Étude d'un récepteur orphelin apparenté aux récepteurs aux hormones glycoprotéiques : LGR4

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Université Libre de Bruxelles Faculté de Médecine

Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire

Étude d'un récepteur orphelin apparenté aux récepteurs aux hormones glycoprotéiques : LGR4

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques

Grégory VAN SCHOORE

Promoteur : Pr Gilbert Vassart

Année Académique 2007 - 2008

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Remerciements

Après un peu plus de sept années maintenant, cette thèse a fini par aboutir. Ce ne fut pas une mince affaire et les obstacles furent multiples, et si j'ai su les franchir (parfois les contourner) c'est avant tout grâce à une série de personnes que je voudrait remercier.

En premier lieu, mon promoteur Gilbert Vassart qui, un beau jour de printemps 2001, a recueilli dans son équipe deux jeunes doctorants perdus sans collier, sans projets et sans labo. Il leur a offert sur un plateau un projet, un labo et surtout une dose de confiance en soi et d'optimisme que leur récente expérience avait su ébranler. Merci donc, de nous avoir permis de repartir, Laurent et moi vers de nouveau horizons. Merci aussi d'avoir eu en permanence cette foultitude d'idées qui ont permis de maintenir à flot le groupe LGR au cours de ces années et parfois de le faire repartir lorsque le sort (et aussi AJ Hsueh) semblait s'acharner sur nous.

Ensuite, les membres successifs du très restreint groupe LGR : Sylvie tout d'abord, qui

a lancé le projet LGR et qui m'a formé à toute une série de techniques (la culture cellulaire

mais aussi et surtout l'étiquetage multicolore des Eppendorf et la gestion au quotidien d'un

iMac caractériel). Puis Fernando qui – entre le pôle sud et l'Argentine – a fait une escale de

quelques années à l'IRI. Son optimisme débordant et ses cocolitos ont certainement

contribué à une atmosphère détendue mais néanmoins productive. Nos longues séances de

tatouage de doigts de souris resteront des moments extrêmement marquants. Marie-Isabelle

qui aujourd'hui a repris le flambeau et qui – j'espère – finira par mettre la main sur ce satané

ligand qui nous tient en haleine depuis tout ce temps. Ensuite, il y a tous ceux qui ont

participé d'un peu plus loin au projet LGR : Patrick, notre Monsieur souris (et chinchin les

jours de drink), puis Marie-Alexandra qui contre vents et marées a fini par placer l'article 3-

D, Roland Pochet, qui au prix de nombreuses heures passées devant un microscope m'a

patiemment appris à faire la différence entre une cellule épithéliale sur une coupe

histologique et une trace de doigt sur l'objectif du microscope ...

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D, Audrey S, Bernadette, Cathy, Cédric, Colette, Daniel, Danièle, Didier, Eneko, Françoise Miot, Fred, Frédéric Libert, Guillaume, Isabelle, Jacques E. Dumont, Jean-Yves, Jing, Joëlle, Lara, Laura, Marc Parmentier, Marie-Jeanne, Marielle, Milutin, Nicolas, Pïtou, Sabine Costagliola, Sébastien, Séverine, Valérie, Vanessa, Véro, Xavier, ...

( je laisse des pointillés pour pouvoir compléter).

Une thèse c'est aussi une course de fond, on ne tient jusqu'à la ligne d'arrivée que si on est ravitaillé tout au long du parcours et soutenu par son entourage. Ce soutient je l'ai trouvé depuis le début, dans la famille tout d'abord : mes parents qui bien que ne voyant pas toujours bien l'intérêt de fabriquer des souris bleues m'ont toujours soutenu ; mon père qui ne connaîtra pas non plus la fin de cette histoire-ci ; ma p'tite Lara qui en plus de me supporter depuis le début a réussi ces derniers mois à cumuler les rôles de femme de ma vie et de lectrice-correctrice des très nombreuses versions du manuscrit de cette thèse ; et puis Françoise (dite fp), promis la prochaine fois je ferai des souris oranges !

Viennent également les amis, dont la présence proche ou lointaine m'a souvent permis de relativiser l'importance (certes fondamentale mais quand même pas tant que cela) de la découverte de l'agoniste d'un récepteur orphelin par rapport au reste de l'existence. Avec une mention très spéciale pour Lo, l'évadé du Ceria, le collègue, le témoin, le joueur de tarot mais surtout l'ami, Merci donc aussi à Zizo, Bruno, Florence, Michaël, Nico, Alice, Alex, Stef, Dai, Gilles, David, Alessandro, Gentiane, Viviane, Christian, toute la clique de Clair-Vivre, leurs moitiés et les pitchounes : Julie, Laurent, Manon, Eve, Pif, Stéphanie, Vincent, Sarah, Mélanie, et encore plein d'autres que j'oublie sûrement de m'avoir permis de temps à autres de redescendre un peu sur terre.

Finalement une dernière salve de remerciements à mes actuels collègues (de l'école), qui m'ont pas mal encouragés ces derniers temps à persévérer et à boucler ce travail : Myriam, Marianne, Robert, Chantal, Denis, Georges, Martine, Jacqueline, Benoît, John- Chris et les autres.

Greg

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Table des matières

Table des matières ... i

Abréviations ... iv

Résumé ... vi

Partie A - Introduction ... 1

1 Les récepteurs couplés aux protéines G ... 3

1.1 Fonction(s) ... 3

1.2 Structure(s) des RCPG ... 7

1.1 Dimérisation des RCPG ... 11

1.3 Classification des RCPG ... 11

1.4 Pathologies associées aux RCPG et applications thérapeutiques ... 11

2 Un cas particulier : la rhodopsine ... 15

3 La famille LGR ... 17

3.1 Les LGR de type A ... 21

3.1.1 Les récepteurs aux hormones glycoprotéiques (TSHr, LH/CGr et FSHr) ... 21

3.1.2 Ghra : un LGR de cnidaire ... 23

3.1.3 DLGR1 : L'homologue des RHG chez la drosophile ... 23

3.1.4 nLGR : un LGR de nématode ... 25

3.2 Les LGR de type B ... 25

3.2.1 DLGR2 : le récepteur au bursicon ... 25

3.2.2 Cg-LGRB : un LGR d'huître ... 27

3.2.3 LGR4, LGR5 et LGR6 : les LGR orphelins de mammifères ... 29

3.2.4 LGR5 (GPR49 – HG38 – FEX) ... 29

3.2.4.1 Expression de LGR5 dans des cellules cancéreuses ... 31

3.2.5 LGR6 ... 31

3.3 Les LGR de type C ... 33

3.3.1 LGR7 et LGR8 : les récepteurs à la relaxine ... 33

3.3.2 GRL101, un LGR de gastéropode ... 35

3.3.3 DLGR3 et DLGR4, deux autres LGR de drosophile ... 35

4 LGR4 ... 37

4.1 Identification et clonage ... 37

4.2 Structure du gène et du récepteur ... 37

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Partie C - Résultats ... 45

1 Cartographie de l'expression de LGR4 chez la souris ... 47

1.2 Introduction ... 47

1.3 Résultats ... 47

1.4 Discussion ... 49

1.5 Article ... 51

2 Étude des caractéristiques phénotypiques des souris inactivées pour LGR4 ... 71

2.1 Introduction et résultats ... 71

2.2 Discussion et données supplémentaires ... 73

2.3 Article ... 77

3 Préparation d'outils moléculaires destinés à la recherche d'agoniste(s) naturel(s) de LGR4 95

3.1 Introduction ... 95

3.2 Clonage du récepteur LGR4 humain et sous-clonage dans différents vecteurs ... 97

3.2.1 Construction du plasmide hLGR4/pCRII ... 97

3.2.2 Construction du plasmide hLGR4/pcDNA ... 97

3.2.3 Construction du plasmide hLGR4/pEFIN ... 97

3.3 Préparation d'anticorps monoclonaux dirigés contre le domaine extracellulaire de LGR4 humain ... 99

3.3.1 Immunisation génique et test des sérums ... 99

3.3.2 Préparation d'hybridomes ... 101

3.3.3 Immunodétection de LGR4 : optimisation des conditions expérimentales ... 101

3.4 Utilisation du domaine extracellulaire de LGR4 comme agent de détection de son agoniste ... 101

3.4.1 Principe ... 101

3.4.2 Construction du plasmide ECD-hLGR4-SEAP-8his-GPI/pEFIN ... 103

3.4.3 Préparation des lignées cellulaires CHO exprimant la sonde LGR4-SEAP ... 103

3.4.4 Préparation d'une sonde LGR4-SEAP ... 105

3.4.5 Détection de l'agoniste de LGR4 sur coupes de tissus frais ... 105

3.5 Utilisation du domaine extracellulaire de LGR4 comme agent de purification de son agoniste ... 105

3.5.1 Principe ... 105

3.5.2 Construction du plasmide ECD-hLGR4-8his-GPI/pEFIN ... 105

3.5.3 Préparation des lignées cellulaires CHO exprimant la construction ECD-hLGR4-8his ... 107

3.5.4 Préparation d'un greffon ECD-hLGR4-8his ... 107

3.6 Préparation de lignées cellulaires destinées à suivre la purification d'activités agonistes ... 107

3.6.1 Principe du test æquorine ... 107

3.6.2 Préparation de lignées cellulaires WTA11 ... 109

3.7 Utilisation des outils – expériences préliminaires ... 109

3.7.1 Anticorps monoclonaux anti-LGR4 ... 109

3.7.2 Sonde LGR4-SEAP ... 111

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Partie D - Discussion générale – conclusions - perspectives ... 113

L'expression de Lgr4 chez la souris ... 115

Effets de l'inactivation de Lgr4 chez la souris ... 119

Préparation à la recherche de l'agoniste de LGR4 ... 123

L'identité de l'agoniste ... 125

Conclusions - perspectives ... 133

Partie E - Bibliographie ... 137

Partie F - Annexes ... 157

1 Manuscrit d'un article supplémentaire : Three dimensional reconstruction of efferent ducts in wild type and LGR4 knockout mice ... 159

2 Membres du Jury de thèse ... 191

3 Curriculum vitæ ... 193

4 Thèse annexe : résumé et références choisies ... 195

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Abréviations

3-D tridimensionnel

5-HT 5-^H ydroxy^T ryptamine ou sérotonine 7TM à sept domaines ^T rans^M embranaires

8-his 8 histidines

a.a. acide aminé

ACTH A dreno C orticoT ropic H ormone

(hormone corticotrope)

ADN ^A cide ^D ésoxyribo^N ucléique

ADNc ^A cide ^D ésoxyribo^N ucléique complémentaire ADP A dénosine D iP hosphate

AMPc ^A dénosine ^M ono^P hosphate cyclique ARNm ^A cide ^R ibo^N ucléique messager

AT ^A ngio ensine^T

BCIP 5-^B romo-4-^C hloro-3- ndolyl ^I ^P hosphate BMP ^B one ^M orphogenic ^P rotein

BSA ^B ovine ^S erum ^A lbumine

C-ter extrémité carboxyterminale

Cg-LGRB

Crassostrea gigas

L G R de type B

CHO ^C hinese ^H amster ^O vary

(cellule d'ovaire de hamster chinois)

CMV ^C yto^M égalo irus^V

Da ^D alton

DAN ^D ifferential screening-selected gene berrative in ^A euroblastoma^N DLGR Drosophila ^L eucine-rich G-protein-coupled ^R eceptor

ECD ^EC to^D omaine

EDTA ^E thylene^D iamine ^T etraacetic ^A cid

(acide éthylène-diamine-tétraacétique)

EST ^E xpressed equence ^S ^T ag

FACS ^F luorescence ^A nalysis ell ^C ^S orter FISH F luorescence ^I n ^S itu ^H ybridization

FITC ^F luoresceine so^I ^T hio^C yanate

(isothiocyanate de fluorescéine)

FSH ^F ollicle ^S timulating ^H ormone

(hormone folliculo-stimulante ou gonadostimuline A)

FSHr ^F ollicle ^S timulating ^H ormone ^R eceptor

(récepteur à l'hormone folliculo-stimulante)

GABA ^A cide γ-^A mino^B utyrique

GDP Guanosine ^D i^P hosphate

Ghra G protein-coupled hormone receptor from

Anthopleura

GMP ^G uanosine ^M ono^P hosphate

GPCR G-P rotein- oupled C R eceptor

(récepteur couplé aux protéines G)

GPHR ^G lycoprotein ^H ormone ^R eceptor

GPI ^G lycosyl^P hosphatidyl^I nositol

GREAT G-protein-coupled ceptor RE A ffecting T estis descent (LGR5) GPR G-^P rotein-coupled eceptor^R

GTP ^G uanosine ^T ri hosphate^P

GTPase ^G uanosine ^T ri hosphate hydrolase^P HBSS Hanks' ^B alanced ^S alt olution^S

hCG human ^C horionic ^G onadotropin

(gonadotrophine chorionique)

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IL ^I nner-^L oop

(boucle intracellulaire)

Inhba ^I nhibin β A

INSL ^INS ulin- ike peptide^L

IRES ^I nternal ^R ibosome ^E ntry ^S ite

(site interne d'entrée de ribosome)

ISH ^I n ^S itu ^H ybridization

kDa kilo^D alton

KO ^K nock^O ut

lacZ

gène de la β-galactosidase bactérienne LGR ^L eucine-rich G-protein-coupled ^R eceptor

LH ^L uteinizing ^H ormone

(hormone lutéinisante ou gonadostimuline B)

LH/hCGr ^L uteinizing ^H ormone / ^H uman ^C horionic onadotropin ^G ^R eceptor

(récepteur à l'hormone lutéinisante et la gonadotrophine chorionique)

LRR ^L eucine-^R ich ^R epeat

N-ter extrémité aminoterminale

NBT ^N itro^B leu de ^T étrazolium

nLGR nematode ^L eucine-rich G-protein-coupled ^R eceptor OCT ^O ptimal ^C utting ^T emperature

OL ^O uter- oop ^L

(boucle extracellulaire)

ORF ^O pen ^R eading ^F rame

(phase ouverte de lecture)

PAF p ra^A ormaldéhyde^F

p.b. paire de bases

PBS ^P hosphate uffered ^B ^S aline

(tampon phosphate salin)

PCR ^P olymerase hain ^C eaction^R

(réaction de polymérase en chaîne)

PDGF ^P latelet- erived ^D ^G rowth ^F actor

Pi-PLC P hosphatidylI nositol-specific P hosphoL ipase C

PLAP p acental ^L ^Alkaline ^Phosphatase

(phosphatase alkaline placentaire)

PLC ^P hospho^L ipase C

RCPG ^R écepteur ouplé aux ^C rotéines G^P

RHG R écepteur aux H ormones lycoprotéiquesG

RT-PCR ^R everse ^T ranscription ^P olymerase ^C hain eaction^R RXFP ^R elaxin ^F amily ^P eptide ^R eceptor

SEAP s ^E creted lkaline ^A ^P hosphatase

T3 triiodothyronine

T4 thyroxine

TGF ^T ransforming ^G rowth ^F actor TM ^T rans-^M embrane (domain)

TSH ^T hyroid-^S timulating ^H ormone

(thyréotropine)

TSHr ^T hyroid-^S timulating ^H ormone receptor

(récepteur à la thyréotropine)

X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-^D-galactopyranoside

β-gal β-galactosidase

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Résumé

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont impliqués dans la majeure partie des communications intercellulaires. Un grand nombre de RCPG ont été découverts en comparant la séquence des récepteurs connus avec les données fournies par le séquençage du génome humain. Pour plus d'une centaine de ces récepteurs, le ligand activateur ou agoniste est inconnu. Ces récepteurs sont dès lors qualifiés d'orphelins.

Les LGR forment une sous-famille de RCPG structurellement proches de la rhodopsine qui comprend les récepteurs aux hormones glycoprotéiques (TSH, LH, hCG, FSH) et à la relaxine. LGR4 est un membre de cette famille dont ni la fonction précise, ni l'agoniste ne sont connus.

Dans un premier temps, une cartographie détaillée de l'expression de Lgr4 chez la souris a été obtenue.

Nous avons tiré parti de l'existence d'une lignée de souris transgéniques dont le gène Lgr4 a été interrompu par l'introduction d'une cassette comportant deux marqueurs histologiques. L'activité β-galactosidase d'un de ces marqueurs a été analysée chez les souris hétérozygotes. Ces dernières ne présentent pas de phénotype particulier, ce qui permet d'estimer que l'expression des marqueurs rend effectivement compte de l'expression normale du gène Lgr4. Lgr4 est exprimé dans un grand nombre de structures, notamment dans le cartilage, le rein, les appareils reproducteurs mâle et femelle et certaines cellules du système nerveux.

Ensuite, le phénotype des souris homozygotes pour l'inactivation de Lgr4 (LGR4KO) a été exploré. Ces souris présentent à la naissance un poids inférieur à leurs congénères des autres phénotypes. Les mâles sont stériles à cause d'une malformation des tubules efférents et de l'épididyme. Un blocage au niveau des tubules efférents reliant le testicule à l'épididyme contraint les spermatozoïdes à s'accumuler à la sortie du testicule, dans la région du rete testis. De plus, les tubes de l'épididyme, pourtant normaux à la naissance, ne s'allongent pas pour former la structure convolutée habituelle. L'épithélium de ces tubes est aplati et est entouré d'une quantité anormalement élevée de mésenchyme.

Dans un troisième temps, des outils nécessaires aux futures tentatives d'identification de l'agoniste naturel de LGR4 ont été réalisés. Il s'agit : (1) d'anticorps monoclonaux dirigés contre la partie extracellulaire du récepteur humain. (2) d'un appât moléculaire pour la ‘pêche au ligand’. Cet appât est constitué du domaine extracellulaire du récepteur humain couplé à un marqueur histologique. (3) d'une construction peptidique constituée du domaine extracellulaire du récepteur humain couplé à une queue poly-histidine. Cette construction est destinée à servir de greffon lors de chromatographies d'affinités devant permettre de purifier le ligand. (4) de lignées cellulaires exprimant le récepteur LGR4 humain ainsi que le système æquorine devant permettre de détecter l'activation de ce récepteur.

Les données apportées par ce travail montrent un rôle important du récepteur LGR4 au cours du développement et permettent de circonscrire le champ des recherches futures. Ceci, ainsi que les outils moléculaires développés, constitue une base pour l'identification future de l'agoniste et la détermination précise de la fonction de LGR4.