des protéines ( lO^ng/ml ) affecte aussi le processus de différenciation.
En centrifugeant des oeufs avant la seconde division de maturation, Clement ( 1935 ) a pu déplacer le fuseau méiotique hors du pôle animal. Certains de ces oeufs formaient un second globule polaire géant.
semblables, que l'étirement d'un oeuf ou d'un fragment d'oeuf est un facteur qui contribue à la division entreprise par le fuseau méiotique déplacé.
Le comportement de la surface cellulaire pendant la seconde division de matxiration et le premier clivage a été étudié par Dan et Dan
( 1942 ) en observant la distance entre des particixles de kaolins collées à la membrane. Leurs observations indiquent que, durant la seconde division de maturation, la région du pôle animal se rétrécit tandis que la région du lobe polaire s'étire; ces changements se maintiennent pendant le stade sphérique suivant. Il se produit donc un déplacement de l'aire végétative de l'oeuf vers l'aire animale pendant la seconde division de maturation. On ne sait pas si
tel déplacement a lieu pendant la 1ère division de maturation.
Le retard dans le clivage, induit par les rayons X administrés à différents stades durant le cycle mitotique, a été étudié par Cather ( 1959 ).
Butros ( 1956 ) a recherché l'effet de plusieurs inhibiteurs métaboliques sur la viscosité cytoplasmique, la rigidité de la
surface et la segmentation des oeufs,
La segmentation des oeufs d ' Ilÿâjiàssa n'est pas inhibée en présence de cyanure ( Clement 1940 ).
25.
8. Constitution chimique des oeufs d*Ilyànâssa. 8.1. Enzymes protéolytiques.
Collier ( 1954a,b, 1957a,b ) a localisé et mesuré l'activité de certaines enzymes protéolytiques ( glycylglycine dipeptidase, aminotripeptidase, alanyl-1-histidine dipeptidase, cathepsine II, pepsine, trypsine, alanylglycine dipeptidase, cathepsine III et leucine aminopeptidase ) dans les oeufs d *Ilyànassà. Cette activité augmente surtout au 5ème jour ( stade où commence la formation des organes ) et cette augmentation se poursuit jusqu'au lOème jour
( larve véligère ) où elle atteint 700^- de la valeur trouvée dans les oeufe indivis.
Collier ( 1957a ), étudiant l'activité de 1'alanylglycine dipeptidase pendant le développement d'Ilyànàssa, a comparé cette activité
dans l'oeuf entier, dans AB isolé, CD, C et D et dans le lobe polaire isolé au premier clivage. Il a constaté que l'activité de l'enzyme est proportionnelle au volume du protoplasme hyalin. Il n'a trouvé aucune relation entre la distribution de l'enzyme et la ségrégation du matériel du lobe au 1er et 2d clivage.
Le volume du protoplasme hyalin, déterminé pour chaque entité mentionnée, exprimé en pourcentage de la quantité de protoplasme hyalin dans l'oeuf entier est le suivant: lobe polaire; 16,5^; oeuf délobo; 84,2^«; AB: 42, lf.; CD: 57,8/.; C: 20,3/ et D: 39,8/.
Pendant la période de différenciation des organes, entre le 3ème
et 5ème jour, 5 bandes disparaissent et f> autres apparaissent.
Freeman ( 1971 ) a comparé l'activité de certaines isoenzymes
( lactate déshydrogénase, malate déshydrogénase, glucose-6-phosphate déshydrogénase, phosphatase alcaline et une estérase non spécifique ) dans les embryons délobés et normaux d*Ilÿànàssa. Il a constaté que l'ablation du lobe interfère avec le développement de certaines isoenzymes ( phosphatase alcaline et estérase ), Certaines bandes d'activité enzymatique étaient fortement réduites ou nulles tandis que d'autres apparaissaient normales: le lobe polaire serait donc indispensable à l'activation de certaines enzymes spécifiques,
8.2. Synthèse des protéines chez Ilyanassa.
Collier et Schwartz ( 1969 ) ont analysé les synthèses protéiques chez Ilyahàssa. Ils ont essayé de résoudre le problème de la perméar bilité en mesurant les pools d'acides aminés et le taux de pénétration
14 14
de leucine C , ainsi que l'incorporation de leucine C dans les protéines. La pénétration a été déterminée en mesurant le pool de
14 14
leucine C et la quantité de leucine C incorporée pendant un puise de 2 heures.
L'incorporation dans les protéines est très forte quand la pénétra tion de leucine C^^ est petite; les pools d'acides aminés sont soit constants, soit décroissants ( 3-4 Jours ), Collier et Schwartz concluent de leurs observations que l'incorporation est faible pendant les Jeunes stades, mais qu'elle augmente dans les stades ult «^rieurs,
Tyler et Clement ( 19^7 ) ont mesur(^ l’incorporation d'acides aminés radioactifs dans des lobes lobes polaires isolés et dans des embryons délobés. La somme de ces 2 composants est égale à la valeur trouvée dans l'oeuf entier, ce qui suggère l'existence d'une synthèse
protéique normale dans le lobe polaire isolé.
Comme l'activité se prolonge pendant au moins 24 heures bien que le lobe polaire soit dépourvu de noyau, des RIîAs messagers à longue vie doivent y être présents. La faible activité du lobe polaire isolé pourrait être due au fait que celui-ci est bourré de vitellus.
Au moyen du microscope électronique, Geuskens ( 1969 ) a montré la présence de polysomes dans le lobe polaire. Des lobes polaires isolés avaient été incubés pendant 2 heures en présence de phényalanine
et de leucine H^, puis étudiés par autoradiographie à haute
résolution. Si les grains d'Argent localisés à proximité immédiate des polysomes sont bien les témoins d'une synthèse à ce niveau, les résultats indiquent que les acides aminés marqués sont incorporés dans des chaînes polypeptidiques formées par les polysomes.
Plus récemment, Geuskens et de Jonghe d'Ardoye ( 1971 ) ont observé une incorporation d'uridine tritiée dans le lobe polaire isolé, Mirkes ( 1970 ) a observé une incorporation d'acides aminés dans les oeufs vierges d'Ilyànàssb, La pénétration et l'incorporation des
acides aminés augmentent 15 min, après la fécondation. Un net accroissement dans le taux de synthèse devient évident après la fécondation. Il a été particulièrement bien démontré par des expériences de "précharge": des oeufs préincubés en présence de leucine ont été lavés et fécondés; ces oeufs ont montré un accroissement de la traduction après fécondation.
29 de polysomes présents pendant le développement. Les oeufs vierges possèdent déjà une petite population de polysomes actifs dans la synthèse protéique. La fécondation induit une augmentation du nombre de ces polysomes. Au stade véligère, l'activité synthétique est multipliée par 5.
La synthèse protéique est parallèle à celle des RNAs. Un traitement à la puromycine pendant les stades Jeunes bloque la plupart des
synthèses protéiques et bloque aussi la segmentation de façon légèrement réversible.
Collier ( 1961 b ) a également étudié l'effet de l'ablation du lobe polaire sur la synthèse de protéines. Il a mesuré la synthèse
14 protéique par l'incorporation de leucine C
La délobation au premier clivage interfère avec la capacité de 1' 14
embryon d'incorporer de la leucine C dans les protéines et il a été conclu que la diminution des synthèses protéiques dans l'embryon délobé n'est pas due à sa taille plus petite que celle de l'embryon normal, i'ar contre, Teitelman ( 1973 ) n'a pas observé de différences dans le profil des protéines marquées dans les embryons délobés
Jusqu'au 5ème jour. Des études préliminaires lui ont montré que le spectre des protéines marquées du lobe polaire est identique à celui des embryons délobés et des embryons normaux dans les premiers
stades du développement. Ces observations suggèrent que les facteurs morphogènes associés au lobe polaire ne doivent pas être recherchés parmi les protéines nouvellement synthétisées.
Toutefois, Donohoo et Kafatos ( 1973 ) ont observé des différences dans les protéines synthétisées par les descendants des 2 premiers blastomères d'Ilyànâssà. Après environ 4 heures de séparation, la
8.3. Acides nuclf^iques.
La principale parti cul arit'^ biochimique du lobe polaire est une
concentration en nucl^^otides plus élevée que dans les autres régions.
Berg et Kato ( 1959 ) ont trouvé que les lobes polaires isolés d*Ilyànàssà contiennent, par imité de volume, 75^ en plus de
substances acido-solubles présentant le spectre d'absorption typique des purines et pyrimidines. Au stade 2, le blastomère CD en contient
47/j de plus que AB. Ces composés acido-solubles sont surtout des polynucléotides. Une distribution parallèle du vitellus et du matériel acido-soluble suggère l'association d'im ou plusieurs nucléotides avec le vitellus.
Collier ( 1960a ) a trouvé une concentration plus élevée en Phosphore total, acido-soluble et phospholipides dans le lobe polaire et le blastomère CD que dans l'oeuf entier ou le blastomère AB. Sur la base de ces résultats et d'autres. Collier ( 1965a ) a proposé que la déficience de la différenciation dans les embryons délobés
serait le résultat d'ime déficience en précurseurs des acides nucléiques, et que cette déficience produirait une répression
sélective de la synthèse de RNA informationnel.
S'il en bien ainsi, il serait surprenant que les précurseurs d'acides nucléiques soient associés avec le vitellus du lobe polaire, puisque des fragments végétatifs nucléés d'un oeuf duquel la plus grande partie du vitellus a été enlevée, peut former un lobe polaire et différencier des structures dépendantes du lobe ( Clement 1968 ),
8.3.1. Acides ribonucléiques
Employant des méthodes microchimiques quantitatives. Collier ( 1958, 1960b ) a trouvé que la teneur en RNA était plus élevée dans AB
à celle du blastomère CD. Il n'y aurait pas de RNA dans les plaquettes vitellines,
La distribution de RNA suit un gradient antéro-postérieur et il n'existe pas de corrélation entre la concentration en RNA et la ségrégation des composants mésodermiques dans le blastomère CD.
Collier ( 1961a ) a étudié la synthèse du RNA et des protéines dans l'embryon normal d'Ilÿàhassà. Il se produit une incorporation
32
importante de P dans le RNA avant la brusque montée d'incorporation qui a lieu à la fin du troisième jour, ISie corrélation étroite a été trouvée entre l'incorporation du P dans le RNA et celle de la
leucine dans les protéines ( Collier 196la ). Tant les RNAs que les protéines sont synthétisés antérieurement, mais il n'y a pas de net accroissement avant la gastrulation, La période de synthèse ihtensivè de protéines et de RNA a lieu après la détermination embryonnaire et juste avant le début de la différenciation histologique,
L'actinomycine D, qui bloque la synthèse des RNAs, permet le développement jusqu'à la gastrulation. Collier ( 1966 ) a montré
qu'il existe une période critique précédant le développement de chaqu organe, où le traitement à l'actinomycine inhibe spécifiquement
le développement de cet organe. Il a conclu que la segmentation et la gastrulation ne requièrent pas de transciption du génome, mais que ce dernier n'est pas complètement réprimé pendant ces premiers stades,
Un RNA qui a la même composition en bases que le DNA ( dRNA ) a été séparé par élution sur colonne d'albumine méthylée. Ce RNA est
relativement stable ( Collier 1965b ). Ce mRNA ( RNA messager ),
a été séparé d'embryons où débute la différenciation ( 5 jours à 19°C Suivant Collier, une synyhèse du mRNA a aussi été observée dans un
embryon de 3 jours, avant que les f^bauches d'organes n'apparaissent.
Davidson et al, ( 19b5 ) ont constata que l'ablation du lobe polaire au 1er clivage entraîne une diminution du taux de synthèse des RNAs, qui devient décelable l8 heures après le 1er clivage. Ceci suggère que le cytoplasme du lobe polaire poumait diriger l'activation génétique pendant l'embryogénèse précoce.
Collier et Weinstein ( 1968 ) ont suivi la synthèse du RNA riboso- mial et du dRNA pendant l'embryogénèse d'Ilyàhàssà. Ces RNAs sont déjà présents au stade 4 et on les retrouve à tous les stades suivants. Le tatix maximum de synthèse de rRNA a lieu 1 jour après la gastrulation, tandis que le taux maximum de synthèse des dRNAs coïncide avec la gastrulation.
Collier et Yuyama ( 1969 ) ont extrait et fractionné par chromato graphie sur colonne MAK le RNA d'embryon d'Ilyanàssa pendant les preMers stades et après 5 joiirs d'embryogénèse. Les 2 stades
étudiés contenaient approximativement le même porircentage de RNA 43 ( 14;" ), 53 ( 1,2^4 ) et rRNA ( 83,8^- ). Du RNA tritié, synthétisé par des embryons de 5 jours, a été séparé par chromatographie sur colonne MAK; les RNAs de haut poids moléculaire ont ensuite été caractérisés par hybridation RNA-DNA. Trois fractions de RNA à
haut poids moléculaire contiennent du dRNA. Ces dRNA sont différents par leur vitesse de marquage à l'uridine et par leur degré
Koser et Collier ( 1971 ) ont mesuré le poids moléculaire et la thermosensibilité du rRNA d *Ilyànàssa.
Le rRîLi 26S est sensible à la chaleur, à l'urée et à la privation
de Ce précurseur du rRNA l8S se décompose en 4 fragments de
tailles distinctes, quand il est soumis à la chaleur: il donne respectivement, par molécule de 263, deux composants de l8S
( P.M. 1,37.10^ + 0,004.10^) et 1 à 2 composants 7S ( P.M, 0,71.10^
+
0,
002.
10^ ),
Les mêmes auteurs ( Koser et Collier 1972 ) ont ensuite caractérisé le précurseur du rRNA d'Ilyanàssà.
Les embryons synthétisent un RNA de haut poids moléculaire
rapidement marqué, dont la quantité diminue au cours du temps, à mesxire que celle du rRNA natif augment-e. Ce RNA rapidement marqué
serait le précurseur ribosomial dont le P.M. serait de 2,4 à 2,5.10^D, Ils ont aussi isolé une molécule de 1,8.10^D, qui est produite au même taux, et qui serait sans doute un intermédiaire de la synthèse du RNA 263.
Collier ( 1971 ) a estimé le nombre des cistrons rRNA par la réaction d'hybridation RNA-DNA. Il a trouvé 1,58.10^ cistrons pour la teneur diploïde en DNA des cellules somatiques,
8.3.2. Acide désoxyribonucléique.
Une quantité anormalement élevée de DNA a été dosée dans l'oeuf vierge d'Ilÿanassa ( Collier et Mc Cann Collier 1962 ).
La comparaison de la quantité de DNA par cellule, dans l'embryon à 25 cellules ( stade où commence la gastrulation ) avec celle
trouvée dans l'oeuf, montre que du DNA commence à être néosynthétisé à ce stade; la quantité de DNA présent dans l'embryon est cependant encore excédentaire ( 5 fois trop ) par rapport à la quantité
La localisation nucl'^aire ou cytoplasmique de ce DNA excédentaire n'a pas '^té précisée.
Collier ( 1963 ) a encore constaté que l'uridine constitue un bon précurseur pour la synthèse du DNA chez l'embryon d*Ilyémassa et a proposé qu'elle pourrait jouer un rôle dans la régulation des
synthèses de RNA et de DNA. En effet, entre le second et le sixième jour de développement, l'embryon est capable d'utiliser l'uridine
poxir la synthèse du DNA; des taiix variables d'accumulation de l'uridine et de la thymidine dans le pool des nucléotides s'observent à différents stades du développement.
Davidson et al, ( 1971 ) ont présenté un profil des séquences répétitives chez Ilyànàssà, basé sur des mesures de cinétique de réassociation de DNA,
Ils ont trouvé que le DNA d'Ilyâhàssà ( dont l'estomac, le pied, et d'autres parties extérieures avaient été enlevés ) consiste en 38^ de séquences répétitives; au moins 12^ des séquences
répétitives ont environ 20 répétitions par séquence; au moins 157^ des séquences répétitives ont environ 1000 répétitions par séquence
et l8^i d'un composant qui se réassocie extrêmement rapideraenif. Ce composant contiendrait soit des régions à homologies internes,
Le problème central de l'embryologie actuelle est celui de la régulation de l'activité g^^n^^tique pendant le d(^veloppement. Kous aimerions savoir comment certains gènes s'expriment dans une
cellule et pas dans xme autre.
Il semble clair que l'un des mécanismes de la régulation gén<^tique est une distribution différentielle des facteurs
cytoplasmiques pendant le processus de segmentation.
Le grand avantage de l'oeuf d'Ilyanassa est que, l'un ou un ensemble de ces facteurs cytoplasmiques, est presque complètement
s<«gr<^gé dans le lobe polaire au moment de la première division. Kous sommes donc en mesure, non seulement d'‘^tudier les effets de l'ablation du lobe polaire, mais aussi d'étudier celui-ci à l'état isolé.
Nous nous sommes donc attaché à contribuer à l'étude du pouvoir morphogène du lobe polaire, en étudiant sa morphologie, sa cytochimie ultrastructurale et les synthèses de protéines et d'acides nucléiques par autoradiographie photonique et à haute
résolution. Nous avons également étudié toute l'oogénèse d'Ilyanassa pour tenter de comprendre l'évolution des organites subcellulaires et leur ségr^^gation ultérieure.
Feu d'études ultrastructurales ont ét« faites sur Ilyanassa. En ce qui concerne l'oogénèse, Taylor et Anderson ( 1969 ) ont décrit les différents types d'oocytes présents dans l'ovaire.
La première description au microscope électronique du lobe polaire a été faite par Crowell ( 1964 ). Ensuite, d'autres auteurs se sont également attachés à décrire la structure fine des oeufs d'Ilyanassa en étudiant plus particulièrement la distribution des ribosomes
36.
D'autres auteurs enfin, ont f^tudif^ la formation du lobe polaire au microscope électronique ( Conrad 1973; Conrad et al. 1973;
Conrad et Williams 1974a,b ). Rappelons que Geuskens ( 1969 ) a mis en évidence, au microscope électronique, des polysomes actifs dans la synthèse protéique, dans les lobes polaires isolés d*Ilyanassa
37.
Les escargots marins Ilyanassa obsoleta proviennent du Supply Department, Marine Biological Laboratory, Woods Hole,
Massachussetts, et sont maintenus dans un aquarium où l'eau de mer est constamment refiltrée. Ils sont nourris deux fois par semaine avec des praires ou des morceaux de poisson. La température de la pièce est de l8-20°C et ils sont éclairés 12 heures par jour.
Pour l'^^tude de l'oogénèse, l'animal est disséqué: sa coquille est d'^^bord cassée dans un étau, puis on coupe l'extrémité du tortillon où se trouvent la gonade et une partie de la glande digestive.
Les animaux sont gonochoriques et les sexes se reconnaissent très difficilement.
Les oeufs fécondés ( entre 40 et 100 ) sont pondus dans vin cocon rempli d'vm liquide nutritif albumineux où nageront les embryons éclos ( voir photo 2 ).
Après avoir rincé, à plusieurs reprises, les capsules choisies et les avoir essuyées sur un papier filtre pour les débarrasser des
organismes contaminateurs, on ouvre au scalpel l'une des extrémités d'une capsule. Les oeufs sont ensuite libérés par pression douce de la capsule au moyen de fines pinces.
?. Microscopie photonique.
1. Morphiolo^^ie r/'n''nilfi.
Les pièces sont fixf^es pendant une heure dans le Zenker et ensuite rincées à l'eau courante pendeuat toute ime nuit.
Elles sont ensuite déshydratées et enrobées dans de la paraffine. Puis les blocs sont débités en tranches de 10 et les coupes sont déposées sur des lames albuminées.
Les lames sont ensuite déparaffinées et réhydratées avant d'être colorées par l'une des méthodes suivantes; Ilnna ( vert de méthyle- pyronine \ Feulgen, PAS ( Periodic Acid Schiff ), quinacrine et acridine orange. Ces deux dernières colorations sont observées au microscope à fluorescence.
2.2. Autoradiographie
Les fragments d'ovaire sont mis en culture dans milieu convenable ( Jones 1066 ) en présence des différents précurseurs radioactifs; la radioactivité du milieu est de 10 *iCi/ml.
Les précursevirs employés sont; -Thymi d i ne - 6-H -Uridine-5-H^ -L-Lysine-4,5-T(n) 5 Ci/mM 29,8 Ci/mM 4,6 Ci/mM
The Radiochemical center Amersham
39
Des digestions enzymatiques ont été effectuées sur les coupes:
- DNAase ( 0,1 mg/ml ) dans du MqCl2 M/300 pendant 1 h.30, à 37°C. - KNAase ( 0,2 mq/ml ) dans de l'eau à pH 6,ü pendant 1 h.30, à 37®C. Les lames sont ensuite recouvertes d'émulsion Ilford L4 diluée de moitié, et mises à exposer pendant 6 à 11 jours. Elles sont ensuite développées à l'Amidol et colorées a l'Unna.
Des coupes de 2,5 pm ont également été faites dans des fragments d'ovaire inclus dans l'Araldite ( méthode décrite plus loin ) et ont donné de meilleurs résultats quant aux images obtenues.
3. Microscopie électronique
3.1. Morphologie ultrastructurale
3.1.1. Fixation
Des fragments d'ovaire, des oeufs indivis et des embryons au stade en trèfle ont été fixés dans une solution de glutaraldéhyde à 1,5% dans du tampon au phosphate de Sttrensen 0,1 M ( pH 7,3 ) pendant
15 min. à 4°C. Les différentes pièces sont ensuite lavées pendant une nuit dans le tampon et postfixées le lendemain avec du
tétroxyde d'Osmium à 1% toujours tamponné de la même façon. 3.1.2. Inclusion
Après un bref rinçage à l'eau distillée, les pièces sont déshydratées dans des bains d'alcool éthylique à concentration croissante et
3.1.3, Coupes et coloration
Les coupes sont obtenues à l’aide d'un ultrotome Reichert muni de couteaux de verre ou de diamant. Elles sont directement recueillie sur des grilles de Cuivre à 150 trous recouvertes d'un film de
Formvar» Elles sont contrastées par l'acétate d'Uranyle à 5%
dans du tampon de Michaelis ( Kellenberger et al.1958 ), et par le citrate de Plomb suivant Reynolds ( 1963 ). Les grilles reçoivent
O
ensuite une couche de Carbone d'environ 70 A avant d'être examinées au microscope électronique A.E^I., type EM6B,
3.2. Cytochimie ultrastructurale 3.2.1, Fixation
Le matériel est fixé à 4°C soit à la glutaraldéhyde pendant 15 min., soit à la paraformaldéhyde à 2%, pendant 30 min. dans du
tampon de SOrensen. Les pièces sont lavées dans ce tampon pendant une nuit.
3.2.2, Inclusion
On procède ensuite à l'inclusion dans le Glycol-Méthacrylate suivant la technique de Leduc et Bernhard ( 1967 ),
3.2.3, Traitement des coupes
Les coupes ultrafines sont recueillies sur le baquet de 1'ultrotome au moyen d'anneaux en plastique, selon la technique de Marinozzi
( 1964 ) , puis mises à flotter à 37°C sur les différentes solutions d'enzyr:;es ou les solutions témoins correspondantes;
- Pepsine ( Sigma 1:10.000 ) a 0,1% dans HCl 0,1N pendant 30 min. ou une heure.
- Ribonucléase ( Sigma, type 1-A, 5x cristallisée ) à 0,1% pendant 1 heure ou 0,5% pendant 2 heuresjdans de l'eau distillée ajustée à pH 6,8
- Désoxyribonucléase ( Worthington Biochemical Corp. D7AB ) à 0,1% dans du MgCl2 0,03M pendant 3 heures.
Les coupes rincées soigneusement puis recueillies sur des grilles,sont contrastées avec de l'acétate d'Uranyle et du citrate de Plomb
( 15 sec.) comme nous l'avons décrit plus haut.
41.
3.3. Autoradiographie
Les fragments d'ovaire sont mis en culture dans un milieu convenable ( Jones 1966 ) en présence des différents précurseurs radioactifs: - L-Lysine-4,5-H^ (n ) , 19 Ci/mM
- 5-H-Uridine, 25 Ci/mM The Radiochemical Center
Amersham - méthy1-H-Thymidine, 17 Ci/mM ,
La radioactivité du milieu est de 100 yCi/ml et les temps d'incorpo ration sont de 6 h. et 24 h.
Les fragments sont ensuite fixés dans la glutaraIdéhyde à 1,5%
dans du tampon Sttrensen pendant 15 min. à 4°C et rincés pendant une nuit dans le tampon.
Les fragments traités par la thymidine radioactive
sont lavés à la tnymidine non radioactive ( 1 mq/ml ).
Après une heure de surfixation à 1' OsO^ ( à 1% dans le tampon fe SOrensen ), les pièces sont déshydratées et incluses dans l'araldite comme nous l'avons décrit plus haut.
Les coupes ultrafines sont déposées au moyen d'anneaux en plastique sur des lames recouvertes d'un film de Collodion.
Les lames sont ensuite recouvertes d'émulsion Ilford diluée 5x et
elles sont mises à exposer pendant des temps allant de 1 à 3 mois.
Elles sont ensuite développées au Microdol X, contrastées a l'acétate d'Uranyle et au citrate de Plomb ( 8 min. ) suivant la technique
habituelle. Les coupes sont recueillies sur des grilles de Cuivre à 200 trous en décollant le film de Collodion de la lame.
Elles sont finalement carbonnées et observées au microscope électronique.
4. "Coloration"3 1'actinomycine D tritiée
Des fragments d'ovaire fixés à la paraformaldéhyde et inclus dans le Glycol-Méthacrylate sont sectionnés en tranches de 2,5 .pm. Ces coupes sont déposées sur des lames gélatinées et plongées dans
1'actinomycine D tritiée ( 5 pCi/ml ) pendant 1 heure ( Brachet et Ficq 1964 Elles sont ensuite rincées à l'eau courante pendant une heure et
séchées avant de couler l'émulsion. Lés lames ont expose 15 jours et ont été développée^ à l'amidol et colorées a l'Unna.
La même coloration a été essayée à l'échelle de la microscopie
