Développement d'outils « biocapteurs/modèle cellulaire » pour l'identification de ligands et l'étude des interactions ADN/protéine et protéines/protéines

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Développement d’outils “ biocapteurs/modèle cellulaire

” pour l’identification de ligands et l’étude des

interactions ADN/protéine et protéines/protéines

Alexandre Berthier

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Alexandre Berthier. Développement d’outils “ biocapteurs/modèle cellulaire ” pour l’identification de ligands et l’étude des interactions ADN/protéine et protéines/protéines. Sciences du Vivant [q-bio]. Université de Franche-Comté, 2008. Français. �tel-00404562�

UNIVERSITE DE FRANCHE-COMTE UFR DES SCIENCES ET TECHNIQUES

Doctorat de l’Université de Franche-Comté

Sciences de la Vie et de la Santé

Développement d’outils « biocapteurs/modèle

cellulaire » pour l’identification de ligands et

l’étude des interactions ADN/protéine et

protéines/protéines

THESE

Alexandre BERTHIER

M. Michael Canva Directeur de recherches, CNRS-UMR 8501 Université Paris-Sud M. Benoit Roig Maître de conférences, HDR Ecole des Mines d’Alès ƒ Examinateurs :

M. Pierre Tiberghien Professeur Université de Franche-Comté / IFR 133 M. Philippe Picart Professeur Université de Franche-Comté / FEMTO-ST ƒ Directeur de thèse :

M. Régis Delage-Mourroux Professeur Université de Franche-Comté / IFR 133 ƒ Codirecteur de thèse :

Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier les membres du jury.

Je suis très sensible à l’honneur que me font messieurs Michael Canva et Benoit Roig en acceptant de juger ce travail. Je suis touché de voir en leur présence un gage de qualité.

Je tiens aussi à remercier messieurs Pierre Tiberghien et Philippe Picart d’avoir accepté de participer à ce jury. L’intérêt que vous portez à mon travail me touche particulièrement.

Au moment où cette thèse s’achève, je me rends compte du grand nombre de personnes qui m’a soutenu au cours de ces dernières années. Ainsi, j’aimerais ici toutes les remercier, en espérant n’oublier personne…

Je tenais avant tout à remercier le tandem de choc qui a encadré ce travail : Régis

Delage-Mourroux et Wilfrid Boireau. « Plus que des directeurs de thèse pour moi, vous

êtes devenus des amis… »

« Régis, tu m’as donné le goût de la recherche. C’est à partir de la licence que nos routes se sont croisées et que tu as su me transmettre cette passion…Tu as été un véritable guide lors de ces quatre dernières années, surtout dans les moments les plus difficiles. Tu m’as soutenu lorsque j’en avais besoin, tu m’as encouragé et remonté le moral dans les moments les plus durs. Je ne serais jamais arrivé jusque là sans toi… »

« Wilfrid, tu m’as fait découvrir le monde des nanosciences. Tu as toi aussi été un guide dans cet univers bien particulier. Je tenais à te remercier pour le temps que tu as su trouver pour m’aider à mieux surmonter les nombreux obstacles qui ont jalonné mon chemin. Je voulais aussi te remercier pour la convivialité que tu as créée au sein de notre équipe qui naquit pendant cette thèse. L’ambiance du labo ainsi que nos petites sorties CLIPP vont me manquer… »

Je tenais aussi à remercier tout particulièrement Michèle Jouvenot pour m’avoir accueilli dans son laboratoire.

« Michèle, la passion qui t’anime me laisse sans voix. Je tenais à te remercier pour tous tes précieux conseils, ainsi que pour le temps que tu m’as consacré, malgré un emploi du temps plus que chargé. »

Merci à Annick et Pascale qui m’ont prodigué de précieux conseils et qui m’ont permis de mener à bien mon travail.

Je ne peux oublier mes collègues de la « gec1 team » : Fabrice, Stéphanie et Virginie. « Fab, j’ai énormément appris avec toi. Ton départ vers de nouveaux horizons a laissé un grand vide, même si je sais que nous garderons toujours contact. Les petites sessions bricolage n’étaient plus pareilles sans toi… »

« Stéphanie, ma chère « pouasse-woman » je suis heureux de t’avoir rencontrée et d’avoir travaillé avec toi. Je voulais te remercier d’avoir accepté de relire ma thèse, afin d’y relever les dernières coquilles. J’espère que la chance te sourira pour la fin de ta thèse. Bon courage, je suis sur que tu y arriveras… »

Je tenais à remercier aussi tous mes compagnons de route Karine, Sophie, Nicolas,

Fatima, Kevin, Elise et Romain.

« Bonne chance à tous ceux et celles qui soutiendront bientôt leurs thèses. Bon courage à ceux qui la débute, profitez bien de cette expérience enrichissante, vous serez bientôt à ma place… Enfin, à ceux qui sont encore sur les bancs de la fac, je vous souhaite d’atteindre vos objectifs, le plus sereinement possible. »

Un grand merci à notre « wonder-technicienne », Valérie.

« Valérie, encore merci pour toute la précieuse aide que tu m’as apporté. Tu es la clé de voûte de ce labo… Ne laisse jamais quelqu’un te dire le contraire ! »

Je remercie également tous les membres de l’équipe E2SNC : Jean, Maï, Michael, Martine, Pierre-Yves, Martine, Gabrielle, Fabrice, Claude J., Christophe, Claude C. et Annie.

Je tenais à remercier les gens de CLIPP et en particulier Céline, Alain et Benoît.

« Merci à vous trois pour l’aide et le soutien que vous m’avez apportés depuis que nos chemins se sont croisés.

Céline, j’ai vraiment apprécié de t’avoir rencontrée et d’avoir travaillé avec toi. Tu m’as fait découvrir un drôle d’appareil : le microscope à force atomique (un nom très impressionnant pour un si petit appareil !) Tu as souvent été là pour me remonter le moral, alors encore merci.

Alain, nos petites discussions accoudés à la paillasse ou au comptoir vont me manquer. Qui sait, peut être qu’un jour tu seras à ma place…

Benoît, tu n’es arrivé que tardivement (là, je ne parle pas de tes heures d’arrivée au labo !) mais j’ai beaucoup apprécié de travailler avec toi. Tous mes voeux de réussite pour la suite… »

J’aimerais aussi remercier mes collègues moniteurs et monitrices : Jean-Sébastien,

Guillaume, Marie-Laure et Emilie ; ainsi que celles que je n’ai pas encore cité et avec qui

j’ai découvert la dure réalité de l’organisation du forum des jeunes chercheurs : Carole et

Adeline.

Je remercie également mes proches et mes amis : Stéphanie, Pierre, Charlotte (mon adorable petite nièce), Claude, Dominique, Marine, Gouillle, Faust, Ceix, Estelle, Malp,

Julien, Corinne, Docky et tous les autres sanins et sanines….

« Merci d’avoir toujours été là pour moi, de m’avoir soutenu et de m’avoir permis de faire un « break » quand j’en avais besoin. »

« Papa, Maman, je vous remercie du plus profond de mon cœur de m’avoir permis de découvrir le passionnant métier de chercheur. Merci pour votre soutient tout au long de mon parcours scolaire et universitaire. Je vous remercie aussi de m’avoir appris à ne pas renoncer, même si parfois le message avait du mal à rentrer dans ma petite tête... Vous êtes les meilleurs parents du monde et je suis fier d’être votre fils ! »

Enfin je tenais à remercier celle qui a du me supporter pendant cette épreuve, ma chérie

Coralie.

« Tu as été là à chaque instant, partageant avec moi les bons comme les mauvais moments et je t’en remercie. Dès l’instant où j’ai croisé ton regard j’ai su que nous étions faits l’un pour l’autre. C’est vrai que les débuts de notre relation n’ont pas vraiment été simples, mais j’ai toujours cru en notre amour. Merci de m’avoir toujours soutenu et apaisé durant ces années. Et surtout, merci pour le plus merveilleux de tous les cadeaux que tu vas m’offrir dans quelques jours : un fils. Tu es et tu resteras toujours mon petit rayon de soleil. JE T’AIME !»

Enfin je tenais à dédier cette thèse à mon fils.

« A l’heure où j’écris ses quelques lignes, tu n’es pas encore parmi nous. Ta mère et moi n’avons toujours pas pris notre décision quant au prénom que nous allions te donner, mais tu es déjà au centre de toutes nos pensées. Même si je ne cesse de répéter à ta mère qu’il ne faut pas que tu arrives avant que j’ai rendu ce manuscrit, je suis impatient de faire ta connaissance et de te prendre dans mes bras…»

Préambule

Cette thèse s’inscrit dans le cadre d’une collaboration entre l’équipe « Estrogènes,

Expression Génique et Pathologies du Système Nerveux Central (E2SNC); IFR 133

Ingénierie et Biologie Cellulaire et Tissulaire (IBCT) » et la plateforme protéomique « CLinical & Innovation Proteomic Platform (CLIPP) ; département Micro Nano Sciences & Systèmes (MN2S) ; Institut Franche-Comté Electronique Mécanique Thermique et Optique - Sciences et Technologies (FEMTO-ST) et IFR 100 (Dijon) ».

L’objectif général de mes travaux a consisté à développer des outils permettant l’étude des interactions ADN/protéine et protéines/protéines. Pour ce faire, j’ai développé un modèle

cellulaire ainsi que deux biocapteurs SPR (Résonance Plasmonique de Surface) nommés prototype « lipidique » et prototype « C11/C16 ». Ce dernier étant compatible avec l’étude

des interactions ADN/protéine et protéines/protéines. Ces modèles ont été utilisés pour identifier des molécules estrogéniques et de partenaires de la protéine GEC1.

Les xénoestrogènes sont des molécules capables de moduler l’expression génique via l’interaction spécifique des récepteurs aux estrogènes (RE) avec une séquence ADN au voisinage d’un gène cible. L’interaction de ces récepteurs avec l’ADN est donc une étape indispensable à l’activité estrogénique. Cependant, afin de transactiver un gène, ces derniers doivent recruter les différents acteurs de la machinerie transcriptionnelle. Ainsi, l’utilisation d’un biocapteur ADN/protéine permet un précriblage de molécules afin de ne retenir que celles capable de moduler l’interaction du RE avec sa cible nucléotidique. La détermination de la nature agoniste ou antagoniste des molécules sélectionnées nécessite quant à elle, l’utilisation d’un contexte biologique plus complexe possédant tous les acteurs de la transcription (co-activateur, co-répresseurs et facteurs généraux de la transcription). J’ai donc développé, en parallèle, un modèle cellulaire permettant la caractérisation des molécules présectionnées.

Enfin, afin de prouver que le prototype « C11/C16 » permettait l’étude des interactions protéines/protéines, j’ai choisi comme application biologique l’identification de partenaires protéiques de GEC1. Cette protéine étant codée par un gène estrogénodépendant.

Ce manuscrit s’articule en six parties, dont la première intitulée « contexte

bibliographique » présente les connaissances actuelles dans les domaines de la régulation

génique par les estrogènes et des biocapteurs SPR. La seconde partie intitulée « cadre et but

du travail » présente les stratégies mises en place lors de mes travaux ainsi que leurs intérêts.

La partie « matériel et méthodes » regroupe l’ensemble des techniques utilisées pour mener à bien ce projet. La partie « résultats » regroupe l’ensemble de mes résultats obtenus en réponse à mes objectifs :

1) Mise au point de biocapteurs ADN/protéine

- Le prototype « lipidique » dont la conception et la caractérisation sont présentées dans la publication numéro I :

“Nanobioengineering and Characterization of a Novel Estrogen Receptor Biosensor”.

Alexandre Berthier, Céline Elie-Caille, Eric Lesniewska, Régis Delage-Mourroux et Wilfrid

Boireau. Sensors, 2008 ; vol 8 : 4413-4428

- Le prototype « C11/C16 » qui a permis le précriblage de molécules comme la 7-O-β-D-glucopyranosylchrysine.

2) La mise au point d’un modèle cellulaire MCF-7 qui a permis l’identification d’un nouveau phytoestrogène : la 7-O-β-D-glucopyranosylchrysine. Les résultats de cette

“Effect of 7-O-β-D-Glucopyranosylchrysin and its Aglycone Chrysin Isolated from

Podocytisus caramanicus on Estrogen Receptor a Transcriptional Activity.” Alexandre

Berthier, Corinne Girard, Aurélie Grandvuillemin, Frédéric Muyard, Alexios-Leandros

Skaltsounis, Michèle Jouvenot et Régis Delage-Mourroux. Planta Medica, 2007 ; vol 73 (14) : 1447-1551

3) La mise au point d’un biocapteur protéines/protéines, basé sur le prototype « C11/C16 », ayant permis l’identification de l’homodimérisation de GEC1.

La cinquième partie intitulée « conclusion-discussion » reprend l’ensemble des résultats en les replaçant dans le contexte bibliographique. Enfin, la sixième et dernière partie intitulée « perspectives » permet d’entrevoir la poursuite de ces travaux, ainsi que les nouvelles applications envisagées.

SOMMAIRE

1. REGULATION DE L’EXPRESSION GENIQUE PAR LES ESTROGENES 21

1.1. GENERALITES 21

1.2. LES RECEPTEURS NUCLEAIRES AUX ESTROGENES 21

1.2.1 Structures et fonctions des récepteurs nucléaires 21

1.2.2 Les récepteurs aux estrogènes de types α et β 24

1.2.2.1 Organisation génique 24

1.2.2.2 Structures protéiques 25

1.2.3 Actions génomiques des RE 28

1.2.3.1 Actions génomiques directes 28

1.2.3.2 Actions génomiques indirectes 30

1.2.4 Autres voies d’action des RE 32

1.2.4.1 Voie d’action indépendante du ligand 32

1.2.4.2 Voie d’action non génomique : les RE membranaires 33

1.3. LES LIGANDS DES RECEPTEURS AUX ESTROGENES 34

1.3.1 Les estrogènes physiologiques 34

1.3.2 Les xénoestrogènes 36

1.3.2.1 Les molécules d’origine naturelle 36

1.3.2.2 Les molécules d’origine synthétique 40

1.3.2.2.1 Molécules à usage thérapeutique 40

1.3.2.2.2 Les perturbateurs endocriniens 43

2. GENES REGULES PAR LES ESTROGENES 45

2.1. MECANISME DE REGULATION TRANSCRIPTIONNELLE 45

2.2. DIFFERENTS GENES CIBLES 47

2.3. DIFFERENTS ELEMENTS DE REPONSE AUX ESTROGENES 48

2.4. EXEMPLE DE GENE REGULE PAR LES ESTROGENES :GEC1 49 3. MODELES D’ETUDES DES INTERACTIONS ADN/PROTEINE ET PROTEINES/PROTEINES 53

3.1. LES MODELES CELLULAIRES 53

3.1.1 Criblage de xénoestrogènes 53

3.1.2 Identification de partenaires protéiques 54

3.2. LES BIOCAPTEURS 54

3.2.1 La résonance plasmonique de surface (SPR) 55

3.2.2 Exemples d’application 57

3.2.3 Différentes surfaces de puce 58

3.2.3.1 Les surfaces tridimensionnelles (Dextran) 59

3.2.3.1.1 Description 59

3.2.3.1.2 Avantages et inconvénients 60

3.2.3.2.1 Description 61

3.2.3.2.2 Avantages et inconvénients 64

3.2.4 Les capteurs ADN/protéine 65

3.2.5 Les capteurs protéines/protéines 67

CADRE ET BUT DU TRAVAIL 69

MATERIELS ET METHODES 76

1. MATERIELS 77

1.1. LES COMPOSES ETUDIES 77

1.1.1 Les composés d’origine synthétique 77

1.1.2 Les composés d’origine naturelle 77

1.2. LES CONSTITUANTS DES DIFFERENTS BIOCAPTEURS 78

1.2.1 Les biocapteurs ADN / protéines 78

1.2.1.1 Prototype « lipidique » 78 1.2.1.2 Le prototype « C11 / C16 » 79 1.3. LA LIGNEE CELLULAIRE MCF-7 80 1.4. LES VECTEURS 80 1.4.1 Vecteur 2ERE-pS2-Luc 80 1.4.2 Vecteur pSVβ-Gal 81 1.4.3 Vecteurs pGEX4T2 81

1.4.4 Vecteur pSBET -FLAG-GEC1-(His)6 82

2. AMPLIFICATION, PURIFICATION ET SEQUENÇAGE DES VECTEURS 82

2.1. TRANSFORMATION DES BACTERIES COMPETENTES 82

2.2. EXTRACTION DES ADN PLASMIDIQUES 83

2.2.1 Mini-préparation par lyse alcaline 83

2.2.2 Maxi-préparation 83

2.3. SEQUENÇAGE DES VECTEURS 83

3. CULTURE CELLULAIRE 83

3.1. MILIEUX DE CULTURE 83

3.2. PASSAGE DES CELLULES 84

3.3. CONGELATION ET DECONGELATION DES CELLULES 84

3.4. TRANSFECTION CELLULAIRE TRANSITOIRE 85

4. ANALYSE, EXPRESSION ET PURIFICATION DE PROTEINES 85

4.1. DETERMINATION DES ACTIVITES ENZYMATIQUES LUCIFERASE ET β-GALACTOSIDASE 85

4.2. ANALYSE BIOCHIMIQUE DES PROTEINES D’INTERET 86

4.2.1 Electrophorèse SDS-PAGE (Sodium dodecylsulfate –PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) 86

4.2.2 Western blotting 86

4.3. PRODUCTION ET PURIFICATION DE PROTEINES RECOMBINANTES 87

4.3.1 Protéines GST, GST-GEC1 et GST-GABARAP 87

4.3.2 Protéine FLAG-GEC1-(His)6 88

4.4. GST PULL-DOWN 88

5. ASSEMBLAGE DES BIOCAPTEURS 89

5.1. LES BIOCAPTEURS ADN/PROTEINE 89

5.1.1 Prototype « lipidique » 89

5.1.1.1 Spécificité 89

5.1.1.2 Couplage des oligonucléotides au cytochrome b5 modifié 90

5.1.1.3 Formation des hybrides d’intérêt : (P-DNA)2 92

5.1.1.4 Assemblage du biocapteur 92

5.1.1.5 Etude de l’interaction du RE avec l’ADN 93

5.1.1.6 Microscopie à force atomique (AFM) 94

5.1.2.1 Spécificité 94

5.1.2.2 Assemblage du biocapteur 95

5.1.2.3 Criblage de composés 96

5.2. BIOCAPTEUR PROTEINES/PROTEINES 96

5.2.1 Spécificité 96

5.2.2 Assemblage du biocapteur 97

5.2.3 Confrontation de partenaires potentiels 97

RESULTATS 98

1. MISE AU POINT DES BIOCAPTEURS ADN/PROTEINE 99

1.1. LE PROTOTYPE « LIPIDIQUE » 99

1.1.1 Conception et caractérisation du biocapteur 99

1.1.2 Problèmes rencontrés. 122

1.2. LE PROTOTYPE « C11/C16 » 124

1.2.1 Assemblage du biocapteur 124

1.2.2 Validation du biocapteur 125

1.2.3 Criblage de composés 126

2. NOUVEAUX PHYTOESTROGENES : LA CHRYSINE ET SON GLUCOPYRANOSIDE 128 3. BIOCAPTEUR PROTEINES/PROTEINES : IDENTIFICATION DE PARTENAIRES DE LA PROTEINE

GEC1 135

3.1. GENERALITES ET OBJECTIFS 135

3.2. BIOCAPTEUR PROTEINES/PROTEINES 135

3.2.1 Production et purification pSBET-FLAG-GEC1-(His)6 135

3.2.2 Assemblage du biocapteur 136

3.2.3 Validation du biocapteur 137

3.2.4 Etude des interactions 138

3.3. CONFIRMATION DES RESULTATS SPR PAR GST PULL-DOWN 139

DISCUSSION – CONCLUSIONS 140

1. DEVELOPPEMENT DES BIOCAPTEURS RE/ERE 141

1.1. MAITRISE DE L’ARCHITECTURE 142

1.2. PERFORMANCE DES BIOCAPTEURS RE/ERE 144

2. IDENTIFICATION D’UN NOUVEAU PHYTOESTROGENE 148

3. HOMODIMERISATION DE GEC1 149

PERSPECTIVES 151 BIBLIOGRAPHIE 154

ANNEXES 179

1. PUBLICATION NUMERO III : 180

2. LISTE DES COMMUNICATIONS ORALES 199

3. LISTE DES COMMUNICATIONS PAR AFFICHE 199

ABREVIATIONS

17-HSD : 17-β-HydroxyStéroïde Déshydrogénase ADN : Acide désoxyribonucléique

ADNc : Acide DésoxyriboNucléique complémentaire AF : Activation Function

AFM : Atomic Force Microscopy AIB1 : Amplified In Breast cancer-1

AMPc : Adénosine MonoPhosphate cyclique ARH : Autosomal Recessive Hypercholesterolemia ARN : Acide RiboNucléique

ARNm : Acide RiboNucléique messager BPA : BisPhénol A

CBP : Cyclic AMP responsive element binding protein Binding Protein CMD : CarboxyMéthyl-Dextran

CMH : Complexe Majeur d’Histocompatibilité CRE : cAMP Response Element

CHOP : Cyclophosphamide, Doxorubicine, Vincristine, Prednisone CTAB : Bromure d'hexadécyltriméthylammonium

DBD : DNA Binding Domain (domaine de liaison à l’ADN) DDT : DichloroDiphénylTrichloroéthane

DDX47 : DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) boX polypeptide 47 DES : DiEthylStilbestrol

DHAS : DeHydroepiAndrostérone Sulfate DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

DMPC : Dimyrisoyl Phosphatidyl Choline DMSO : Diméthyl SulfOxyde

DNase : DésoxyriboNucléase

DOGS : 1,2-DiOleoyl-sn-Glycero-3[(N (5-amino-1-carboxypentyl) imminodiacetic acid) Syccinyl]

DTT : DiThioThréitol E1 : Estrone

E2 : Estradiol-17β

E3 : Estriol

EBAG9 : Estrogen receptor-Binding fragment-Associated Gene 9 EDC : l-Ethyl-3- (3- Diméthylaminopropyl ) Carbodiimide EDTA : Ethylen Diamine Tetra-acetic Acid

EGF : Epidermal Growth Factor

EMSA : Electrophoretic Mobility Shift Assay ERAP140 : ER Associated Protein 140 ERE : Element de Réponse aux Estrogènes ESR1 et 2 : EStrogen Receptor 1 et 2 GABA : Gamma-AminoButyric Acid

GABARAP : GABAA Receptor Associated Protein

GEC : Glandular Epithelial Cells

GEC1 : Glandular Epithelial Cell protein 1

GRIP1 : Glutamate Receptor Interacting Protein 1 GPR30 : G Protein-coupled Receptor-like

GST : Glutathion-S-Transferase

HPLC : High Pressure Liquid Chromatography (chromatographie liquide à haute pression) HRE : Elément de Réponse à l’Hormone

HRP : HoRseradish Peroxydase

HS-C11-OH : 11-mercapto-1-undécanol

HS-C15-COOH : acide 16-mercaptohexadécanoïque

HSP : Heat Shock Protein IDA : ImminoDiacetic acid

IGF-1 : Insulin-like Growth Factor-1 IL : InterLeukine

INFγ : INterFéron γ

IPTG : IsoPropyl-β-D-Thio-Galactopyranoside kpb : Kilo Paire de Bases

LB : Luria Bertani

LBD : Ligand Binding Domain (Domaine de liaison du ligand)

LC-SPDP : Succinimidyl 6-[3’-(2-PyridylDithio)-Propionamido] hexanoate LDL : Low-Density Lipoprotein

MAPK : Microtubule Associated Protein Kinase MC : Milieu Complet

MCDS : Milieu Complet DéStéroïdé MS : Milieu de Stimulation

NADPH : Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate NHS : N- HydroxySuccinimide

NLS : Nuclear Localisation Sequence (séquence de localisation nucléaire) NMDA : N-Methyl-D-Aspartic acid

OG : Octyl Glucopyranoside OM : Octadécyl Mercaptan

ONPG : Ortho-Nitro-Phényl-β-D-Galactopyranoside pb : Paires de Bases

PBS : Phosphate Buffer Saline PCB : PolyChloroBiphényles PEI : PolyEthylenImine PEG : PolyEthylène Glycol PEO : PolyEthylène Oxide

PI3K : Phosphatidyl-Inositol 3-Kinase

PPAR : Peroxisome-Proliferator-Activated Receptors PRIP1 : Phopholipase C-Related Inactive Protein 1 PVDF : PolyVinylidene DiFluoride

QCM : Quartz Crystal Microbalance RE : Récepteur aux Estrogènes RN : Récepteur Nucléaire

SAM : Self Assembled Monolayer (monocouche auto assemblée) SAW : Surface Acoustic Wave

SDS : Sodium DodecylSulfate

SDS-PAGE : Sodium DodecylSulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis SERM : Selective Estrogen Receptor Modulator

Sp1 : Specific Promoter transcription factor 1 SPR : Surface Plasmon Resonance

SRC : Steroid Receptor Coactivator SVF : Sérum de Veau Foetal

TBS : Tris Buffer Saline TFF1 : TreFoil Factor 1

TGF : Transforming Growth Factor THS : Traitement Hormonal Substitutif TNF : Tumor Necrosis Factor

ULK1 : Unk51-Like Kinase UTR : UnTranslated Region

VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor ZEA : ZEAralenone

1. Régulation de l’expression génique par les

estrogènes

1.1. Généralités

Les estrogènes et en particulier l’estradiol-17β (E2) contribuent au contrôle de la

différenciation et de la prolifération cellulaires et aussi de l’apoptose. Pour ce faire, ces molécules doivent interagir avec les Récepteurs aux Estrogènes (RE). Ceux-ci appartiennent à deux grandes catégories distinctes, à savoir, la superfamille des Récepteurs Nucléaires (RN) et les récepteurs membranaires. Lors de nos travaux, nous avons focalisé notre attention sur les RE nucléaires. Ces récepteurs sont des facteurs de transcription capables de se fixer sur une séquence cis-régulatrice appelée Elément de Réponse aux Estrogènes (ERE). Ils modulent ainsi l’expression de gènes au voisinage desquels se trouve un ERE.

1.2. Les récepteurs nucléaires aux estrogènes

1.2.1 Structures et fonctions des récepteurs nucléaires

La superfamille des RN regroupe des facteurs de transcription qui présentent une organisation structurale et fonctionnelle commune. En absence de ligand, certains de ces récepteurs sont localisés dans le noyau (en interaction ou non avec l’ADN), les autres étant localisés dans le cytoplasme. Les ligands de ces récepteurs sont de nature liposoluble, donc capables de diffuser à travers la membrane plasmique et ainsi d’entrer à l’intérieur de la cellule. C’est la liaison du ligand à son récepteur qui entraîne l’activation puis la dimérisation de celui-ci qui peut alors interagir avec une séquence cible nucléotidique appelée Elément de Réponse à l’Hormone (HRE). Une fois lié à l’ADN, le dimère de récepteurs activés recrute des co-régulateurs transcriptionnels (co-activateurs ou co-répresseurs). Ces RN sont des modulateurs de la transcription impliqués dans le contrôle d’un grand nombre de fonctions

physiologiques comme le développement embryonnaire, la différenciation cellulaire et l’homéostasie (Gronemeyer et Laudet, 1995, Mangelsdorf, et al., 1995).

De plus, l’analyse phylogénétique de la superfamille des RN a montré une évolution commune de ces récepteurs et a permis de les classer en six sous familles. (1) Une sous famille contenant les récepteurs aux hormones thyroïdes, à l’acide rétinoïque, à la vitamine D et à l’ecdysone, les Peroxisome-Proliferator-Activated Receptors (PPAR) ainsi qu’un grand nombre de récepteurs orphelins. (2) Une autre composée du récepteur X rétinoïde, du facteur de transcription du promoteur de l’ovalbumine de Poulet ainsi que le facteur hépatique nucléaire 4. (3) Une correspondant au facteur de croissance nerveuse et les facteurs inductibles du groupe I-B des récepteurs orphelins. (4) La sous famille du facteur 1 stéroïdogénique et du récepteur au facteur 1 « fushi tarazu » de Drosophile. (5) Celle constituée du récepteur nucléaire du facteur 1 des cellules germinales. Enfin, (6) la sous famille regroupant les récepteurs aux hormones stéroïdes avec les récepteurs aux estrogènes, aux glucocorticoïdes, aux minéralocorticoïdes, à la progestérone et aux androgènes (Laudet, et al., 1999, Escriva, et al., 2004).

Les différentes activités des récepteurs nucléaires sont dues à la présence de cinq domaines protéiques distincts (Figure 1) (Altucci et Gronemeyer, 2001). Le premier domaine,

le domaine A/B, contient la fonction AF-1 (Activation Function-1) responsable de

l’activation de la transcription, indépendante de la fixation du ligand. Le second, le domaine

C, forme deux doigts de zinc responsables de la liaison à l’ADN au niveau de séquences

HRE. Chaque doigt de zinc possède quatre résidus cystéines, très conservés, qui établissent des liaisons de coordination avec un ion Zn2+. Les boîtes P (pour Proximale) et D (pour Distale) jouent un rôle dans la reconnaissance des HRE (Figure 1b). Le domaine D est une petite région charnière entre les domaines C et E. Il participe à la fonction de dimérisation des récepteurs et de liaison de l’ADN (Figure 1). Le domaine E est le domaine de liaison de

l’hormone. Il participe également à d’autres fonctions, telles que la dimérisation des récepteurs, la localisation nucléaire dépendante du ligand, la liaison avec la protéine de choc thermique HSP90 et la transactivation dépendante du ligand ou fonction AF-2 (Figure 1).

Figure 1 : Structure générale des récepteurs nucléaires. A) Fonctions associées aux différents domaines. Les

domaines C et E, les plus conservés, sont encadrés des régions plus variables, les domaines A/B, D et F. La fonction d’activation indépendante du ligand (AF-1) est localisée dans le domaine A/B alors que celle dépendante du ligand (AF-2) se situe au niveau du domaine E. Les Séquences de Localisation Nucléaire (NLS), peuvent être constitutivement actives ou activées par la liaison du ligand (dans le domaine E), et permettent la reconnaissance du récepteur au niveau des pores nucléaires et sa translocation du cytoplasme vers le noyau. B) La fixation des récepteurs à l’ADN sur l’HRE fait intervenir des structures en doigts de zinc du domaine C (DBD). La reconnaissance des demi-sites des HRE et de la distance qui les sépare est assurée par la boîte P et la boîte D. C) La fixation d’un ligand entraîne un changement conformationnel du récepteur qui passe de la configuration apo-récepteur à la configuration holo-récepteur (ou récepteur activé). Cette modification entraîne un mouvement de l’hélice α H12 (en rouge) qui permet ainsi l’interaction du RN avec les corégulateurs transcriptionnels. Le RN représenté est le récepteur à la vitamine D.

Le domaine E contient une large proportion d’acides aminés hydrophobes, constituant une poche de liaison pour l’hormone. La connaissance des structures 3D des domaines de liaison de l’hormone de certains récepteurs nucléaires a permis de mieux comprendre les mécanismes d’activation du domaine AF-2. La comparaison des structures liées et non liées à l’hormone, suggère que la liaison de l’hormone induit un mouvement de l’hélice α H12 C-terminale qui vient recouvrir la poche de liaison du ligand (Figure 1c). Cette hélice α ainsi positionnée forme une surface d’interaction avec les cofacteurs transcriptionnels qui servent

eux-mêmes de pont avec la machinerie transcriptionnelle ou ont une activité histone acétyl transférase (Wurtz, et al., 1996).

1.2.2

α

β

A ce jour, deux types de RE nucléaires ont été identifiés : le récepteur des estrogènes α (REα) et le récepteur de type β (REβ). En général, ces deux récepteurs ne présentent pas le même profil d'expression tissulaire. Le REα est majoritairement exprimé dans les ovaires, l'utérus et la glande mammaire alors que le REβ est présent dans les ovaires, les testicules et la prostate (Muramatsu et Inoue, 2000). Cependant, les deux isoformes peuvent coexister dans certains organes et notamment dans le système nerveux central (SNC). Dans ce dernier, certaines régions expriment uniquement REα ou REβ, alors que d’autres régions expriment les deux types de récepteurs (Shughrue, et al., 1997). Cependant, dans l’ensemble du SNC, REα est le plus exprimé.

1.2.2.1 Organisation génique

Le REα humain a été cloné en 1986 grâce au criblage d’une banque ADNc issue d’une lignée de cellules humaines de cancer du sein (MCF-7) (Walter, et al., 1985, Green, et al., 1986b). En 1996, un second récepteur, appelé REβ, a été isolé à partir d’une banque d’ADNc issue de prostate de Rat (Kuiper, et al., 1996). Cette découverte a suscité l’intérêt de différentes équipes, qui ont identifié tour à tour des ARNm codant des protéines de 477, 485 puis 530 acides aminés (Mosselman, et al., 1996, Enmark, et al., 1997, Moore, et al., 1998, Ogawa, et al., 1998).

Chez l’Homme, les récepteurs aux estrogènes REα et REβ sont les produits de deux gènes distincts (ESR1 et ESR2, estrogen receptor 1 et 2 respectivement) présents sur des chromosomes différents (locus 6q25.1 pour REα et locus 14q23-24.1 pour REβ) (Gosden, et al., 1986, Enmark, et al., 1997).

ESR1 et ESR2 sont constitués de huit exons et représentent respectivement plus de 140 kpb (kilo paires de bases) et environ 40 kpb. Une partie de l’exon 1 code une grande partie de la région A/B. Les exons 2 et 3 codent la partie terminale de la région A/B et la majeure partie de la région C. L’exon 4 code une partie de la région C, toute la région D et une partie de la région E. Le reste de la région E est codée par les exons 5 à 8. La fin de la partie codante de l’exon 8 correspond à la région F (Green, et al., 1986a, Green, et al., 1986c, Greene, et al., 1986, Kuiper, et al., 1996, Enmark, et al., 1997). La maturation des ARNm ERS1 et ERS2 par épissage alternatif peut aboutir à la synthèse d’un grand nombre de transcrits différents tant au niveau pathologique que physiologique (Moore, et al., 1998, Flouriot, et al., 2000, Deroo et Korach, 2006). Par ailleurs, l’existence de promoteurs multiples est aussi une caractéristique de ESR1. Ainsi, la synthèse des messagers chez l’Homme est complexe et spécifique du tissu (Kos, et al., 2001).

1.2.2.2 Structures protéiques

Le domaine AF-1 (région A et B) est impliqué dans les interactions protéine / protéine et dans la transactivation des gènes cibles (McInerney, et al., 1998, Onate, et al., 1998, Webb, et al., 1998). Ce domaine permet vraisemblablement une modulation de la transcription en interagissant directement avec la machinerie transcriptionnelle ou via un co-activateur comme SRC1 (Steroid Receptor Coactivator 1), SRC2, SRC3 aussi appelé AIB1/ACTR (Amplified In Breast cancer-1/ACTR), CBP/p300 (Cyclic AMP responsive element binding protein Binding Protein) ou ERAP140 (ER Associated Protein) (Shao, et al., 2002). De plus, il a été montré que deux parties distinctes de ce domaine AF-1 du REα étaient responsables respectivement de l’effet agoniste de E2 et de l’effet antagoniste du 4-hydroxytamoxifène

(OH-TAM) (McDonnell, et al., 1995). En ce qui concerne REβ, cette fonction secondaire de AF-1 est absente (McInerney et Katzenellenbogen, 1996, Nilsson, et al., 2001, Merot, et al., 2004).

Contrairement aux domaines A/B, le domaine C est très conservé. En effet, les domaines de liaison à l’ADN (DBD) des récepteurs REβ et REα, présentent 97% d’identité (Figure 2), en particulier au niveau de la boîte P, indispensable à l’interaction spécifique avec l’ADN. Ce qui permet aux deux récepteurs d’interagir avec l’ADN avec la même affinité (Klinge, 2001, Nilsson, et al., 2001).

Figure 2 : Représentation schématique des domaines fonctionnels de REα et REβ humains. Les

pourcentages d’identité entre les deux récepteurs sont précisés, ainsi que la fonction des différents domaines. Le domaine D possède une Séquence de Localisation Nucléaire (NLS), impliquée dans les mouvements cytoplasme-noyau, ainsi que des sites de modifications post-traductionnelles (acétylation et sumoylation) (McEwan, 2004, Sentis, et al., 2005). De plus, ce domaine charnière, qui change de conformation après fixation du ligand, est impliqué dans la fixation de corépresseurs (Chen et Evans, 1995, Horlein, et al., 1995).

Le domaine E représente la deuxième région la plus conservée (59% d’identité) entre les récepteurs REα et REβ (Figure 2) (Ruff, et al., 2000, Nilsson, et al., 2001). Cependant, la différence significative d’identité peut expliquer les différences d’affinités des deux types de récepteurs pour une même molécule (Escande, et al., 2006).

Par ailleurs, l’efficacité de l'activation de la transcription par les récepteurs aux estrogènes est influencée par les interactions entre les régions N et C terminales du récepteur (Kraus, et al., 1995). Lorsque le DBD est en interaction avec l’ADN, le domaine AF-1 (en absence de ligand) peut activer la transcription d’un gène cible de manière constitutive

(McInerney et Katzenellenbogen, 1996), mais l’activité transcriptionnelle maximale requiert une synergie avec le domaine AF-2 (Kumar et Thompson, 1999, Kumar et Thompson, 2003). Les domaines d’activation de la transcription (AF-1 et AF-2) ne présentent que très peu d’homologie entre les deux récepteurs (Figure 2). Ces données suggèrent que l’activation transcriptionnelle des gènes cibles pourrait être différente, en fonction de la nature du ligand et du récepteur.

De plus, un grand nombre de molécules de structures diverses sont capables d’interagir avec les RE. Une fois en interaction avec ceux-ci, elles vont influencer le positionnement de l’hélice 12 (domaine AF-2) et ainsi produire un effet qui dépendra de la nature du ligand fixé.

En effet, si le ligand lié aux récepteurs est un agoniste (E2), la position de l’hélice 12

permet le recrutement de co-activateurs. En revanche, la fixation d’un antagoniste (raloxifène) a pour conséquence un changement d’orientation de cette zone, créant ainsi une région incapable de lier un co-activateur et/ou capable de recruter un co-répresseur (Figure 3) (Brzozowski, et al., 1997, Shiau, et al., 1998, Pike, et al., 1999).

Figure 3 : Représentation schématique du domaine de liaison du ligand du REα. (A) L’hélice 12 (en

jaune) recouvre la poche de fixation du ligand après fixation d’estradiol-17β permettant ainsi le

recrutement de co-activateurs (flèche verte). (B) L’hélice 12 (en jaune) est positionnée différemment en présence d’un antagoniste (raloxifène) et empêche la fixation de co-activateurs.

Il est à noter que de récentes études ont prouvé l’existence d’une seconde poche de fixation du ligand. Cette région, dont la conformation n’est pas modulée par la fixation d’un ligand, n’a pas de fonction connue à l’heure actuelle (van Hoorn, 2002). Par ailleurs, la première poche de fixation du ligand étant plus hydrophobe que la seconde, les ligands ont tendance à privilégier l’interaction avec celle-ci (Ascenzi, et al., 2006).

Enfin, le domaine F du REα, quant à lui, jouerait un rôle dans la régulation de l’expression génique (Montano, et al., 1995). Récemment, Yang et collaborateurs ont montré que ce domaine limite la dimérisation des REα induite par E2, ainsi que le recrutement de

SRC1 (Yang, et al., 2008).

1.2.3 Actions génomiques des RE

Les mécanismes moléculaires du contrôle de l’expression génique par les estrogènes reposent sur le fait que les RE sont des facteurs de transcription activés par un ligand (O'Malley, 2005). Les effets biologiques des RE résultent de la modification d’expression d’un ensemble de gènes cibles. Cette régulation de la transcription génique est accomplie par le recrutement des RE au voisinage des gènes cibles, soit par une interaction directe des RE au niveau de séquences spécifiques de l’ADN, soit par une interaction indirecte des RE par l’intermédiaire d’autres facteurs de transcription.

1.2.3.1 Actions génomiques directes

Les actions génomiques directes résultent de la liaison directe des RE activés, sous forme de dimères, au niveau d’un ERE. Ce dimère agit le plus souvent comme un activateur transcriptionnel quelle que soit la distance qui la sépare du promoteur, son orientation et sa position par rapport au site d’initiation de la transcription (Klinge, 2001).

Suite à une stimulation estrogénique, chacun des différents gènes régulés ne répond pas de la même manière dans le temps. Ainsi, il est apparu qu’une hiérarchie des gènes

contrôlés par les estrogènes existait et une classification a été proposée (Rories et Spelsberg, 1989, Dean et Sanders, 1996) (Figure 4). Dans les minutes qui suivent la stimulation estrogénique, une première série de gènes est exprimée. Il s'agit des gènes précoces (primary response genes ou early regulatory genes) qui sont directement induits par les RE activés, via un ERE, et dont l'expression ne nécessite pas de synthèse protéique de novo (Figure 4). Les protéines codées par les gènes précocement régulés ont différentes fonctions. Certaines sont des facteurs de transcription (par exemple FOS, JUN, MYC), d’autres des cytokines (TGF-α), des facteurs neuroendocrines (prolactine, ocytocine), des enzymes (créatine kinase B, cathepsine D), et aussi des protéines anti-apoptotiques (BCL-2).

Figure 4 : Activation de la transcription des gènes précoces, précoces retardés, et tardifs par les estrogènes. ER : récepteur aux estrogènes ; ERE : élément de réponse aux estrogènes.

A cette phase précoce, succède une phase tardive dans les heures, voire les jours qui suivent la stimulation initiale par les estrogènes. Au cours de cette phase, deux catégories de gènes sont exprimées : les gènes tardifs (secondary response genes ou late structural genes) et les gènes précoces retardés (delayed primary response genes) (Figure 4). L'expression des gènes tardifs est contrôlée par les protéines codées par des gènes précocement régulés par les estrogènes et survient dans les heures qui suivent la stimulation estrogénique sauf en présence d'un inhibiteur de synthèse protéique. L’expression des gènes tardifs dépend uniquement de

l’activation de la transcription par ces facteurs de transcription (Figure 4). Les gènes tardifs sont pour la plupart des gènes de structure. Les gènes précoces retardés sont régulés à la fois par la liaison directe du récepteur aux estrogènes activé et par la liaison d'une protéine précocement induite sur sa séquence cible.

1.2.3.2 Actions génomiques indirectes

Certains gènes, n’ayant aucun motif ressemblant à un élément ERE, sont capables de répondre à une stimulation estrogénique via des RE activés.

Pour la plupart des gènes concernés par une interaction indirecte avec les RE, le médiateur prédominant à cette réponse estrogénique est le facteur de transcription SP1 (O'Lone, et al., 2004). La protéine SP1 se fixe sur l’ADN au niveau d’un site appelé Sp1 ou boite GC, qui correspond à une séquence consensus 5’-GGGCGG-3’ (Sugawara, et al., 2004). D'après les données de la littérature, deux types d'interaction sont possibles (Figure 5). La première est une interaction indirecte nécessitant à la fois, la liaison de l'homodimère (E2-REα-REα-E2) sur

un ERE, ou un demi-site ERE, et la liaison du facteur SP1 sur sa séquence cis-régulatrice (Figure 5A). La seconde est une interaction directe du récepteur REα ou REβ activé avec le facteur SP1 lié à la boîte GC (Figure 5B). Dong et collaborateurs (1999) ont recherché, par des expériences de transfection transitoire, la zone du promoteur de l'oncogène bcl-2 nécessaire à l’activation transcriptionnelle par les estrogènes. L’analyse des séquences cis-régulatrices a révélé que la réponse estrogénique nécessitait la présence d'une séquence de 25 pb contenant deux sites Sp1. Des interactions de complexes REα/SP1 avec ces deux séquences Sp1 ont, par ailleurs, été montrées par des expériences de retard sur gel (Dong, et al., 1999). La fixation du RE à SP1 augmente l’efficacité de fixation au niveau du site Sp1 et contribue au recrutement de co-activateurs, et ceci indépendamment du ligand et du type de RE (Porter, et al., 1997).

Figure 5 : Mode d'interaction du récepteur aux estrogènes (RE) avec le facteur de transcription SP1. (A)

Interaction indirecte du RE avec SP1. (B) Interaction directe du RE avec SP1. AF-1, AF-2, fonction d’activation 1 et 2 respectivement ; DBD, domaine de liaison à l’ADN ; ERE, élément de réponse aux estrogènes ; E2,

estradiol-17β ; Sp1, site de fixation du facteur de transcription SP1.

Les RE peuvent interagir également avec les facteurs de transcription FOS/JUN au

niveau d’un site AP-1 pour stimuler l’expression génique (Figure 6). Cette action nécessite la

liaison des protéines FOS et JUN au niveau du site AP-1 soit sous la forme d’homodimère JUN/JUN ou d’hétérodimère plus stable FOS/JUN (Figure 6) (Gaub, et al., 1990).

Figure 6 : Mécanisme d’action du RE au niveau d'un site AP1. Le RE, activé par l’hormone, vient interagir

avec les facteurs de transcription FOS et JUN fixés au niveau du site AP1.

AF-1, AF-2, fonction d’activation 1 et 2 respectivement ; DBD, domaine de liaison à l’ADN ; E2, estradiol-17β.

Le site AP-1 correspond à la séquence consensus 5'-TGAGTCA -3'. Les complexes FOS/JUN résultent de combinaisons entre les différents membres de la famille FOS (c-FOS, FRA-1, FRA-2 et FOSB) et ceux de la famille JUN (c-JUN, JUNB et JUND). L’activation transcriptionnelle par E2 nécessite une interaction entre le RE et les dimères FOS/JUN ou

JUN/JUN (Teyssier, et al., 2001). Le gène de l’IGF-I (insulin-like growth factor I) est régulé par cette voie (Umayahara, et al., 1997).

Quelques gènes sont régulés par les estrogènes via un Elément de Réponse à l'AMPc

(CRE) dont la séquence consensus est 5'- TGACGTCA -3'. Le CRE est la cible des facteurs

de transcription de la famille CREB/CREM/ATF. Sabbah et collaborateurs (1999) ont montré, par des expériences de transfection transitoire et de retard sur gel, que la stimulation estrogénique du gène de la cycline D1, dans des cellules HeLa, pouvait également s'expliquer par la liaison d’un complexe comprenant REα à un site CRE (Sabbah, et al., 1999). Dans ce mécanisme d'action des estrogènes, REα interagit avec le dimère JUN/ATF-2 pour activer la transcription via le CRE (Figure 7).

Figure 7 : Mécanisme d’action du RE au niveau d'un site CRE. Le RE, activé par l’hormone, vient interagir

avec les facteurs de transcription JUN et ATF2 fixés au niveau du site CRE.

AF-1, AF-2, fonction d’activation 1 et 2 respectivement ; DBD, domaine de liaison à l’ADN ; E2, estradiol-17β ;

CRE, élément de réponse à l'AMPc.

Dans les cellules HeLa, l’activation des facteurs de transcription JUN et ATF-2 est indépendante de la voie de la protéine kinase A (PKA) activée consécutivement à une augmentation du taux d’AMPc intracellulaire.

1.2.4 Autres voies d’action des RE

1.2.4.1 Voie d’action indépendante du ligand

L’activation du RE par la fixation de E2 entraîne une phosphorylation de certains

phosphorylée via la voie des MAPK ou de la PI3K sous le contrôle de facteurs de croissance

comme l’EGF, ou l’IGF-1 (Martin, et al., 2003). Suite à ces phosphorylations, l’affinité du

récepteur pour la séquence ERE est augmentée et la transcription de gènes cibles est activée indépendamment du ligand.

1.2.4.2 Voie d’action non génomique : les RE membranaires

Certains auteurs ont suggéré que les effets des estrogènes sont initiés par la liaison à une sous-population de récepteurs, localisés au niveau de la membrane plasmique (Razandi, et al., 1999). La protéine GRP30 est un récepteur couplé à une protéine G qui lie E2 avec une

grande affinité et dont l’expression a été montrée dans le cerveau (Filardo et Thomas, 2005). D’autres études montrent que le REα peut être S-palmitoylé au niveau de la cystéine 447 et ainsi interagir avec la membrane plasmique au niveau des cavéoles et lier la cavéoline-1 (Kim, et al., 1999, Acconcia, et al., 2004, Acconcia, et al., 2005). Les récepteurs seraient fonctionnels sous forme de dimères lorsqu’ils sont activés par les estrogènes (Razandi, et al., 2000). Les récepteurs membranaires des estrogènes sont associés à une variété de molécules signalantes comme la protéine G-Ras (Razandi, et al., 1999), la kinase Src (Migliaccio, et al., 1998), la sous unité régulatrice de la PI3-kinase (Simoncini, et al., 2000) et Shc (Song, et al., 2002). La cascade d’événements induite par le récepteur membranaire activé peut aboutir à la modulation de l’expression de certains gènes ou à la modulation de l’activité de certaines protéines. Cependant, le rôle exact que jouent les récepteurs membranaires dans l’action globale des estrogènes reste à déterminer.

1.3. Les ligands des récepteurs aux estrogènes

1.3.1 Les estrogènes physiologiques

Les estrogènes, comme tous les stéroïdes, sont des dérivés naturels des cyclopentanophénanthrènes synthétisés à partir du cholestérol (Figure 8). En effet, ce lipide, d’origine alimentaire, qui entre dans la composition des membranes plasmiques, sert également de précurseur à la vitamine D, aux sels biliaires et surtout aux hormones stéroïdiennes.

Il existe trois estrogènes physiologiques (Figure 8) : l’estrone (E1), l’estradiol-17-β (E2) et

l’estriol (E3).

L’estrone (E1) est produite par aromatisation de l'androsténedione, d'origine

gonadique et surrénalienne. Chez la femme, après la puberté, 50 % de l’estrone sont sécrétés par les ovaires et les glandes surrénales, alors que chez l'enfant prépubaire, l'homme et la femme ménopausée, la majeure partie de l'estrone provient de la conversion périphérique (foie, tissus adipeux et muscles) de l'androsténedione par l’aromatase (Nonnenmacher, 2003). L’estrone est biologiquement inactive. Cependant, une fois conjuguée à un groupement sulfate (via l’estrogène sulfotransférase), elle devient la forme circulante des estrogènes dans le sang (Pasqualini, 2004). De plus, E1 peut être convertie en forme active E2 sous l’action de

la 17-β-HydroxyStéroïde Déshydrogénase de type 1 (17-HSD type 1) (Gast, et al., 1989, Luu The, et al., 1989). Cette conversion est réversible sous l’effet de la 17-β-HydroxyStéroïde Déshydrogénase de type 2 (17-HSD type 2) (Wu, et al., 1993) (Figure 8). Ainsi, E1 permet de

transporter E2 et de moduler son taux au niveau des organes cibles.

L’estradiol-17β (E2) peut être synthétisé soit par réduction de E1 par la 17-HSD type 1

soit par aromatisation de la testostérone sous l’action d’une aromatase constituée d’un cytochrome P-450 et d’une cytochrome réductase à NADPH (Figure 8). Dans l’espèce

humaine, E2 est la molécule la plus abondante et la plus efficace des estrogènes

physiologiques.

Cette hormone module la croissance, la différenciation et la fonction de différents organes tels que la glande mammaire, l’utérus, le vagin, l’ovaire, mais aussi le testicule et la prostate. Par ailleurs, E2 régule l’homéostasie au niveau osseux en limitant l’activité des ostéoclastes tout

en stimulant les ostéoblastes chez l’homme et la femme. De plus, E2 agit sur le système

cardiovasculaire (vasodilatation, prévention de l’athérosclérose, effets cardioprotecteurs) (Ascenzi, et al., 2006), ainsi que sur le système nerveux central (neurogenèse et neuroprotection) (McEwen et Alves, 1999, McEwen, 2001, Amantea, et al., 2005).

Malheureusement, E2 est aussi intimement lié au développement et à la progression

des cancers du sein, de l’utérus et de la prostate (Bradlow et Sepkovic, 2004, Castagnetta, et al., 2004, Harkonen et Makela, 2004, Platet, et al., 2004).

Figure 8 : Voie de synthèse des estrogènes physiologiques. L’estradiol-17β (E2) est synthétisé à partir

d’estrone (E1) ou de testostérone, dérivant initialement de l’androsténedione, produite à partir du cholestérol.

L’estriol (E3) est synthétisé à partir de E2 et/ou de E1 (17-HSD type 1 et 2 : 17-β-hydroxystéroïde

déshydrogénase de type 1 et 2).

L’estriol (E3) est produit en très faible quantité chez la femme pré-ménopausée non

produit en quantité massive par l’unité foeto-placentaire. La prégnénolone placentaire est réduite en DeHydroepiAndrostérone Sulfate (DHAS) dans la surrénale fœtale. La DHAS retourne au placenta où elle est transformée en androstènedione puis en E3. Les concentrations

d’E3 augmentent fortement au cours de la grossesse et sont donc le reflet de la coopération

foeto-placentaire et de la vitalité fœtale (Nonnenmacher, 2003). Cependant, le rôle de E3 n’est

pas encore connu à l’heure actuelle.

1.3.2 Les xénoestrogènes

Il existe plusieurs types de molécules, stéroïdiennes ou non, capables de lier les RE. Certains composés vont produire les mêmes effets au niveau des différents organes cibles (agonistes ou antagonistes). D’autres vont présenter un effet qui sera fonction de la nature du tissu cible : on parle alors de Modulateurs Sélectifs des RE (SERM).

1.3.2.1 Les molécules d’origine naturelle

Il existe deux types de composés d’origine naturelle (végétale) capables de lier les RE et d’engendrer une activité estrogénique sur le système nerveux central, d’induire l’oestrus et de stimuler la prolifération des cellules du tractus génital chez la femelle (Knight et Eden, 1995). Ce sont les mycoestrogènes et les phytoestrogènes.

Les mycoestrogènes, sont des mycotoxines non stéroïdiennes dont la plus étudiée est la zéaralénone (ZEA) (Figure 9). Cette molécule est un métabolite secondaire produit par un grand nombre d’espèces de Fusarium fungi proliférant sur les céréales (Ryu, et al., 2002, Obremski, et al., 2003). Cette toxine est donc susceptible d’être retrouvée dans l’alimentation animale et humaine (Kim, et al., 1993, Yuwai, et al., 1994). Une contamination de la nourriture provoque chez l’animal : vulvovaginites, grossesses nerveuses, oestrus constant et stérilité (Etienne et Dourmad, 1994). Cette molécule est aussi connue pour induire une puberté précoce chez les jeunes filles (Pitt, 2000, Massart, et al., 2008). La ZEA est un

agoniste pur des estrogènes pour REα et est à la fois agoniste (seule) et antagoniste (en présence de E2) pour REβ (Kuiper, et al., 1998).

Les phytoestrogènes sont des composés phénoliques non stéroïdiens, produits par les plantes, qui présentent une similarité structurale et fonctionnelle avec E2. Il existe aussi des

composés non phénoliques (terpénoïdes et saponines) capables de mimer l’activité de E2

(Dijsselbloem, et al., 2004). A l’heure actuelle, on dénombre cinq familles de composés phénoliques produits par les plantes et considérés comme des phytoestrogènes : (1) les isoflavonoïdes présents dans les légumineuses, (2) les coumestanes présents dans les luzernes (alimentation animale), (3) les stilbènes présents dans le raisin et dans le vin, (4) les lignanes présents dans diverses céréales (graines de lin, son, seigle, sarrasin, millet, soja, avoine et orge) et (5) les flavonoïdes présents dans les agrumes (Cos, et al., 2003, Cornwell, et al., 2004, Dijsselbloem, et al., 2004) (Figure 9).

Figure 9 : Structures des principaux représentants des cinq familles de phytoestrogènes et d’un mycoestrogène. Formules développées de la génistéine, du coumestrol, du resvératrol, de l’entérolactone, de la

Par ailleurs, une étude a révélé que certains intermédiaires dans la synthèse des isoflavones, comme les déoxibenzoïnes, peuvent être considérés comme des phytoestrogènes (Fokialakis, et al., 2004). Dans ce rapport, nous décrirons succinctement les effets des représentants des 5 familles de phytoestrogènes : (1) la génistéine, (2) le coumestrol, (3) le resvératrol, (4) l’entérolactone et (5) la chrysine.

La génistine du soja, après hydrolyse par les β-glucuronidases bactériennes (de la flore intestinale) et tumorales produit la génistéine, phytoestrogène le plus étudié (Yuan, et al., 2003). La génistéine (Figure 9) interagit avec les deux formes de RE (Maggiolini, et al., 2001), mais présente une plus forte affinité pour REβ (Gutendorf et Westendorf, 2001). Des études sur des cellules MCF-7 dérivées de cancer du sein ont montré que cette molécule, à concentration élevée (50 et 100 µM) pouvait via REα inhiber l’expression de ce récepteur (aux niveaux transcriptionnel et post-transcriptionnel) et inhiber la croissance cellulaire en réduisant l’expression du facteur de réponse au sérum et en inactivant les tyrosines kinases (Chen, et al., 2003). D’autres études ont rapporté qu’une forte concentration de génistéine sur des MCF-7 induit un arrêt du cycle cellulaire en G2/M et déclenche l’apoptose après traitement de plus de 48 heures (Magee et Rowland, 2004). De plus, ce phytoestrogène potentialise l’effet antitumoral de la chimiothérapie par CHOP (Cyclophosphamide, Doxorubicine, Vincristine, Prednisone) dans le traitement de lymphomes non Hodgkiniens (Mohammad, et al., 2003).

Le coumestrol (Figure 9) est un puissant phytoestrogène présent dans le soja (Lookhart, 1979), la luzerne et les germes de trèfle (Franke, et al., 1995). Il est capable d’interagir avec les deux RE avec la même affinité que E2 (Kuiper, et al., 1998). Cette

molécule qui présente un effet estrogénique supérieur à celui produit par la génistéine (Markiewicz, et al., 1993) prévient la réduction de la densité osseuse chez le Rat (Draper, et al., 1997, Ye, et al., 2003). De plus, le coumestrol agit sur le métabolisme lipidique (réduction

de l’hypocholestérolémie). Cependant, cette molécule stimule aussi la prolifération des cellules MCF-7 et induit une hypertrophie utérine importante (Dodge, et al., 1996).

Le resvératrol (Figure 9) est à l’origine du concept de « French paradox » décrit dans les années 70. En effet les études épidémiologiques de l’époque révélaient une corrélation inverse entre la consommation de vin rouge en France et le nombre de maladies cardiovasculaires. A l’heure actuelle, plusieurs études ont permis de découvrir les effets bénéfiques du resvératrol sur la santé (Fremont, 2000). En effet, ce composé, qui joue un rôle important dans le métabolisme lipidique, interagit avec les lipoprotéines plasmatiques (Belguendouz, et al., 1998) et inhibe l’oxydation de LDL (low-density lipoprotein) in vitro (Frankel, et al., 1993, Kerry et Abbey, 1997). Par ailleurs, in vitro, le resvératrol réduit l’agrégation plaquettaire (Wang, et al., 2002) et la production de formes réactives de l’oxygène (ROS) par les polynucléaires (Rotondo, et al., 1998). In vivo, il favorise la vasorelaxation (Li, et al., 2000) et surtout présente des propriétés anti tumorales (Jang, et al., 1997, Gusman, et al., 2001).

L’entérolactone (Figure 9) est un lignane issu de la conversion du secoisolariciresinol diglycoside par les bactéries de la flore intestinale (Axelson, et al., 1982). C’est ce métabolite qui possède une activité biologique et non son précurseur. Les lignanes sont les phytoestrogènes les plus souvent retrouvés dans les régimes alimentaires des populations occidentales (Raffaelli, et al., 2002). L’entérolactone présente un intérêt thérapeutique dans le traitement de l’ostéoporose (Feng, et al., 2008) et semble posséder des propriétés anti-prolifératives et anti-angiogéniques in vitro et in vivo (Thompson, 1998, Power et Thompson, 2003, Bergman Jungestrom, et al., 2007). Cependant, les connaissances actuelles restent assez contradictoires sur l’implication d’une consommation d’entérolactone dans la protection contre le cancer du sein. D’après une récente étude clinique, les lignanes n’auraient aucun effet sur les risques de développement de cancer du sein (Verheus, et al., 2007). Selon

d’autres études, il semblerait qu’une consommation élevée de lignanes chez une femme pré-ménopausée pourrait être un facteur de risque de cancer du sein. Cependant, les mécanismes liant ces phytoestrogènes à la maladie ne sont pas encore élucidés (Thompson, 1998, Adlercreutz, 2002b, Boccardo, et al., 2006).

La chrysine (Figure 9) est un flavanoïde extrait de la passiflore (passiflora cœrulea) qui interagit in vitro avec le REα et provoque une transactivation d’un gène cible via ce récepteur (Liu, et al., 2006). Une concentration élevée de ce phytoestrogène (10 µM) stimule la prolifération de cellules MCF-7 mais n’a aucun effet sur la prolifération des fibroblastes. De plus, la chrysine inhibe l’activité de l’aromatase dans les fibroblastes (van Meeuwen, et al., 2007).

1.3.2.2 Les molécules d’origine synthétique

Il existe à l’heure actuelle différents types de molécules de synthèse capables

d’interagir avec les RE : les hormones de synthèse (diéthylstilbestrol, éthynilestradiol), les

antagonistes pures (ICI 182,780…) et les SERM ou antagonistes partiels (tamoxifène,

raloxifène, tibolone…), ainsi que les polluants industriels ou perturbateurs endocriniens

(parabènes, DDT, PCB…)

1.3.2.2.1 Molécules à usage thérapeutique

Le DiEthylStilbestrol (DES ; Figure 10) synthétisé par E.G. Dodds en 1938 (Dodds,

et al., 1938), a été utilisé entre 1940 et 1977 chez les femmes enceintes pour prévenir les

avortements spontanés et les hémorragies gravidiques (Palmlund, et al., 1993). Les enfants

ayant été exposés in utero au DES ont développé des pathologies et des malformations

lourdes. En effet, les filles ont développé des cancers du vagin et du col de l’utérus (Herbst, et

al., 1971) ainsi que des anomalies structurales, morphologiques et fonctionnelles du vagin,

garçons présentent des atteintes de l’appareil uro-génital (kystes épididymaires, anomalies

testiculaires…) (Bibbo, et al., 1977). Actuellement, le DES reste commercialisé en France

dans le cadre du traitement de certaines pathologies prostatiques (d’après les

recommandations de l’Agence Française Sanitaire des Produits de Santé, 2003).

L’ICI 182,780 (« fulvestrant ou Faslodex® » ; AstraZeneka ; Figure 10) est un stéroïde

de synthèse présentant une activité antagoniste pur du REα. Cette molécule limite l’interaction RE/ERE, réduit la dimérisation du récepteur, augmente sa dégradation et limite

son entrée dans le noyau (Arbuckle, et al., 1992, Dauvois, et al., 1993, Parker, 1993, Pink et

Jordan, 1996). De tels mécanismes ont pour conséquence de bloquer l’activité estrogénique en

annihilant l’activité transcriptionnelle du REα ainsi qu’en réduisant la quantité de ce récepteur. Cette molécule est utilisée dans le traitement d’un cancer du sein RE positif,

résistant à une thérapie antihormonale (ex : tamoxifène) préalable (McCormack et Sapunar,

2008).

Le tamoxifène (AstraZeneka ; Figure 10) est un dérivé triphényléthylénique

synthétique capable de lier le REα. Ce composé est métabolisé au niveau hépatique en OH-TAM par un cytochrome P450 (CYP2D6) (Desta, et al., 2004). Cette molécule inhibe la

fonction transactivatrice AF-2 et stimule la fonction AF-1. On peut donc qualifier cette

molécule de SERM puisqu’elle présente un effet agoniste (via sa fonction AF-1) et

antagoniste (via AF-2). L’effet estrogénique ou anti-estrogénique sera fonction de la

localisation tissulaire. En effet, le tamoxifène est un antagoniste de E2 au niveau du sein, il a

donc été utilisé dans le cadre du traitement du cancer du sein hormonodépendant (Morrow et

Jordan, 2000). Il présente, en revanche, chez la femme ménopausée un effet cardioprotecteur

en modulant le métabolisme lipidique (effet agoniste de E2) (Love, et al., 1994). Ce SERM

peut aussi agir sur la densité osseuse, en l’augmentant chez la femme ménopausée, ou en la

Enfin, ce composé présente un effet agoniste de E2 au niveau de l’utérus, ce qui lors d’un

traitement à long terme, peut induire le développement de cancer de l’endomètre (Saim, et al.,

2008).

Figure 10 : Classification des xénoestrogènes d'origine synthétique à usage thérapeutique. Formules

développées du diéthylstilbestrol, de l’ICI 182,780, du tamoxifène et du raloxifène.

Le raloxifène(Eli Lilly ;Figure 10) est un benzothiophène qui lie préférentiellement le

REα. Il présente un effet positif au niveau de la densité osseuse et surtout n’entraîne pas d’effet agoniste de E2 au niveau de l’endomètre (Cohen, et al., 2000). Cette molécule, très

efficace dans le cadre du traitement de l’ostéoporose chez les femmes ménopausées, apparaît être aussi un candidat très intéressant dans le cadre du traitement du cancer du sein (Martino, et al., 2004a, Martino, et al., 2004b). Par ailleurs, le raloxifène semble avoir un impact positif sur le système cardiovasculaire (Blumenthal, et al., 2004). Cependant, la persistance ou l’augmentation de bouffées de chaleur et l’augmentation du risque de thromboembolie lors d’un traitement peut être un facteur limitant l’utilisation prolongée du raloxifène (Cohen et Lu, 2000, Miller, et al., 2003). Il est à noter qu’un dérivé du raloxifène, l’arzoxifène (LY 353,381) présente 100 fois plus d’affinité pour le RE que le raloxifène et semble avoir des

effets estrogéniques plus puissant. Cette molécule pourrait être efficace dans le cadre du traitement du cancer du sein (Buzdar, et al., 2003, Fabian, et al., 2004).

La tibolone (Organon ; Figure 10) est un stéroïde de synthèse métabolisé au niveau hépatique en deux métabolites estrogéniques (3α et 3β-OH-tibolone) capables de lier les RE, et un de ces métabolites est capable d’interagir avec les récepteurs de la progestérone et des androgènes. Cette molécule est utilisée en Europe et au Canada afin de traiter les symptômes climatères (changements endocriniens, somatiques et psychologiques qui surviennent à la ménopause), les dysfonctionnements sexuels et l’ostéoporose. En effet, la tibolone réduit les bouffées de chaleur et l’insomnie, et améliore l’humeur (Genazzani, et al., 1987, Landgren, et al., 2002). Ce SERM qui augmente la densité osseuse chez les femmes ménopausées (Gallagher, et al., 2001, Jacobsen, et al., 2008) permet aussi d’améliorer la libido (Nathorst-Boos et Hammar, 1997, Doren, et al., 2001).

1.3.2.2.2 Les perturbateurs endocriniens

Les diverses molécules présentées ci-dessus sont destinées à un usage thérapeutique (contraception, traitement de la ménopause et des cancers). Toutefois, elles sont retrouvées dans l’environnement au niveau des eaux usées, des eaux de surface ou des nappes phréatiques (Yin, et al., 2002, Boyd, et al., 2003). Dans le cadre d’une exposition non thérapeutique ces molécules sont considérées comme des perturbateurs endocriniens potentiels susceptibles d’affecter les animaux (féminisation des poissons) (Jobling, et al., 1998) voire l’Homme (reproduction, système immunitaire) (Inadera, 2006).

De plus, de nombreuses molécules n’ayant aucun rôle thérapeutique sont classées comme des perturbateurs endocriniens. Le DichloroDiphénylTrichloroéthane (DDT ; Figure 11), utilisé comme pesticide dans les pays développés jusque dans les années 80, et en particulier son métabolite majoritaire, le 1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlorophényl)-ethylène, sont très souvent retrouvés chez les poissons présentant des anomalies du développement gonadique (Zhang et

Hu, 2008). Ces pesticides organochlorés engendrent des troubles de la fertilité chez la femme en altérant le développement et le fonctionnement ovarien et utérin (Tiemann, 2008). Par ailleurs, une exposition au DTT avant la puberté augmente les risques de développer un cancer du sein à l’âge adulte (Clapp, et al., 2008).

Figure 11 : Structures des perturbateurs endocriniens. Formules développées du DDT

(dichlorodiphényltrichloroéthane), des PCB (polychlorobiphényles), du Bisphénol A (BPA), des parabènes. Certains polluants industriels comme les PolyChloroBiphényles (PCB ; Figure 11) sont considérés comme des perturbateurs endocriniens ayant un impact sur le métabolisme des estrogènes. De plus, ces molécules réduisent l’expression de la catéchol-o-méthyltransférase via le REα dans des MCF-7, ce qui augmenterait les risques de cancérogenèse (Ho, et al., 2008).

L’Homme est, par ailleurs, exposé tout au long de sa vie à d’autres composés considérés comme des perturbateurs endocriniens (dérivés plastiques, conservateurs). En effet, le BisPhénol A (BPA ; Figure 11), initialement développé dans les années 30 comme estrogène de synthèse, n’a jamais été utilisé à ces fins (remplacé par le DES, plus prometteur à l’époque). Cependant, ce composé est actuellement largement utilisé dans la fabrication de récipients en polycarbonate (bouteille, biberon, conserve) ou de résines époxy (prothèses dentaires). Ce composé estrogénique module l’expression du REα chez le Rat en fonction du sexe (diminution chez le mâle et augmentation chez la femelle) et affecte le système