CELLULES SOUCHES ET DIFFERENCIATION CELLULAIRE

CELLULES SOUCHES

ET DIFFERENCIATION CELLULAIRE

I. Différenciation cellulaire A. Introduction

B. Les différents niveaux de régulation de l'expression des gènes C. 3 exemples de mécanisme de régulation

1. Au niveau de l'ADN

a) Mécanismes épigénétiques

b) Remodelage de la chromatine au moment de la transcription

2. Au niveau des ARNm

a) Facteurs de régulation de la transcription (FRT)

b) Régulation de l'expression d'un gène via son épissage alternatif

c) Petits ARNs non-codants (ex : microARNs) II. Cellules souches

A. Différents types de cellules souches

B. Deux exemples d’application : médecine régénératrice et

étude de maladies génétiques

I. Différenciation cellulaire A. Introduction

La synthèse protéique est un phénomène permanent qui permet à la cellule de renouveler ses constituants, mais aussi de maturer, de se différencier d'une cellule jeune en une cellule adulte différenciée (exemple cellule épithéliale avec des cils au niveau apical).

La différenciation cellulaire permet, à partir d'une cellule jeune indifférenciée, d'obtenir toutes les cellules du corps telles que les neurones, les cellules musculaires, les cellules épithéliales...

Ces cellules ayant des caractéristiques particulières sont différenciées, aussi bien sur le plan morphologique que fonctionnel.

Cependant, toutes les cellules de l’organisme ont le même patrimoine génétique : comment peut-on alors expliquer la différenciation cellulaire ?

En fait, la différenciation cellulaire dépend de la régulation extrêmement fine de l'expression des gènes.

L'information génétique est présente en très large excès, mais seulement une partie est utilisée (environ 20 000 - 25 000 gènes chez l'homme).

On distingue 2 catégories de gènes :

• domestiques, ce sont les gènes qui s'expriment dans toutes les cellules quelques soit leurs types ou leurs origines.

 enzymes de la glycolyse indispensable pour la cellule...

• spécifiques du type cellulaire, ce sont les gènes qui ne sont actifs que dans certaines cellules, et permettent ainsi la différenciation

 neurones, muscles...

=> Les gènes peuvent donc être exprimés, et actifs, ou réprimés

Une régulation est donc nécessaire : il y a 9 niveaux de régulation de l'expression des gènes

Parmi les intervenants de cette régulation, il faut noter l'intervention de facteurs spécifiques : les protéines FRT (Facteur de la Régulation de la Transcription).

B. Les différents niveaux de régulation de l'expression des gènes

Figure 1 chapitre 10 : Les 9 niveaux de régulation de l'expression des gènes La régulation se fait à différents niveaux ; elle peut se faire à tous les niveaux :

- au niveau de l'ADN avec des phénomènes épigénétiques, c'est-à-dire les niveaux de compaction, qui gèrent l'organisation structurale et fonctionnelle de la chromatine, donc l'activité du gène

▪ euchromatine : gènes exprimés et ADN actif

▪ hétérochromatine : structure plus compacte, gènes réprimés, ADN inactif

 Épigénétique - au moment de la transcription

▪ complexe de transcription

▪ FRT, en réponse à des signaux extracellulaires

▪ maturation : épissage, élaboration de la queue poly A, plus la queue poly est longue et plus c’est stable...

▪ transport et adressage des ARNm vers le cytosol ou le nucléoplasme, puis stockage (durée de vie)

▪ traduction des ARNm en protéines, rôle des microARN, siRNA.

▪ dégradation des ARNm, en fonction de signaux extracellulaires

- au niveau des protéines synthétisées

▪ modifications post-traductionnelles des protéines néosynthétisées : glycosylation...

▪ adressage et utilisation des protéines

▪ dégradation des protéines

La régulation a lieu a tous les niveaux. Elle peut donc avoir lieu :

• dans le noyau (ADN et ARNm pour la transcription et la maturation)

• lors du transport nucléo-cytoplasmique

• dans le cytoplasme (ARNm pour la traduction et la dégradation, et protéines) C. 3 exemples de mécanisme de régulation

1. Au niveau de l'ADN

a) Mécanismes épigénétiques

Par définition, les mécanismes épigénétiques sont l'ensemble des modifications réversibles et transmissibles d'une cellule à sa descendance, portant sur l'expression des gènes, sans changement de la séquence nucléotidique de ces gènes. C’est le niveau de compaction qui est modifié.

Le contrôle épigénétique de l’expression des gènes regroupe au moins 4 types de phénomènes :

• méthylation de l'ADN

• combinaison de plusieurs modifications post-traductionnelles

• remodelage de la chromatine

• ARN non codants

➢ Méthylation de l'ADN et fixation de protéines reconnaissant l'ADN méthylé

Le premier niveau de régulation correspond à la méthylation de l'ADN.

Elle se fait au niveau d'un résidu cytosine au niveau de dinucléotides CG consécutifs (CpG) :

• soit isolés

• soit en îlots (région 5' des gènes, au niveau du promoteur)

Cette méthylation (par l’ADN Méthyl Transférase) entraîne la répression des gènes.

La fixation de protéines reconnaissant l'ADN méthylé permet le maintien de l'état réprimé de la transcription.

➢ Combinaisons de plusieurs modifications post-traductionnelles

Les combinaisons de plusieurs modifications post-traductionnelles, réversibles, des histones composent un code différent du code génétique, c'est le code des histones qui est parallèle au code génétique.

• organisation de la chromatine (euchromatine ou hétérochromatine)

 contrôle de :

▪ la transcription

▪ la réplication/réparation de l'ADN

• modifications de l'extrémité N-terminale des histones nucléosomiques

• réversibilité ; couples d'enzymes à effets antagonistes

 ex : acétylase/acétyl-transférase et méthylase/méthyl-transférase

➢ Complexes de remodelage de la chromatine

Les complexes de remodelage de la chromatine contrôlent la transcription des gènes.

Il s'agit de complexes protéiques interagissant avec les histones modifiées : - trithorax : transcription favorisée

- polycomb : transcription inhibée en raison de la compaction de l'ADN

➢ ARN non-codants

Des ARN non codants (ne son pas à l’origine d’une protéine) participent au contrôle épigénétique.

C'est par exemple le cas dans le phénomène de l'inactivation de l'un des 2 chromosome X chez la femme :

• Blocage de la transcription de 85% des gènes du chromosome X inactivé

 Même dosage génique entre homme et femme

• Gène XSIT : longs transcrits non traduits recouvrant la chromatine du même chromosome = structure inactive grâce au corpuscule de Barr.

Dans le cas d'une anomalies chromosomique 47 XXX (triplo X), la cellule lutte contre cette anomalie en inactivant de 2 chromosomes X, il y a donc 2 corpuscules de Barr.

Phénomène de l’inactivation de l’un des chromosomes X. Exemple du pelage du chat (calico) qui prend la moitié de la couleur du père et l’autre moitié de la mère : c’est pour ça qu’on retrouve plusieurs couleurs sur des chats.

b) Remodelage de la chromatine au moment de la transcription

Au moment de la transcription, il est nécessaire que la chromatine soit remodelée afin de permettre l'accès aux protéines.

En effet, la transcription d'un gène nécessite la décompaction partielle et temporaire de la chromatine pour rendre la double hélice d'ADN accessible.

Figure 2 chapitre10 : Remodelage de la chromatine au moment de la transcription

Cette décompaction met en jeu 2 mécanismes : - l'acétylation des histones

- l'intervention d’un complexe protéique, dit complexe de remodelage de la chromatine (dans lequel il y a une sous unité du protéasome) qui permet :

➔ la libération d'octamères d'histones acétylées

➔ le libre accès au complexe de transcription

Le complexe de remodelage permet ainsi d'introduire une première courbure de l'ADN (une deuxième courbure sera induite par la fixation des FRT), ce qui va permettre le rapprochement physique du FRT et du complexe de transcription.

Ces deux facteurs permettent une désorganisation de la fibre nucléosomique : l'ADN devient ainsi accessible aux FRT et au complexe de transcription.

Lorsque les histones sont acétylées, et que la chromatine est remodelée ; il y a une désorganisation localisée qui libère des histones acétylées : elles libèrent la double hélice d’ADN où se fixent des complexes de remodelage et de transcription.

2. Au niveau des ARNm

a) Facteurs de régulation de la transcription (FRT)

Les FRT se fixent à l'ADN au niveau des régions régulatrices de gènes.

Un FRT est une protéine spécialisée dans la régulation de la transcription à (au moins) 3 domaines indispensables à leur activité :

o domaine de dimérisation, car les FRT agissent toujours à plusieurs, donc au moins sous forme de dimère (homo ou hétéro)

o domaine de fixation à l'ADN, car les FRT doivent se fixer sur une séquence cible sur l'ADN, c'est-à-dire une séquence régulatrice de gènes, au niveau d'une boucle fonctionnelle

 cette fixation induit une deuxième courbure de l'ADN

o domaine de régulation de la transcription, qui va s'associer au complexe de transcription (ARN polymérase II + facteurs de transcription)

Figure 3 chapitre 10 : Les 3 domaines fonctionnels d'un FRT

La fixation de FRT permet de courber à nouveau l'ADN, et la formation de ces 2 courbures est indispensable pour rapprocher physiquement le FRT et le complexe de transcription, permettent ainsi une interaction directe de type protéine/protéine. Agis toujours sous forme de dimère → homodimère ou hétérodimère (peut aussi être trimère etc..) mais jamais de monomère

Rappel figure 15 chapitre 9

Figure 4 chapitre 10 : Fixation du FRT sur l’ADN et régulation de l'expression du gène

Les régions régulatrices de la transcription, ou éléments de réponses, sont multiples pour un même gène.

En effet, il existe plusieurs sites de fixation de différents facteurs de régulation de la transcription, et chaque FRT s'y fixant peut réguler de manière positive ou négative l'expression de ce gène.

Figure 5 chapitre 10 : Plusieurs régions régulatrices pour un même gène (sur lesquelles peuvent se fixer des FRT différents)

L'expression du gène ciblé résulte alors d'un effet combinatoire des différentes actions des FRT (A+B peut augmenter la transcription et A+C la diminuer).

Il y a un phénomène de rétroaction, positive ou négative. Un FRT sera capable de réguler l'expression-même de son propre gène.

Les FRT sont indispensables à la différenciation cellulaire et tissulaire.

Exemples 1 : La protéine MyoD1 est un FRT qui intervient dans la différenciation de la cellule musculaire squelettique.

Plusieurs FRT agissent mais leur action est séquentielle. L'action d'un facteur peut entraîner une rétroaction positive ou négative sur le FRT antérieur ou le FRT suivant (avec un autre programme on pourra avoir des neurones)

Par exemple, le facteur C :

✗ inhibe le facteur B

✗ active le facteur D.

A + B entrainent une augmentation de la transcription ; A + C entrainent une diminution.

Figure 6 chapitre 10 : Exemple de la protéine MyoD1, FRT impliqué dans la différenciation de la fibremusculaire squelettique

La protéine MyoD1 régule l'expression de gènes codant pour des protéines de l'appareil contractile ou encore de canaux ioniques de la membrane plasmique, spécifiques de certains stades de développement.

Au cours de la différenciation cellulaire, l'expression du FRT MyoD1 varie :

o

au stade de myoblaste, donc de jeune cellule peu différenciée,

o au stade embryonnaire de myotube, il y a un pic de l'expression de la protéine, qui entraîne la transcription de gènes codant pour les formes embryonnaires de protéines par exemple des canaux ioniques sous forme embryonnaire…

o au stade adulte, un nerf moteur vient innerver la cellule, il y a alors une chute de l'expression de MyoD1, ce sont les gènes codant pour les formes adultes de protéines qui sont codées

o Si l'on dénerve la cellule adulte, les taux de MyoD1 augmentent, on retrouve alors l'expression des MyoD1 des cellules embryonnaires.

Les protéines à domaines homéobox ou homéodomaine sont codées par des gènes homéotiques.

Ce sont des FRT. Elles présentent plusieurs caractéristiques :

 elles sont indispensables à la différenciation précoce de l'embryon : polarité, segmentation...

 leurs gènes sont très conservés, de la drosophile à l'homme

 une mutation génique provoque la transformation d'une partie de corps de l'embryon en une autre partie de corps.

Exemple 2 : protéines à domaine « homéobox » (homéodomaines)= codées par des gènes homéotiques

▪ Différenciation précoce de l’embryon : polarité, segmentation…

▪ Gènesconservés de la Drosophile (mouche) à l’Homme

▪ Mutation génétiques  transformation d’une partie du corps de l’embryon et une autre partie.

Exemple : Anomalie du gène HOX A13 (HomeobOx)

b) Régulation de l'expression d'un gène via son épissage alternatif

Chez l'homme, il y a 20 000 - 25 000 gènes pour 100 000 protéines environ.

Ainsi, un gène code pour 4 ARNm différents en moyenne, et ce grâce à l'épissage alternatif.

En fait, il y a une sélection aléatoire des exons conservés dans l'ARNm mature.

Ce mécanisme est un moyen pour la cellule d'obtenir, à partir d'un même gène, une multitude de protéines différentes.

Il faut différencier l'excision des introns de ce phénomène d'épissage alternatif des exons.

c) Petits ARNs non-codants (ex : microARNs)

Seulement 2% du génome code pour des protéines.

Le concept de « junk DNA » (« ADN poubelle ») considère ainsi que la majorité de l'ADN du génome, qui ne code pas pour des protéines, est « inutile ».

Cependant, concept a été remis en question.

Il y a en fait transcription de la grande majorité du génome, surtout en ARNs non codants (courts et longs) : ils sont fonctionnels.

En effet, de petits ARN contrôlent : - la transcription des ARNm - leur épissage

- leur traduction

- leur dégradation dans le cytosol.

Ces petits ARNs sont :

- de petite taille : 19-25 nucléotides

- non-codants (ils ne codent pas pour des protéines)

- de 2 types selon leur mode de production :

 siRNAs (small interferent RNA, petits ARN interférents) ils sont codés par notre génome et ils sont très utilisés en recherche pour inactiver des gènes

▪ naturels : endogènes dans les cellules où sil se trouvent, génome viral,

▪ artificiels (dans un cadre expérimental)

 miRNAs (microRNAs) codés par des gènes spécifiques (2 500 environ dans notre génome), qui ne codent pas pour des protéines

Figure 7 chapitre 10 : Régulation de l'expression de gènes par des petits ARNs non codants (siRNA ou miRNA) Les siRNAs et les miRNAs sont :

• Endogènes

 issus du clivage d'ARN endogènes double brin de plus grande taille (siRNAs)

 transcrits à partir de gènes spécifiques (miRNAs)

• Exogènes : apportés par un ARN viral (par exemple).

La production des microRNAs nécessite plusieurs étapes de clivages faisant intervenir une ribonucléase, ou RNAse, appelée Dicer.

Les ARN viraux et siRNAs sont clivés en ARN double brin de 19 à 25 nucléotides. Ils sont ensuite pris en charge par un complexe RISC.

S'il y a reconnaissance parfaite de la séquence d'ARN cible (hybridation totale), il y a clivage d'ARNm.

L'ARN viral peut également entraîner la stimulation de la protéine mitochondriale MAVS (membrane externe), ce qui provoque l'activation de NF-KB. Rappel de la figure 8 chapitre 5.

D'autres microRNAs, les miRNAs, sont transcrits à partir de gènes miRNAs, puis ils sont exportés dans le cytosol, et clivés. Ils sont alors pris en charge par RISC.

Il y a ensuite 2 possibilités :

• si la reconnaissance avec l'ARN cible est parfaite, il y a clivage de l'ARN

• si la reconnaissance est partielle (hybridation partielle), il y a un blocage de la traduction.

 Dans les deux cas, il y a le même effet, c'est-à-dire l'absence de production protéique.

Un miRNA peut s'hybrider totalement ou partiellement avec plusieurs ARNm différents, et ainsi réguler de nombreux gènes.

Petits ARN et applications expérimentales :

Après transfection/infection, on observe une production cellulaire de siRNAs, qui a pour effets : - le blocage de l'expression d'un gène sélectionné → fonction de la protéine

- le blocage temporaire du fonctionnement de virus (hépatite C...)

=> future application thérapeutique ??

Figure 8 chapitre 10 : Régulation de l'expression génique par les miRBAs : ciblage de l'ARm ou de la région promotrice du gène (ADN)

L'action régulatrice des miRNAs sur les ARNm cibles (blocage ou clivage) dans le cytoplasme n'est pas unique.

En effet, les miRNA peuvent maturer dans le cytoplasme puis retourner dans le noyau et jouer un rôle non pas sur les ARN, mais sur le promoteur.

Ils peuvent alors s'hybrider sur une séquence d'ADN cible localisée dans le promoteur et exercer une action positive ou négative : ils participent ainsi à la régulation de la transcription directement sur le gène.

Les miRNAs sont de nouveaux outils diagnostiques, pronostiques et thérapeutiques, puisqu'ils permettent :

• régulation de nombreuses fonctions cellulaires

➔ 1 miRNA = contrôle de la fonction de plusieurs ARNm différents

➔ 1 ARNm = cible de plusieurs miRNAs différents

➔ Nouvelle cible thérapeutique

• variation d'expression dans le cancer ou d'autres pathologies : sur- ou sous-expression

Les miRNAs constituent de nouvelles cibles thérapeutiques.

Les miRNAs constituent une nouvelle classe de signaux de communication intercellulaire.

➢ HC : Échange de microRNAs entre cellules :

 Via des vésicules d’origine cellulaire : - microparticules (MP)

- corps apoptotique (apoptose)

-

 Extra vésiculaire

II. Cellules souc III. hes

A. Différents types de cellules souches

Les cellules souches sont des cellules indifférenciées qui peuvent se renouveler à l'identique, mais aussi se différencier en cellules spécialisées sous l'effet d'un signal, et acquérir ainsi des fonctions particulières (tissu, organe, organisme...)

Rappel Figure 14 chapitre 1 : Le devenir d'une cellule souche

Il existe 4 types de cellules souches :

• Cellules totipotentes

 œuf fécondé et cellules filles issues des premières divisions après la fécondation (stade de blastomère)

 capables d'engendrer un organisme entier

Figure 9 chapitre 10 : Cellules souches embryonnaires

• Cellules pluripotentes

 cellules de la masse interne du blastocyste (blastula) à l'origine de l'embryon et de certaines annexes

= cellules souches embryonnaires ou cellules ES

 capables de se différencier en de nombreux tissus (neurone, tissus musculaire), mais pas un organisme entier

 cultivées in vivo, elles peuvent se différencier sous l'effet d'un signal

 greffées dans la cavité péritonéale d'une souris, elles forment une tumeur appelée tératome (mélange de tissus différenciées)

• Cellules multipotentes

 présentes dans des tissus adultes = cellules souches adultes

 localisées dans des « niches »

 capacité de régénérer ces mêmes tissus dans lesquelles elles se trouvent

 état quiescent, puis réalisent des divisions asymétriques sous l'influence de signaux

 exemple : cellules souches hématopoïétiques

• Cellules unipotentes

 capables de générer un seul type de tissu

 exemple : cellules hépatiques (régénération après chirurgie hépatectomie comme pour le foie qui a la capacité de se régénérer lorsqu’on enlève un bout, il « repousse » en quelque sorte)

B. Deux exemples d’application : médecine régénératrice et étude de maladies génétiques La médecine régénératrice consiste à utiliser ces cellules souches pour réparer un tissu lésé.

Elle suscite beaucoup d'espoir, notamment dans le traitement par greffe de cellules souches dans de nombreux cas :

- infarctus du myocarde - diabète insulino-dépendant...

Hors concours :

❖ Cellule souches adultes : - Isolement de CS

- « Manipulation des cellules » :

▪ culture

▪ modification du patrimoine génétique (« transfection ») pour correction d’une anomalie du génome nucléaire= « thérapie génique » - Ré administration au même patient

❖ Thérapie génique

Chez l’homme : correction d’un déficit immunitaire (1999…)  maladie des « bébés bulles » Problème :

- Taille des gènes

- Intégration dans le génome  cancer (leucémie), apoptose… (test chez la souris) Découvert par Alain Fischer : médecin pédiatre et immunologiste.

Cependant, les cellules souches embryonnaires posent des problèmes :

• éthiques : destruction d’un embryon. Loi de bioéthique 2013 : recherche sur cellules ES sur dérogation en France (accord de l’Agence de Biomédecine)

Assouplissement avec Loi de Bioéthique 2019 : Consentement écrit des parents ayant recours à la PMA et dont les embryons surnuméraires congelés ne feraient plus l’objet d’un projet parental.

cellules ES à partir d'embryons humains surnuméraires ou importées en France dans des unités de recherche très contrôlées (Loi de Bioéthique)

• techniques avec difficultés

Figure 10 chapitre 10 : 2 exemples de techniques d'obtention de cellules souches

La reprogrammation d'un ovocyte par transfert de noyau est la technique qui a été utilisée pour produire Dolly en 1996.

Elle consiste à transférer in vitro le noyau d'une cellule somatique (différenciée) dans un ovocyte préalablement énuclée aboutissant à la reprogrammation génétique de cet ovocyte.

La reprogrammation de cellules adultes permet la transformation de ces cellules en cellules souches par transfection via un vecteur rétroviral des gènes codant pour 4 protéines nucléaires.

Les cellules souches générées sont dénommées iPS (Technique découverte par Ymanaka) (induces Pluripotent Cells). Elles sont très utiles, par exemple pour l'étude de maladies génétiques. Dans ce cas là, on conserve le code génétique.

Dans la progeria de Hutchinson-Gilford, les fonctions cognitives sont conservées (ils ont un Qi normal) malgré les atteintes pluritissulaires.

Les iPs (= modèle de pathologie humaines) ont permis l'étude de ces phénomènes, du fait de leur capacité de différenciation, par exemple en neurones, que l'on a pu étudier.

On voit donc 2 techniques utilisables pour obtenir des cellules souches ; ces techniques ont été inventées par des chercheurs.

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