TP ANAGENE : correction.
Le but du Tp était d’utiliser les enzymes de restriction afin de déterminer l’origine du polymorphisme allèlique du gène codant pour la rhodopsine : pigment rétinien.
Le principe :
- Les enzymes de restriction sont des enzymes reconnaissant des séquences spécifiques d’ADN et réalisant des coupures au niveau de ces séquences.
- On fait agir plusieurs enzymes sur le gène de référence Rhodonorm, et 3 allèles de ce gène : rhoret 2, 3 et 5.
- Si on obtient un nombre de sites de coupure différents avec le même enzyme, sur ≠ allèles, cela signifiera que la séquence est différente et que des mutations ont fait apparaître (ou disparaître ) la séquence spécifique de restriction .
- On prendra soin de choisir de façon pertinente le ou les enzymes à faire agir.( Utilisation du
« tableau »)
- On pourra localiser la position des mutations.( utilisation du « graphique » = carte de srestriction) Manipulation :
- Penser à bien sélectionner « tableau » et « graphique », lors de la sélection des enzymes.
- Penser à choisir l’affichage des fenêtres en « mosaïque »
- Le tableau donne le nombre de site de restriction pour chaque enzyme et chaque allèle choix de l’enzyme à utiliser.
Exemple : différence de séquence entre les allèles Hba (normal) et Hbs (muté)
- Dans cet exemple, seule l’utilisation de Mnl I, apportera une solution à notre problème. Il existe 4 sites de restriction avec HbA, 3 avec HbS, ce qui signifie que leur séquence est différente et qu’une mutation a fait disparaître un site de coupure, c’est-à-dire a modifié la séquence des nucléotides au niveau d’un des sites de restriction de HbA.
- Le graphique représente la carte de restriction de l’allèle sélectionné par l’enzyme sélectionné.
: les sites de restriction sont affichés en rouge ainsi que les modes de coupure de l'enzyme. Le curseur vert permet de « zoomer » sur la partie de la séquence où se situe la coupure, afin d’identifier la position exacte et la séquence concernée (penser à choisir « I » information , qui vous donne le site de coupure le nombre et la taille des fragments, ainsi que leurs délimitations.
Exemple : Comparaison des cartes de restriction HBS et HBA par l'enzyme Mnl I( site à 4 bases)
- Les 3 sites de restriction apparaissent par les traits rouges.
- Le premier site est situé entre le 12° et le 13°
nucléotide.
- La séquence reconnue = GAGG (19° au 22°
nucléotide)
- La coupure est dissymétrique (voir infoslimite des fragments)
- Le premier site a disparu donc, une mutation a fait disparaître la séquence reconnue : en
position 20, une substitution a remplacé AT , la séquence GTGG n’est pas reconnue.
- On a bien mis en évidence une substtitution du 20° nucléotide.
Représentation : HbA
10 11 20 ? ? GAGG
CTCC HbS
20 GTGG CACC Substitution Dans notre exemple :
- Alu I permettra l’identification des mutations caractérisant l’allèle Rhoret 3 ( 2 sites/Rhodnorm, 3 pour Rhoret 3)
- Hpa II permettra l’identification des mutations caractérisant l’allèle Rhoret 2 ( 4 sites/Rhodnorm, 3 pour Rhoret 2).
- Mnl I permettra l’identification des mutations
caractérisant l’allèle Rhoret 5 ( 12 sites/Rhodnorm, 11 pour Rhoret 5).
- La différence du nombre de sites de restriction témoigne des différences de séquences, que l’on peut localiser et identifier.