Etude des fonctions mitotiques du domaine amino-terminal de CENP-A

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amino-terminal de CENP-A

Damien Goutte-Gattat

To cite this version:

Damien Goutte-Gattat. Etude des fonctions mitotiques du domaine amino-terminal de CENP-A.

Autre [q-bio.OT]. Université de Grenoble, 2011. Français. �NNT : 2011GRENV079�. �tel-00716378�

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DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE GRENOBLE

Spécialité : Biologie cellulaire et moléculaire

Arrêté ministériel : 7 août 2006

Présentée par

Damien G ^OUTTE -G ^ATTAT

Thèse dirigée par Stefan D

préparée au sein du laboratoire I

U823

et de l’École Doctorale Chimie et Sciences du Vivant

Étude des fonctions mitotiques du domaine amino-terminal de CENP-A

Thèse soutenue publiquement le 16 décembre 2011, devant le jury composé de :

Dr. Stefan D IMITROV

Institut Albert Bonniot, Grenoble, directeur de thèse

Pr. Hans G EISELMANN

Institut Jean Roger, Grenoble, président

Dr. Marie-Josèphe G IRAUD P ANIS

Laboratoire de Biologie et Pathologie des Génomes, Nice, rapporteur

Dr. Pierre J ALINOT

Laboratoire de Biologie Moléculaire de la Cellule, Lyon, rapporteur

Dr. Marie-Noëlle P RIOLEAU

Institut Jacques Monod, Paris, examinateur

Dr. Dimitrios S KOUFIAS

Institut de Biologie Structurale, Grenoble, examinateur

Résumé

Le variant d’histone CENP-A est le facteur responsable de la détermination épigéné- tique du centromère. Il permet le recrutement de nombreuses protéines centromériques, et constitue ainsi la brique fondatrice du kinétochore. Il possède un domaine amino-terminal non structuré dont la fonction précise reste encore à élucider, bien qu’il soit déjà établi chez certaines espèces que ce domaine est requis pour le bon fonctionnement du cen- tromère et conséquemment le bon déroulement de la mitose. Nous avons construit des lignées cellulaires humaines exprimant stablement diverses formes mutantes de CENP-A, qui nous ont permis de réaliser des expériences de pseudogénétique en supprimant l’ex- pression de la protéine CENP-A endogène. Nous observons une augmentation drastique du taux de défauts de ségrégation des chromosomes et de cellules plurinucléées dans des cellules exprimant uniquement le domaine globulaire de CENP-A, ce qui est en accord avec les données de la littérature et confirme l’importance du domaine amino-terminal. Un phénotype similaire est observé dans des cellules exprimant une protéine CENP-A entière mais dont le domaine amino-terminal n’est pas phosphorylable. Nos résultats montrent l’implication de la phosphorylation de la sérine de CENP-A dans le bon déroulement de la mitose, et suggèrent que la fonction mitotique du domaine amino-terminal est centrée sur cette seule phosphorylation.

Mots-clés

chromatine, variant d’histone, mitose, phosphorylation

Signalement de la thèse en langue anglaise

Title

Investigating Functions of CENP-A N-tail in Mitosis

Abstract

The histone variant CENP-A is the epigenetic factor responsible for centromere deter- mination. It allows the recruitment of a handful of centromeric proteins, and thus acts as the primary foundation for the kinetochore. It comprises an unstructured amino-terminal domain to which no precise function has yet been assigned, although it is established in some species that the mere presence of that domain is required for proper centromere func- tion and thus successful completion of mitosis. We have established several human cell lines stably expressing GFP-tagged CENP-A constructs, allowing us to perform pseudoge- netic experiments by siRNA-mediated silencing of the endogenous CENP-A. Our results show a dramatic increase of mitotic defects and plurinuclear cells when cells express only the globular domain of CENP-A; this is in accordance with the litterature and confirms the importance of the amino-terminal tail. More importantly, a similar increase of mitotic defects is observed when cells express a full-length, but non-phosphatable, CENP-A. Our results show the involvement of the phosphatable serine 7 of CENP-A in the successful completion of mitosis, and may suggest that the role of the whole amino-terminal tail of CENP-A could be reduced to this single phosphorylation event.

Keywords

chromatin, histone variant, mitosis, phosphorylation

Je remercie en premier lieu Stefan Dimitrov de m’avoir accueilli toutes ces années dans son équipe et d’avoir supervisé ce travail de thèse.

Je remercie chaleureusement tous les membres de l’équipe n

4 ; particulièrement Fa- bienne Hans , qui a guidé mes premiers pas dans cet univers. Les anciens membres de l’équipe, que j’ai vu partir avec une pointe de regret, sont pleinement concernés.

Je remercie encore les enseignants des UE BIO110, BIO121, BIO361 et BIO421 avec qui j’ai effectué mes services de moniteur et d’ATER au cours des quatre dernières années.

Merci à Axelle pour nos nombreuses discussions et le soutien mutuel que nous nous sommes apportés.

Un remerciement tout particulier à Patrick ; c’est gràce à vous que tout cela a été possible en premier lieu, je ne l’ai pas oublié.

Une pensée pour vous, Djessy, Yan et Joey. Il a suffi que je m’absente le temps de faire quelques études — à peine dix ans — pour que vous deveniez des grands derrière mon dos. Aux yeux de votre oncle vous resterez probablement « ses petits » pour encore une bonne dizaine d’années.

iv

Table des figures . . . vii

Liste des tableaux . . . viii

Liste des abbréviations . . . ix

I Introduction 1 1 La chromatine 2 1.1 Le nucléosome . . . . 2

1.1.1 Les histones . . . . 3

1.1.2 La particule de cœur . . . . 5

1.1.3 Le chromatosome . . . . 6

1.2 Niveaux d’organisation supérieurs . . . . 6

1.2.1 Le nucléofilament . . . . 7

1.2.2 La fibre de 30 nm . . . . 8

1.2.3 Le chromosome mitotique . . . 10

1.3 Dynamique chromatinienne . . . 11

1.3.1 Facteurs de remodelage . . . 11

1.3.2 Modifications post-traductionnelles des histones . . . 12

1.3.3 Variants d’histones . . . 14

2 La mitose 18 2.1 Déroulement et régulation de la mitose . . . 18

2.1.1 Déroulement de la mitose . . . 18

2.1.2 Régulation de la mitose . . . 19

2.2 Le fuseau mitotique . . . 22

2.2.1 Les microtubules . . . 22

2.2.2 Les centrosomes . . . 23

2.2.3 Le kinétochore . . . 24

2.3 Mouvements des chromosomes . . . 25

2.3.1 Accrochage au fuseau mitotique . . . 25

2.3.2 Congression . . . 26

2.3.3 Ségrégation . . . 27

2.3.4 Le point de contrôle du fuseau mitotique . . . 28

3 La chromatine centromérique 31 3.1 Détermination épigénétique du centromère . . . 31

3.2 Structure de la chromatine centromérique . . . 32

3.3 Chromatine centromérique et transcription . . . 35

3.4 Le variant d’histone centromérique CENP-A . . . 35

v

3.4.1 Structure et conservation . . . 35

3.4.2 Maintenance de CENP-A aux centromères . . . 36

3.4.3 CENP-A et l’assemblage du kinétochore . . . 39

3.4.4 Fonctions extra-mitotiques . . . 40

3.4.5 CENP-A et pathologie . . . 40

3.4.6 Le domaine amino-terminal . . . 41

II Matériels et méthodes 44 4 Matériels et méthodes 45 4.1 Construction des plasmides . . . 45

4.1.1 PCR . . . 45

4.1.2 Construction de GFP-CENP-A et dérivés . . . 46

4.1.3 Construction de GFP-H3-CENP-A et dérivés . . . 47

4.2 Construction des lignées cellulaires . . . 47

4.3 ARN interférence contre CENP-A . . . 48

4.4 Immunofluorescence . . . 48

4.5 Préparation d’extraits protéiques nucléaires . . . 49

4.6 Immunoblots . . . 50

4.7 Préparation d’extraits d’ARN poly-adénylés . . . 51

4.8 RT-PCR . . . 51

III Résultats et discussion 52 5 Résultats 53 5.1 Introduction . . . 55

5.2 Results . . . 58

5.2.1 A CENP-A tail is required in mitosis . . . 60

5.2.2 CENP-A tail phosphorylation is required in mitosis . . . 61

5.2.3 Localization of mitotic checkpoint proteins . . . 63

5.2.4 CENP-A tail phosphorylation is required for CENP-C localization . 65 5.3 Discussion . . . 67

5.4 Acknowledgements . . . 70

5.5 Supplementary figures . . . 70

6 Discussion 75 6.1 De la validité des résultats . . . 75

6.2 De l’importance du domaine amino-terminal de CENP-A . . . 76

6.3 Du rôle de la phosphorylation de CENP-A . . . 78

6.4 Des perspectives . . . 80

A Autres publications 81

B Bibliographie 100

1.1 Le nucléosome . . . . 3

1.2 Les histones de cœur . . . . 4

1.3 La particule de cœur du nucléosome . . . . 5

1.4 Le nucléofilament et la fibre chromatinienne . . . . 7

2.1 Déroulement de la mitose . . . 19

2.2 Structure du kinétochore . . . 24

2.3 Attachements des kinétochores au fuseau mitotique . . . 29

3.1 Organisation de l’ADN centromérique . . . 32

3.2 Organisation de la chromatine centromérique . . . 34

3.3 Conservation des protéines CenH3 . . . 36

5.1 CENP-A NH

-tails are highly divergent . . . 58

5.2 CENP-A NH

-tail is required in mitosis . . . 59

5.3 CENP-A phosphorylation is required in mitosis . . . 62

5.4 Localization and behavior of checkpoint proteins . . . 64

5.5 Localization of CCAN anchor proteins . . . 66

5.6 Role of CENP-A phosphorylation in mitosis . . . 68

5.7 Localization of GFP-CENP-A fusions . . . 70

5.8 Duration of mitosis in GFP-CENP-A cell lines . . . 71

5.9 SAC function in GFP-CENP-A cell lines . . . 71

5.10 Localization of CENP-B . . . 72

5.11 Localization of ZWINT . . . 72

5.12 Localization of Bub1 . . . 73

5.13 Localization of INCENP . . . 74

vii

4.1 Amorces utilisées . . . 46 4.2 Anticorps primaires. . . 49 4.3 Anticorps secondaires. . . 50

viii

ADN acide désoxyribonucléique ADP adénosine diphosphate

APC/C anaphase-promoting complex/cyclosome ARN acide ribonucléique

ATP adénosine triphosphate BSA bovine serumalbumin CAD CENP-A distal complex CATD CENP-A targeting domain

CENP-A

CENP-A nucleosome associated complex CCAN constitutive centromere-associated network CPC chromosomal passengers complex

CREST calcinosis, Raynaud’s phenomenon, esophageal dysmotility, sclerodactyly, telangiectasia

dNTP désoxynucléotide triphosphate END essential N-terminal domain GFP green fluorescent protein γ-TURC γ-tubulin ring complex HAT histone acétyl transférase HDAC histone déacétylase HFD histone fold domain

H(K)MT histone (lysine) méthyl transférase KMN Knl1–Mis12–Ndc80

MCAK mitotic-centromere-associated kinesin MCC mitotic checkpoint complex

MMLV Moloney murine leukemia virus NCP nucleosome core particle

PARG poly(ADP-ribose) glycohydrolase PARP poly(ADP-ribose) polymérase PBS phosphate buffer saline

PCM pericentriolar material PCR polymerase chain reaction

ix

PRMT protein arginine methyltransferase SAC spindle [assembly] checkpoint SDS sodium dodecylsulfate

shRNA short hairspin RNA

siRNA short interfering RNA

SVF sérum de veau fœtal

Introduction

1

start where the last man left off.

— Thomas E DISON

Chapitre 1

La chromatine

La chromatine est la forme sous laquelle se présente le matériel génétique dans le noyau des cellules eucaryotes. Elle a été identifiée en 1881 par Walther Flemming comme une substance nucléaire dotée d’une forte affinité pour les colorants qui lui a donné son nom,

« chromatine » (Olins and Olins, 2003). Sa composition globale est d’un tiers d’acide désoxyribonucléique (ADN) — découvert à la même époque, mais dont le rôle comme support de l’information génétique ne sera montré qu’en 1944 — et deux tiers de protéines ; la moitié de la fraction protéique est composée de petites protéines basiques appelées

« histones », l’autre moitié étant composée de protéines diverses collectivement désignées

« protéines non-histones ».

1.1 Le nucléosome

Le nucléosome représente l’unité de base de la chromatine. Il est formé d’une par- ticule de cœur ou nucleosome core particle (NCP), elle-même constituée d’un fragment d’environ 150 paires de bases d’ADN enroulé autour d’un octamère d’histones. L’addition de 20 paires de bases supplémentaires et d’une histone dite « de liaison » forme le chro- matosome. Le terme nucléosome désigne stricto sensu l’association d’un chromatosome avec un segment d’ADN de liaison, bien qu’il soit fréquemment employé pour désigner

2

Figure 1.1 – Représentation schématique du nucléosome et de ses sous-parties : la particule de cœur, for- mée de l’octamère d’histones et d’environ 150 paires de bases ; et le chromatosome, formé par l’association de la particule de cœur avec l’histone de liaison H1.

uniquement le chromatosome ou même la particule de cœur (figure 1.1).

1.1.1 Les histones

Les histones représentent la moitié de la composante protéique de la chromatine. Elles ont été découvertes peu après la chromatine elle-même, en 1884 par Albrecht Kossel (Olins and Olins, 2003). Ce sont de petites protéines d’environ 15 kDa, très basiques. Il en existe cinq classes, H1, H2A, H2B, H3 et H4, réparties en deux familles en fonction de leur contribution à la structure du nucléosome. Les histones de la classe H1 contribuent à la formation du chromatosome, et sont dites « histones de liaison » ; les histones des quatre autres classes contribuent à la formation de la particule de cœur du nucléosome, et sont dites pour cette raison « histones de cœur ».

Les quatre histones de cœur partagent une structure générale identique, consistant

en un domaine globulaire (structuré) central flanqué d’une extension amino-terminale de

15 à 45 résidus et d’une extension carboxy-terminale beaucoup plus courte, de quelques

résidus seulement (figure 1.2a). La caractéristique principale du domaine globulaire est la

présence de l’histone fold domain (HFD), un motif structural formé d’une longue hélice

α centrale flanquée par deux hélices α plus petites auxquelles elle est reliée par deux

courtes boucles (Arents et al., 1991). Ce motif est retrouvé dans un grand nombre de

protéines, depuis les bactéries jusqu’aux eucaryotes supérieurs, et définit la famille des

(a)

N-ter C-ter

α 1 L1

α 2

L2 α 3

domaine N-terminal domaine globulaire (b)

Figure 1.2 – Structure des histones de cœur. (a) Représentation schématique d’une histone de cœur.

Les segments grisés indiquent les hélices α du domaine histone-fold. (b) Structure de deux domaines histone-fold interagissant selon le motif dit de la « poignée de main », qui permet la dimérisation des histones.

protéines « histone-like » (Sullivan et al., 2002). Le domaine HFD permet la dimérisation des protéines qui le contiennent, gràce à une interaction qualifiée de « poignée de main » (figure 1.2b) (Arents and Moudrianakis, 1995). Les extensions amino-terminales sont très divergentes entre les quatre classes d’histones de cœur, et ne sont pas structurées.

Les histones de la classe H1 ont une structure à trois domaines : un domaine amino-

terminal d’environ 45 résidus ; un domaine central globulaire très conservé d’environ 75 ré-

sidus ; et un domaine carboxy-terminal d’une centaine de résidus (Happel and Doenecke,

2009). Les domaines N- et C-terminaux des différents sous-types d’histones H1 sont diver-

gents en taille et en séquence, mais possèdent tous une proportion importante de résidus

basiques. Le domaine carboxy-terminal n’est pas structuré en solution aqueuse, mais ac-

quière une structure secondaire spécifique sitôt associé à l’ADN (Roque et al., 2005). Le

domaine central globulaire n’est pas un domaine histone-fold (Arents and Moudrianakis,

1995) ; les histones de la classe H1 ne présentent pas de similarité avec les histones de

cœur.

Figure 1.3 – Structure de la particule de cœur du nucléosome, telle que résolue par crystallographie aux rayons X.

1.1.2 La particule de cœur

La particule de cœur est un sous-ensemble du nucléosome découvert et défini par la protection de l’ADN contre la digestion par des nucléases. Elle contient un cœur protéique formé de deux exemplaires de chacune des histones de cœur. Autour de ce cœur protéique s’enroulent environ 150 paires de bases d’ADN sur environ un tour trois quart. Les histones et l’ADN contribuent chacun environ pour moitié à la masse totale de la particule, soit 205 kDa (Harp et al., 2000).

L’octamère d’histones résulte de l’assemblage de deux dimères H3–H4 et de deux

dimères H2A–H2B (figure 1.3). Les deux dimères H3–H4 s’associent via une interaction

entre les hélices α2 et α3 des deux histones H3, formant un tétramère (H3–H4)

. Chaque

dimère H2A–H2B s’associe ensuite au tétramère via une interaction similaire entre les

hélices α 2 et α 3 des histones H2A et H4 (Luger et al., 1997). Les interactions en poignée de

main entre chaque paires d’histones provoquent la formation de ponts β entre les boucles

L1 et L2. Ces ponts constituent une partie des sites de liaison à l’ADN. L’association entre

l’octamère d’histones et le fragment d’ADN est principalement le fait de l’insertion des

chaînes latérales des résidus arginine dans le sillon mineur de la double hélice d’ADN (Harp

et al., 2000).

1.1.3 Le chromatosome

Le chromatosome est formé par l’association d’une histone de liaison H1 à la particule de cœur (Holde and Zlatanova, 1999). L’histone H1 lie l’ADN au niveau où celui-ci rentre et sort de la particule de cœur. Elle induit le rapprochement des ADN de liaison entrant et sortant sur une trentaine de paires de bases, limitant leurs mouvements et scellant ainsi le complexe nucléo-protéique. Ce faisant, elle contribue à protéger environ 20 paires de bases supplémentaires en plus des quelques 150 associés à la particule de cœur.

D’autres protéines que des histones H1 sont susceptibles de lier les ADN de liaison. Il a été proposé de les désigner collectivement « protéines de liaison », et d’étendre la définition du chromatosome pour inclure toute association d’une particule de cœur avec une protéine de liaison, qu’il s’agisse ou non d’une histone (Zlatanova et al., 2008). La nature de la protéine de liaison est supposée influer à la fois sur les propriétés du nucléosome et sur la capacité de la fibre de chromatine à former des structures d’ordre supérieur.

1.2 Niveaux d’organisation supérieurs

Dans le contexte de la chromatine, un « niveau d’organisation supérieur » désigne tout assemblage de nucléosomes adoptant une conformation spaciale reproductible. L’exemple le plus flagrant d’une telle structure de niveau supérieur est le chromosome mitotique.

Les concepts de structures primaires, secondaires, tertiaires et quaternaires, définis pour l’étude des protéines, peuvent être appliqués à l’étude de la structure de la chroma- tine (Woodcock and Dimitrov, 2001), avec l’enchaînement des nucléosomes constituant la structure primaire, et les interactions entre nucléosomes donnant lieu à des structures secondaires et au-delà.

Le niveau de structure le plus élevé, et le degré de compaction de l’ADN résultant,

varie avec le cycle cellulaire et la nature de la chromatine. En interphase, la chromatine

existe sous deux formes : l’euchromatine et l’hétérochromatine, cette dernière étant plus

compacte et constituant un environnement réfractaire à la transcription. En phase M,

l’ensemble de la chromatine forme les chromosomes mitotiques. Le taux de compaction

(a) (b)

Figure 1.4 – Les premiers niveaux d’organisation de la chromatine. Micrographies électroniques de nucléofilaments (a) et d’une fibre de chromatine de 30 nm (b). L’enchaînement des particules de cœur (flèches) sur le nucléofilament a valu à cette structure son surnom de « collier de perles ». Échelles : 50 nm.

de l’ADN est alors maximal ; chez les mammifères, il est d’un facteur d’environ 20 000 × par rapport à de l’ADN nu, 50 × par rapport à de l’euchromatine, 4 × par rapport à de l’hétérochromatine (Belmont, 2006).

1.2.1 Le nucléofilament

La « structure primaire » de la chromatine est constituée par l’enchaînement des nu-

cléosomes le long d’un double-brin d’ADN. Cet enchaînement forme le nucléofilament, ou

fibre de chromatine de 10 nm (parfois 11 nm, selon les auteurs), ou encore de façon imagée

le « collier de perles », en raison de l’apparence de cette structure lorsqu’elle fut observée

en microscopie électronique dans les année 1970 (figure 1.4a). Les particules de cœur y

apparaissent séparés par un segment d’ADN de liaison dont la longueur varie selon les

espèces et les tissus entre 20 pb chez la levure bourgeonnante à 70 pb dans le sperme des

échinodermes (Woodcock et al., 2006). Bien qu’il s’agisse de la première structure chroma-

tinienne caractérisée in vitro, le nucléofilament n’est néanmoins vraisemblablement qu’un

artefact expérimental résultant de l’exposition de la chromatine à de faibles forces io-

niques, l’enchaînement de nucléosomes n’adoptant jamais une conformation aussi étendue

dans des conditions physiologiques (Hansen, 2002).

1.2.2 La fibre de 30 nm

Le niveau de structure suivant est représenté par la fibre de chromatine de 30 nm, observée in vitro dans des conditions de salinité physiologiques et en présence d’histone de liaison à raison d’une histone de liaison par nucléosome (figure 1.4b). L’agencement exact des nucléosomes au sein de cette fibre fait depuis plus de trente ans l’objet d’un débat qui n’est pas encore tranché aujourd’hui. Deux modèles sont principalement proposés : le modèle « solénoïde », dans lequel le nucléofilament s’enroule en une hélice simple, en surface de laquelle les nucléosomes consécutifs du nucléofilament sont adjacents (Robinson and Rhodes, 2006) ; et le modèle « zig-zag », dans lequel les nucléosomes consécutifs sont alternativement d’un côté et de l’autre de la fibre, formant une hélice double (Bednar et al., 1998).

Le débat est d’autant plus délicat à trancher que la fibre chromatinienne est une structure dynamique, dont la conformation exacte peut varier en fonction de plusieurs paramètres comme la force ionique, les propriétés du nucléosome et la présence de pro- téines auxiliaires (Hansen, 2002). L’existence même d’une fibre chromatinienne de 30 nm de structure unique, in vivo, peut ainsi être remise en cause (Tremethick, 2007).

Si les travaux sur la fibre de chromatine de 30 nm n’ont pas permis d’apporter de réponse définitive sur sa structure, ils ont en revanche permis de mieux comprendre les mécanismes dirigeant la compaction du nucléofilament. Deux voies de compaction sont aujourd’hui considérées : une voie intrinsèque, où la compaction ne dépend que des pro- priétés du nucléofilament, et une voie extrinsèque, où la compaction est modulée par des protéines associées au nucléofilament.

Compaction intrinsèque

La structure des nucléosomes, incluant les extensions amino-terminales des histones

de cœur, influence directement la capacité du nucléofilament à former une fibre. En parti-

culier, l’extension N-terminale de l’histone H4 est indispensable à la formation d’une telle

fibre (Dorigo et al., 2003) : elle interagit avec un « patch acide » formé par l’histone H2A

à la surface de la particule de cœur (Luger et al., 1997), et favorise ainsi les interactions

inter-nucléosomes. L’étendue du patch acide, qui peut être modifiée par l’incorporation de sous-types variants de l’histone H2A, module directement la compaction de la fibre résultante (Fan et al., 2004).

Le rôle de l’histone de liaison dans la compaction du nucléofilament est aujourd’hui peu clair (Woodcock et al., 2006). La présence d’histones de liaison dans un rapport stœchiométrique 1:1 avec les particules de cœur a longtemps été considérée comme stric- tement nécessaire à la formation de la fibre chromatinienne, sur la base notamment des expérimentations in vitro. L’histone de liaison se voyait également attribuer un rôle géné- ral d’inhibiteur de la transcription, ce qui pouvait s’expliquer par sa propension supposée à compacter le nucléofilament et à réduire ainsi l’accessibilité de l’ADN. Cette vue est depuis peu remise en cause ; la formation de fibres chromatiniennes in vitro en absence d’histone H1 (Dorigo et al., 2004 ; Schalch et al., 2005) et l’absence d’effets transcription- nels majeurs in vivo (Fan et al., 2005) laissent supposer pour l’histone de liaison un rôle plus complexe que celui initialement imaginé.

Compaction extrinsèque

Plusieurs protéines ou complexes protéiques ont été remarqués pour leur capacité à s’associer au nucléofilament et à favoriser sa compaction. MeCP2 est un inhibiteur de transcription ; l’explication première de son effet inhibiteur réside dans sa capacité à lier les dinucléotides CpG méthylés et à recruter des histones déacétylases, créant un contexte chromatinien défavorable à la transcription. Néanmoins, il a été montré que cette protéine pouvait se lier au nucléofilament en absence de méthylation et provoquer sa compaction in vitro (Georgel et al., 2003), suggérant une régulation transcriptionnelle indépendante de l’acétylation des histones.

Les protéines du complexe Polycomb sont responsables au cours du développement

du maintien de certains gènes dans un état inactif (Ringrose and Paro, 2004). Ce com-

plexe s’associe à la particule de cœur du nucléosome, indépendamment des extensions

N-terminales des histones, à raison d’un complexe Polycomb pour trois nucléosomes. Il

impose au nucléofilament une conformation compacte spécifique, distincte de la fibre de

30 nm typique, et qui interdit in vitro la transcription ou le remodelage de la chroma- tine (Francis et al., 2004).

D’autres protéines s’étant vues attribuer un rôle dans la compaction du nucléofilament incluent MENT, une protéine exprimée dans les cellules sanguines différenciées (Grigo- ryev et al., 1999 ; Springhetti et al., 2003), et HP1, une marque typique de l’hétérochro- matine (Zhao et al., 2000 ; Eissenberg and Elgin, 2000).

1.2.3 Le chromosome mitotique

Au début de la mitose, l’ensemble de la chromatine adopte une conformation de com- paction maximale, qui apparaît sous la forme des chromosomes mitotiques. Le chromosome mitotique typique a une forme de X aplati, avec deux chromatides parallèles maintenues à proximité l’une de l’autre par des cohésines. Les principaux éléments fonctionnels du chromosome sont les télomères, qui protègent l’ADN aux extrémités de chaque chroma- tide, et les centromères, qui constituent les points d’ancrage par lesquels les microtubules mobilisent les chromatides au cours de la mitose. Le plus long chromosome humain fait environ 10 µm de long pour un peu moins de 2 µm de large, et contient 250 Mb d’ADN dans chaque chromatide (Marko, 2008).

La structure et la formation de ces chromosomes sont encore peu connues et largement

débattues. Un des premiers modèles proposés, dit des boucles radiales, suppose que les

fibres de 30 nm forment des boucles d’environ 50 à 100 kb d’ADN de long fixées à un

squelette de protéines non-histones (Marsden and Laemmli, 1979), mais la réalité de ce

squelette protéique, qui pourrait n’être qu’un artefact expérimental, n’est pas certaine

(Belmont, 2002). Les modèles de type repliement hiérarchique proposent que le chromo-

some mitotique résulte de plusieurs niveaux de repliement sucessifs, les fibres de chro-

matine de 30 nm s’enroulant en fibres plus épaisses qui à leur tour s’enroulent en fibres

de niveau supérieur (Belmont et al., 1987). La structure de ces hypothétiques fibres de

plus haut niveau reste inconnue. Elles pourraient s’organiser autour d’un squelette axial

de condensines permettant de stabiliser la chromatide (Almagro et al., 2004 ; Kireeva et

al., 2004) et de lui conférer les propriétés élastiques révélées par des essais d’étirement de

chromosomes in vitro (Houchmandzadeh and Dimitrov, 1999).

1.3 Dynamique chromatinienne

La chromatine n’est pas une structure figée. Son remodelage partiel ou total lui confère de nouvelles propriétés structurales et fonctionnelles permettant notamment le déroulement d’activités nucléaires comme la transcription, la réplication ou la répara- tion de l’ADN. Trois mécanismes principaux assurent ce dynamisme de la chromatine : la mobilisation des nucléosomes par des complexes de remodelage, la modification post- traductionnelle des histones, et l’incorporation de variants d’histone au sein des nucléo- somes.

1.3.1 Facteurs de remodelage

Les complexes de remodelage de la chromatine exploitent l’énergie fournie par l’hydro- lyse d’ATP pour moduler l’état de compaction de la chromatine en déplaçant, éjectant ou modifiant les nucléosomes. Les complexes de remodelage connus à ce jour appartiennent à quatre familles distinctes mais partageant toutes certaines propriétés :

– ils ont une certaine affinité pour le nucléosome ;

– ils possèdent des domaines capable de reconnaître certaines modifications post- traductionnelles des histones ;

– ils exhibent une activité ATPasique ADN-dépendante ou nucléosome-dépendante, par laquelle ils peuvent mobiliser l’ADN et rompre les interactions histone-ADN ; – cette activité ATPasique est régulée, soit par un autre domaine au sein de la même

enzyme, soit par d’autres protéines du complexe ;

– ils peuvent interagir avec d’autres facteurs chromatiniens, notamment des facteurs de transcription.

Les familles de complexes de remodelage sont définies en fonction de la sous-unité

portant l’activité ATPasique. Ces familles sont SWI/SNF (switching defective/sucrose

nonfermenting) (Mohrmann and Verrijzer, 2005), ISWI (imitation switch) (Corona and

Tamkun, 2004), CHD (chromodomain, helicase, DNA binding) (Marfella and Imbalzano, 2007) et INO80 (inositol requiring 80 ) (Bao and Shen, 2007).

1.3.2 Modifications post-traductionnelles des histones

Les histones, et particulièrement leurs extrémités amino-terminales, sont la cible d’un grand nombre de modifications post-traductionnelles, un phénomène reconnu dès les an- nées 1960 (Allfrey et al., 1964). Certaines de ces modifications sont associées à des proces- sus comme la transcription, la réparation de l’ADN ou la condensation de la chromatine.

La présence d’une ou plusieurs histones modifiées peut altérer les propriétés du nucléo- some, mais seulement dans une faible marge (Mutskov et al., 1998). Les modifications post-traductionnelles des histones exerceraient donc plutôt leurs effets non pas tant par l’altération du nucléosome que par le recrutement de protéines spécifiques sur les histones modifiées. Une forme plus poussée de ce modèle postule qu’outre les modifications in- dividuelles, les combinaisons de modifications peuvent avoir une signification propre et recruter des protéines distinctes, laissant imaginer un « code histone » (Strahl and Allis, 2000). Cette hypothèse reste néanmoins largement débattue, faute notamment d’un lien de causalité clairement établi entre des modifications post-traductionnelles et l’activation ou la répression de la transcription (Henikoff and Shilatifard, 2011).

Principales modifications

Acétylation L’acétylation des histones est une réaction d’amidation résultant en l’ad-

dition d’un groupement acétyl sur le groupement amine ǫ des résidus lysines. Cette modi-

fication est fréquemment associée à une activation de la transcription, l’hypo-acétylation

des histones étant inversement associée à la chromatine transcriptionnellement inactive

(Grunstein, 1997 ; Katan-Khaykovich and Struhl, 2002). La réaction est catalysée par des

histones acétyltransférases (HAT), dont il existe deux types : les HAT de type A, localisées

dans le noyau et impliquées dans l’acétylation des histones au sein de la chromatine, et les

HAT de type B, localisées dans le cytoplasme et qui acétylent les histones nouvellement

synthétisées avant leur transfert dans le noyau (Sterner and Berger, 2000). Le retrait du

groupement acétyl est catalysée par des histones déacétylases (HDAC), qui reconnaissent les lysines acétylés via un domaine spécialisé, le bromodomaine (Dhalluin et al., 1999 ; Jacobson et al., 2000).

Méthylation La méthylation des histones est l’addition d’un à trois groupements mé- thyles sur un résidu lysine ou d’un ou deux groupements méthyles sur un résidu ar- ginine. La méthylation sur lysine est catalysée par des histone (lysine) methyltransfe- rases (H(K)MT), la méthylation sur arginine par des protein arginine methyltransferases (PRMT). Chaque enzyme cible généralement un résidu bien précis, et l’effet net de la méthylation varie selon le résidu modifié et le nombre de groupements méthyles transfé- rés (Lachner and Jenuwein, 2002 ; Lachner et al., 2003). Trois lysines, en particulier, sont associées à une activation de la transcription lorsqu’elles sont méthylées : H3K4, H3K36 et H3K79 ; inversement, la méthylation de H3K9, H3K27 et H4K20 est fréquemment associée à une répresseion de la transcription. La di- et tri-méthylation de H3K9, en particulier, est une marque typique de l’hétérochromatine, qui est directement reconnue par la protéine HP1 (Bannister et al., 2001).

Phosphorylation La phosphorylation est l’addition d’un groupement phosphate sur un résidu sérine, thréonine ou tyrosine. C’est un mécanisme de régulation majeur, agissant comme un interrupteur moléculaire et contrôlant un grand nombre d’aspects de la vie de la cellule (notamment, le cycle cellulaire). Dans la chromatine, la phosphorylation semble occuper une place moins prépondérante. Néanmoins, la phosphorylation de H3 en H3S10 et H3S28 est impliquée dans la condensation des chromosomes au début de la mitose, et est médiée par les kinases mitotiques Aurora (Hans and Dimitrov, 2001). La phosphorylation de H2A.X, un variant de l’histone H2A, est associée à la réparation des cassures double-brins de l’ADN (Rogakou et al., 1998).

Ubiquitination L’ubiquitine est une protéine acide globulaire de 8,6 kDa hautement

conservée chez les eucaryotes. L’ubiquitination est l’addition d’une ou plusieurs ubiqui-

tines sur le groupement amine ǫ des résidus lysines. Dans le cytoplasme, l’ubiquitination

est essentiellement associée au contrôle de la dégradation des protéines, les protéines ubi- quitinées étant envoyées vers le protéasome. Au sein de la chromatine, deux principaux sites de (mono)-ubiquitination des histones ont été identifiés : H2A sur K119 et H2B sur K120 (Jason et al., 2002). L’ubiquitination des histones ne conduit pas à leur dégradation.

La mono-ubiquination de H2B est associée à l’activation et l’élongation de la transcrip- tion (Vitaliano-Prunier et al., 2008 ; Pavri et al., 2006) ; la mono-ubiquitination de H2A, à l’inverse, est impliquée dans le maintien de la répression transcriptionnelle imposée par le complexe Polycomb (Wang et al., 2004).

ADP-ribosylation La poly(ADP-ribosyl)ation est la fixation d’un polymère d’ADP- ribose, plus ou moins long et éventuellement branché, à une protéine. Cette réaction est catalysée par les enzymes de la famille poly(ADP-ribose) polymérase (PARP), ubiqui- taire chez les eucaryotes, la réaction inverse par l’enzyme poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG). Toutes les histones sont susceptibles d’être ADP-ribosylées, et cette modification altère grandement la conformation du nucléosome. La poly(ADP-ribosyl)ation est impli- quée à la fois dans la réplication, la transcription et la réparation de l’ADN (D’Amours et al., 1999).

1.3.3 Variants d’histones

Chaque classe d’histone, exceptée la classe H4, comprend plusieurs sous-types distin- gués en fonction de leur profil d’expression :

– les sous-types dont l’expression est couplée à la réplication de l’ADN ;

– les sous-types dont l’expression est indépendante de la réplication de l’ADN ; – les sous-types exprimés spécifiquement dans certains tissus ou à certaines étapes du

développement.

Dans les cellules cyclantes, les sous-types dont l’expression est couplée à la réplication

sont majoritaires dans la chromatine, c’est pourquoi on les qualifie d’histones convention-

nelles ou canoniques. Par opposition, les autres sous-types sont collectivement appelés des

variants d’histones.

Les gènes codant les histones conventionnelles sont généralement présents en de mul- tiples copies dans le génome et sont organisés en clusters — chez l’homme, trois clusters sur les chromosomes 1 et 6 (Marzluff et al., 2002). Ils présentent des caractéristiques atypiques pour des gènes eucaryotes, comme l’absence d’introns et une terminaison de la transcription signalée par une structure de type tige-boucle au lieu d’un signal de poly-adénylation. Plusieurs mécanismes de régulation, à la fois transcriptionnels et post- transcriptionnels, assurent que les niveaux d’ARN messagers augmentent drastiquement au cours de la phase S et chutent brutalement sitôt l’ADN répliqué (Osley, 1991).

À l’opposé, les gènes codants les variants d’histones ne sont présents qu’en une ou deux copies et sont répartis isolément dans tout le génome. Ils possèdent tous au moins un intron et un signal de poly-adénylation. Par définition, les produits de ces gènes ont tous la capacité de remplacer l’histone conventionnelle correspondante dans un nucléo- some ; l’incorporation d’un tel variant dans un nucléosome est susceptible de conférer au nucléosome variant des propriétés structurales et fonctionnelles distinctes de celles d’un nucléosome conventionnel.

Variants de H2A

La classe H2A comprend le plus grand nombre de variants, parmi lesquels les variants H2A.Z et H2A.X, retrouvés chez la plupart des eucaryotes, et les variants H2A.Bbd et MacroH2A, spécifiques des vertébrés.

H2A.Z représente environ 10 % des histones H2A totales. Sa suppression est léthale au stade embryonnaire chez la drosophile (Daal and Elgin, 1992) et la souris (Faast et al., 2001). Un nucléosome variant contenant H2A.Z en lieu et place de l’histone H2A conven- tionnelle présente une structure moins stable qu’un nucléosome conventionnel (Abbott et al., 2001), pouvant permettre un accès plus facile à la double hélice d’ADN. Chez la levure, H2A.Z est impliquée dans l’activation de la transcription et la prévention de l’hétérochromatinisation (Meneghini et al., 2003).

H2A.X est caractérisée par la présence à son extrémité C-terminale d’un motif conservé

contenant une sérine phosphorylable. La forme phosphorylée de la protéine, indépendam-

ment de l’espèce, est désignée γ -H2A.X. La phosphorylation intervient notamment en réponse à des cassures double-brin de l’ADN (Rogakou et al., 1998), où des foci γ-H2A.X apparaissent dans les dix minutes suivant l’induction des cassures et disparaissent progres- sivement dans les deux heures. H2A.X sous sa forme phosphorylée participe à la réparation des cassures, notamment en aidant au recrutement de facteurs de réparation et en favo- risant le remodelage de la chromatine à proximité du site de lésion (Thiriet and Hayes, 2005). Elle n’est toutefois pas strictement indispensable au processus de réparation (Yuan et al., 2010).

MacroH2A est caractérisée par une large extension C-terminale, le domaine macro.

Elle est associée à la répression de la trancription et est notamment trouvé enrichie sur le chromosome X inactif (Mietton et al., 2009). Sa présence dans un nucléosome perturbe à la fois le recrutement de facteurs de transcription comme NF- κ B et le remodelage du nucléosome par le complexe SWI/SNF (Angelov et al., 2003), ainsi que l’acétylation des histones nécessaire à la transcription (Doyen et al., 2006b).

À l’inverse de macroH2A, H2A.Bbd, un variant identifié plus récemment, est exclue du chromosome X inactif (d’où son nom, Bbd pour Barr-body deficient) et est associée à la chromatine transcriptionnellement active (Chadwick and Willard, 2001). H2A.Bbd forme un nucléosome dont la particule de cœur est plus relâchée qu’un nucléosome convention- nel, et qui ne protège que 118 à 128 pb d’ADN (Bao et al., 2004 ; Doyen et al., 2006a).

Ce nucléosome est résistant au remodelage par SWI/SNF mais plus perméable à la trans- cription in vitro (Angelov et al., 2004).

Variants de H2B

Les variants de la classe H2B sont peu nombreux et ceux actuellement décrits ne sont

exprimés que dans les tissus testiculaires, laissant supposer un rôle spécifique au cours

de la gamétogenèse. Ces variants incluent TH2B (Testis H2B) et H2B.FWT. TH2B rem-

place majoritairement l’histone conventionnelle H2B dans les spermatocytes chez le rat

(Meistrich et al., 1985). Chez l’homme, elle est exprimée tout au long de la spermatoge-

nèse, où elle est trouvée dans des régions précises de la chromatine tels que les télomères

(Zalensky et al., 2002). H2B.FWT est un variant étonnamment divergent (environ 45 % d’identité avec les histones H2B conventionnelles) qui ne semble présent que chez l’homme et les grands singes (Churikov et al., 2004). Elle est associée aux régions télomériques.

La reconstitution de nucléosomes in vitro contenant ce variant a montré que H2B.FWT ne perturbe pas le remodelage du nucléosome par SWI/SNF, mais que son domaine N- terminal, très divergent par rapport à H2B, ne lui permet pas de contribuer à l’assemblage du chromosome mitotique (Boulard et al., 2006).

Variants de H3

La classe H3 comprend cinq sous-types : deux sous-types conventionnels H3.1 et H3.2, et trois sous-types variants H3.3, H3.4 (ou H3.t, ou TH3) et CenH3. À l’exception de CenH3, tous les sous-types sont homéomorphes, c’est-à-dire qu’ils ne divergent entre eux que par quelques résidus (un résidu entre H3.1 et H3.2 par exemple).

Le variant H3.3 ne diverge de H3.1 que par cinq résidus et de H3.2 par quatre résidus.

Il est généralement associé à la chromatine transcriptionnellement active (Ahmad and Henikoff, 2002 ; McKittrick et al., 2004) et est supposé être une marque distinctive des gènes actifs (Hake and Allis, 2006), quoique ce rôle soit depuis peu remis en cause au vu de la présence de H3.3 dans des régions d’hétérochromatine constitutive (Szenker et al., 2011).

Le variant H3.4, divergeant de H3.1 par quatre résidus et de H3.2 par cinq résidus, est un variant spécifique des tissus testiculaires. Chez le rat, il représente jusqu’à 40 % des histones H3 totales tout au long de la spermatogenèse (Meistrich et al., 1985). Chez l’homme, son expression est restreinte aux spermatocytes, où il représente potentiellement l’histone H3 majoritaire (Witt et al., 1996). Le nucléosome H3.4 apparaît moins stable que le nucléosome conventionnel, avec notamment une plus faible interaction entre le tétramère H3.4:H4 et les dimères H2A:H2B (Tachiwana et al., 2010).

Le variant CenH3, ou CENP-A, est un variant spécifique de la chromatine centromé-

rique. Il est au cœur de ce travail de thèse et sera conséquemment détaillé un peu plus

loin.

molecules known as genes.

— Richard D AWKINS

Chapitre 2 La mitose

La mitose est le processus par lequel une cellule eucaryote répartit son matériel gé- nétique lors de sa division. Avec la cytokinèse, la division effective de la cellule en deux cellules-filles, elle constitue la phase M du cycle cellulaire. Après avoir rappelé brièvement le déroulement de la mitose, nous nous arrêterons plus particulièrement sur les structures et mécanismes impliqués dans la mobilisation des chromosomes.

2.1 Déroulement et régulation de la mitose

2.1.1 Déroulement de la mitose

La mitose est divisée en cinq phases. Au cours de la prophase (figure 2.1a), la chro- matine interphasique se condense jusqu’à former des chromosomes bien individualisés ; les deux centrosomes migrent chacun vers un pôle de la cellule et émettent des micro- tubules dans toutes les directions ; l’enveloppe nucléaire disparaît. En prométaphase (fi- gure 2.1b), les chromosomes désormais totalement condensés migrent vers un plan équa- torial, la plaque métaphasique. Ce mouvement, dit de congression, est notamment dû au fuseau mitotique, un ensemble de microtubules reliant les centrosomes aux chromosomes auxquels ils s’attachent au niveau du centromère. Les chromosomes restent sur la plaque métaphasique pendant toute la métaphase (figure 2.1c), pendant laquelle la cellule s’as-

18

(a) (b) (c) (d) (e) (f)

Figure 2.1 – Déroulement de la mitose. (a) Prophase : les chromosomes se condensent et la membrane nucléaire disparaît. (b) Prométaphase : capture des chromosomes par les microtubules. (c) Métaphase : alignement des chromosomes sur la plaque métaphasique. (d) Anaphase : les chromatides se séparent et migrent vers les pôles. (e) Télophase : les chromosomes se décondensent et les membranes nucléaires se reforment. (f) Cytokinèse : division du cytoplasme.

sure de la bonne orientation et du bon attachement bipolaire de chaque chromosome au fuseau mitotique. Survient alors l’anaphase (figure 2.1d), où la cohésion des chromatides sœurs est rompue et où chaque chromatide migre vers un pôle de la cellule. En télophase (figure 2.1e), au terme de cette migration, une enveloppe nucléaire se reforme autour des deux lots de chromatides, les microtubules du fuseau mitotique se dissocient et la chro- matine commence à se décondenser. Parallèlement à la télophase, se produit la cytokinèse (figure 2.1f), la division du cytoplasme ; un anneau contractile se resserre progressivement et conduit à la séparation presque totale des deux cellules-filles qui ne sont plus reliées que par une petite structure très dense, le corps résiduel, dont la disparition signe la fin effective de la division cellulaire.

2.1.2 Régulation de la mitose

L’ensemble des processus mitotiques est strictement contrôlé. Deux mécanismes molé- culaires ont une importance prépondérante dans ce contrôle : la protéolyse, qui permet de dégrader un effecteur lorsque sa fonction n’est plus nécessaire, et la phosphorylation, qui sert d’interrupteur à de nombreuses enzymes et permet leur activation ou désactivation.

Nous nous concentrerons ici sur quelques-unes des familles de kinases impliquées dans le contrôle de la mitose.

Principales kinases mitotiques

La famille CDK Les kinases de la famille CDK (cyclin dependent kinases) sont parmi

les plus importants chefs d’orchestre de la progression à travers le cycle cellulaire. En

mitose, la kinase prédominante de cette famille est CDK1. Exprimée à partir de la phase G2, elle est maintenue inactivée par la phosphorylation de ses résidus thréonine-14 et tyrosine-15, médiée par les kinases Wee1 et Myt1. La déphosphorylation de ces résidus par Cdc25 et l’association à la cycline B permet l’activation de la kinase et signe l’entrée de la cellule en mitose.

Les cibles du complexe cycline B/CDK1 sont multiples et incluent notamment : les lamines, ce qui conduit à leur dépolymérisation et à la rupture de l’enveloppe nucléaire ; des kinésines et autres protéines liées aux microtubules, favorisant l’assemblage du fu- seau mitotique ; les condensines, impliquées dans la condensation des chromosomes ; les cohésines situées sur les bras des chromosomes.

Finalement, lors de la transition métaphase/anaphase, la destruction de la cycline B par l’anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) conduit à la désactivation de CDK1, ce qui ouvre la voie aux processus de complétion et de sortie de la mitose.

La famille PLK La famille des PLK (Polo-like kinases) regroupe les homologues de la protéine Polo, identifiée chez la drosophile dans un crible visant des altérations du fuseau mitotique. Chez les mammifères, cette famille comprend quatre membres, PLK1 à 4, PLK1 étant celle impliquée en mitose (Weerdt and Medema, 2006). Elle est exprimée à partir de la phase G2. Initialement répartie dans toute la cellule, elle est localisée aux niveaux des centrosomes et des kinétochores de la prophase à la métaphase. Elle est majoritairement dégradée par l’APC/C lors de la transition métaphase/anaphase, exceptée une fraction qui subsiste sur le fuseau central et le corps résiduel en fin de mitose.

PLK1 favorise l’entrée en mitose, à la fois par une activation directe du complexe

cycline B/CDK1 et par la phosphorylation de Cdc25c, qui promeut sa localisation nu-

cléaire (Roshak et al., 2000). Au niveau des centrosomes, elle favorise le recrutement des

complexes γ-tubulin ring complex ( γ -TURC) par la phosphorylation de Asp (Petronczki

et al., 2008). Sur les kinétochores, elle contribue au recrutement du complexe NDC80

(Wong and Fang, 2005). Finalement, elle participe à la transition métaphase/anaphase,

soit en phosphorylant directement des sous-unités de l’APC/C (Golan et al., 2002), soit

en promouvant la dégradation d’un de ses inhibiteurs, Emi1.

La famille NRK La kinase NIMA (never in mitosis A) a été identifiée chez Aspergillus nidulans dans un crible visant des mutants du cycle cellulaire ; les mutants nimA restaient arrêtés en phase G2 sans jamais entrer en mitose. Les homologues de NIMA définissent la famille NRK ou NIMA-related kinases (O’Connell et al., 2003). Chez les vertébrés, l’homologue fonctionnel le plus probable est la kinase NEK2. Elle est essentiellement im- pliquée dans la maturation et la séparation des centrosomes. En phosphorylant C-Nap1, elle favorise la dissolution d’une structure maintenant les centrosomes ensemble après leur duplication (Bahe et al., 2005) ; elle rompt également l’interaction entre la protéine Root- letin et la β-caténine, ce qui est nécessaire à la séparation des centrosomes (Bahmanyar et al., 2008).

La famille Aurora La protéine fondatrice de la famille Aurora est la kinase du même nom identifiée chez la drosophile dans un criblant visant des mutants de la formation du fuseau mitotique. Cette famille comprend trois membres chez les mammifères, Aurora A, B et C. Aurora C semble exprimée spécifiquement dans les cellules germinales, ce qui laisse supposer une possible fonction spécialisée dans la division méïotique. Aurora A et Aurora B sont toutes deux impliquées dans la mitose somatique et partagent quelques caractéristiques communes : elles sont exprimées uniquement en G2/M ; leur activation dépend de leur association à des co-facteurs spécifiques couplée à une autophosphoryla- tion ; elles sont dégradées en fin de mitose par ubiquitination dépendante de l’APC/C.

Aurora A contribue à l’entrée en mitose et à la maturation des centrosomes. Elle

affiche initialement une localisation cytoplasmique, où elle forme un complexe avec son

cofacteur Bora. Le complexe Bora/Aurora A phosphoryle notamment PLK1 (Macůrek et

al., 2008 ; Seki et al., 2008), ce qui a pour effet de favoriser à la fois l’entrée en mitose (par

l’action de PLK1 sur le complexe cycline B/CDK1) et la phosphorylation et la dégradation

de Bora. Aurora A s’associe alors à son autre cofacteur, TPX2 (Chan et al., 2008), qui la

localise au niveau des centrosomes. Là, elle permet le recrutement de plusieurs éléments du

matériel péricentriolaire (Hannak et al., 2001) et la mobilisation de protéines associées aux

microtubules (Dutertre et al., 2002). Elle phosphoryle également la fraction centrosomique

de Cdc25 (Dutertre et al., 2004), permettant de maintenir l’activation locale du complexe cycline B/CDK1.

Aurora B est le membre enzymatique du complexe chromosomal passengers com- plex (CPC), un ensemble de protéines caractérisées par leur profil de localisation au cours de la mitose. Ce complexe, et notamment la protéine INCENP, permet à la fois l’autoac- tivation complète de la kinase et sa bonne localisation. Les fonctions d’Aurora B suivent son voyage au travers de la cellule en division. En prophase, elle est associée aux bras des chromosomes, où elle participe à la condensation de la chromatine par la phosphorylation des condensines et la sérine-10 de H3 (Giet and Glover, 2001 ; Lipp et al., 2007) ; elle assiste également au retrait des cohésines le long des bras, conjointement avec PLK1 (Giménez- Abián et al., 2004). En prométaphase et métaphase, localisée sur les centromères, elle supervise l’attachement des microtubules aux kinétochores, notamment en déstabilisant les attachements incorrects (Shang et al., 2003 ; Liu and Lampson, 2009 ; Tanaka et al., 2002 ; Lampson et al., 2004 ; Cimini et al., 2006 ; Knowlton et al., 2006) et en activant le point de contrôle du fuseau mitotique. En télophase, elle est localisée sur le fuseau central, pour le désassemblage duquel elle est requise (Buvelot et al., 2003). Enfin, en cytokinèse, sur le corps résiduel, elle contribue à la formation de l’anneau contractile (Minoshima et al., 2003).

2.2 Le fuseau mitotique

2.2.1 Les microtubules

Le fuseau mitotique est composé de microtubules, une structure cylindrique formée

par l’association de treize protofilaments eux-mêmes composés d’hétérodimères d’ α - et

β-tubuline (Nogales, 2001). C’est une structure polarisée : l’agencement des dimères de

tubuline est tel que les deux extrémités d’un protofilament ne sont pas équivalentes ; tous

les protofilaments d’un microtubule étant orientés dans le même sens, on différencie ainsi

une extrémité n’exposant que des molécules d’α-tubuline, qualifiée de positive ( + ), et une

extrémité n’exposant que des molécules de β-tubuline, qualifiée de négative ( − ).

Le microtubule est une structure hautement dynamique, dont la longueur varie par l’ajout ou le retrait de dimères de tubuline aux extrémités du polymère (Desai and Mitchi- son, 1997). L’extrémité d’un microtubule alterne entre des phases de polymérisation lente et des phases de dépolymérisation rapide (« catastrophe »), en fonction notamment de la concentration locale en dimères de tubuline. À une extrémité donnée, le taux de polymé- risation et la fréquence des catastrophes déterminent si le microtubule est globalement en phase de croissance ou de rétraction. Chaque extrémité peut exhiber des propriétés dynamiques distinctes, ce qui confère au microtubule la possibilité de croître ou de se rétracter dans un sens particulier.

Lorsque les propriétés dynamiques des deux extrémités sont telles qu’une extrémité croît au même rythme que l’extrémité opposée décroît, on observe un phénomène de

« tapis roulant » (treadmilling) : les dimères de tubuline ajoutés à l’extrémité croissante sont progressivement décalés vers l’extrémité décroissante où ils se dissocient du polymère ; la longueur du microtubule reste constante (Margolis and Wilson, 1998).

2.2.2 Les centrosomes

Le centrosome est le principal centre organisateur des microtubules de la cellule. Il est

dupliqué lors de la phase S et les deux centrosomes résultants définissent les pôles du fuseau

mitotique lors de la division qui s’ensuit (Urbani and Stearns, 1999). C’est un organelle

d’environ 1 µm de large constitué d’une paire de centrioles (eux-mêmes un assemblage

de neuf triplets de microtubules) entourés d’un matériel péricentriolaire (pericentriolar

material , PCM) amorphe. Un composant majeur du PCM est un complexe annelaire de

γ-tubuline, γ-TURC, qui sert de modèle de nucléation pour la formation de microtubules

(Zheng et al., 1995). Au cours de la mitose la capacité de nucléation des centrosomes est

accrue par le recrutement de plus grandes quantités de γ -TURC (Khodjakov and Rieder,

1999 ; Piehl et al., 2004). Cela permet une augmentation rapide de nombre de microtubules

émis à partir du centrosome et ainsi la formation du futur fuseau mitotique. Toutefois, le

centrosome n’est pas strictement indispensable dans ce processus, et un fuseau mitotique

Figure 2.2 – Le kinétochore. Micrographie électronique d’un chromosome de souris (en encart) et vue agrandie de la région du kinétochore. Échelle : 100 nm.

fonctionnel peut se former en absence de centrosome (Mahoney et al., 2006). Le centrosome a également un rôle important dans la régulation du cycle cellulaire (Doxsey et al., 2005).

2.2.3 Le kinétochore

Le kinétochore est un complex protéique transitoire associé aux centromères au cours de la mitose. C’est par son intermédiaire que les microtubules du fuseau mitotique ac- crochent les chromosomes.

Observé en microscopie électronique (figure 2.2), le kinétochore présente une morpho- logie trilamellaire révélant trois régions (McEwen et al., 2007) : le kinétochore interne, très étroitement associé à la chromatine ; le kinétochore externe, une région épaisse de 50 à 60 nm qui sert d’interface avec les microtubules ; et le kinétochore central, une région peu dense aux électrons séparant les deux précédentes. Un réseau de fibres, la couronne fibreuse, est associé à la surface du kinétochore externe.

Le kinétochore le plus simple, celui de Sacharromyces cerevisiae, fixe un seul microtu-

bule. Il est constitué d’environ soixante protéines (McAinsh et al., 2003 ; Westermann et

al., 2007) essentiellement réparties en cinq complexes : CBF3, Ndc80, Mtw1, Spc105 et

Dam1. Trois d’entre eux, Ndc80, Mtw1 (appelé Mis12 chez l’homme) et Spc105 (Knl1 chez

l’homme) sont conservés chez les eucaryotes supérieurs (Musacchio and Salmon, 2007 ;

Cheeseman and Desai, 2008 ; Welburn and Cheeseman, 2008), ce qui suggère que leurs

kinétochores, plus volumineux et qui lient chacun plusieurs microtubules (15 à 20 micro- tubules pour un kinétochore humain) sont formés d’une répétition du module élémentaire trouvé chez la levure (Joglekar et al., 2008). Un autre complexe, le constitutive centromere- associated network (CCAN), est également conservé chez tous les eucaryotes et est supposé être la fondation du kinétochore, le socle sur lequel le reste du kinétochore est assemblé.

Néanmoins, l’association permanente de la plupart des membres de ce complexe au cen- tromère (d’où son nom), opposée à la nature transitoire du kinétochore, commande de considérer le CCAN comme un composant de la chromatine centromérique davantage que comme un composant du kinétochore.

Le module fonctionnel élémentaire du kinétochore est le réseau Knl1–Mis12–Ndc80 (KMN), constitué des trois complexes conservés Ndc80, Mtw1/Mis12 et Spc105/Knl1 (Cheeseman et al., 2006). Dans ce réseau, le complexe Ndc80 interagit directement avec le microtubule, avec une affinité faible mais qui augmente de façon synergique lorsqu’il est associé aux complexes Mtw1/Mis12 et Spc105/Knl1. Le complexe Ndc80 comprend quatre protéines et forme une structure cylindrique avec deux têtes globulaires à chaque extrémité, séparées par une longue région super-enroulée (Ciferri et al., 2007). Une extré- mité du cylindre, composée des régions globulaires de Ndc80 et de Nuf2, lie directement les microtubules (Cheeseman et al., 2006 ; Wei et al., 2007) ; l’autre extrémité, composée des régions globulaires de Spc24 et Spc25 (Wei et al., 2006), est associée au kinétochore in- terne. Chaque microtubule est lié au kinétochore par plusieurs complexes KMN (Joglekar et al., 2006).

2.3 Mouvements des chromosomes

2.3.1 Accrochage au fuseau mitotique

Tous les mouvements des chromosomes au cours de la mitose nécessitent leur accro-

chage aux microtubules du fuseau mitotique. Les microtubules accrochés à un kinétochore

forment une fibre K ; ces microtubules sont orientés avec leur extrémité ( + ) ancrée au ki-

nétochore et leur extrémité ( − ) ancrée au centrosome.

Deux modèles, non-nécessairement exclusifs, tentent d’expliquer comment les chromo- somes sont accrochés aux microtubules du fuseau mitotique au cours de la prométaphase.

Le modèle « recherche et capture » (McIntosh et al., 2002) propose que les microtubules émis à partir des centrosomes explorent l’espace avoisinant dans toutes les directions jus- qu’à entrer en contact avec un kinétochore. Les microtubules ayant établi un tel contact sont stabilisés alors que ceux dont la recherche est infructueuse sont dépolymérisés. Ce mécanisme est permis notamment par l’augmentation de la nucléation des microtubules au niveau des centrosomes, conséquence du recrutement accru de γ-tubuline et de l’action d’Aurora A (Khodjakov and Rieder, 1999 ; Brittle and Ohkura, 2005).

Le modèle d’« auto-assemblage » propose que des microtubules se forment au voisinage immédiat de la chromatine, indépendamment des centrosomes. Une partie d’entre eux au moins sont accrochés par les kinétochores et s’orientent parallèlement pour former une fibre K (McKim and Hawley, 1995). Ce modèle pourrait expliquer la formation d’un fuseau mitotique fonctionnel observé en l’absence de centrosome (Mahoney et al., 2006).

2.3.2 Congression

La congression est le processus par lequel les chromosomes accrochés au fuseau mi- totique s’alignent sur la plaque métaphasique en prométaphase. Le mouvement général en direction de la plaque métaphasique est généralement accompagnée de mouvements oscillatoires en direction de l’un et l’autre des deux pôles.

Une des forces responsables de ces mouvements provient de la dépolymérisation des extrémités positives des microtubules associés à un kinétochore ; le racourcissement de la fibre K qui en résulte entraîne le chromosome en direction du pôle correspondant.

Sur le kinétochore opposé, on observe une polymérisation des extrémités positives des microtubules et l’élongation de la fibre K, mais ce phénomène ne permet pas de « pousser » le chromosome vers la plaque métaphasique (Khodjakov and Rieder, 1996).

Un autre mécanisme contribuant à la congression est le déplacement latéral d’un chro-

mosome le long d’une fibre K déjà formée. Ce mouvement est possible gràce à l’action

de moteurs moléculaires associés aux microtubules ayant une activité motrice dirigée

vers l’extrémité positive, comme la kinésine CENP-E (Kapoor et al., 2006). Il permet la congression d’un chromosome non encore bi-orienté, et favorise justement la bi-orientation en rapprochant le chromosome de la plaque métaphasique et donc des faisceaux de mi- crotubules émis par le pôle opposé.

2.3.3 Ségrégation

La ségrégation des chromatides vers les deux futures cellules-filles au cours de l’ana- phase est le résultat de deux mouvements distincts définissant deux sous-phases, l’ana- phase A et l’anaphase B. Au cours de l’anaphase A, les chromatides migrent en direction du pôle qui leur fait face ; au cours de l’anaphase B — qui ne commence pas nécessaire- ment après l’anaphase A, un chevauchement temporel des deux phases étant possible —, les pôles eux-mêmes migrent dans des directions opposées. La contribution de chaque mouvement à la ségrégation des chromatides est variable entre les espèces et les types cellulaires.

Anaphase A

Le mouvement des chromatides en direction des pôles au cours de l’anaphase A est le fait de principalement deux mécanismes : la dépolymérisation des microtubules et l’acti- vité de protéines motrices au niveau du kinétochore.

La dépolymérisation des microtubules par leur extrémité positive (du côté du kinéto- chore) provoque le raccourcissement des fibres K et la traction des chromatides en direction du pôle (Gorbsky et al., 1987 ; Gorbsky et al., 1988). Le même effet peut également être obtenu par une dépolymérisation à l’extrémité négative (du côté du centrosome) associée à une polymérisation de l’extrémité positive, si le taux de dépolymérisation est supérieur au taux de polymérisation (Khodjakov and Kapoor, 2005 ; Kwok and Kapoor, 2007)..

Plusieurs protéines motrices apparaissent impliquées dans le mouvement des chroma-

tides en direction des pôles, bien que le rôle exact de chacune d’elle reste peu clair. Une

des premières identifiées est la dynéine, retrouvée associée aux kinétochores lors de l’ana-

phase et exhibant une activité motrice dirigée vers l’extrémité négative (Pfarr et al., 1990 ;

Steuer et al., 1990) ; son rôle pourrait être de livrer des protéines favorisant la dépolymé- risation aux pôles (Gaetz and Kapoor, 2004). De telles protéines incluent des membres de la famille kinésine-13 (Ganem and Compton, 2004).

Anaphase B

Après la séparation initiale des chromatides, se forme sur la plaque équatoriale lais- sée vacante une nouvelle structure microtubulaire, le « fuseau central » (central spindle), constitué de microtubules en provenance des deux pôles. Les moteurs moléculaires recru- tés au niveau du fuseau central font « glisser » les microtubules anti-parallèles, générant ainsi des forces qui éloignent chaque moitié du fuseau l’une de l’autre et contribuent aux mouvements des centrosomes (Brust-Mascher and Scholey, 2002 ; Brust-Mascher et al., 2004 ; Zhu et al., 2005).

Les microtubules astraux, reliant les centrosomes au cortex cellulaire, contribuent éga- lement à la migration des centrosomes (Rosenblatt, 2005).

2.3.4 Le point de contrôle du fuseau mitotique

Le point de contrôle du fuseau mitotique ou spindle [assembly] checkpoint (SAC) a

pour fonction d’empêcher la cellule d’entrer précocément en anaphase avant que tous les

chromosomes ne soient correctement attachés au fuseau mitotique. L’attachement cor-

rect est l’attachement dit amphitélique (figure 2.3), dans lequel le kinétochore de chaque

chromatide est lié à des fibres K venant du centrosome qui lui fait face. Les autres types

d’attachements possibles sont : l’attachement monotélique, où un seul des deux kinéto-

chores est lié au fuseau ; l’attachement syntélique, où les deux kinétochores sont liés à des

fibres K en provenance du même centrosome ; et l’attachement mérotélique, où l’un des

kinétochores est lié à des fibres K en provenance des deux centrosomes. En présence de

chromosomes non attachés ou attachés de manière incorrecte, le SAC retarde la transition

métaphase/anaphase jusqu’à la résolution du problème d’attachement.