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Submitted on 1 Jun 2020
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Croissance vegetative et initiation fructifere in vitro de Pleurotus cornucopiae (Paul. ex Fr) : effets des ions
acetate et ammonium compares a d’autres sources carbonees et azotees
M. Mamoun, Jacques Delmas
To cite this version:
M. Mamoun, Jacques Delmas. Croissance vegetative et initiation fructifere in vitro de Pleurotus
cornucopiae (Paul. ex Fr) : effets des ions acetate et ammonium compares a d’autres sources carbonees
et azotees. Agronomie, EDP Sciences, 1984, 4 (9), pp.849-859. �hal-02720254�
Croissance végétative et initiation fructifère in vitro de Pleurotus cornucopiae (Paul. ex Fr.) : effets des ions acétate et ammonium com-
parés à d’autres sources carbonées et azotées
Michèle MAMOUN Jacques DELMAS
LN.R.A., Station de Recherches sur les Champignons, Centre de Recherches de Bordeaux, F 33140 Pont-de- la-Maye
RÉSUMÉ Le pleurote en corne d’abondance a fait l’objet récemment de plusieurs études concernant sa nutrition in vitro,
son écologie et ses possibilités de culture sur substrat organique.
La présente étude a pour but de préciser l’utilisation de certains sels organiques et celle d’azote ammoniacal
par Pleurotus cornucopiae pour sa croissance et son initiation fructifère. Cette alimentation est comparée à celle fournie par certains acides aminés utilisés classiquement dans le milieu de culture.
On montre en particulier l’intérêt des ions acétate et ammonium pour un rapport anion/cation proche de celui correspondant à l’équilibre ionique de la molécule d’acétate d’ammonium, soit 1/1, ceci notamment pour l’obtention des primordia.
Mots clés additionnels : Pleurote, nutrition, sels organiques.
SUMMARY In vitro growth and fruiting initiation of Pleurotus cornucopiae (Paul. ex Fr.) : effect of acetate
and ammonium ions as compared with other carbon and nitrogen sources.
Several experiments were carried out recently on the nutrition in vitro and the ecology of P. cornucopiae and the possibility of its culture on organic substrate. The object of the present work was to check the response of P. cornucopiae to some organic salts and ammoniacal nitrogen. This type of nutrition was compared with the amino-acids usually used in the culture medium. The authors demonstrated, especially for primordium forma- tion, the positive, effect of acetate for an anion/cation ratio close to the ionic equilibrium of the ammonium acetate molecule, i.e. 1/1.
Additional key works : Pleurots, nutrition, organic salts.
1. INTRODUCTION
L’alimentation carbonée et azotée des champignons supérieurs a fait l’objet de nombreuses études in vitro
en vue d’une meilleure connaissance de leur métabo- lisme et du choix de substrats particulièrement adaptés à leur culture en assurant une bonne croissance mycé- lienne et une fructification intense et homogène.
Le caractère mésothermophile de Pleurotus cornu-
copiae (Paul. ex Fr.), allié à ses qualités alimentaires
et gustatives, conduit à développer sa culture en vue
d’une rotation annuelle où il alternerait avec des
champignons mésophiles (Pleurotus ostreatus et
autres) et thermophiles (Volvariella volvacea par
exemple), d’où les recherches entreprises sur ses exi-
gences nutritives.
En matière de nutrition carbonée, la source la meil- leure diffère selon les espèces, voire les souches (Bonus, 1959). Le glucose, utilisé par presque tous les
champignons cultivés (COCHRANE, 1958) se place vis-à-
vis de la croissance mycélienne non loin du mannose et
du fructose pour de nombreuses espèces (COCHRANE, 1958)
-en particulier pour P. cornucopiae (DE LMAS
& MAMO U N, 1980) -, du mannose et de l’amidon
chez P. ostreatus (HAS HIM O TO & T AKAHASHI , 1974), du maltose et de l’amidon chez certaines souches de Pleurotus eryngii (D. C. ex Fr.) Quelet (CAILLEUx et al., 1974) ou du maltose et du saccharose pour Pleu- rotus flabellatus (S RISVASTAVA & B ANO , 1970).
Généralement les hexoses conviennent pour une fructification asexuée mais diminuent ou répriment totalement la reproduction sexuée, même pour une concentration inférieure à celle utilisée pour la crois-
sance mycélienne (AINSWORTH & S U SS MAN , 1966).
L’effet inhibiteur du glucose sur la fructification est
observé chez le genre Pleurotus.
Cet effet inhibiteur peut être levé empiriquement dans le cas de plusieurs espèces par l’asparagine utili-
sée comme aliment azoté (M AN ACHERE, 1970). En outre, l’asparagine est souvent une des meilleures
sources d’azote pour la croissance mycélienne (COC H -
RA NE, 1958).
AINSWORTH (1966) note qu’en général la même ori-
gine azotée est convenable pour la croissance et la fructification. Ceci se retrouve avec l’asparagine pour
P. cornucopiae (DELMAS & MAMOUN, 1980).
Le remplacement de l’asparagine par un sel
d’ammonium comme source d’azote peut conduire à
une réduction de la croissance, si l’anion est un acide fort, en raison de la baisse de pH qu’entraîne l’absorption de l’ion NH+ (SRIVASTAVA & B ANO , 1970 ; HASHIMOTO & TAKAHASHI, 1974).
L’utilisation du carbonate ou du phosphate d’ammonium, ou l’incorporation d’un sel organique
dans le milieu, doit donc être préférée (COCH RAN E, 1958). En présence d’un sel organique le pH est main-
tenu à l’optimum (> 6 dans le cas des pleurotes) et
l’ion ammonium est facilement absorbé et métabolisé ainsi que l’ion organique qui l’accompagne.
L’effet acide organique est un effet pH (MORTON &
Me MILLAN, 1954), et l’utilisation de l’ion ammo-
nium ne peut être déterminée que si l’effet pH est exclu expérimentalement (COCHRANE, 1958).
Des travaux ont montré que chez certains champi-
gnons, dont le champignon de couche (Bonus, 1959), le complexe sel organique-ammonium fournit une
excellente source d’azote et participe à l’alimentation carbonée ou, tout au moins, stimule l’utilisation du
glucose pendant la phase mycélienne.
De même, sur milieu synthétique renfermant du
glucose, l’apport d’azote sous forme de citrate d’ammonium induit chez P. flabellatus une meilleure
croissance que l’asparagine, elle-même mieux utilisée que les sels d’ammonium d’acides forts (SRIVAST AVA
& B AN O, 1970).
En présence d’acétate, une souche de Saccharomy-
ces cerevisiae à asques bisporées retrouve un cycle
sexuel normal avec faculté de produire des asques
tétrasporées. Chez cette même levure, le glucose cons- titue un inhibiteur de la méiose (BILINSKI & MILLER,
1980).
Gibberella zeae (Schw.) Petch sporule 10 fois plus si l’acétate remplace le glucose comme seule source de
carbone (HUA NG et al., 1979).
TURIAN (1963) suggère que l’acétate en excès acca-
parerait le coenzyme A au détriment de l’acide a-céto-
glutarique ; ce dernier, accumulé, provoquerait alors
un refoulement de la 1 r e séquence du cycle de Krebs jusqu’à sa bifurcation isocitrique, l’isocitratase ouvrant alors la voie glyoxylique.
Les agents exerçant un anti-effet Pasteur, tels que les ions NH4, sont anti-conidiogènes. Ce double effet
négatif n’a lieu qu’en présence d’un fort apport de
sucre fermentescible (effet glucose). Une subtile balance régulative entre la respiration et la fermenta- tion contrôle le taux de formation des conidies (T
URIAN
, 1970).
Dans le cas de P. cornucopiae, peu de travaux ont été entrepris sur son alimentation carbonée et azotée.
D
UDKA (1976) signale, pour un mélange amidon et chlorure d’ammonium (milieu de Molish), une crois-
sance mycélienne supérieure à celle obtenue sur un
substrat renfermant du glucose et de la peptone. Des ébauches composées d’un pied blanc et d’un chapeau jaune clair ou crème apparaissent uniquement sur le
l
er milieu. La valeur du pH (non indiquée) et la pureté de l’amidon utilisé (présence éventuelle de facteurs de
croissance) pourraient expliquer cet effet obtenu avec un sel d’acide fort. Il faut noter cependant que ce résultat n’a pas été retrouvé avec la souche blanche de P. cornucopiae récoltée en Gironde (DELMAS &
M AM O UN
, 1980).
Compte tenu de l’ensemble des résultats évoqués ci-
dessus et portant sur d’autres espèces dont quelques-
unes du genre Pleurotus, les auteurs de cette note ont
cherché à expérimenter in vitro l’effet éventuel des ions organiques et celui de l’ammonium et de leur combinaison, tant sur la croissance mycélienne que
sur l’initiation fructifère (formation des primordia).
L’accent est mis particulièrement sur l’ion acétate
en présence d’ammonium en comparaison avec
d’autres sources carbonées et azotées.
La relation doit être faite entre l’utilisation des sels
organiques par le champignon et le métabolisme car-
boné et azoté de l’organisme à travers le cycle tricar- boxylique ou la voie des pentoses phosphates emprun- tés par certaines espèces (LE Roux, 1962, 1965).
On peut ainsi, à titre d’exemples, reprendre le schéma de H UAN G (1979) montrant le rôle de l’incor-
poration d’acétate dans le substrat pour le fonctionne-
ment du cycle tricarboxylique et du cycle glyoxylique,
en vue, notamment, de la synthèse des acides aminés (LE Roux, 1965), ainsi que celui de TURIAN (1963)
sur les voies métaboliques alternatives : cycles de
Krebs - cycle glyoxylique.
Il faut souligner l’importance, pour ces études sur
la nutrition, du rapport C/N dans le milieu de cul- ture, ainsi que l’effet néfaste d’une concentration en azote trop élevée (A INSWORTH , 1966 ; BOH U S, 1959) pouvant même jouer le rôle de fongicide si cet excès
azoté est sous forme ammoniacale (COCHRANE, 1958).
II. MATÉRIEL ET MÉTHODES
A. Souches utilisées
Les expérimentations décrites dans cet article ont
été effectuées avec une souche blanche de P. cornuco-
piae issue d’un bouturage de carpophore prélevé sur feuillu à Pessac (Gironde), à la fin de l’automne 1977
(souche G).
L’effet de l’acétate d’ammonium sur la croissance mycélienne a également été testé sur 3 autres isolats.
Deux d’entre eux, blanc à crème, obtenus l’un par
bouturage (B), l’autre par germinations plurispores (P), proviennent de carpophores récoltés sur une sou-
che de peuplier, en bordure du Cher, à Villandry (Indre-et-Loire), le 3 mai 1982 ; le 3 e est une souche commerciale (Somycel 3040), d’origine asiatique, pré-
sentant un chapeau jaune citron.
Les descriptions des espèces européennes (P. cornu- copiae (Fr.) Quel.) et asiatiques (P. aff. cornucopiae)
sont données par CORNER (1981).
B. Description et nomenclature des milieux testés Le milieu Tanaka (Ou, 1972) modifié (tabl. 1)
-ornithine remplacée par asparagine
-a été choisi
comme milieu témoin en raison de son aptitude à
induire à la fois une croissance correcte et une bonne initiation fructifère (DELMAS & MAMOUN, 1980).
Les milieux testés ont tous en commun les macro- et
micro-éléments minéraux du milieu témoin.
Afin de les différencier, principalement pour les cal- culs statistiques, ils ont reçu une appellation dérivant
de leur composition :
-
T 100 p. 100 de l’azote est apporté par l’aspa- ragine
-
Tg 100 p. 100 de l’azote est apporté par le glu-
tamate
-
T * 100 p. 100 de l’azote est apporté par le chlo-
rure d’ammonium
-
T’ 100 p. 100 de l’azote est apporté par un sel
organique d’ammonium
-
a apport d’acétate de sodium
-
a k apport d’acétate de potassium
-
A apport d’acétate d’ammonium
-
ci apport de citrate de sodium
-
Ci apport de citrate d’ammonium
-
ox apport d’oxalate de sodium
-
Ox apport d’oxalate d’ammonium
-
C ’ et C&dquo; : modification de la teneur en carbone
-
L’indice numérique placé après les lettres a ou A
indique le pourcentage de carbone apporté par l’acé- tate par rapport au carbone total (ex. : T * a 4 = 4 p. 100
du carbone sous forme d’acétate de sodium). D’après
cette nomenclature, le milieu témoin est noté T.
Tous les milieux possèdent les mêmes taux d’azote (0,19 g/1) et de carbone (8,32 g/1), et le même C/N (soit 43,8) que le milieu de référence, exception faite
pour les études portant sur des quantités croissantes d’acétate d’ammonium qui entraînent une augmenta- tion proportionnelle du taux d’azote.
Deux cas sont alors envisagés : soit le C/N est
maintenu constant par addition de glucose, soit la
teneur en carbone est laissée identique à celle du
milieu témoin, ce qui conduit à des C/N de 21,9 et 14,6. Ces valeurs sont comprises dans l’intervalle con-
venable pour la croissance et l’initiation fructifère (DELMAS & MAMOUN, 1980).
Le citrate et l’oxalate de sodium ou d’ammonium
sont apportés aux concentrations conduisant à un taux d’azote de 0,19 g/1 de milieu, soit identique à
celui du milieu témoin.
Tous les milieux ont un pH de 6,4 ou ajusté (avec
NaOH IN) à cette valeur, ce qui évite de mauvais résultats dus à un pH trop bas (DELMAS & MAMOUN,
1980 ; SRIVASTAVA & BANO, 1970).
La répartition en g/1 et en p. 100 des sources de car-
bone est indiquée dans les tableaux 2 à 5 où T, T * , et
T’ différencient les origines azotées.
C. Mode opératoire
Les différents milieux gélosés (20 g d’agar Difco/1
de milieu) sont répartis à raison de 20 ml par boîte de Petri et inoculés avec un explantat de 0,8 cm de dia- mètre provenant d’une pré-culture sur milieu Raper complet (bonne croissance mais faible fructification), âgée d’environ 10 jours.
Pour les études de croissance, les boîtes sont incu- bées à 24 °C pendant 10 j, durée optimale pour obte- nir par la suite une bonne initiation fructifère (D EL -
MAS & M AMOUN , 1980). Le développement mycélien
est déterminé par la valeur moyenne de 2 diamètres
perpendiculaires.
Après incubation, les boîtes sont placées en condi- tions de fructification dans une salle climatisée à 17- 20 °C avec une humidité relative de 70-90 p. 100. Un tube « lumière du jour » (réf. Claude U 40 RS) assure
une intensité lumineuse de 300 à 400 lux au niveau des cultures. La photopériode est fixée à 18 h de lumière par 24 h. Ces conditions ont été déterminées comme
étant optimales pour l’initiation fructifère de P. cor-
nucopiae (D ELMA S & M AMOUN , 1982).
Les primordia obtenus présentent tous un chapeau bien formé, distinct du pied, et parfois des lamelles.
Le nombre d’ébauches est noté après 30 j en salle de fructification.
D. Analyses statistiques
Afin de déterminer si les variations observées sont
significatives, nous avons choisi parmi les tests statis- tiques proposés par SOKAL & ROHLF (1969) :
-
le test de Student, afin de détecter une éventuelle influence du milieu de base sur la croissance mycé- lienne ;
-
le test G pour les résultats exprimant le nombre de primordia obtenus par boîte sur les différents milieux (ce test a l’avantage de permettre de comparer
de petits nombres) ;
-
l’analyse de la variance à une voie et la décom- position orthogonale des effets du traitement pour définir l’influence d’apports croissants d’acétate de sodium ou d’ammonium sur la croissance ou l’initia- tion fructifère.
III. RÉSULTATS
Le tableau 6 et les figures 1 à 3 permettent de com- parer l’action des diverses sources carbonées et azo-
tées utilisées seules ou en mélange.
L’alimentation carbonée sous forme de glucose et
asparagine et la nutrition azotée fournie exclusivement
par cet acide aminé (T) conduisent à une croissance
convenable (fig. la) et à une très active initiation fruc- tifère (DELMAS & MAMOUN, 1980). Cette dernière est moins importante si l’on remplace l’asparagine par le
glutamate (Tg - fig. lb).
En présence de glucose comme source de carbone, le remplacement de l’azote aminé par de l’azote
ammoniacal, apporté par du chlorure d’ammonium
(T
*
- tabl. 2) conduit à une meilleure croissance (fig. la et annexe 1), mais inhibe totalement la forma- tion de primordia (fig. lb). Ce comportement peut varier suivant les espèces de pleurotes. Ainsi, HASHI-
MOTO & T AKAHA SHI (1974) signalent-ils un développe-
ment moindre de P. ostreatus en présence de chlorure d’ammonium qu’avec l’asparagine.
Par contre, l’effet anti-sporulant des ions NHQ paraît être généralisé (T URIAN , 1970).
L’apport d’acétate de sodium (a) ou de potassium (a
k
) en présence d’acide aminé (Ta et Ta k : acétate et asparagine, Tga et Tga k : acétate et glutamate —
tabl. 2) entraîne une amélioration de la croissance qui
ne s’avère hautement significative que si l’azote est
fourni par le glutamate (fig. la et annexe I) et conduit à une initiation fructifère dans chaque cas (fig. lb et
annexe 2).
En présence d’acétate de sodium, si tout l’azote est ammoniacal — suppression de l’acide aminé — (T * a - tabl. 2), la croissance est particulièrement activée (fig. la et annexe 1) et l’initiation fructifère a ten-
dance à s’intensifier, toutefois non significativement
au seuil de 5 p. 100 (fig. lb et annexe 2).
L’apport de quantités croissantes d’acétate de sodium en présence d’une quantité fixe de chlorure d’ammonium (T * a 2 à T * a 8 - tabl. 3) maintient le même niveau de croissance, supérieur au témoin (T) et
au milieu T * . Aucune variation significative reproduc-
tible n’est observée entre les différents apports d’acé-
tate dans les limites de l’expérimentation (fig. 2a et
annexe 3).
Pour un équilibre acétate-ammonium correspon- dant à la molécule d’acétate d’ammonium (4 p. 100 du carbone total), une amélioration répétitive (cf.
essais 1 et 2, fig. 2b) de l’initiation fructifère par rap- port à celle obtenue sur le milieu T ne s’avère toute- fois pas significative au seuil de 5 p. 100 (annexe 4).
Une plage optimale pour la formation de primordia
est observée pour un apport d’acétate compris entre 4
et 6 p. 100 du carbone total et un phénomène de toxi- cité s’amorce pour un taux de 7 p. 100 (fig. 2b et
annexe 4).
Enfin, l’apport d’acétate d’ammonium (T’ A) - en remplacement de l’acétate de sodium plus chlorure d’ammonium (T * a 4 )
-conduit également à un opti-
mum significatif pour la croissance (tabl. 4 - fig. 3a et
annexe 5).
Le ralentissement de la croissance mycélienne
-ramenée au niveau du témoin — observé avec le milieu T’A 4 C&dquo; (0,99 g C/1 fourni par l’acétate
d’ammonium) et C/N total constant (tabl. 4) peut s’expliquer par l’effet inhibiteur du glucose apporté ici
en grande quantité afin de maintenir le C/N. L’amé- liora
t
ion de la croissance notée avec le milieu T’ Ag
(annexe 5) qui renferme la même quantité d’acétate
d’ammonium (0,66 g C/1) mais moins de glucose que le milieu T’A 4 C’ (tabl. 4) semble confirmer cette
hypothèse.
L’initiation fructifère optimale, en présence d’acé-
tate d’ammonium (fig. 3b et annexe 6) est obtenue,
par contre, avec un apport supplémentaire de glucose (T’.A
4
C’ et T ’ A 4 C &dquo; tabl. 4). Le rapport de la teneur
en carbone des 2 molécules, acétate et glucose (identi-
que dans T’A 4 , T’A 4 C’ et T’A 4 C&dquo;), pourrait jouer
un rôle important, un équilibre étant nécessaire pour la levée de l’effet inhibiteur du glucose par l’acétate.
Toutefois, une tendance à la réduction du nombre de primordia pour un apport élevé d’acétate est obser- vable pour les 2 rapports C/N et peut donc être sup-
posée due à l’excès de sel organique, sa concentration dans le milieu de culture intervenant également.
L’amélioration de la croissance mycélienne liée à l’apport d’acétate d’ammonium (0,33 g C/1) se
retrouve pour les autres souches blanches (B et P) d’origine européenne ainsi que pour la souche jaune asiatique (J) de P. cornucopiae ; l’effet de ce sel sur l’initiation fructifère n’a pas été testé sur ces 3 isolats.
COCHRANE (1958) signale la présence du citrate parmi les acides organiques les plus utilisés par les
champignons, ainsi que l’assimilation de l’acide oxali- que par certains organismes dont Psalliota bispora. Le citrate d’ammonium est un excellent apport nutritif
pour la croissance de P. ostreatus (VOLTZ, 1972).
Cette étude sur l’utilisation des sels organiques par
P. cornucopiae (G) a été poursuivie avec les ions
citrate et oxalate (tabl. 5 et 7). Les résultats sont à
rapprocher de ceux obtenus avec l’acétate.
En présence d’asparagine, l’apport de citrate ou
d’oxalate de sodium n’entraîne pas de variation signi- ficative de la croissance au seuil de 5 p. 100 (cf.
annexe 7). Dans le cas où l’azote est ammoniacal, on
note une amélioration de la croissance mycélienne et
aucune différence n’est observée au seuil de 5 p. 100 entre l’apport de sel organique d’ammonium (T’ Ci et T’Ox) et celui du mélange : sel organique de sodium
correspondant plus chlorure d’ammonium (T * ci et T
* ox).
L’initiation fructifère n’est en aucun cas modifiée
significativement par rapport à T au seuil de 5 p. 100,
que les ions citrate ou oxalate soient associés à l’aspa- ragine ou à l’ion ammonium. On peut noter un très léger avantage de T’Ox sur T * ox (cf. annexe 8).
IV. DISCUSSION ET CONCLUSION
Les résultats de ces expériences conduites in vitro
sur diverses souches de P. cornucopiae ont montré l’influence positive des ions organiques et, particuliè- rement, de l’ion acétate ainsi que celle de l’ion ammo-
nium sur la croissance mycélienne.
L’effet sur l’initiation fructifère est marqué dès l’apport d’une faible quantité d’ion organique en pré-
sence d’ammonium comme source d’azote, ce dernier
s’avérant alors beaucoup mieux utilisé qu’une source amidée ou aminée (glutamate, asparagine).
Le maximum de formation de primordia est obtenu
pour un équilibre du C/N partiel (C apporté par l’acétate/N provenant de l’ammonium) proche de
celui correspondant à la molécule d’acétate d’ammo- nium (C/N = 2 pour cette molécule).
Les autres sels organiques n’exercent pas un effet aussi bénéfique.
L’action favorable de l’apport concomitant d’ions acétate et ammonium s’exerçant à la fois sur la crois-
sance et sur l’initiation fructifère, cette alimentation représente une amélioration certaine par rapport à celle fournie par la plupart des milieux de culture. On observe, en effet, généralement, une corrélation inverse entre la croissance mycélienne et l’intensité de la fructification (A IN SWORTH, 1966) sur un même milieu, un mycélium à croissance moyenne conduisant par la suite à une fructification plus intense qu’un mycélium poussant rapidement (COCHRA N E, 1958).
La plupart des observations relevées par différents
auteurs sur d’autres espèces de champignons sont con- firmées pour P. cornucopiae.
On peut les résumer ainsi :
-
influence du pH,
-
influence du rapport C/N,
-
rôle stimulateur de l’ion organique sur l’utilisa-
tion du glucose,
-
action synergique de l’ion organique et de l’ion ammonium,
-