Identification et caractérisation de nouveaux médiateurs de l'activité biologique de la protéine suppresseur de tumeur p53

Université Libre de Bruxelles (IBMM) Faculté des Sciences

Département de Biologie Moléculaire Laboratoire d'Embryologie Moléculaire

Directeurs de thèse : Dr. Eric Bellefroid

Dr. Jean-Christophe Marine

Identification et caractérisation de nouveaux médiateurs de l'activité biologique de la protéine suppresseur

de tumeur p53

Thèse présentée en vue de l'obtention du grade académique de Docteur en Sciences

Gilles Doumont

Année académique 2004 - 2005

Université Libre de Bruxelles (IBMM) Faculté des Sciences

Département de Biologie Moléculaire Laboratoire d'Embryologie Moléculaire

Directeurs de thèse : Dr. Eric Bellefroid

Dr. Jean-Christophe Marine

Identification et caractérisation de nouveaux médiateurs de l'activité biologique de la protéine suppresseur

de tumeur p53

Thèse présentée en vue de l'obtention du grade académique de Docteur en Sciences

Gilles Doumont

Année académique 2004 - 2005

Identification et caractérisation de nouveaux médiateurs de l'activité biologique de la protéine suppresseur de tumeur p53

Thèse présentée en soutenance privée le mercredi 20 juillet 2005 et en soutenance publique le mardi 13 septembre 2005 devant le jury composé des membres suivants :

Dr. L. Droogmans Université Libre de Bruxelles Président Pr. R. Herzog Université Libre de Bruxelles Secrétaire

Dr. E.J. Bellefroid Université Libre de Bruxelles Directeur de thèse Dr. J-C. Marine Université Libre de Bruxelles Directeur de thèse

Vlaams Instituut voor Biotechnologië (Gent, België)

Dr. M. Voz Université de Liège (Liège, Belgique) Expert extérieur Pr. J-M. Ruysschaert Université Libre de Bruxelles Expert de la Faculté Dr. S. Schurmans Université Libre de Bruxelles Expert de la Faculté

Gilles Doumont

Laboratoire d'Embryologie Moléculaire Département de Biologie Moléculaire

Institut de Biologie et Médecine Moléculaire (I.B.M.M.), Faculté des Sciences

Université Libre de Bruxelles (U.L.B.)

REMERCIEMENTS

Je tiens à remercier tout particulièrement les Professeurs Eric Bellefroid et Jean- Christophe Marine pour m'avoir accueilli dans leur laboratoire respectif, et le Docteur Jean-Christophe Marine pour avoir accepté de diriger mon travail.

Je voudrais également remercier tous les membres des Laboratoire d'Embryologie Moléculaire (ULB-IBMM, Gosselies) et Lab for Molecular and Cancer Biology (LMCB - UGent VIB, Zwijnaarde) qui, par leur soutien, m'ont permis de mener à bien ce travail.

J'aimerais aussi remercier les personnes qui ont directement contribué aux projets, à savoir le Docteur Alain Martoriati (Laboratoire d'Embryologie Moléculaire et LMCB) qui a participé de manière égale aux deux publications, Chantal Beeckman (LMCB) et le Docteur Sven Bogaerts (LMCB) pour leur contribution aux expériences d'incorporation de BrdU en cellules, le Professeur Pier Giuseppe Pelicci et les Docteurs Myriam Alcalay et Emanuella Colombo des Department of Experimental Oncology (European Institute of Oncology) et FIRC Institute of Molecular Oncology (Milan, Italie) pour leur aide dans les technologies de criblage des biopuces et de PCR quantitative, le Professeur Austin Smith et le Docteur Patrick Joe Mee pour avoir mis à disposition leur lignée de souris inactivées pour le gène ptprv, le Professeur Fabrice Bureau pour son aide dans les expériences de cytométrie de flux, et enfin les Docteurs Francesco Marchesi et Eugenio Scanziani pour l'analyse histopathologique de cadavres de souris. Je tiens également à remercier les Docteurs Geert Berx et Jody Haigh et le Professeur Aart Jochemsen, ainsi que les membres de leur laboratoire respectif, pour leurs avis et conseils scientifiques.

Mes remerciements vont également aux différents organismes ayant financé ce travail, à savoir le Fonds pour la Formation à la Recherche dans l'Industrie et l'Agriculture (FRIA), le Télévie, l'Université Libre de Bruxelles (ARC), la Vlaams Instituut voor Biotechnologië (VIB) et la Fondation Jean Brachet d'une part, et Fortis Banque Assurance, AICR, la Fédération Belge contre le Cancer et le programme FP6 ACTIVEP53 de l'Union Européenne d'autre part.

De manière moins officielle je voudrais vous remercier tous les deux, Eric et Jean- Christophe, pour votre aide, vos conseils judicieux, votre soutien inconditionnel et votre patience qui m'ont beaucoup aidé durant ces années que j'ai passé à vos côtés.

Merci, Bruno, pour m'avoir inculqué avec patience le métier que j'ai pu exercer pendant mes années de thèse. Le partage sans limite de tes connaissances mais aussi ton soutien et la bonne humeur qui te caractérisent resteront à jamais gravés dans ma mémoire.

Alain, le binôme que nous avons formé m'a fait découvrir en toi bien plus qu'un

collègue: un véritable ami. Je pense que notre entraide, le partage de nos d'idées et

de nos expériences précédentes, nos consensus et surtout notre amitié ont été essentiels à l'aboutissement de ce travail.

Merci Ludivine pour ta bonne humeur, ton efficacité, ton travail mais surtout pour ton amitié.

Quant à vous Marion et Françoise, sachez que jamais je n'oublierai ces années ponctuées de grandes joies et de fous rires. J'ai pu découvrir en vous de véritables amies sur lesquelles je sais que je peux et pourrai toujours compter. J'ai eu un immense plaisir d'avoir pu aider du mieux que j'ai pu quelqu'un comme toi, Marion, pendant ton mémoire, puis par la suite d'avoir pu former un binôme avec toi. J'ai été ravi d'avoir pu participer à tes projets de thèse.

Sarah, Claude, Vincent, Julien et Pascal, je tiens aussi à vous remercier tout particulièrement. Sachez que votre soutien et surtout votre sincère amitié durant toutes ces années m'ont été, me sont toujours, et me seront précieux.

De même je suis très content d'avoir pu travailler à vos côtés Emmanuelle, Virginie, Sarah, Katia, Sadia, Frédéric, Flavio et Massimo. Merci pour les bons moments que nous avons passé ensemble au laboratoire.

Dank u wel Chantal, Ines, Dieter en Sven. Als we waren niet aan de samen plaats voor werken waren, waren uw hulp en vriendschap capitaal tijdens de maanden en de jaren van mijn doctoraal studies.

Enfin, je ne peux vous oublier Valérie, Odile, Sophie et Serge pour vos aides, soutiens mais surtout pour votre amitié. Merci aussi à vous, Chiat, Kadiombo et Reginald, pour votre aide et amitié mais aussi Annick, Charlotte, Bénédicte, Nathalie, Marianne, Eileen, Céline, Monique, Dominique, Isabelle, Evelyne, Bernard, Stéphane, Frédéric, Hakim, Johan, Karim et Marie-Jeanne (IRIBHM) et Nathalie (Laboratoire de Chimie Biologique).

Je voudrais aussi remercier tous les membres de l'IBMM et Biovallée qui ont pu m'aider à l'un ou l'autre moment, en particulier Christelle (Biovallée).

Je tiens enfin et surtout à remercier ma famille et mes proches pour leur soutien et

leur compréhension pendant ces années d'études doctorales.

TABLE DES MATIERES

Liste des abréviations et symboles utilisés

I. Introduction 1. Le cancer

1.1. Qu’est-ce qu’un cancer ?

1.2. Les différents types de tumeurs

1.3. Oncogenèse et propriétés des cellules tumorales 1.4. Origine des cellules tumorales

1.5. Causes du cancer

2. p53, la principale protéine suppresseur de tumeur connue à ce jour 2.1. Généralités

2.2. Structure

2.3. Quels sont les mécanismes par lesquels p53 est régulé ?

2.3.1. Les principales modifications post traductionnelles de p53

2.3.2. Les protéines régulatrices de l'activité et de la stabilité de p53

2.4. L'activation de p53 induit l'élimination des cellules potentiellement tumorales via sa fonction d'activateur transcriptionnel

2.4.1. Quelle est l'action de p53 quand il est activé ? .

2.4.2 Quels sont les mécanismes par lesquels p53 induit l'apoptose ou l'arrêt du cycle cellulaire ?

1 1 1 2 3 3 7 7 8 9

9

11

16 16

19

II. But du travail III. Résultats

1. Identification de cibles de p53

2. Dapk1 (Death Associated P rotein Kinase 1) 2.1. Introduction

2.2. Résultats

2.2.1 mdapk1 constitue une nouvelle cible transcriptionnelle directe de p53

2.2.2. L'induction de l'expression de mdapk1 par c-Myc nécessite la présence de p53

3. Ptprv (Protein T yrosine Phosphatase Receptor typeV) 3.1. Introduction

3.2. Résultats

3.2.1. mptprv constitue une nouvelle cible transcriptionnelle directe de p53

3.2.2. Etude de l'implication potentielle de Ptprv dans les deux principales réponses cellulaires après activation de p53: l'apoptose et l'arrêt de la prolifération cellulaire dépendant de p53

3.2.3. Ptprv est induit suite à un stress oncogénique induisant un arrêt du cycle cellulaire en phase G1

3.2.4. Ptprv se comporte comme un suppresseur de tumeur in vivo

IV. Conclusion, discussion et perspectives

1. Identification de gènes dont la transcription est activée par p53 et comparaison du profil d'expression des gènes dans les tissus apoptotiques et non apoptotiques

23 25 25

26

31 32 26

32 34

34

40

46

47

49

2. Le premier gène étudié: dapk1 3. Le deuxième gène étudié : ptprv

Références Annexes

Annexe I. Matériel et méthodes

1. Techniques de base de biologie moléculaire 2. Utilisation des modèles murins

2.1. Génération 2.2. Génotypage

2.3. Accouplement des souris et récupération d'embryons de souris avant naissance

3. Culture cellulaire

3.1. Types cellulaires utilisés

3.2. Transfection de la lignée cellulaire Soas-2 3.3. Infection rétrovirale des MEFs

3.4. Courbe de croissance 3.5. Test du 3T3

3.6. Génération d'une lignée cellulaire permettant l'expression inductible de Ptprv

3.6.1. Plasmides générés

3.6.2. Génération de la lignée stable 4. Préparation d'ARN total

51 54

I I I I

II III III IV IV VI VI

VI

VII

VIII

VIII

4.1. ARN total de tissus non neuronaux d'embryons de souris au stade E10,5

4.2. ARN total de cellules

5. Criblage de biopuces à ADN ("micro-Array") – Système Affymetrix

5.1. Préparation des sondes pour le criblage des biopuces à ADN

5.2. Criblage des biopuces à ADN 6. Préparation d'ADNc à partir d'ARN

7. RT-PCR quantitative en temps réel : utilisation du système TaqMan

8. RT-PCR semi-quantitative

9. Analyses protéiques par immunodétection 10. Expérience de protection à l'ARNase (RPA)

10.1. Génération des plasmides pCR2.1-Ptprv murin partiel et pCR2.1-HPRT murin partiel

10.2. Synthèse de la sonde radioactive

10.3. Hybridation des sondes ribonucléotidiques avec les ARN préparés comme décrits au paragraphe 4.2

11. Hybridation in situ

11.1. Traitement des lames de microscope

11.2. Emballage en paraffine et coupe des embryons 11.3. Préparation de la sonde ribonucléotidique 11.4. Hybridation in situ

VIII IX

IX

IX IX X

X XI XIII XIV

XIV XIV

XV

XVI

XVI

XVI

XVI

XVII

12. Expérience de retard de migration d'ADN sur gel (ElectroMobility Shift Assay)

12.1. Production de la protéine p53 en TNT

12.2. Génération des sondes et des compétiteurs, et mise en évidence du retard de migration sur gel

13. Expérience d'immunoprécipitation de chromatine (chIP) 14. Expérience d'activation d'un gène rapporteur luc

14.1.Constructions plasmidiques utilisées

14.2. Mesures de l'activité des enzymes Luciférase

"firefly" et "Renilla"

15. Mise en évidence de l'activité de la β galactosidase 16. Détection de l'apoptose

16.1. Exclusion au bleu trypan

16.2. Mise en évidence de l'apoptose sur des thymocytes de souris traités aux rayons γ

16.3. Immunohistochimie sur sections en paraffine de cerveaux de souris

17. Analyse de la prolifération des cellules

17.1. Mesure de l'incorporation de BrdU dans des MEFs

17.2. Evaluation de la capacité d'incorporation de BrdU dans les cellules épithéliales du petit intestin de souris par immunohistochimie sur sections en paraffine

18. Induction de tumeurs épithéliales sur des souris Annexe II. Publications

XVIII XVIII

XIX XX XXII XXII

XXII XXII XXIII XXIII

XXIII

XXIV XXV XXV

XXVII

XXVII

a

LISTE DES ABREVIATIONS ET SYMBOLES

UTILISES

4-OHT : 4-hydroxytamoxifène

α - : fait référence à l'élément contre lequel est dirigé un anticorps Ac : anticorps

ADN : acide déoxyribonucléique ADNc : ADN complémentaire ARN : acide ribonucléique ARNm : ARN messager AT : Ataxia Telangiectasia BrdU : 5-Bromo-2 ′ -deoxyuridine

CAR : carcasse de l'embryon de souris (E10,5), c'est-à-dire les tissus non neuronaux CHAPS : acide sulfonique 3[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-propane

Cdk : Cyclin Dependent Kinase (kinase cycline dépendante) CNS : Central Nervous System; système nerveux central Da : Dalton

DMBA : 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene

E. suivi d'un chiffre : donne l'âge de l'embryon de souris. Ce nombre correspond au nombre de jours après accouplement.

eau DEPC : eau traitée au diéthyl pyrocarbonate EDTA : acide éthylènediaminetetraacetique ES : embryonnaires souches

EST : Expressed Sequence Tag; séquence exprimée au niveau transcriptionnel EtOH : éthanol

HEPES : acide 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonique IgG : immunoglobuline

IHC : immunohistochimie

IRS : Inner Root Sheath; gaine épithéliale interne du follicule pileux ISH : hybridation in situ

kb : kilobase kDa : kilodalton

LRCs : Label-Retaining Cells

LTR : Long Terminal Repeat; longue répétition terminale

Lys (suivi d'un chiffre) : résidu lysine; le chiffre indique la position du résidu dans la protéine

MAPK : Mitogen Associated Protein Kinase

MEFs : Mouse Embryonic Fibroblasts (encore appelées PEFs, pour Primary Embryonic Fibroblasts ); fibroblastes embryonnaires de souris

MMLUV : Moloney Murine Leukemia Virus

NES : Nuclear Export Signal; signal d'export nucléaire

b Neur : neuroépithélium

NoLS : Nucleolar Localisation Signal; signal de localisation nucléolaire NLS : Nuclear Localisation Signal; signal de localisation nucléaire ORS : Outer Root Sheath; gaine épithéliale externe du follicule pileux P : valeur de la probabilité statistique associée à l'événement nul

P53RE (suivi d'un chiffre) : P53 Responsive Element; séquence cible de p53 PAGE : PolyAcrylamide GEl; gel de polyacrylamide

pb : paire de bases

PCR : Polymerisation Chain Reaction; réaction de polymérisation en chaîne PDGF : Platelet-Derived Growth Factor

PIPES : acide 1,4-Piperazinediéthanesulfonique PTK : protéine tyrosine kinase

PTP : protéine tyrosine phosphatase Pu : purine

Py : pyrimidine

RPTP : protéine de type récepteur tyrosine phosphatase RT : Reverse Transcription; transcription inverse SDS : sodium dodecyl sulfate

Ser (suivi d'un chiffre) : résidu sérine; le chiffre indique la position du résidu dans la protéine

Su(H)RE : Suppressor of Hairless Responsive Element; séquence cible de la protéine Suppressor of hairless

Tween 20 : monolaurate de polyéthylène glycol sorbitan

Triton X100 : 4-(1,1,3,3-Tétraéthylbutyl)phényl-polyéthylène glycol Tm : température d'hybridation d'amorces oligonucléotidiques

u : unité d'enzyme

UV-C : rayons ultaviolets C

A, C, G, T, U désignent les nucléotides, respectivement l'acide adénylique, l'acide cytidylique, l'acide guanylique, l'acide thymidylique et l'acide uridylique.

ATP, CTP, GTP, TTP, UTP désignent chacun des nucléosides triphosphates, respectivement l'adénosine, cytidine, guanosine, thymidine et uridine triphosphate.

De manière générale le nom des gènes est indiqué en italique, le nom des protéines

en caractère normal et commençant par une majuscule.

I. INTRODUCTION

I. Introduction

1

I. INTRODUCTION

1. Le cancer.

1.1. Qu’est-ce qu’un cancer ?

C’est Hippocrate, médecin grec vivant au IV°siècle avant JC, qui observa certaines lésions sur le corps humain qu’il dénomma « karkinos » (crabe en grec) en vertu de leur aspect (partie centrale arrondie prolongée en rayons). C’est au I ^er siècle après JC que Celsus, médecin romain, traduisit en latin « karkinos » en « cancer ».

Le cancer ne décrit pas une maladie bien précise, mais constitue plutôt un terme générique correspondant à un grand nombre de maladies. De nos jours on parle d’ailleurs de "maladies oncologiques", c’est-à-dire l’ensemble des maladies initialement regroupées sous le terme de "cancer" et qui désignent les tumeurs cancéreuses.

Du début du XX ^ième siècle à nos jours il a été compris, suite aux progrès considérables effectués par la médecine, que ces tumeurs cancéreuses résultaient du dérèglement des mécanismes régulateurs fondamentaux de certaines cellules, les cellules tumorales.

La maladie appelée communément "cancer" constitue la première cause de décès avant l'âge de 65 ans dans nos sociétés occidentales, soit un quart de la mortalité totale dans l'Union Européenne. Le cancer le plus répandu chez l'homme est celui du poumon et chez la femme celui du sein. Il apparaît de plus en plus clairement que le mode de vie influe directement sur la susceptibilité à développer un cancer (données tirées d'informations fournies par l' Institut Jules Bordet (Bruxelles, Belgique), et par l'association Fondation contre le Cancer ).

La compréhension des mécanismes par lesquels un cancer se développe apparaît donc comme essentielle aussi bien dans la prévention de la maladie que dans sa thérapie.

1.2. Les différents types de tumeurs.

Les tumeurs peuvent être

• soit bénignes, c’est-à-dire qu’elles restent confinées dans la région où elles se sont déclarées (l’exemple le plus connu de ce type de tumeur est la verrue); elles ne constituent donc pas un cancer.

• soit malignes, c’est-à-dire composées de cellules tumorales capables non seulement de se développer à partir de leur point d’origine, mais également d’envahir les tissus avoisinants.

Les tumeurs sont classées selon le type de cellules dont elles dérivent. Les

principales tumeurs malignes sont les carcinomes (se développant à partir des

cellules épithéliales), les sarcomes (tumeurs solides qui affectent les cellules des

tissus conjonctifs), les leucémies (tumeurs malignes qui se développent à partir des

amorçage

progression

Invasion ( métastases)

Figure 1.1. Schéma représentant les différentes étapes menant à la formation d'une tumeur maligne.

Cellule immortalisée, ayant acquis un avantage prolifératif

Cellule transformée

Cellules transformées capables de coloniser d'autres tissus et de former des métastases

stress

I. Introduction

2 cellules du système sanguin) et les lymphomes (se développant à partir des cellules du système immunitaire).

1.3. Oncogenèse et propriétés des cellules tumorales.

Le processus par lequel une cellule présentant des caractéristiques génotypiques (intégrité de leur génome) et phénotypiques (présentant des propriétés de croissance, de prolifération et de rentrée en sénescence) normales devient une cellule tumorale est un processus qui se déroule par étapes. Ces étapes sont schématisées à la figure 1.1.

amorçage

La première étape est qualifiée d’amorçage. Une cellule acquiert, suite à l’action d’un ou plusieurs stress extérieurs et sur lesquels il sera revenu plus loin, un avantage prolifératif lui permettant de se multiplier de manière non contrôlée et de donner lieu à la formation d’une tumeur.

La totalité des cellules constituant cette tumeur présentent un patrimoine génétique identique. Ces cellules sont définies comme immortelles car incapables de rentrer en sénescence. La sénescence cellulaire est un processus d'arrêt irréversible de la prolifération cellulaire induit in vitro après un certain nombre de divisions cellulaires (Campisi, 2001). Les cellules immortelles ne sont cependant pas capables de proliférer in vitro à haute densité (on parle d’inhibition de contact à haute densité), elles poussent in vitro en monocouche et nécessitent pour pousser un support solide ainsi que l'apport de facteurs de croissance.

progression

Au cours de cette étape les cellules immortalisées vont accumuler des dommages génétiques supplémentaires, conférant à certaines un avantage sélectif. Ces cellules acquièrent alors des propriétés de cellules transformées:

• elles sont capables de proliférer à haute densité cellulaire (elles ont perdu la propriété d’inhibition de contact),

• leur exigence en matière de facteurs de croissance est réduite,

• elles sont également capables de former des colonies en milieu semi-solide

• et enfin elles se multiplient et donnent des tumeurs lorsqu’elles sont injectées dans des souris immunodépressives. Les cellules transformées constituent des cellules tumorales.

invasion

L'étape terminale est l’invasion, au cours de laquelle les cellules transformées sont capables de coloniser d’autres tissus, via la sécrétion de protéases détruisant les composants extracellulaires des cellules avoisinantes, et de pénétrer dans les systèmes sanguins et/ou lymphatiques, constituant des métastases.

Au cours de l’oncogenèse, les cellules tumorales vont également développer la

formation d’un réseau sanguin capable d’irriguer la tumeur et de l’alimenter en

Cellule souche multipotente

Cellule progénitrice multipotente

Cellule spécialisées, différenciées

autorenouvellement

Figure 1.3. Schéma représentant le modèle de la cellule souche multipotente comme origine des cellules cancéreuses. Ces cellules présentent la capacité de s'autorenouveler et de se différencier en cellule progénitrice multipotente. La dérégulation du contrôle de l'autorenouvellement peut mener à la formation de cellules tumorales.

Système normal

Développement tumoral

Cellule souche multipotente

Cellule progénitrice multipotente

Cellule spécialisées, différenciées

autorenouvellement

différenciation

différenciation développement tumoral

Figure 1.2. Schéma représentant les deux processus que subit une cellule souche multipotente:

autorenouvellement et différenciation en cellules spécialisées, d'abord en cellules progénitrices

multipotentes puis en cellules totalement différenciées (lignage cellulaire).

I. Introduction

3 éléments nutritifs et en oxygène via la sécrétion de molécules impliquées dans la prolifération, la migration et l’assemblage de cellules endothéliales à l’origine des vaisseaux sanguins (Carmeliet et Jain, 2000).

1.4. Origine des cellules tumorales.

Les tumeurs ont pour origine des cellules ayant acquis différentes altérations de leur patrimoine génétique. Des travaux récents effectués sur certains types de leucémies tendent à montrer que les cellules tumorales proviennent de cellules souches multipotentes, c'est-à-dire capables de donner naissance à différents types cellulaires spécialisés (Reya et al ., 2001). Ces cellules souches multipotentes présentent la capacité de s'autorenouveler, c’est-à-dire de se diviser pour donner des cellules filles qui présentent des propriétés de prolifération, de différenciation et d’autorenouvellement en tous points similaires à la cellule mère. Le lignage d'une telle cellule souche multipotente est schématisé à la figure 1.2.

Une cellule cancéreuse présente également cette propriété d'autorenouvellement.

L’hypothèse retenue actuellement prédit donc pour l'origine des cellules cancéreuses des cellules souches qui ont perdu leur capacité à réguler les mécanismes régissant leur capacité de croissance et d’autorenouvellement. Ces pertes conduisent à terme à l’apparition de cellules transformées (voir figure 1.3).

L’expression de protéines impliquées dans la différenciation cellulaire dans des voies telles que la voie Notch ou la voie WNT-β caténine est d’ailleurs modifiée au cours de l’oncogenèse, renforçant l’idée émergente de l’origine des cellules souches pour les cellules tumorales (Taipale et Beachy, 2001).

1.5. Causes du cancer

De nombreux facteurs peuvent être à la base de l'apparition d'une cellule tumorale.

Toute anomalie génétique affectant une cellule peut lui conférer un avantage prolifératif, lui permettant de se multiplier de manière non contrôlée et être à l'origine d’une tumeur.

a) Les agents cancérigènes

Tous les stress génotoxiques susceptibles d'induire des dommages à l'ADN peuvent donc être considérés comme carcinogènes potentiels. Ces stress génotoxiques englobent

• l'action des rayonnements énergétiques tels que les rayonnements ultraviolets (UV-C) ou γ

• l'action de certaines substances chimiques mutagènes telle que le diméthylbenzanthracène (DMBA) ou la doxorubicine.

Ces stress génotoxiques sont qualifiés d'initiateurs tumoraux car susceptibles

d'interférer sur la prolifération cellulaire. Certains agents chimiques tels que les

esters de phorbol ou certaines hormones, comme les oestrogènes, n'induisent pas

directement des dommages au patrimoine génétique de la cellule et ne peuvent donc

Tableau 1.1. Virus identifiés comme capables d'induire la transformation cellulaire (adapté de Gènes VI (édition française), Lewin, Ed. De Boeck Université, 1998).

leucémie T chez l'adulte rétrovirus

virus tumorigènes à ARN virus tumorigènes à ARN

lymphome de Burkitt et carcinome nasopharyngien virus de l'herpès (Epstein-Barr)

aucun (modèle de transformation de cellules in vitro) adénovirus

cancer du col de l'utérus virus de papillomes

aucun (modèle de transformation de cellules in vitro) SV40 et virus du polyome

cancer du foie virus de l'hépatite B

virus tumorigènes à ADN virus tumorigènes à ADN

tumeur humaine associée famille virale

sarcome de Rous src

Sarcome de Kirsten rasK

Sarcome de Harvey rasH

myélocytomatose aviaire myc

sarcome aviaire 17 jun

sarcome ostéogène murin FBJ fos

leucémie d'Abelson abl

maladie associée oncogène

Tableau 1.2. Liste des oncogènes rétroviraux les plus étudiés (adapté de Gènes VI

(édition française), Lewin, Ed. De Boeck Université, 1998).

I. Introduction

4 être considérés comme mutagènes, mais sont capables de stimuler la prolifération cellulaire. Ils sont à ce titre qualifiés de promoteurs tumoraux.

b) Certains virus chez l'homme, via l'expression d'oncogènes

Certains virus induisent également des cancers, via l'expression d'oncogènes capables de déréguler les mécanismes régissant la croissance et la prolifération cellulaire et amenant à la transformation de la cellule.

Différents virus ont été identifiés comme capables d'induire la transformation cellulaire. Ces virus peuvent présenter aussi bien un génome constitué d'ADN que d'ARN. Ils sont repris dans le tableau 1.1. C'est l'étude des rétrovirus qui a permis d'identifier des gènes codant des protéines capables de transformer les cellules, nommés oncogènes.

Les oncogènes

Le premier oncogène a été identifié à partir du rétrovirus du sarcome de Rous. De multiples études réalisées sur différents mutants de ce virus capables de se répliquer mais pas de transformer la cellule hôte ont permis d'identifier la protéine oncogénique Src, nécessaire et suffisante à la transformation de la cellule hôte (Martin, 2004). Depuis, d'autres oncogènes rétroviraux ont été identifiés. Les plus étudiés sont repris dans le tableau 1.2.

Il a été démontré que les oncogènes rétroviraux étaient issus de formes modifiées de gènes existant dans des cellules initialement saines et appelés proto-oncogènes (Stehelin et al., 1976). Leur intégration dans le génome rétroviral s'est réalisée au cours de l'évolution. Ces proto-oncogènes codent des protéines impliquées dans la régulation des voies contrôlant la prolifération cellulaire (telles que la voie MAPKinase), la différenciation cellulaire ou la mort cellulaire programmée (l'apoptose). L'expression des oncogènes correspondants induit une dérégulation de ces voies, induisant une stimulation de la prolifération cellulaire ou la survie de cellules présentant un comportement anormal.

L'oncogène diffère du proto-oncogène. Ces différences peuvent résulter :

de la présence de mutations ponctuelles dans le proto-oncogène

Ces mutations induisent alors une dérégulation de la prolifération cellulaire.

L'exemple le mieux décrit est celui des proto-oncogènes rasH, rasK et rasN. Ces

gènes codent des protéines impliquées dans le contrôle de l'activation de facteurs de

transcription par la voie "Ras-MAPK" : elles sont capables de fixer les guanines et

présentent une activité GTPasique. L'oncogène ras diffère du proto-oncogène rasH

par une mutation ponctuelle, induisant au niveau protéique une modification du

12 ^ième acide aminé (une glycine) en valine (protéine "RasV12"). Cette mutation

confère à la protéine une activité de fixation du GTP constitutive induisant une

réduction de son activité GTPasique et stimulant la prolifération de la cellule de

manière constitutive (Bos, 1989).

Figure 1.4. Représentation schématique du cycle cellulaire et des différentes phases le constituant (adapté de Gènes VI (édition française), Lewin, Ed. De Boeck Université, 1998).

Phase G1 (6-12h) ADN 2n

Phase G2 (3-4h) ADN 4n

Phase M (1h)

Phase G0 (réactivation)

Phase S (6-8h) Synthèse d’ADN 2-4n

Phase G0 (sortie)

Point de contrôle G1/S

Point de contrôle G2/M

I. Introduction

5 de la modification du contrôle de son expression

L'expression du proto-oncogène peut être dirigée par le promoteur et les séquences amplificatrices virales, conduisant à une perte de régulation de la prolifération cellulaire (c'est le cas de l'oncogène Raf; Wellbrock et al., 2004). Des réarrangements génétiques tels que les translocations chromosomiques peuvent également déboucher sur une modification du contrôle de l'expression d'un gène, comme pour l'oncogène c-myc (Hermeking et al., 2003).

Des translocations chromosomiques peuvent également donner lieu à la création d'une séquence codant une protéine oncogénique hybride, comme la fusion entre les séquences des gènes pml et du récepteur α de l'acide rétinoïque, rar α _(PML-RAR α ) (Piazza et al., 2001).

Enfin, le caractère oncogénique de certaines protéines peut être dû à l'amplification génique du gène qui la code. C'est le cas de l'oncogène mdm2 dont le locus est amplifié dans 5 à 10% des tumeurs humaines (Oliner et al., 1992).

c) Les inactivations des protéines suppresseurs de tumeurs

Le premier suppresseur de tumeur fut identifié chez l'humain suite à l'étude du rétinoblastome, une tumeur occulaire se développant chez l'enfant. Il est très vite apparu que les individus présentant un rétinoblastome étaient caractérisés au niveau génomique par des délétions d'une même région chromosomique. L'analyse détaillée de ce locus a permis de mettre en évidence le gène rb codant la protéine dont l'absence est responsable du rétinoblastome, Rb (Friend et al., 1986). rb est inactivé dans différentes tumeurs humaines; il est à ce titre qualifié de gène suppresseur de tumeur. Rb est également capable d'éliminer le caractère tumoral de cellules initialement inactivées pour rb. (Harbour et al, 1988 ; Bookstein et al., 1990 ; Goodrich et Lee, 1993).

La perte de l'activité de protéines suppresseurs de tumeur peut donc être considérée comme cause de cancer. D'une manière générale, les protéines suppresseurs de tumeur freinent la prolifération cellulaire. Leur perte favorise donc la cancérisation.

Dans le cas de Rb, c'est sa capacité à arrêter la prolifération de la cellule via l'arrêt de son cycle cellulaire en phase G1 qui lui confère sa propriété de suppresseur de tumeur (Weinberg, 1995).

Pour rappel le cycle cellulaire se définit comme la période entre deux divisions mitotiques. Il peut être divisé en 4 phases (voir figure 1.4) :

• La phase G1, phase de synthèse des ARN et des protéines (elle dure de 6 à 12h)

• La phase S, phase de réplication de l'ADN. C'est au cours de cette phase que le contenu en ADN de la cellule passe de 2n à 4n (elle dure de 6 à 8h)

• La phase G2 , phase de préparation à la mitose qui s'étend de la fin de la phase

S jusqu'à la phase M (elle dure de 3 à 4h)

Figure 1.5. Représentation schématique de la voie Rb/E2F, contrôlant la progression du cycle cellulaire au point de contrôle G1/S. Suite à l'action de signaux stimulant la prolifération cellulaire les complexes cyclineD/Cdk4 et 6 et cyclineE/Cdk2 vont induire la phosphorylation de Rb, permettant la déséquestration de E2F et son activation transcriptionnelle. Il en résulte un passage des cellules en phase S du cycle cellulaire.

E2F

E2F

Complexes cyclineD/Cdk4 et 6 cyclineE/Cdk2

Gènes cibles impliqué dans la progression du cycle cellulaire

Rb P P P

Stimulation de la croissance OU

Stimulation de la croissance

Pas de stimulation de la croissance arrêt du cycle cellulaire

Stimulation de la croissance progression du cycle cellulaire

Rb E2F

Complexes

cyclineD/Cdk4 et 6

cyclineE/Cdk2

Action de p16

I. Introduction

6

• La phase M , phase de division au cours de laquelle il y a ségrégation d'un jeu diploïde de chromosomes dans les deux cellules filles ainsi qu'une répartition équitable des autres composants de la cellule (elle dure environ 1h).

L'état d'avancement dans le cycle cellulaire est contrôlé aux points de restriction ou points de contrôle, points d'engagement dans la phase suivante (G1/S et G2/M). Il existe également un état hors cycle, la phase G0, durant laquelle la cellule ne se divise pas.

La capacité de Rb d'induire l'arrêt du cycle cellulaire en phase G1 lui est conférée par sa propriété de régulation de l'activité des facteurs de transcription appartenant à la famille E2F. Ces protéines sont capables de lier et d'activer les promoteurs de gènes codant des protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire (Thalmeier et al ., 1989 ; Dalton, 1992 ; Ohtani et al ., 1995).

Le mécanisme d'action de Rb est schématisé à la figure 1.5. Rb constitue un corépresseur qui, sous sa forme hypophosphorylée, est capable de former un complexe avec les protéines E2F (Chellappan et al ., 1991 ; Dyson, 1998). Ces dernières sont dès lors incapables d'induire leurs gènes-cibles impliqués dans la progression du cycle cellulaire qui est arrêté en phase G1. A l'inverse, la forme phosphorylée de Rb est incapable de lier les protéines E2F. Ces dernières peuvent donc induire la transcription de leurs gènes-cibles et le passage des cellules en phase S du cycle cellulaire. Il est à noter que le caractère oncogénique de la protéine adénovirale E1A (adenovirus Early region 1A) résulte de sa capacité à former un complexe avec la protéine Rb, permettant l'activation de l'action transactivatrice des protéines E2F (Whyte et al ., 1988 ; Whyte et al ., 1989 ; Chellappan et al ., 1991).

L'état de phosphorylation de Rb est déterminé par l'activité kinase des complexes cyclineD/kinases cycline-dépendantes (Cdk) 4 et Cdk6 et cyclinE/Cdk2. Ces complexes sont eux-mêmes régulés par une protéine de 16kDa, p16 (codée par le gène ink4a ), capable d'inactiver l'assemblage des complexes et leur activité kinase et induisant consécutivement l'arrêt du cycle cellulaire (Lukas et al ., 1995 ; Medema et al ., 1995). p16 est capable de bloquer le cycle cellulaire et constitue également un suppresseur de tumeur; en effet il est inactivé dans différents types de tumeurs (Okamoto et al ., 1994).

Suite à la recherche de partenaires protéiques de l'antigène T de SV40 (dont

l'expression est associée à la transformation de cellules en culture (Aaronson et

Todaro, 1968 ; Uchida et Watanabe, 1969) ), une protéine cellulaire de 53kDa, p53,

fut identifiée (Crawford et Lane, 1977 ; Reich et Levine, 1982). Initialement

considérée comme un oncogène, son inactivation combinée à l'expression de la

protéine oncogénique Ras apparut comme capable d'induire la transformation de

fibroblastes de rat in vitro (Hinds et al ., 1989 ; Hicks et al ., 1991) (par opposition

la transformation de fibroblastes sauvages nécessite l'expression combinée de deux

oncogènes (Land et al ., 1983) ). L'expression de p53 pouvait également inhiber la

croissance de cellules tumorales in vitro (Baker et al ., 1990) et diminuer leur

Apoptose

p53

Hypoxie Stress génotoxique

Gènes-cibles codant des médiateurs de l'activité biologique de p53

Bax Bid Puma Noxa p53AIP Stress oncogénique Choc thermique

Apaf1 Fas/APO1 KILLER/DR5 Pidd

Figure 1.6. Représentation schématique de l'action de p53 après son activation suite à différents stress. p53 est capable d'activer la transcription de ses gènes cibles, codant principalement des protéines impliquées dans l'arrêt du cycle cellulaire ou dans l'apoptose

p21

?

Arrêt du cycle cellulaire

en phase G1 en phase G2

14-3-3 σ

Gadd45

Cycline G1

Gtse1

I . Introduction

7 tumorigénicité (Chen et al., 1990). Ces observations conduisirent à l'hypothèse que p53 constituait une protéine suppresseur de tumeur (Finlay et al., 1989 ; Eliyahu et al., 1989).

Cette hypothèse fut démontrée suite à l'observation qu'il y a perte de l'activité de p53 dans pratiquement toutes les tumeurs humaines: le gène codant p53, Trp53 (p53) est muté dans la moitié des tumeurs humaines (Nigro et al., 1989; Hollstein et al., 1991 ; Hollstein et al., 1994) et que dans la plupart des autres cas des protéines cellulaires ou des oncogènes viraux inactivent p53 (Oliner et al., 1992 ; Scheffner et al., 1990).

Chez l'humain, l'inactivation de p53 est à l'origine du syndrome familial rare de Li-Fraumeni, caractérisé par le développement de divers cancers (principalement des ostéosarcomes, des sarcomes de tissus mous, des cancers du sein, des leucémies et des lymphomes) parmi les membres d'une même famille (Li et Fraumeni, 1969 ; Malkin et al., 1990 ; Srivastava et al., 1990).

Enfin les souris inactivées de manière homozygote pour p53 sont viables mais présentent une prédisposition au cancer (elles développent spontanément des tumeurs dès l'âge de 5 mois (Donehower et al., 1992) ); de plus les MEFs p53-/- sont transformées par l'expression d'une seule protéine oncogénique, comme Ras ou E1A (Lowe et al., 1994).

La perte de p53 favorise donc la cancérisation. Cette protéine a donc fait et fait toujours l'objet d'un grand nombre de recherches dans l'étude des mécanismes moléculaires impliqués au cours du processus de cancérisation.

2. p53, la principale protéine suppresseur de tumeur connue à ce jour.

2.1. Généralités

Comme mentionné dans le chapitre précédent, p53 constitue une protéine

suppresseur de tumeur. p53 est un facteur de transcription qui agit essentiellement

comme activateur transcriptionnel à la fois in vitro et in vivo, en se liant à une

séquence spécifique d'ADN (Fields et Jang, 1990 ; Scharer et Iggo, 1992 ; Kern et

al., 1992 ; el-Deiry et al., 1992). Elle permet à la cellule ayant subi un stress

susceptible de lui conférer un potentiel tumoral d'induire des réponses

antiprolifératives comme l'arrêt de sa croissance, son entrée en sénescence voire sa

destruction, par activation de la transcription de ses gènes cibles (Levine, 1997). p53

est à ce titre considérée comme "Gardien du génome" (Lane, 1992). Ces différents

stress incluent les stress génotoxiques (Kastan et al., 1991), des signaux

hyperprolifératifs (Lowe, 1999), l'hypoxie (Graeber et al., 1994), les chocs

thermiques (Graeber et al., 1994), ou la culture in vitro (Itahana et al., 2001). Un

schéma reprenant l'action de p53 est proposé à la figure 1.6.

Figure 1.7. Représentation schématique de la protéine p53, avec ses domaines principaux (NLS:

signal de localisation nucléaire ; NES: signal d'export nucléaire).

Domaine de transactivation

N C

Région riche en résidus proline

(PXXP)

Domaine de liaison à l'ADN Domaine d'oligomérisation NLS

Domaine C-terminal de régulation de la

liaison à l'ADN

NES

I. Introduction

8 2.2. Structure

La structure de p53 est schématisée à la figure 1.7. p53 comprend chez l'humain 393 acides aminés et est constituée de 4 domaines structurels et fonctionnels principaux:

le domaine de transactivation

Le premier domaine correspond aux premiers 80 acides aminés de la région amino-terminale de la protéine. Il est constitué de deux domaines de transactivation fonctionnant de manière indépendante. Ils s'étendent respectivement des acides aminés 1 à 42 et 43 à 63. Ils ont été montrés comme capables d'interagir avec différents facteurs impliqués dans la transcription (Lu et Levine, 1995 ; Thut et al., 1995 ; Candau et al ., 1997 ; Zhu et al., 1998).

Une région riche en proline sépare les deux premiers domaines fonctionnels, et s'étend des acides aminés 60 à 90. Cette région comprend 5 motifs de type PXXP (où P constitue une proline et X n'importe quel autre acide aminé) et a été montrée comme nécessaire pour un arrêt efficient de la croissance cellulaire et l'apoptose induites par p53. Cette région ne semble pas directement nécessaire pour l'action transactivatrice de p53 mais participerait plutôt à la régulation de sa stabilisation (Dornan et al., 2003).

le domaine de liaison à l'ADN

La région centrale correspond au domaine de liaison de p53 à l’ADN. Il s'étend des acides aminés 102 à 292 (Cho et al., 1994). C'est dans la séquence codant ce domaine que se retrouvent les principales mutations trouvées dans 50% des tumeurs humaines (Hollstein et al., 1994).

le domaine d'oligomérisation

Un signal de localisation nucléaire sépare le domaine de liaison à l'ADN du troisième domaine fonctionnel de la protéine, qui permet son oligomérisation. En effet p53 lie l’ADN sous forme de tétramère. Il correspond aux acides aminés 325 à 363. Un signal d'export nucléaire a également été identifié dans ce domaine (Hupp et Lane, 1994 ; Jeffrey et al., 1995 ; Stommel et al., 1999).

le domaine carboxy-terminal de régulation de la liaison à l'ADN

La partie carboxy-terminale de la protéine constitue le quatrième domaine

fonctionnel. Il corrrespond aux 26 derniers acides aminés et est capable de lier

l'ADN simple brin tel que l'ADN clivé suite à un stress génotoxique, et permet donc

de réguler la liaison du domaine central de p53 à l'ADN. Il a par ailleurs été

démontré que la phosphorylation de certains résidus sérine localisés dans ce

domaine, sa délétion, ou encore sa liaison à l'anticorps pAB421 permet une liaison

constitutive de la région centrale de p53 à l'ADN (Hupp et Lane, 1994 ; Lee et al.,

1995).

Tableau 1.4. Liste reprenant les résidus sérine et lysine de p53 cibles respectivement de

phosphorylation et d'acétylation identifiés à ce jour (tiré de Xu, 2003).

I . Introduction

9 2.3. Quels sont les mécanismes par lesquels p53 est régulé ?

De par sa propriété de suppresseur de tumeur, p53 doit être capable d'induire une réponse cellulaire (arrêt de la prolifération ou élimination de la cellule) suite à l'action de stress pouvant induire la cancérisation. Afin de permettre une réponse efficace et surtout adaptée à l'état dans lequel se trouve la cellule au moment du stress, l'activité et la stabilité de p53 doivent être régulées (Vogelstein et al., 2000).

Différents mécanismes permettant cette régulation ont été mis à jour ces dernières années, la plupart impliquant des molécules capables d'induire différentes modifications posttraductionnelles de p53 (Xu, 2003).

2.3.1. Les principales modifications posttraductionnelles de p53.

a) Les phosphorylations sur résidus sérine et thréonine.

La modification posttraductionnelle la plus fréquente de p53 est la phosphorylation de résidus sérine et thréonine, induite essentiellement à la suite de l'action de stress génotoxiques sur la cellule. La phosphorylation de certains résidus sérine de p53, notamment de la sérine localisée en position 15 (ser15), permet sa stabilisation et consécutivement l'augmentation de son activité transactivatrice (Shieh et al., 1997 ; Fuchs et al., 1998 ; Zhang et Xiong, 2001). Leur déphosphorylation induit une diminution de la stabilité de p53. Parfois l'augmentation de l'activité transactivatrice passe par une déphosphorylation de résidus sérine. Par exemple la déphosphorylation du résidu ser376 dans des cellules irradiées aux rayons γ induit l'association de la protéine 14-3-3σ et p53, permettant d'augmenter l'affinité de la liaison de ce dernier à l'ADN (Waterman et al., 1998).

La liste des résidus sérine et thréonine cibles de la phosphorylation connus à ce jour est reprise au tableau 1.4. La fonction de certains n'est pas connue.

L'Ataxia Telangiectasia et p53

Les premiers mécanismes d'induction de l'activation de p53 ont été mis en

évidence par l'étude de l'Ataxia Telangiectasia (AT). Cette maladie génétique est

caractérisée par une incapacité d'une cellule à stopper la réplication de l'ADN suite

à l'action de radiations ionisantes γ (ces radiations induisent des cassures au niveau

des deux brins d'ADN), conduisant à une probabilité accrue de développer un

cancer (Painter et Young, 1980). Des cellules inactivées pour p53 présentant le

même phénotype après traitement aux rayons γ (Rudolph et Latt, 1989 ; Kastan et

al., 1991), l'hypothèse selon laquelle le gène dont l'inactivation est responsable de

l'AT codait une protéine capable de "détecter" les dommages à l'ADN et d'activer

consécutivement p53 a été émise. Le taux de p53 est normalement faible dans des

cellules sauvages mais augmente suite à l'action de stress génotoxiques tels que

l'irradiation aux rayonnements γ (Kastan et al., 1991). L'irradiation aux rayons γ de

lignées cellulaires dérivées de lymphoblastes prélevés chez des patients souffrant

de l'AT n'induit pas le niveau de p53 par rapport aux mêmes lignées non induites,

Irradiation γ γ γ γ

ATM

p53

p53 p53

p53 C-Abl

Phosphorylation de Ser-15

activation transcriptionnelle

activation

Liaison à p53, ce qui le stabilise

UV-C

Chk2 ATR

Phosphorylation de Ser-20

Phosphorylation de Ser-15 et Ser37

Figure 1.8. Action des principales kinases activatrices de p53 suite à l'action de différents stress génotoxiques (irradiation γ, action des rayons UV-C). Les kinases ATM, ATR et chk2 sont capables de phosphoryler directement certains résidus sérine de p53. La kinase c-Abl est capable de lier p53 et de le stabiliser après activation par ATM. Certaines modifications posttraductionnelles induisent l'association de p53 à la protéine 14-3-3σ, permettant l'augmentation de la liaison de p53 à l'ADN et donc son action transactivatrice.

14-3-3σ

I. Introduction

10 confirmant que le gène dont l'inactivation était responsable de l'AT codait une protéine capable d'activer p53 (Kastan et al ., 1992).

Le gène dont l'inactivation est à la base de l'AT code ATM, une protéine de type sérine/thréonine kinase appartenant à la famille des PI3K (Savitsky et al ., 1995) capable de phosphoryler le résidu ser15 de p53 après irradiation aux rayons γ (Shieh et al ., 1997; Siliciano et al ., 1997 ; Canman et al ., 1998) (voir figure 1.8).

Par la suite, d'autres protéines kinases ont également été montrées comme capables de phosphoryler p53. Parmi elles, la protéine ATR ( A taxia T elangiectosa and R ad3 related protein) qui, comme ATM, est capable de phosphoryler le résidu Ser15 de p53 mais après action de rayonnements UV-C (ces radiations induisent des cassures au niveau d'un seul brin d'ADN). ATR phosphoryle également le résidu ser37 de p53 suite à l'action de rayons UV-C (Tibbetts et al ., 1999).

ATM a également été montrée comme capable d'activer p53 via l'activation d'autres protéines kinases, comme c-Abl ou Chk2 suite à des stress génotoxiques.

L'activation de c-Abl par ATM induit sa liaison avec p53, provoquant sa stabilisation. Quant à Chk2 elle semble phosphoryler in vitro le résidu ser20 de p53 aussi bien suite à l'action de radiations ionisantes que de rayons UV-C sur la cellule.

Cette phosphorylation induit également la stabilisation de p53 (Baskaran et al ., 1997;

Sionov et al ., 1999 ; Chehab et al ., 1999 ; Matsuoka et al ., 2000).

b) Les acétylations sur résidus lysine.

Il a été montré que différents résidus lysine de p53 peuvent être acétylés suite à l'action de stress génotoxiques sur la cellule. La liste des résidus lysine cibles de l'acétylation connus à ce jour est reprise au tableau 1.4. Comme dans le cas des phosphorylations la fonction de l'acétylation de certains résidus n'est pas connue.

Ces résidus sont pour la plupart localisés dans le domaine carboxy-terminal de la protéine et leur acétylation après dommage à l'ADN a été montrée à la fois in vitro et in vivo . Cette acétylation est médiée par les protéines de type histone acétyltransférase p300/CBP (Creb Binding Protein), un coactivateur de p53, et PCAF ( P 300 and C BP A ssociated F actor) suite à l'action de stress génotoxiques (Gu et Roeder, 1997 ; Liu et al ., 1999; Sakaguchi et al ., 1998). D'autres protéines telles que p33ING2 semblent également capables d'induire l'acétylation de certains résidus lysine suite à l'action de stress génotoxiques (Nagashima et al ., 2001). Plus récemment il a été établi que la phosphorylation de résidus sérine et thréonine localisés dans la partie carboxy-terminale de p53 avait un impact sur l'acétylation de ces résidus lysine (Ou et al ., 2005).

L'acétylation de ces résidus lysine après un stress génotoxique semble augmenter

l'affinité de la liaison de p53 à l'ADN, expliquant au niveau moléculaire la capacité

du domaine carboxy-terminal de p53 de réguler sa liaison à l'ADN (Gu et Roeder,

1997 ; Liu et al ., 1999; Sakaguchi et al ., 1998 ; Luo et al ., 2004). Cette forme

acétylée constituerait une forme active de p53, par opposition à la forme non acétylée

qui constituerait une forme latente de p53. L'acétylation des résidus lysine de p53 a

en outre été montrée comme empêchant la dégradation de p53 in vivo (Ito et al .,

I. Introduction

11 2001) et de recruter le complexe p300/CBP et la protéine PCAF au niveau des promoteurs de ses cibles transcriptionnelles, pouvant agir comme coactivateurs de p53 (Barlev et al ., 2001).

c) La sumoylation de certains résidus lysine.

En plus des phosphorylations et acétylations, p53 a également été montré comme pouvant être la cible de sumoylations, à la fois in vitro et in vivo . La sumoylation est un processus de modification posttraductionnelle qui consiste en le transfert d'une protéine proche de l'ubiquitine, SUMO-1, sur des résidus lysine de la protéine ciblée.

Ce processus fait intervenir l'enzyme Ubc9, présentant une activité ligase de type ubiquitine E2, suffisante pour permettre la sumoylation des résidus lysine (Bernier- Villamor et al ., 2002). La sumoylation ne semble pas induire directement la dégradation de la protéine ciblée par la voie du protéasome mais plutôt la capacité de la protéine à interagir avec d'autres facteurs cellulaires (Müller et al ., 2004).

p53 a été montrée comme capable d'être modifiée au niveau du résidu lysine 386 (lys386), localisé dans la partie carboxy terminale de la protéine. Cette sumoylation requiert uniquement Ubc9 et SUMO-1 (Gostissa et al ., 1999 ; Rodriguez et al ., 1999). La sumoylation de ce résidu a été montrée comme permettant l'augmentation de la capacité de transactivation de p53 (Gostissa et al ., 1999 ; Rodriguez et al ., 1999 ; Melchior et Hengst, 2002), mais des données plus récentes ne confirment pas cette hypothèse. Il a en effet été montré qu'une interaction directe entre Ubc9 et p53 induisait la sumoylation de cette dernière, mais que cette interaction était diminuée par la phosphorylation de ser20 de p53 suite à un stress génotoxique (Lin et al ., 2004).

2.3.2. Les protéines régulatrices de l'activité et de la stabilité de p53.

L'activation de p53 suite à des stress génotoxiques résulte de l'augmentation rapide du taux de protéine dans la cellule, conséquence de l'augmentation de la demi- vie de la protéine (Kastan et al ., 1991). L'étude des mécanismes qui permettent l'augmentation de la demi-vie de p53 s'est donc très vite imposée.

a) La protéine Mdm2

Des études in vitro ayant montré que la stabilité de p53 était régulée par la machinerie protéolytique dépendant de l'ubiquitine (Chowdary et al ., 1994), l'hypothèse selon laquelle un facteur cellulaire capable de réguler p53 par la voie du protéasome a été formulée. Cette hypothèse fut confirmée par l'étude de la protéine connue sous le nom de Mdm2, capable de jouer ce rôle (Haupt et al ., 1997; Kubbutat et al ., 1997).

Mdm2 a initialement été identifiée chez la souris comme gène amplifié au niveau

des chromosomes double minute de cellules murines transformées BalbC/3T3; c'est

la raison pour laquelle elle a été nommée Mdm2 (pour M ouse 3T3 cell D ouble

M inute 2 ) (Fakharzadeh et al ., 1991). Le gène codant Mdm2 est amplifié dans 5 à

10% des tumeurs humaines, en particulier dans des sarcomes affectant les tissus

Domaine de type "RING finger H2"

Figure 1.9. Représentation schématique de la protéine Mdm2, avec ses domaines principaux (NLS : signal de localisation nucléaire ; NES : signal d'export nucléaire ; NoLS : signal de localisation nucléolaire).

Domaine de liaison à p53

N C

Motif de type doigt de zinc

NoLS NLS NES

Sous-unité 26S du protéasome p53

p53

p53

Mdm2

Mdm2

Mdm2 Mdm2

Ub Ub Ub

Ub Ub

Ub

Ub Ub

Ub

noyau cytoplasme

Figure 1.10. Représentation schématique de l'action de Mdm2 dans la régulation négative de

p53. Mdm2 est capable à la fois de lier p53 et d'inhiber ainsi son activité transcriptionnelle,

mais aussi de l'ubiquitinyler et de l'exporter vers la sous-unité 26S du protéasome.

I. Introduction

12 mous, et présente les caractéristiques d'une protéine oncogénique (Oliner et al ., 1992; Fakharzadeh et al ., 1991 ; Finlay, 1993).

La structure de Mdm2 est schématisée à la figure 1.9. Mdm2 comprend deux domaines principaux : un domaine amino-terminal lui permettant de lier p53 (Oliner et al ., 1993), ainsi qu'un domaine carboxy-terminal de type "RING finger H2" (Fang et al ., 2000). Elle comprend également un motif de type doigt de zinc dont la fonction est inconnue ainsi que des signaux d'export (Roth et al ., 1998) et de localisation nucléaire (Chen et al ., 1995). Un signal de localisation nucléolaire a également été identifié dans le domaine de type "RING finger H2" (Lohrum et al ., 2000).

Mdm2 est une protéine qui transite continuellement du noyau au cytoplasme (Roth et al ., 1998). Elle régule négativement p53 en agissant à deux niveaux, comme schématisé à la figure 1.10 :

a) d’une part Mdm2 est capable de bloquer l’activité transcriptionnelle de p53 en se liant par son domaine amino-terminal au domaine de transactivation de p53, l'empêchant d’activer la transcription de ses gènes-cibles (Momand et al ., 1992 ; Oliner et al ., 1993).

b) d'autre part Mdm2 est capable de réguler la demi-vie de p53 en induisant sa dégradation par la machinerie protéolytique dépendant de l'ubiquitine (Haupt et al ., 1997 ; Kubbutat et al ., 1997). Il a en effet été montré que Mdm2 présente une activité de ligase de groupements ubiquitine de type E3. Cette activité lui est conférée par son motif de type "RING finger H2" ainsi que par sa partie centrale (Fang et al ., 2000). Mdm2 est capable d'ubiquitinyler p53 sur ses résidus lysine normalement acétylés en condition de stress (Lai et al ., 2001). Le complexe Mdm2- p53(ubiquitinylé) va alors migrer dans le cytoplasme et s'y accumuler (Roth et al ., 1998 ; Tao et Levine, 1999a ; Geyer et al ., 2000) pour y être protéolysé via la sous- unité 26S du protéasome (Honda et al ., 1997 ; Tao et Levine, 1999a ; Fang et al ., 2000). L'export nucléaire du complexe requiert la liaison de Mdm2 à p53 mais pas le signal d'export nucléaire de Mdm2 (Roth et al ., 1998 ; Geyer et al ., 2000). Un signal d'export nucléaire identifié dans le domaine de tétramérisation de p53 a toutefois été montré comme nécessaire et suffisant pour l'export nucléaire du complexe (Stommel et al ., 1999 ; Geyer et al ., 2000).

De plus, Mdm2 induit la déacétylation des résidus lysine de p53 localisés dans sa

partie carboxy-terminale. Cette déacétylation passe par l'inhibition des fonctions

activatrices des protéines p300 et PCAF sur p53, à savoir leur capacité à stimuler la

liaison de p53 à l'ADN ainsi qu'à induire son acétylation sur résidus lysine (Kobet et

al ., 2000 ; Ito et al ., 2001; Jin et al ., 2002). Mdm2 recrute également la protéine

histone déacétylase HDAC1, permettant la déacétylation des lysines qui seraient

acétylées (Ito et al ., 2002). Enfin en présence de conditions particulières où le taux

nucléaire de Mdm2 est fort élevé, la dégradation de p53 ne passe pas par son export

nucléaire: dans ce cas Mdm2 va induire l'ubiquitinylation de p53 qui sera dégradé au

sein même du noyau par le protéasome nucléaire (Grossman et al ., 2003; Li et al .,

2003 ; Shmueli et Oren, 2004).

Figure 1.11. Représentation schématique du gène ink4a/arf et de ses deux transcrits, le transcrit α (codant la protéine p16 ^INK4a ) et le transcrit β (codant la protéine p19 ^ARF ).

transcrit β (p19 ^ARF ) transcrit α (p16 ^INK4A )

ATG

ATG TGA

TGA exon 1β β β β

exon 1α α α α exon 2 exon 3

gène ink4a/arf

AUG UGA

AUG UGA