Conception, synthèse et caractérisation de vecteurs pour la nanomédecine : applications en thérapie anticancéreuse

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Conception, synthèse et caractérisation de vecteurs pour la nanomédecine : applications en thérapie

anticancéreuse

Adrien Grassin

To cite this version:

Adrien Grassin. Conception, synthèse et caractérisation de vecteurs pour la nanomédecine : applica- tions en thérapie anticancéreuse. Médecine humaine et pathologie. Université Grenoble Alpes, 2015.

Français. �NNT : 2015GREAV004�. �tel-01179814�

THÈSE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ GRENOBLE ALPES

Spécialité : CHIMIE ET SCIENCES DU VIVANT

Arrêté ministériel : 7 août 2006

Présentée par

Adrien GRASSIN

Thèse dirigée par Pascal Dumy et codirigée par Didier Boturyn

préparée au sein du Département de Chimie Moléculaire dans l'École Doctorale Chimie et Sciences du Vivant

Conception, synthèse et

caractérisation de vecteurs pour la nanomédecine : applications en thérapie anticancéreuse

Thèse soutenue publiquement le 5 Mai 2015, devant le jury composé de :

Mr, Benoit, FRISCH

Directeur de Recherche, Université de Strasbourg, Rapporteur

Mr, Gilles, SUBRA

Professeur, Université de Montpellier 1, Rapporteur

Mr, Arnaud, FAVIER

Chargé de recherche, INSA Lyon, Examinateur

Mr, Fabrice, THOMAS

Professeur, Université Grenoble-Alpes, Président

Mr, Didier, BOTURYN

Directeur de recherche, Université Grenoble-Alpes, Examinateur

Mr, Pascal, DUMY

Remerciements

Remerciements

Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier le Prof Pascal Dumy, Directeur de l’École nationale supérieure de chimie de Montpellier, de m’avoir accueilli au sein du laboratoire à Grenoble.

Je tiens également à remercier tout particulièrement le Dr Didier Boturyn de m’avoir dirigé, conseillé et accordé sa confiance pendant ces trois années.

Je souhaite remercier la région Rhône-Alpes pour le financement de ces travaux

Je souhaite également remercier vivement les personnes d’avoir accepté d’examiner et d’évaluer ce travail :

- Prof Fabrice Thomas - Dr Arnaud Favier - Prof Gilles Subra - Dr Benoit Frisch

Je tiens à remercier le Dr Jean-Luc Coll et toute son équipe à l’Institut Albert Bonniot de Grenoble de m’avoir accueilli et encadré pour les évaluations sur cellules. Je tiens à remercier tout particulièrement Maxime Henry d’avoir pris le temps de me former, et Thibault Jacquet de nous avoir aidé par la suite, mais aussi Laetitia, Sandrine, Victor, Tao, Anastasia et Yoon pour leur accueil et leur disponibilité.

Je tiens également à remercier le Prof Patrick Couvreur pour son accueil chaleureux, ainsi que toute son équipe à l’Institut Galien de l’Université Paris Sud pour la formulation des nanoparticules de squalène. Je tiens à remercier tout particulièrement Simona Mura de m’avoir encadré au long de ces deux mois, ainsi que mes collègues de bureau pour leur aide précieuse : Dunja, Nadia et Alice, mais également Julie Mougin.

Je tiens aussi à remercier le Dr Arnaud Favier et Damien Duret pour la collaboration et les

Remerciements

Je souhaite également remercier tous le laboratoire I2BM, en particulier le Dr Muriel Jourdan pour son aide très précieuse sur la modélisation. Mais aussi tous les membres du laboratoire que j’ai rencontrés et qui m’ont aidé tout au long de ma thèse, en particulier Christopher, Michaël, Émilie, Nabil, Baptiste, Romaric, Morgane, Dhruv, Hugues, Marie, Damien, Fabien, Marc et Carlo.

Je souhaite aussi remercier tout le personnel du DCM, en particulier le plateau de spectrométrie de masse et le plateau de spectrométrie RMN.

Je souhaite enfin remercier ma famille et mes proches, Hélène, Bérenger, Mathias, Cyrielle,

mes sœurs Mathilde et Julie, et enfin mes parents Antoine et Evelyne pour m’avoir soutenu tout

au long de mes études.

Table des matières

Table des matières

Table des matières

Abréviations ... viii

INTRODUCTION ... 1

1 Préambule ... 2

2 Le développement de la nanomédecine ... 3

3 Vectorisation ... 5

3.1 Effet EPR ... 6

3.1.1 Limitations de l’effet EPR et améliorations ... 7

3.1.2 PEGylation ... 7

3.2 Utilisation de ligands ... 11

3.2.1 Cell penetrating peptides (CPP) ... 12

3.2.2 Acide Folique (vitamine B9) ... 12

3.2.3 Acide Hyaluronique ... 13

3.2.4 Anticorps ... 14

3.2.5 Aptamères ... 16

3.2.6 Sucres ... 18

3.2.7 Transferrine ... 19

3.2.8 Peptides ... 19

3.2.9 Interactions avec le micro environnement de la tumeur ... 21

3.2.10 Avantages et limitations des ligands ... 22

4 Nanoparticules ... 23

4.1 Nanoparticules Lipidiques ... 23

4.1.1 Micelles ... 23

4.1.2 Liposomes ... 24

4.1.3 Nanoparticules à base de lipides solides – Lipides nanostructurés ... 25

Table des matières

4.2.2 Polymères ... 28

4.2.2.1 Poly(alkyl cyanoacrylate) ... 28

4.2.2.2 Acide hyaluronique ... 28

4.2.2.3 Chitosane ... 29

4.2.2.4 Acide lactique / glycolique ... 30

4.3 Nanoparticules inorganiques ... 31

4.3.1 Or ... 31

4.3.2 Oxyde de fer ... 33

4.3.3 Quantum Dots ... 34

4.4 Nanotubes de carbone ... 36

5 Objectifs des travaux ... 38

CHAPITRE I OPTIMISATION DU VECTEUR PEPTIDIQUE ... 40

1 Introduction ... 41

1.1 L’interaction RGD-intégrine ... 41

1.2 Résultats antérieurs du laboratoire ... 42

2 Conception et synthèse ... 44

3 Résultats et discussions ... 53

3.1 Déroulement des tests biologiques ... 53

3.2 Résultats ... 54

3.3 Modélisation moléculaire ... 56

3.3.1 Introduction ... 56

3.3.2 Résultats et discussions ... 57

4 Conclusions et perspectives ... 62

CHAPITRE II DEVELOPPEMENT D’UNE STRATEGIE DE REACTION « ONE-POT » 63 1 Introduction ... 64

1.1 CuAAC ... 66

1.2 Thioacid-mediated amine acylation (TAA) ... 67

Table des matières

2 Optimisation de la TAA ... 68

2.1 Influence de la concentration ... 69

2.2 Effet du tampon ... 69

2.3 Effet du catalyseur ... 70

3 Étude de la réaction « one-pot » CuAAC + TAA ... 71

3.1 Objectif ... 71

3.2 Synthèse des composés ... 72

3.3 Cinétique ... 74

3.3.1 Réactions séquentielles CuAAC puis TAA ... 75

3.3.2 Réactions séquentielles TAA puis CuAAC ... 76

3.3.3 Réactions CuAAC/TAA simultanément ... 78

4 Couplage de composés d’intérêt biologique ... 78

5 Conclusion ... 82

CHAPITRE III SYNTHESE ET FONCTIONNALISATION DE NANOPARTICULES POUR LA THERAPIE ... 83

1 Introduction ... 84

2 Antécédents ... 84

2.1 Nanoparticules « squalénées » ... 84

2.2 Lipopeptides ... 88

3 Conception et Synthèse ... 88

4 Formulation et évaluation biologique des NP ... 94

4.1 Formulation ... 94

5 Conclusion et perspectives ... 99

CHAPITRE IV SYNTHESE ET FONCTIONNALISATION DE NANOPARTICULES POUR L’IMAGERIE ... 100

1 Introduction ... 101

Table des matières

2.1.1 Polymérisation RAFT ... 101

2.1.2 Copolymères NAM/NAS ... 101

2.1.3 Applications en imagerie ... 103

3 Conception et Synthèse ... 104

3.1 Introduction ... 104

3.2 Polymères linéaires ... 104

3.3 Nanoparticules polymériques ... 107

3.3.1 Conception ... 107

3.3.2 Avancement et perspectives ... 108

4 Résultats ... 108

5 Conclusions et perspectives ... 111

CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES ... 112

PARTIE EXPERIMENTALE ... 116

BIBLIOGRAPHIE ... 156

ANNEXES ... 168

Abréviations

Abréviations

Abréviations

ABC Accelerated blood clearance

Ac Acétyl

AcOEt acetate d’éthyl AcOH Acide acétique

ADN Acide Désoxyribonucléique AH Acide hyaluronique

Alloc Allyloxycarbonyl ARN Acide Ribonucléique ASGP-R Asialoglycoprotein receptor Boc Tertio-butyloxycarbonyl BSA Bovine Serum Albumine CDR Complementarity determining

region

CMC Concentration micellaire critique CNT Carbon nanotube

CPP Cell penetrating peptide

CuAAC Copper Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition

DCC N,N’-dicyclohexylcarbodiimide DIPEA N,N-Diisopropyléthylamine DMF N,N-Diméthylformamide DMLA Dégénérescence maculaire liée à

l’âge

DMSO Diméthylsulfoxyde

DSC Differential scanning calorimetry EGFR Epidermal growth factor receptor EPR Enhanced Permeability and

Retention effect équiv. Équivalent molaire ESI Electrospray Ionisation Et2O Éther diéthylique

FR Folate receptor

HACA Human anti-chimeric antibodies

HATU

1-[Bis(dimethylamino)methylene]- 1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxid hexafluorophosphate

HEK(293) Lignée de cellules embryonnaires de rein humain

HPLC High pressure liquid chromatography

IC50 Concentration inhibant un paramètre de 50%

IFN-α2a Interféron α2a

IRM Imagerie par Résonance Magnétique

KAHA Ketoacid-hydroxylamine MEC Matrice extracellulaire MET Microscopie électronique en

transmission MeOH Méthanol

MMP Matrix metalloproteinase MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazolium bromide NCL Native chemical ligation NHS N-hydroxysuccinimide NK Natural killer

NP Nanoparticule

ON Oligonucléotide

PACA poly(alkyl cyanoacrylate) PBS Phosphate Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction PEG Polyéthylène glycol

Abréviations

PSMA Prostate specific membrane antigen

PyBOP

(Benzotriazol-1-

yloxy)tris(pyrrolidino)phosphoniu m hexafluorophosphate

QD Quantum dot

RAFT reversible addition fragmentation chain transfer

RMN Résonance Magnétique Nucléaire ROS Reactive oxygen species

RP-HPLC

Reverse Phase High- PerformanceLiquid Chromatography r.t. Room temperature

SELEX Systematic evolution of ligands by exponential enrichment

SLN Solid lipid nanoparticle

SPION Superparamagnetic iron oxide nanoparticles

SPPS Synthèse peptidique sur phase solide

SQ Squalène

t.a. Température ambiante

TAT Trans-Activator of Transcription t-Bu Tertio-butyl

TFA Acide trifluoroacétique TIS Triisopropylsilane

TNF-α Tumour Necrosis Factor α tR Temps de rétention

Trt trityl

UHPLC Ultra high pressure liquid chromatography

UV Ultraviolet

VEGF Vascular endothelial growth factor

Introduction

INTRODUCTION

Introduction

Introduction

1 Préambule

Le cancer est une maladie caractérisée par une prolifération non contrôlée de cellules anormales. C’est la première cause de mortalité dans les pays développés et la deuxième cause de mortalité dans les pays en voie de développement.

On estime à 14,1 millions le nombre de nouveaux cas de cancer et à 8,2 millions le nombre de décès liés au cancer en 2012.

Le cancer du poumon est le plus diagnostiqué et celui avec le taux de mortalité le plus élevé chez l’homme. Le tabagisme entraine plus de 70% des décès par cancer du poumon. Chez la femme, le cancer du sein est le plus diagnostiqué et responsable du plus grand nombre de décès.

L’hérédité joue un rôle majeur chez 5% des patients seulement, et 30% des cancers sont causés par un style de vie peu sain : tabagisme, consommation d’alcool, surpoids, alimentation pauvre en fruits et légumes et exposition aux rayons UV.

Il existe 3 types de traitements :

- la chirurgie (ablation chirurgicale de la tumeur et, éventuellement, de ses extensions) - la radiothérapie (traitement par diverses sources et modalités de rayonnement)

- les traitements médicamenteux (chimiothérapie, hormonothérapie, immunothérapie...) Afin d’obtenir les meilleurs résultats possibles, il est habituellement utilisé une combinaison de ces trois traitements. Dans la plupart des cas, une ablation chirurgicale est suivie d’une chimiothérapie ou radiothérapie afin d’éliminer les cellules cancéreuses restantes et d’éviter les récidives. Il est également important de préciser que chaque cas de cancer est unique. Ainsi, il n’existe pas de traitement universel, chaque patient doit recevoir un traitement choisi en fonction des caractéristiques de la tumeur.

Cependant ces traitements présentent plusieurs inconvénients. En effet la chirurgie est une approche très invasive et peut laisser des cellules tumorales résiduelles non détectables. La radiothérapie et la chimiothérapie sont deux techniques non sélectives, c’est-à-dire qu’elles détruisent les cellules tumorales comme les cellules saines, ce qui implique des effets secondaires très importants. La chimiothérapie peut aussi s’avérer inefficace lorsque les cellules cancéreuses développent une résistance aux principes actifs.

Les limites des traitements actuels ont conduit à la recherche de nouveaux traitements moins

invasifs et plus spécifiques. Depuis plus de 30 ans, l’explosion de la nanomédecine a permis de

développer de nombreux traitements alternatifs potentiels, mais seulement quelques-uns sont

actuellement disponibles sur le marché. Ceci témoigne de la difficulté rencontrée pour

Introduction

transférer les techniques développées en laboratoire à l'échelle industrielle pour la mise sur le marché, dans le cas des systèmes nanoparticulaires.

2 Le développement de la nanomédecine

Paul Ehrlich (1854-1915) est souvent considéré comme le père de la chimiothérapie, c’est-à- dire du traitement des maladies par des substances chimiques. Il a inventé en 1907 le premier agent chimiothérapeutique dans le cadre du traitement de la syphilis, le Salvarsan, puis a reçu le prix Nobel en 1908 pour ses recherches sur l’immunologie.

Figure 1 - Paul Ehrlich

Ses travaux sur les colorants lui ont permis de comprendre que l’effet biologique d’un composé chimique dépendait de sa composition, et de la cellule avec laquelle il interagissait. En observant la sélectivité de certains colorants pour certains organes il a émis l’idée d’une « magic bullet », un composé qui permettrait d’amener un principe actif sélectivement à la zone à traiter.

Il a ainsi relié la chimie à la biologie et la médecine.

“In order to use Chemotherapy successfully we must search for substances which have an affinity to the cells of the parasites and a power of killing them greater than the damage such substances cause to the organism itself, so that the destruction of the parasites will be possible without seriously hurting the organism. To do this, we must learn to aim with chemical substances”

- Paul Ehrlich

Près d’un siècle après ces premières découvertes, la communauté scientifique est toujours

activement à la recherche d’une « magic bullet » qui permettrait d’augmenter l’efficacité du

Introduction

utilise des systèmes nanoparticulaires : lipidiques ou polymériques et plus récemment inorganiques.

Les nanoparticules sont des particules mesurant de quelques nanomètres à une centaine de nanomètres. Elles sont entre 100 et 10 000 fois plus petites qu’une cellule humaine. Une échelle de taille est représentée dans la Figure 2.

Figure 2 - Échelle de taille allant de la molécule à la cellule

Le développement des nanoparticules (NPs) pour le transport de principes actifs a commencé pendant les années 1970, dans le laboratoire du Prof. Peter Speiser, à l’ETH Zürich, notamment avec l’aide du Prof. Patrick Couvreur.

Dans le cadre d’un usage thérapeutique, les NPs permettent d’amener à la tumeur des composés lipophiles et/ou hydrophiles augmentant ainsi leur solubilité et leur biodisponibilité. Elles permettent aussi d’augmenter les doses limites de toxicité. Ces principes actifs sont généralement encapsulées dans la nanoparticule, par interactions hydrophobe ou hydrophiles.

Lorsqu’elles sont destinées à un usage diagnostique, les nanoparticules permettent d’amener à la tumeur des composés possédant des propriétés fluorescentes après excitation.

Afin de cibler préférentiellement le microenvironnement tumoral, les NPs peuvent être conçues pour s’accumuler dans les imperfections des vaisseaux sanguins irriguant la tumeur. Elles peuvent être également fonctionnalisées par des ligands spécifiques à certains récepteurs surexprimés à la surface des cellules tumorales. Les nanoparticules sont le plus souvent recouvertes de polyéthylène glycol (PEG) afin d’augmenter leur temps de circulation in vivo.

Les groupements PEG empêchent les NPs d’être reconnues par les protéines présentes dans le

Nanomètres

Nano-objets : Micelles Liposomes Dendrimères Nanosphères Nanotubes etc.

Introduction

sang chargées d’éliminer les corps étrangers.

Ces techniques constituent le concept de vectorisation.

Des milliers d’articles concernant le développement de NPs ont été publiés, mais seulement une poignée de systèmes nanoparticulaires ont été approuvés pour des applications cliniques.

Plusieurs facteurs en sont la cause.

Tout d’abord, il est impossible de déterminer les caractéristiques (diamètre, forme, composition, etc.) de la nanoparticule idéale. Ceci doit être fait au cas par cas. Ensuite, les modèles animaux utilisés ne sont pas représentatifs des cas cliniques humains, et le comportement des nanoparticules in vivo est bien plus complexe chez l’Homme que chez les petits animaux (souris, rats, etc.). Les systèmes nanoparticulaires développés en laboratoire par les chercheurs sont souvent très complexes. Il est donc difficile et coûteux de les produire à grande échelle tout en obtenant une reproductibilité des formulations.

De plus, il n’existe pas de standards concernant la caractérisation des nanoparticules (taille, dynamiques de relargage, etc.) ainsi que les tests in vivo et in vitro.

Malgré ces défis à relever, les NPs ont un avenir prometteur. Le marché de la nanomédecine était estimé entre 50,1 et 68 milliards de dollars en 2011 et devrait atteindre entre 97 et 129 milliards de dollars en 2016, selon un rapport récent de la société Bionest Partners. Les traitements à base de NPs disponibles aujourd’hui (Doxil

, Abraxane

…) ont permis d’assurer une place aux nanoparticules dans le combat contre le cancer, en permettant de diminuer les effets secondaires et dans certains cas d’augmenter l’efficacité thérapeutique par rapport aux traitements classiques.

Enfin, le caractère versatile des NPs permet le développement de plusieurs techniques et stratégies novatrices. La théranostique personnalisée (diagnostic + thérapie) par exemple, permet de combiner la thérapie et l’imagerie non invasive, afin de valider puis d’optimiser le traitement pour chaque patient.

Le traitement de cancers métastatiques peut être également développé grâce au temps de circulation plasmatique prolongé des NPs, combiné à différents modes d’injection pour cibler différents organes.

3 Vectorisation

On rappelle qu'il existe deux approches pour la vectorisation de nanoparticules, souvent

Introduction

La première repose principalement sur l’accumulation de NPs dans les vaisseaux sanguins irréguliers qui alimentent les tumeurs. Ce phénomène appelé « effet EPR » peut être accompagné d’une fonctionnalisation des NPs par des groupements polyéthylène glycol hydrophiles. Cette technique permet d’obtenir des NPs « furtives » en augmentant leur temps de circulation dans le sang.

La seconde approche exploite le fait que les cellules cancéreuses surexpriment de nombreux récepteurs par rapport aux cellules saines. La fonctionnalisation des NPs par des ligands qui vont interagir avec leurs récepteurs correspondants permet de faciliter leur internalisation dans les cellules cancéreuses.

Ces deux concepts sont détaillés dans les paragraphes ci-dessous.

3.1 Effet EPR

Afin de permettre leur croissance rapide, les tumeurs ont besoin d’un apport élevé en nutriments et en oxygène. Pour cela, des vaisseaux sanguins sont créés rapidement. Ils se caractérisent par une structure irrégulière ainsi que des cavités allant de 200 à 2000 nm de large.

Ces caractéristiques sont communes au processus de cicatrisation.

Les nanoparticules possédant un temps de circulation in vivo élevé (d’une dizaine d’heures à plusieurs mois) vont alors s’accumuler dans ces cavités.

Puisque les tumeurs ne possèdent pas de vaisseaux lymphatiques fonctionnels

, les nanoparticules ne sont pas évacuées au niveau de ces cavités. Elles peuvent ensuite atteindre la tumeur par extravasation grâce à une pression favorable.

Les NPs biodégradables peuvent ensuite relarguer les composés d’intérêt après actions des diverses enzymes présentes dans l’environnement tumoral (cf. Figure 3).

Figure 3 - Effet EPR - théorie Figure 4 - Effet EPR – réalité

Introduction

Ce sont ces deux caractéristiques (perméabilité des vaisseaux et rétention des nanoparticules) qui composent l’effet EPR, décrit pour la première fois en 1986 par Maeda et al.

La majorité des nanoparticules développées dans le cadre du traitement du cancer exploitent cet effet. De même, toutes les formulations nano approuvées par la FDA pour un usage clinique se basent sur l’effet EPR.

3.1.1 Limitations de l’effet EPR et améliorations

La majorité des études sont basées sur des rongeurs pour lesquels les tumeurs grandissent bien plus vite que chez l’Homme (quelques semaines contre quelques années). L’effet EPR est donc en général beaucoup moins prononcé chez l’humain, sauf dans certains cas particuliers, notamment le sarcome de Kaposi, qui répond assez bien aux traitements de ce type, tel que le Doxil

, formulation liposomale encapsulant la doxorubicine, un agent anticancéreux (cf.

paragraphe 4.1.2).

Une autre limitation est que les nanoparticules doivent traverser plusieurs couches de cellules de péricytes, muscles lisses et fibroblastes pour atteindre leur cible (cf. Figure 4).

Il est possible en utilisant des nanoparticules chargées en agents d’imagerie de déterminer au cas par cas si la tumeur à traiter permet d’exploiter l’effet EPR, et d’adapter ainsi le traitement en fonction de ces résultats.

Afin d’augmenter la perméabilité des vaisseaux et donc la rétention des nanoparticules, il est possible de traiter la tumeur avant l’injection de nanoparticules non ciblées. En utilisant des enzymes telles que la collagénase ou hyaluronidase

ainsi que des agents anti- inflammatoires tels que le facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) et l’histamine,

l’étape d’extravasation peut être facilitée en dégradant les barrières stromales ou en augmentant la perméabilité des vaisseaux sanguins. Cependant, ces traitements peuvent également favoriser le développement de métastases.

3.1.2 PEGylation

Afin d’exploiter pleinement l’effet EPR, il est nécessaire que les NPs possèdent un temps de

circulation dans le sang élevé. Pour éviter une élimination trop rapide par les macrophages, il

est possible de rendre les nanoparticules « furtives » en les fonctionnalisant par une couche de

Introduction

Ce n’est pas une technique propre aux nanoparticules, puisque sa première utilisation remonte à 1977 lorsque Abuchowski et al. ont décrit la PEGylation de l’albumine et de la catalase afin de rendre ces protéines non immunogènes et d’augmenter leur temps de circulation dans le sang.

Le premier traitement PEGylé approuvé par la FDA, en 1990 est l’Adagen

, une adénosine déaminase PEGylée pour le traitement du déficit immunitaire combiné sévère

. Depuis, plusieurs traitements PEGylés, (protéines, liposomes) ont été approuvés pour applications cliniques.

Dans le cas des liposomes, il existe une technique antérieure à celle de la PEGylation, datant de la fin des années 80 : en s’inspirant de la composition des membranes cellulaires riches en sucres des globules rouges, Allen et al. ont fonctionnalisé des liposomes par des gangliosides (composés entre autres d’acide sialique), et ont rapporté un temps de circulation plasmatique prolongé.

Au début des années 90, ces gangliosides ont ensuite été remplacés par des PEG, moins couteux, et qui apportent des performances similaires.

Dans le cas de liposomes, le temps de demi-vie est multiplié par 8, passant de 2,5 heures à 20 heures.

Un chapitre de livre de Harris et al. rapporte l’effet de la PEGylation sur le temps de demi-vie de différentes protéines thérapeutiques.

Figure 5 - Liposomes PEGylés et liposomes conventionnels

Les groupements PEG hydrophiles apportent à la surface du liposome une concentration locale en molécules d’eau élevée, qui va créer une gêne stérique et empêcher les interactions avec une variété de protéines du sang, telles que les opsonines (cf. Figure 5).

Une opsonine est une protéine qui va se fixer sur un agent pathogène pour faciliter sa phagocytose.

Cette technique peut être appliquée à tous types de nanoparticules fonctionnalisables : NPs

lipidiques, NPs polymériques, nanotubes de carbone,

etc.

Introduction

Lorsque la densité de PEG en surface d’une NPs est faible, les PEG adoptent une configuration

« champignon », c’est-à-dire qu’ils sont repliés sur eux-mêmes. Lorsque la densité est élevée, les groupements PEG vont adopter une configuration « brosse », les chaines étant étirées (cf.

Figure 6).

Figure 6 - A gauche, configuration « champignon » - A droite, configuration « brosse »

L’interféron, une glycoprotéine de la famille des cytokines est utilisé dans le cadre du traitement de l’hépatite C. Sa variante PEGylée, Pegasys®, permet d’effectuer des injections hebdomadaires plutôt que toutes les 48 heures (cf. Figure 7). Son élimination rénale est diminuée par un facteur 100.

Figure 7 - Effet de la PEGylation sur la pharmacocinétique de l'interféron IFN-α2a

Couvreur et al. ont également décrit l’effet bénéfique des groupements PEG sur la biodisponibilité de nanoparticules de polycyanoacrylate s’accumulant dans la rate. 30% des NPs PEGylées étaient présentes dans le plasma 6 heures après injection chez la souris, contre moins de 1% pour les NPs non PEGylées.

Malgré cette amélioration très importante de la pharmacocinétique des NPs apportée par les

groupements PEG, Ishida et al. ont observé un effet de mémoire : une première injection de

nanoparticules PEGylées accélère l’éliminations de ces mêmes NPs lors des injections

suivantes (cf. Figure 8).

Cet effet est baptisé effet ABC pour « accelerated blood

Introduction

Figure 8 - Effet ABC lors d'injections répétées de NPs PEGylées

Après la première injection, un anticorps spécifique anti-PEG (IgM anti-PEG), c’est-à-dire qui reconnait les groupements -(O-CH

-CH

)

-, est produit en quelques jours dans la rate.

L’effet ABC est visible lorsque la deuxième injection est effectuée entre 5 et 21 jours après la première injection. Lors de la seconde injection, si les IgM anti-PEG sont toujours présentes dans le sang, elles vont pouvoir complexer les groupements PEG, activer l’opsonisation et l’élimination des NPs PEGylées (cf. Figure 8). En revanche, l’injection d’une troisième dose donne lieu à un effet ABC plus faible voire nul, ce qui serait dû à une saturation des macrophages à cause des injections répétées des NPs PEGylées.

Cet effet dépend cependant de plusieurs paramètres tels que les caractéristiques de la nanoparticule (taille, composition, dose d’agent cytotoxique contenue dans la NP), des groupements PEG utilisés, de la voie d’administration des NPs et du type d’animal sur lequel les tests sont effectués. Ces études prouvent que les NPs PEGylées ne sont pas si « furtives » et déclenchent une réponse du système immunitaire.

Cependant, cet effet concerne principalement les liposomes pas ou très faiblement chargés en

agents cytotoxiques. En effet, plusieurs publications décrivent que les liposomes contenant de

la doxorubicine ou de la mitoxantrone ne déclenchent pas l’effet ABC. Ces agents cytotoxiques

pourraient inhiber la prolifération de lymphocytes et de macrophages, empêchant ainsi la

synthèse d’anticorps anti-PEG.

Cependant, ceci concerne les agents cytotoxiques non

spécifiques du cycle cellulaire. Les liposomes contenant du topotecan (agent spécifique du

cycle cellulaire, de la phase S, c’est-à-dire lors de la duplication du matériel génétique)

déclenchent l’effet ABC. Ceci pourrait également être dû au fait que le topotecan est plus

lipophile que la doxorubicine par exemple, et donc est expulsé du liposome beaucoup plus

rapidement. Ainsi, au moment où le liposome arrive dans la rate, l’effet de l’agent cytotoxique

sur les macrophages et lymphocytes est moindre.

Introduction

L’effet ABC n’est donc à priori pas à prendre en compte dans le cadre d’un traitement anticancéreux à base de NPs, mais doit être considéré pour des applications comme la théranostique, où les NPs sont moins chargées en agents cytotoxiques.

3.2 Utilisation de ligands

À cause de leur besoin de croissance continu, les cellules cancéreuses surexpriment un certain nombre de récepteurs par rapport aux cellules saines. Ces récepteurs peuvent être ciblés en utilisant divers ligands tels que des peptides, sucres, anticorps, aptamères ou de petites molécules. Le ciblage peut servir à améliorer la concentration locale en agents cytotoxiques, et permettre ou améliorer leur entrée dans la cellule, mais aussi dérégler la signalisation cellulaire.

Les premières nanoparticules fonctionnalisées par des ligands de ciblage remontent à 1975. Les travaux de Gregoriadis sur des liposomes présentant des anticorps

ont ainsi permis de décrire l’internalisation des liposomes via une endocytose récepteur dépendant.

Figure 9 - Ciblage - théorie Figure 10 - Ciblage - réalité

L’utilisation de ligands n’est cependant pas une stratégie de ciblage en soi, elle est en fait complémentaire à l’effet EPR. En effet, l’utilisation de ligands ne permet pas d’amener directement les NPs aux cellules surexprimant ces récepteurs (cf. Figure 9). L’accumulation des NPs par effet EPR aux abords de la tumeur est une première étape nécessaire. Le ciblage permet ensuite d’améliorer l’internalisation cellulaire (cf. Figure 10).

Une stratégie multi-étapes peut alors être utilisée : des ligands PEG sont utilisés pour prolonger

la circulation plasmatique de la NP, puis ceux-ci se décrochent aux environs de la tumeur pour

faire apparaitre des ligands de ciblage et ainsi favoriser l’internalisation de la particule. (cf.

Introduction

3.2.1 Cell penetrating peptides (CPP)

Les CPP sont des peptides courts (en général moins de 30 a.a.) utilisés pour leur capacité à passer la membrane cellulaire. Ils sont la plupart du temps chargés positivement.

Le premier usage de CPP remonte à 1988 lorsque deux groupes décrivent indépendamment l’internalisation cellulaire de la protéine TAT

, protéine de 86 acides aminés impliquée dans la transcription du virus du VIH. Neuf ans plus tard, Vivès et al. isolent la plus petite séquence nécessaire à l’internalisation cellulaire, constituée de 13 acides aminés : GRKKRRQRRRPPQ.

La plupart des CPP traversent les membranes via des interactions ioniques (poly arginine) avec la surface des cellules chargées négativement. Les résidus tryptophane des peptides peuvent également interagir avec les résidus tryptophanes présents à la surface des cellules.

Ces interactions sont donc non spécifiques et les CPP interagissent potentiellement avec toutes les cellules qu’ils rencontrent. En thérapie anti-cancéreuse, cela implique des effets secondaires importants. Pour éviter cet inconvénient, il est possible de créer des NPs furtives dont les PEG se détachent aux environs de la tumeur, exhibant ainsi les CPP uniquement autour de cellules tumorales (cf. paragraphe 3.2.9).

3.2.2 Acide Folique (vitamine B9)

Toutes les cellules vivantes nécessitent un apport en vitamines. Les cellules tumorales, à division rapide, ont un besoin particulièrement élevé en vitamines. C’est pourquoi elles surexpriment les récepteurs correspondants.

L’acide folique, aussi connu sous le nom de vitamine B9, est une petite molécule (441,4 g/mol) nécessaire aux cellules eucaryotes pour la synthèse des nucléotides.

Figure 11 - Acide folique

La survie et la prolifération des cellules dépendent de la capacité de la cellule à capter cette molécule.

Il a été décrit au début des années 90 que les deux principaux récepteurs à acide folique, FR-α

et FR-β sont surexprimés à la surface de certaines cellules cancéreuses, notamment dans le cas

Introduction

des cancers de l’ovaire, utérus, endomètre, cerveau, rein, voies aérodigestives supérieures et mésothélium pour le récepteur FR-α, et leucémie et sarcome pour le récepteur FR-β.

L’endocytose de l’acide folique – ainsi que des conjugués de l’acide folique – donne lieu à une internalisation dans l’endosome, suivi d’une sortie de l’endosome vers le cytoplasme par un mécanisme encore inconnu.

Ceci représente un grand avantage par rapport aux autres ligands de ciblage qui amènent les molécules dans le lysosome.

3.2.3 Acide Hyaluronique

L’acide hyaluronique est un polysaccharide naturel, alternant entre 250 et 25 000 motifs d’acide D-glucuronique et de N-acétyl-D-glucosamine (cf. Figure 12). Il fait partie de la famille des glycosaminoglycanes.

Figure 12 - Acide hyaluronique

Il est présent dans la matrice extracellulaire (MEC), le liquide synovial (liquide qui lubrifie les articulations), et de l’humeur vitrée des yeux. Il joue un rôle dans l’hydratation des tissus, puisqu’il fixe des molécules d’eau par ses groupements polaires et retient des cations hydratés.

De plus, l’AH adopte une structure rigide très hydratée qui peut occuper en solution un volume près de 1 000 fois supérieur au volume occupé à l’état sec. Ainsi les solutions d’acide hyaluronique peuvent être très visqueuses, c’est pourquoi il est également impliqué dans l’absorption des chocs. L’AH est dégradé par l’hyaluronidase, qui hydrolyse les liaisons β(1→4).

L’acide hyaluronique est également impliqué dans l’adhésion, la mobilité et la prolifération

cellulaire par le biais de plusieurs récepteurs cellulaires dont CD44 et RHAMM qui sont

surexprimés à la surface de certaines cellules cancéreuses. Le récepteur CD44 est également

exprimé au niveau de la cornée et de la conjonctive. Ainsi les NPs constituées d’AH peuvent

être utilisées pour le traitement de maladies oculaires.

Introduction

Une fois à l’intérieur des cellules, les NPs sont dégradées par les hyaluronidases présentes dans le cytosol des cellules cancéreuses.

3.2.4 Anticorps

Les anticorps sont des glycoprotéines de la superfamille des immunoglobulines synthétisés par les lymphocytes B, qui neutralisent les éléments étrangers ayant pénétré dans l’organisme, en reconnaissant des antigènes. L’anticorps se fixe sur l’antigène, puis le complexe anticorps- antigène est reconnu à son tour par les cellules du système immunitaire (lymphocytes NK, macrophages, protéines du complément), qui induisent la mort de l’élément étranger.

Tous les anticorps monoclonaux spécifiques d’un antigène ne reconnaissent qu’un épitope de cet antigène, alors que les anticorps polyclonaux sont un mélange très hétérogène d'anticorps monoclonaux reconnaissant tous le même antigène, mais sur des épitopes différents.

Les anticorps sont formés de 4 chaines polypeptidiques : - Deux chaines lourdes identiques d’environ 50 kDa - Deux chaines légères identiques d’environ 25 kDa

Ils adoptent une structure en Y. Un anticorps est composé de 2 parties : le fragment Fab et le fragment Fc, liés entre eux par une région charnière flexible (cf. Figure 13).

1 - Fragment Fab

2 - Fragment Fc (deux chaines lourdes (CH2, rouge foncé et CH3, rouge clair))

3 - Chaine lourde (bleu) avec une région variable (VH, bleu clair) suivie d'une région constante (CH1, bleu foncé)

4 - Chaine légère (vert) avec une région variable (VL, vert foncé) et une région constante (CL, vert clair) 5 - Site de fixation à l'antigène (Paratope)

6 - Régions charnières

Figure 13 - Composition d’un anticorps

La synthèse d’anticorps monoclonaux grâce aux hybridomes fut décrite en 1975

par Kohler

et al. Les premières thérapies à base d’anticorps ont rapidement rencontré un obstacle majeur

lorsqu’il a été découvert que les mAb murins engendraient une réponse immunitaire chez

l’Homme via la production d’anticorps anti-mAb murins (Human anti-murine antibody,

Introduction

HAMA).

Ce phénomène a conduit à la production d’anticorps chimériques dans un premier temps, puis humanisés dans un second temps (cf. Figure 14).

Figure 14 - Anticorps murin, chimérique, humanisé et humain

La chimérisation consiste à remplacer les domaines constants d’un anticorps murin par des fragments humains sans altérer sa spécificité. Les anticorps chimériques peuvent tout de même générer des réponses immunitaires, appelées HACA (Human anti-chimeric antibody).

Afin de diminuer davantage les réponses immunitaires, les anticorps humanisés ont été développés. L’anticorps est dit humanisé lorsque les fragments de chaines hypervariables (appelées CDR pour « complementarity determining regions ») sont dérivés d’anticorps de murin, et que le reste de l’anticorps est d’origine humaine.

(Tableau 1)

Tableau 1 Anticorps chimériques et humanisés – chronologie Anticorps chimérique Anticorps humanisé Premier anticorps chimérique, 1984

Premier anticorps humanisé, 1986

Abciximab, ReoPro

, 1993 Contre la formation de caillots lors

d’angioplasties

Daclizumab, Zenapax

, 1997 Contre le rejet lors de transplant de

reins Rituximab, Rituxan

, 1997

Lymphome non Hodgkinien

Trastuzumab, Herceptin

, 1998

Cancer du sein métastasé

Introduction

approuvé par la FDA en 2000, le Gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg

, laboratoires Wyeth) pour le traitement de la leucémie aigüe myéloïde,

avant d’être retiré en 2010.

Ils ont ensuite été conjugués à des nanoparticules, dès le début des années 90 pour l’imagerie de tumeurs

, pour la mise en place d’essais immunologiques plus sensibles

, pour la thérapie photodynamique en utilisant des NPs d’or

, pour l’imagerie et la thérapie avec des liposomes.

Une revue de Friedman et al. regroupe différents exemples d’applications de nanoparticules fonctionnalisées par des anticorps.

L’utilisation d’anticorps comme ligands de ciblage comporte cependant plusieurs inconvénients par rapport à la façon dont l’anticorps est greffé à la nanoparticule. De par la présence de nombreux groupements fonctionnels, la plupart des techniques de ligations, notamment celle dépendant des chaines latérales de lysine et cystéine, ne permet pas de contrôler l’orientation de l’anticorps sur les NPs. En résultent alors des NPs hétérogènes avec des pharmacocinétiques variables. Dans certains cas, les NP-mAb peuvent même être éliminées très rapidement de la circulation.

De même, puisque les anticorps ont une taille de l’ordre de la dizaine de nanomètres, ils peuvent augmenter de façon conséquente la taille de la NP sur laquelle ils sont greffés et changer son comportement.

3.2.5 Aptamères

Les aptamères sont des oligonucléotides (ON) simple brin (ADN ou ARN) adoptant des configurations tridimensionnelles uniques par le biais d’interactions intramoléculaires. Ils sont capables de lier spécifiquement des cibles biomoléculaires allant des petites molécules aux protéines (récepteur à transferrine, HER2, MUC1, PSMA, E-Selectine, intégrine α

β

, VEGF, protéine MMP-9, etc.) avec une forte affinité. Ils possèdent entre 20 et 100 résidus et un domaine constant pour leur reproduction enzymatique. Le terme « aptamère » est un mot inventé combinant le mot latin « aptus », pour « adapté à, attaché à » et le suffixe de grec ancien

« -mer », pour « part, portion ».

Les aptamères sont créés via le processus SELEX (pour Systematic evolution of ligands by

exponential enrichment).

La SELEX a été développée en 1990 par Tuerk et Gold

. Elle

consiste à mettre une banque combinatoire d’oligonucléotides synthétiques en présence d’une

cible définie. Après élimination des ODN non fixés, les ODN fixés sont élués, récupérés et

amplifiés par PCR. Ce processus de sélection et d’amplification est répété jusqu’à obtenir une

spécificité satisfaisante. Les séquences d’aptamères sont ensuite identifiées par séquençage.

Introduction

Figure 15 - Processus SELEX

La contre-SELEX a été développée en 1994 par Jenison et al.

pour augmenter la spécificité de l’aptamère. Les aptamères sont incubés avec des analogues de la cible, puis avec la cible, ce qui permet d’éliminer les aptamères qui se sont liés en premier lieu aux analogues.

Le Macugen® (Pegaptanib) est le premier traitement à base d’aptamères qui a été approuvé par la FDA, en 2004, dans le cadre de la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) sous sa forme « humide », qui correspond à la création de vaisseaux sanguins sur la paroi du globe oculaire, troublant ainsi la vue. En ciblant VEGF, ces ODN empêchent la formation de nouveaux vaisseaux. Ce traitement a ensuite été remplacé par Lucentis® (ranibizumab), un traitement plus efficace, à base d’anticorps monoclonaux.

Il existe aujourd’hui 10 traitements à base d’aptamères en phase clinique, dont deux contre le cancer (leucémie, myélome et cancer du rein métastasé), et de nombreux traitements sont à l’étude au stade préclinique.

Les aptamères sont souvent comparés aux anticorps. Les traitements à base d’aptamères présentent plusieurs avantages, puisqu’il est possible de les produire à grande échelle et qu’ils

Banque d’ODN

Cible Incubation

Élimination des ODN non liés Amplification des

ODN liés Clonage et

séquençage

dernière étape

Répétition

Introduction

et il est facile de modifier leur extrémité afin de les conjuguer à d’autres molécules ou à des NPs, sans problèmes d’orientation, contrairement aux anticorps.

Le principal frein au développement des aptamères a été le brevet qui protège la technique SELEX. Sa tombée dans le domaine public en 2008 devrait augmenter la productivité dans ce domaine. Les aptamères sont également rapidement éliminés de la circulation sanguine :

- lorsqu’ils ne sont pas modifiés, ils sont facilement dégradés par les nucléases - de par leur petite taille, ils peuvent être éliminés par les reins

Une technique permettant de pallier à ces désavantages est de les coupler à une petite molécule, un polymère ou une nanoparticule.

Les premiers exemples de NP-aptamères pour cibler le cancer ont été publiés il y a environ 10 ans par le laboratoire de Robert Langer, au MIT.

Ils décrivent l’utilisation de nanoparticules d’acide polylactique PEGylées contenant du docetaxel et décorées par des aptamères ciblant les cellules épithéliales de la prostate.

Ont suivi ensuite de nombreux articles aussi bien pour la thérapie à base de nanoparticules polymériques

que pour l’imagerie à base de nanoparticules métalliques (SPION, Au)

, en grande partie concernant le cancer de la prostate.

3.2.6 Sucres

Les lectines sont des protéines qui interagissent spécifiquement avec certains complexes osidiques issus de glycolipides ou de glycoprotéines. Cette interaction peut être aussi spécifique qu’une interaction antigène-anticorps ou substrat-enzyme. Elles sont impliquées dans plusieurs processus biologiques tels que la reconnaissance, la croissance, la signalisation, l’apoptose, la migration et l’adhésion des cellules, les interactions cellule-MEC, l’inflammation, etc.

L’équipe de Benjamin Davis a publié un exemple de NPs fonctionnalisées par des sialyl- LewisX ciblant les Selectines DC62, protéines de la famille des lectines, surexprimées lors d’inflammations. Ces NPs d’oxyde de fer permettent la détection de maladies neurologiques par IRM, telles que la sclérose en plaque et la maladie de Parkinson.

Figure 16 - Sialyl-LewisX

Introduction

Plusieurs exemples décrivent leur application en thérapie

et en imagerie

dans le cas du cancer du foie. En effet, de par leur interaction avec les ASGP-R (asialoglycoprotein receptor), protéines de la famille des lectines présentes à la surface des hépatocytes, les NPs fonctionnalisées par des D-Galactose et/ou D-Galactosamine peuvent cibler spécifiquement les cellules parenchymales du foie.

3.2.7 Transferrine

La transferrine est une glycoprotéine responsable du transport des ions de fer dans les cellules via les récepteurs à transferrine, ou TfR. Il existe deux types de récepteurs, TfR1 et TfR2. Le premier est présent en faible quantité sur de nombreux tissus sains, notamment la peau, le pancréas, le foie, le cerveau, les testicules. Le second, un récepteur analogue, est quant à lui exprimé par les hépatocytes sains. Il a 25 fois moins d’affinité pour la transferrine que le récepteur TfR1.

Les deux récepteurs sont surexprimés par certaines cellules cancéreuses,

notamment dans les cas du cancer du côlon, du sein, du rein, du poumon, du rein, de l’estomac et de l’ovaire.

Plusieurs stratégies permettent le ciblage de ces récepteurs : par l’utilisation de la transferrine, d’anticorps anti-TfR, de fragments d’anticorps ou de peptides reconnaissant les TfR. Les fragments d’anticorps de plus petite taille que la transferrine sont plus faciles à produire en grande quantité avec une bonne reproductibilité.

De plus, ils ne possèdent pas le fragment constant de l’anticorps et sont donc moins rapidement reconnus par le système immunitaire.

De nombreux exemples décrivent le couplage de ces ligands directement à des principes actifs ou à des cargos transportant des principes actifs.

La majorité des nanoparticules ciblées à usage thérapeutique contre le cancer en phase clinique utilisent la transferrine comme ligand, du fait de son abondance et de son faible coût.

3.2.8 Peptides

L’utilisation de peptides comme ligands de ciblage présente plusieurs avantages. Ils sont de

plus petite taille que les anticorps et sont facilement synthétisés en grandes quantités. Il est

possible d’identifier et sélectionner des peptides spécifiques d’une cible définie en utilisant le

phage display. L’esprit de cette technique est similaire à celui de la SELEX (cf. paragraphe

3.2.5). Des phages sont modifiés pour exprimer à leur surface des peptides, mais aussi des

Introduction

par infection de bactéries. Ce cycle est répété plusieurs fois, puis les phages sélectionnés sont analysés et testés pour l’activité recherchée. La séquence du peptide (ou de la protéine ou de l’anticorps) est obtenue par séquençage du brin d’ADN correspondant.

Cette technique peut être effectuée in vitro, mais aussi in vivo, comme décrit par Ruoslahti et al. pour la première fois en 1996.

Après injection intraveineuse d’une librairie de phage à une souris, les différents organes de l’animal sont broyés et les phages correspondants amplifiés. Cette technique a permis d’identifier des peptides qui présentent une forte spécificité pour le cerveau.

Puisqu’il existe un très grand nombre de séquences peptidiques pouvant être utilisées pour cibler les tumeurs, nous dressons ici une liste non exhaustive d’exemples de littérature.

Le peptide cyclique c[-RGDfK-] est le peptide le plus utilisé pour la fonctionnalisation de NPs dans le cadre du ciblage des cellules cancéreuses. Il permet de cibler les intégrines α

β

, récepteurs transmembranaires surexprimées à la surface de certaines cellules endothéliales autour de la tumeur. Son utilisation sera plus détaillée dans le l’introduction du Chapitre I.

Le peptide ATWLPPR est spécifique de la neuropiline-1, qui est un récepteur du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF). Benachour et al. ont rapporté l’utilisation de NPs de silice-gadolinium fonctionnalisées par ATWLPPR pour la photothérapie dynamique chez le rat exprimant un glioblastome.

LyP-1 (CGNKRTRGC) est un nonapeptide cyclique découvert par phage display en 2002 par l’équipe d’Erkki Ruoslahti

ciblant la protéine p32, surexprimée à la surface de certaines cellules tumorales, dans les vaisseaux lymphatiques associés aux tumeurs. L’expression de cette protéine dans les zones hypoxiques permet d’amener des composés au cœur de la tumeur.

L’équipe de Weiyue Lu a fonctionnalisé des NPs de PLGA

, puis des liposomes PEGylés

[108]

par le peptide LyP-1 afin de cibler les tumeurs métastasées dans les lymphes.

Valetti et al. ont décrit la fonctionnalisation de nanoparticules de squalène par des peptides

ciblant les vaisseaux sanguins des tumeurs des îlots pancréatiques.

Cette séquence

peptidique (CKAAKN) a été également découverte par phage display par Joyce et al.

Introduction

3.2.9 Interactions avec le micro environnement de la tumeur

Il est également possible de concevoir des nanoparticules capables d’interagir avec le micro environnement de la tumeur, qui possède des caractéristiques particulières.

Puisque les cellules tumorales transforment le glucose majoritairement en acide lactique, le pH aux alentours de la tumeur est plus faible (6,0-7,0) que dans les autres tissus et vaisseaux sanguins (7,4).

Ainsi, de nombreux articles décrivent la synthèse de nanoparticules sensibles au pH, qui, soit par dégradation ou expansion de la matrice de la NP vont libérer le principe actif autour de la tumeur, principalement via la protonation d’amines (chitosan

, poly asparagine

, poly histidine

, sulfonamide

, amines masquées

, etc.

) soit afficher des agents de ciblage au préalable masqués par des PEG via l’utilisation de bras espaceurs acido-labiles (interactions ioniques

, imine

, hydrazone

).

Certaines NPs tirent aussi parti de la présence accrue de métalloprotéinases matricielles (MMP) dans la MEC, qui vont pouvoir couper sélectivement certains fragments peptidiques MMP- sensibles.

Les MMP sont surexprimées dans presque tous les cancers humains, et sont souvent associées à un mauvais pronostique. Ce sont des protéases qui vont défricher la matrice extracellulaire, mais aussi dégrader des précurseurs de facteurs de croissance ou modifier la fonction de protéines pré-existantes. Ces protéines jouent un rôle clé dans l’angiogénèse et la croissance tumorale.

Parmi les exemples publiés, on retrouve l’utilisation d’un dendrimère révélant un bras polycationique après coupure d’un linker MMP-sensible, facilitant l’entrée dans la cellule.

Figure 17 - NP révélant un bras polycationique après l’action de protéines MMP

Un autre article décrit une nanoparticule PEGylée composée de gélatine encapsulant des

Introduction

tumeur, puis libérer les quantum dots (10 nm) lors de la dégradation du gel par les MMP qui pourront entrer en profondeur dans les tissus tumoraux grâce à leur petite taille.

Un autre exemple décrit l’utilisation de NPs de chitosane fonctionnalisées par des fluorophores liés à des « quencher » par une séquence peptidique sélectivement dégradable par les MMP.

Ainsi, lorsque les NPs s’accumulent au niveau de la tumeur, les fluorophores se détachent de la nanoparticule et du « quencher » après dégradation du linker, permettant ainsi leur fluorescence.

Harris et al. décrivent une NP d’oxyde de fer possédant un groupement PEG relié par un fragment peptidique MMP-sensible qui laisse apparaitre des polyarginines après clivage du linker, afin d’améliorer l’internalisation cellulaire. Cette NP est fonctionnalisée par des fluorophores pour des applications en imagerie.

3.2.10 Avantages et limitations des ligands

L’utilisation de ligands de ciblage ne fait pas encore l’unanimité, puisqu’ils ne permettent pas d’amener sélectivement les NPs aux cellules ciblées, mais plutôt de faciliter l’internalisation cellulaire une fois les NPs arrivées à proximité des cellules tumorales par effet EPR. Les interactions ligand/récepteur permettent aux NPs fonctionnalisées d’être retenues plus longtemps dans l’environnement de la tumeur, mais aussi d’être internalisées via une endocytose récepteur-dépendant. Ainsi, les principes actifs ne sont pas relâchés autour de la tumeur pour ensuite pénétrer par eux-mêmes dans les cellules tumorales, mais bien à l’intérieur des cellules après internalisation et dégradation des NP.

Le ciblage pourrait en revanche prendre le relais dans les cas de tumeurs où l’effet EPR est très faible voire inexistant, mais également dans le cas où les composés à amener dans la cellule ne peuvent pas d’eux-mêmes traverser la membrane cellulaire, typiquement les acides nucléiques, ou encore pour éviter les mécanismes de rejet ou « efflux » qui créent une résistance aux petites molécules hydrophobes telles que doxorubicine, vincristine, colchicine et etoposide.

De plus, en cherchant à cibler les cellules endothéliales plutôt que les cellules tumorales, il est possible d’éviter cet effet de résistance. Plusieurs peptides permettent de cibler les vaisseaux sanguins tumoraux

, dont le peptide RGD. Le peptide RGD a également été décrit plusieurs fois comme inhibiteur de métastases.

Comme évoqué précédemment, à ce jour seulement 12 NPs possédant un système de ciblage

ont atteint les tests cliniques dans le cadre du traitement du cancer. Tous ces traitements ont

montré une efficacité augmentée lors des tests précliniques (in vitro et in vivo) par rapport à

Introduction

leurs homologues non fonctionnalisés. Cependant, comme ces résultats ne peuvent être extrapolés chez l’Homme et que les tests cliniques actuels ne sont encore qu’en phase I ou II, il est difficile d’avoir une idée de l’apport réel des ligands de ciblage. De plus, lors de ces tests cliniques, aucune comparaison avec leur homologue non ciblé n’est étudiée.

Finalement, avant d’adopter une stratégie de ciblage, il est pour l’instant nécessaire d’évaluer les avantages et les inconvénients.

4 Nanoparticules

Un très grand nombre de nanoparticules ont été développées en laboratoire. Le choix du type de nanoparticule peut dépendre de l’application envisagée (relargage de principe actifs ou imagerie) en fonction de ses caractéristiques et de sa composition. Elles peuvent être regroupées en différentes familles. Les plus courantes sont présentées dans les paragraphes suivants.

4.1 Nanoparticules Lipidiques 4.1.1 Micelles

Les micelles (cf. Figure 18) sont constituées de molécules amphiphiles qui s’auto-assemblent en une structure possédant un cœur hydrophobe et une partie extérieure hydrophile. Elles ont typiquement une taille inférieure à 100 nm.

Figure 18 - Micelle

Les formes commerciales du paclitaxel et docetaxel, respectivement Taxol

et Taxotere

peuvent être qualifiées de micelles, puisqu’elles sont formulées avec un triglycéride émulsifiant, le Kolliphor

EL.

Les micelles représentent le plus simple des systèmes colloïdaux formés spontanément par des

molécules amphiphiles. Selon le type de molécules amphiphiles utilisées, les micelles peuvent

Introduction

structure micellaire. La concentration la plus faible à partir de laquelle les micelles commencent à se former est appelée la concentration micellaire critique (CMC).

Les systèmes micellaires ont deux principaux désavantages : faible taux de chargement en principe actif dû à un faible espace disponible à l’intérieur de la micelle et dissociation des micelles au moment de l’injection chez le patient.

4.1.2 Liposomes

Observés pour la première fois par Bangham et al. en 1964

, les liposomes (cf. Figure 19) sont des vésicules artificielles formées par une ou plusieurs bicouches lipidiques concentriques composées de molécules amphiphiles qui s’auto-assemblent en milieu aqueux.

Figure 19 - Liposome unilamellaire

Les liposomes peuvent être composés de phospholipides naturels ou synthétiques. À la différence des micelles, les liposomes sont capables d’encapsuler des composés polaires et apolaires, dans le compartiment aqueux et dans la bicouche lipidique respectivement. Ils sont facilement formés à partir de molécules amphiphiles (le plus couramment des phospholipides) non toxiques, non immunogènes, naturels et biodégradables.

Ils ont une taille allant de 20 nm à 150 nm de diamètre.

Le premier « nano » traitement à avoir été approuvé par la FDA est le Doxil®, un liposome PEGylé encapsulant de la doxorubicine, en 1995.

Il existe 4 méthodes classiques pour la synthèse de liposomes

:

- Un mélange de lipides est dissout dans un solvant organique, puis le solvant est évaporé pour obtenir un film lipidique. De l’eau est alors ajoutée, à une température supérieure à celle de transition des lipides utilisés. C’est avec cette technique que les premiers liposomes furent préparés. On obtient cependant des mélanges de liposomes multilamellaires de différentes tailles, allant jusqu’à 5 µm de diamètre. Il est possible

Cœur hydrophile

Couche lipophile

Introduction

de réduire la taille par sonication et d’obtenir des liposomes unilamellaires par extrusion à travers des filtres.

- Une amélioration apportée est la redissolution des lipides dans un éther (diéthylique ou isopropylique) après obtention du film fin. Elle permet d’obtenir une efficacité d’encapsulation plus élevée.

- Un mélange de lipides est dissout dans un solvant (éthanol/éther), puis ajouté à une solution aqueuse. Cette technique permet d’obtenir des liposomes avec une faible polydispersité et une faible taille (< 100 nm) sans avoir recours à l’extrusion ou à la sonication.

- Un mélange de lipides est dissout dans un détergent, qui est ensuite éliminé par dialyse.

Les liposomes sont formés lors de l’étape de dialyse.

La principale difficulté rencontrée lors du développement de formulations concerne la stabilité des liposomes, qui dépend du ratio principe actif/lipide. Idéalement, ce ratio doit être élevé, mais augmenter ce ratio diminue la stabilité des liposomes en milieux aqueux. En général les liposomes sont lyophilisés pour être conservés sous forme de poudre, puis solubilisés juste avant utilisation. La stabilité des liposomes peut être déterminée par différentes techniques : en mesurant la quantité de principe actif relâché par le liposome, par dichroïsme circulaire, par calorimétrie différentielle à balayage (DSC), etc. En plus des problèmes de stabilité et de fuite de principes actifs, les liposomes présentent d’autres inconvénients tels que de faibles taux de chargement en principes actifs lipophiles et le besoin d’utiliser un solvant organique pour leur préparation.

L’utilisation de copolymères amphiphiles possédant une masse molaire plus élevée que les phospholipides (de 1 000 g/mol à 10 000 g/mol) permet d’obtenir des liposomes polymériques, appelés polymersomes, avec une membrane plus épaisse, et donc une imperméabilité et une stabilité améliorées.

4.1.3 Nanoparticules à base de lipides solides – Lipides nanostructurés

Les nanoparticules à base de lipides solides (solid lipid nanoparticles, ou SLN) ont été développées au début des années 90. Elles sont composées de lipides, d’eau et d’émulsifiants.

Les lipides qui les constituent ont la particularité d’être solides à température ambiante et à la

température du corps humain. Étant composées majoritairement de lipides physiologiques, les