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Conséquences de l'expression de la protéine GILZ sur la fonction des cellules dendritiques

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Academic year: 2021

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Conséquences de l’expression de la protéine GILZ sur la

fonction des cellules dendritiques

Joseph Calmette

To cite this version:

Joseph Calmette. Conséquences de l’expression de la protéine GILZ sur la fonction des cellules dendritiques. Immunité adaptative. Université Paris Saclay (COmUE), 2015. Français. �NNT : 2015SACLS272�. �tel-01424121�

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! ! ! ! ! ! ! UNIVERSITÉ*PARIS-SACLAY* ! ! ÉCOLE!DOCTORALE!425!:! ! INNOVATION*THÉRAPEUTIQUE*:*DU*FONDAMENTAL*A*L’APPLIQUÉ* PÔLE!:!IMMUNOLOGIE!ET!BIOTHÉRAPIES! ! DISCIPLINE!:!IMMUNOLOGIE! ! ! ! THÈSE*DE*DOCTORAT* soutenue!le!21!décembre!2015!à!l’Hôpital!Antoine!Béclère! ! par! !

Joseph*CALMETTE*

!! ! ! Directrice!de!thèse!:!!!!!!!!!!!!!!! CoPdirectrice!de!thèse!:!!!!!!!!! * Composition*du*Jury*:** ! Président*du*Jury*:** Rapporteurs*:************************** * Examinateurs*:* ! ! ! ! ! ! ! ! ! Dr!Géraldine!SCHLECHTPLOUF! Dr!Françoise!BACHELERIE! ! ! ! Pr!Eric!TARTOUR! Dr!MariaPCristina!CUTURI! Dr!Gilles!DADAGLIO!!! ! Pr!Eric!TARTOUR!!!! Dr!Laurent!MASCARELL!! ! ! ! ! ! ! ! MCU!Université!ParisPSaclay! DR1!INSERM!!! ! ! ! PUPPH!INSERM! DR2!INSERM! CR1!INSERM! ! PUPPH!INSERM! Responsable!immunologie!préP clinique!et!biologie!! moléculaire,!Stallergènes! ! ! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

Conséquences*de*l'expression*de*la*protéine*

Glucocorticoid-Induced*Leucine*Zipper**

sur*la*fonction*des*Cellules*Dendritiques**

NNT*:**2015*SACLS*272*

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! ! ! ! ! ! ! UNIVERSITÉ*PARIS-SACLAY* ! ! ÉCOLE!DOCTORALE!425!:! ! INNOVATION*THÉRAPEUTIQUE*:*DU*FONDAMENTAL*A*L’APPLIQUÉ* PÔLE!:!IMMUNOLOGIE!ET!BIOTHÉRAPIES! ! DISCIPLINE!:!IMMUNOLOGIE! ! ! ! THÈSE*DE*DOCTORAT* soutenue!le!21!décembre!2015!à!l’Hôpital!Antoine!Béclère! ! par! !

Joseph*CALMETTE*

!! ! ! Directrice!de!thèse!:!!!!!!!!!!!!!!! CoPdirectrice!de!thèse!:!!!!!!!!! * Composition*du*Jury*:** ! Président*du*Jury*:** Rapporteurs*:************************** * Examinateurs*:* ! ! ! ! ! ! ! ! ! Dr!Géraldine!SCHLECHTPLOUF! Dr!Françoise!BACHELERIE! ! ! ! Pr!Eric!TARTOUR! Dr!MariaPCristina!CUTURI! Dr!Gilles!DADAGLIO!!! ! Pr!Eric!TARTOUR!!!! Dr!Laurent!MASCARELL!! ! ! ! ! ! ! ! MCU!Université!ParisPSaclay! DR1!INSERM!!! ! ! ! PUPPH!INSERM! DR2!INSERM! CR1!INSERM! ! PUPPH!INSERM! Responsable!immunologie!préP clinique!et!biologie!! moléculaire,!Stallergènes! ! ! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

Conséquences*de*l'expression*de*la*protéine*

Glucocorticoid-Induced*Leucine*Zipper**

sur*la*fonction*des*Cellules*Dendritiques**

NNT*:**2015*SACLS*272*

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Remerciements*

! Je!souhaite!remercier!très!sincèrement!Madame!Maria2Cristina!Cuturi!et!Monsieur!Gilles! Dadaglio!pour!avoir!consacré!du!temps!à!l’évaluation!de!mon!travail.!Je!suis!également! très!reconnaissant!à!Messieurs!Laurent!Mascarell!et!Éric!Tartour!d’avoir!accepté!d’être! examinateurs!de!ma!thèse.!!! ! Je!remercie!le!Pr!Marc!Pallardy!et!le!Dr!Françoise!Bachelerie!de!m’avoir!accueilli!au!sein! de!leur!Unité.!Je!suis!aussi!très!reconnaissant!à!Françoise!de!sa!disponibilité!et!de!son! soutien!à!mon!égard.!! ! Je!tiens!à!exprimer!toute!ma!gratitude!au!Dr!Géraldine!Schlecht2Louf!qui!m’a!permit!de! découvrir! l’univers! passionnant! de! la! recherche! et! qui! m’a! encadré! avec! patience! et! bienveillance! durant! mon! Master! 2! et! mes! trois! années! de! thèse.! Je! lui! suis! très! reconnaissant!de!tout!ce!qu’elle!m’a!appris!et!de!sa!disponibilité.!!

!

Merci!à!Thi!Tran!pour!m’avoir!supervisé!durant!mes!toutes!premières!manips!quand!je! venais!à!peine!d’arriver!au!labo!et!dans!le!monde!de!la!recherche.!!

!

Je! remercie! aussi! mon! collègue! et! ami,! le! Dr! Mehdi! Ellouze,! qui! s’est! toujours! montré! disponible! et! qui! m’a! soutenu! bien! des! fois! durant! des! moments! difficiles.! Sa! vivacité! intellectuelle!et!sa!rigueur!scientifique!m’ont!énormément!apporté.!!! ! Je!tiens!aussi!à!exprimer!ma!reconnaissance!à!Matthieu!pour!m’avoir!aidé!durant!mes! manips!et!pour!l’investissement!énorme!qu’il!a!porté!à!mes!travaux,!notamment!durant! ma!rédaction!de!thèse.!Son!travail!a!été!primordial!pour!la!finalisation!de!mon!projet.!! ! Un!grand!merci!à!Odile!pour!sa!disponibilité,!sa!gentillesse!et!son!investissement!dans!la! vie!du!laboratoire.!Sans!elle,!les!commandes,!congrès!et!réservation!de!thèses!n’auraient! pas!été!possibles.! ! Merci!à!Bruno,!pour!l’aide!apportée!au!labo!mais!aussi!pour!son!amitié!et!les!moments! plus!détendu!que!nous!avons!passé!ensemble.!! !

Je! remercie! aussi! Marie2Laure,! Hélène! et! Hugo! pour! leurs! conseils! et! leur! aide! sur! la! plateforme!de!cytométrie.!Un!grand!merci!à!Marie2Laure! pour! sa! bienveillance!envers! moi!et!pour!m’avoir!ramené!chez!moi!à!des!heures!très!tardives!après!de!longues!heures! passées! ensemble! devant! le! cytométre.! Merci! à! elle! aussi! pour! son! aide! pour! les! traductions! en! anglais! de! CV! et! autres! lettres! de! motivation.! Je! remercie! bien! évidemment! Mylène! Levant! et! Baptiste! Lecompte! pour! la! gestion! de! la! plateforme! animalerie!et!Françoise!et!Patrice!pour!celle!d’immunohisto/cytochimie.! ! Merci!à!Viviana!pour!l’organisation!des!jeudis!libres.! ! Je!tiens!aussi!à!exprimer!toute!mon!amitié!à!Agnieszka!et!Pasquale,!mes!deux!collègues! de!bureau,!qui!m’ont!toujours!apporté!soutien!et!conseil!durant!ces!années.!Je!remercie! chaleureusement!Agnieszka!pour!l’attention!qu’elle!m’a!toujours!porté.!! !

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Toute! mon! amitié! va! aussi! à! Gladys,! ma! camarade! de! Master! 2! et! de! thèse.! Un! grand! merci!à!elle!pour!son!amitié!indéfectible,!son!aide!et!sa!gentillesse.!!

J’exprime! aussi! toute! ma! sympathie! à! Aude,! Nagham,! Floriane,! Laurence,! Jessica! et! Christelle.!!

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Toute! mon! affection! et! ma! gratitude! vont! aussi! à! Laurélie! qui! m’a! toujours! apporté! soutien!et!aide!durant!cette!dernière!année!de!thèse.! ! Je!n’oublie!pas!non!plus!mes!anciens!collègues!mais!toujours!amis,!Olivier,!Frédéric!et! Mathieu,!avec!qui!j’ai!passé!de!très!bons!moments,!notamment!durant!les!petites!balades! estivales!dans!les!parcs!environnants!(hors!heures!de!travail!évidemment).! ! Un!grand!merci!à!Mélanie!pour!sa!joie!et!son!optimisme!sans!faille.!Ces!deux!qualités!ont! notamment! été! bien! utiles! durant! les! manips! interminables! de! transwell.! A! propos,! merci!à!Odile!pour!nous!avoir!remboursé!le!taxi.!Merci!aussi!à!Nicolas!pour!m’avoir!aidé! à!continuer!ces!manips!dans!une!ambiance!à!l’humour!bien!trempé.!!!! ! Merci!à!tous!les!autres!membres!du!labo!que!j’ai!rencontré!:!Karl,!Marion,!Mebarek!et! tout!ceux!que!j’aurais!oublié.! ! Pour!finir,!je!remercie!bien!évidemment!mes!parents!pour!m’avoir!soutenu!durant!ces! trois!années!de!thèse.!! ! ! ! ! !

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ABREVIATIONS+

! A! AA!:!Acides!aminés! ADN!:!Acide!DésoxyriboNucléique! Ag!:!Antigène! ARN!:!Acide!RiboNucléique! ATP!:!Adénosine!TriphosPhate! ! B! BMADC!:!Bone%Marrow*derived%Dendritic%Cell% ! C! CCL!:!Chemokine!(CAC!motif)!Ligand! CCR!:!Chemokine!(CAC!motif)!Receptor! CD!:!Cluster!de!différenciation! cDC!:!Cellules!Dendritiques!conventionnelles!! CIA!:!CollagenAInduced!Arthritis!! CLR!:!Récepteur!à!Lectine!de!type!C! CMH!:!Complexe!Majeur!d’Histocompatibilité!! CMV!:!Cytomégalovirus!! CPA!:!Cellules!Présentatrices!d’Antigène!

CRD!:! Domaines! de! Reconnaissance! des! Carbohydrates! CTL!:!Cellules!T!lytiques! CTLAA4!:!Cytotoxic%T*lymphocyte*Associated% protein%4% CXCR!:!Chemokine%(C*X*C%motif)%Receptor! CXCL!:!Chemokine%(C*X*C%motif)%Ligand! ! D! DAI!:! DNA*dependent%Activator%of%IFN*regulatory% factors! DAMPs!:!Danger%Associated%Molecular%Patterns! DC!:!Cellules!Dendritiques! DCASIGN!:!DC*Specific%ICAM%Grabbing%% Non*integrin% DNB! dsARN!:!ARN!double!brins! ! ! E! EAE!:!Experimental!Autoimmune! Encephalomyelitis! ESAM!:!Endothelial%Cell%Adhesion%Molecule! ! F! FACS!:!Fluorescence*Activated%Cell%Sorting! Fc!:!Fragment!Cristallisable!! FcR!:!Récepteur!au!Fc! Flt3!:!Fms*Like%Tyrosine%3% Flt3AL!:!Fms*Like%Tyrosine%3%Ligand! ! G! GILZ!:!Glucocorticoid*Induced%Leucine%Zipper! GITR!:! Glucocorticoid*induced% TNFR*Related% protein! ! ! ! GL!:!Ganglion!Lymphatique! GMACSF!:!Granulocyte%Macrophage*Colony%%%%%%% Stimulating%Factor!! ! H!!!!!! HCV!:!Virus!de!l’hépatite!C! HGF!:!Hepatocyte%Growth%Factor!! HIV!:!Human%Immunodeficiency%Virus! HMGB!:!High%Mobility%Group%Box%protein! HOA1!:!Heme%Oxygenase*1!! Hsp!:!Heat%shock%protein! HspR!:!Récepteur!aux!Hsp! ! I!! IBD!:!Inflammatory!Bowel!Disease! IC!:!Complexe!Immun! ICOS!:!Inducible%T*cell%costimulator! IDO!:!Indoleamine%2,3%Deoxygenase! IFN!:!Interferon! Ig!:!Immunoglobuline! IL!:!Interleukine! IRF!:!Interferon%Regulatory%Factor! ITAM!:!Immunoreceptor%Tyrosine*based%%%%%%%% Activation%Motif!!!!! ITIM!:%Immunoreceptor%Tyrosine*based%%%%%%%% Inhibition%Motif! ! L!! LAMP!:!Lysosome*Associated%Membrane%Protein! LAGA3!:!Lymphocyte*Activation%Gene%3! LB!:!Lymphocyte!B! LC!:!Cellules!de!Langerhans! LCMV!:!Lymphocytic%ChorioMeningitis%Virus! LDL!:!Low*Density%Lipid! LPS!:!Lipopolysaccharide! LRR!:!Leucine%Rich*Repeats! LT!:!Lymphocyte!T! LY!:!Lucifer%Yellow! ! M!!! Mφ!:!Macrophage! MoADC!:!MonocyteAderived!Dendritic!Cells! ! N! NFAkB!:!Nuclear!FactorAkappaB! NK!:!Natural%Killer% NLR!:!NOD*Like%Receptor! NrpA1!:!Neuropilin*1! ! O! OVA!:!Ovalbumine! OL!:!Organes!Lymphoïdes! ONL!:!Organes!Non!Lymphoïdes! ! !

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! ! ! ! ! ! ! ! 2! P! PAMPs!:!Pathogen*Associated%Molecular%Patterns% PCCD!:! Progéniteur! Commun! des! Cellules! Dendritiques!

pDC!:!Cellule!Dendritique!plasmacytoïde! PGE2!:!Prostaglandine!E2!

PKC!:!Protéine!Kinase!C!

PMC!:!Progéniteur!Myéloïde!Commun!

PMCD!:! Progéniteur! des! Macrophages! et! des! Cellules!Dendritiques!

PPARγ!:! Peroxisome! ProliferatorAActivated! Receptor!γ!!

PRR!:!Pattern*Recognition%Receptor! !

R!

RA!:!Acide!Rétinoïque!

RAGE!:! Receptor% for% Advanced% Glycosylation% End%

Products! RALDH!:!RetinAldehyde%DeHydrogenase! ROS!:!espèce!réactive!de!l’oxygène!! RIGAI!:!Retinoic%Acid*Inducible%Gene%I! ! S!

Siglec!:! Sialic% acid*binding% mmunoglobulin*type%

lectins% ! T! Tconv! TLR!:!Toll*Like%Receptor! TGF!:!Tumor%Growth%Factor! TNF!:!Tumor%Necrosis%Factor% Treg! TSC!:%Tuberus%Sclerosis%Complex! ! V! VEGF!:!Vascular%Endothelial%Growth%Factor%

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! ! ! ! ! ! ! ! 3!

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Table+des+matières++

! INTRODUCTION+...+11! Partie+I+:+Les+cellules+dendritiques+:+plusieurs+sousEpopulations+de+cellules+spécialisées+ exerçant+des+fonctions+communes+...+15! IA!Ontogénie!et!diversité!des!DC!...!15! 1.!Les!DC!conventionnelles!...!16! 1.1!Les!DC!des!organes!non!lymphoïdes!...!16! 1.1.1!La!sousApopulation!de!cDC!CD103+CD11bA!...!18! 1.1.2!La!sousApopulation!de!cDC!CD11b+!:!...!19! 1.1.3!Les!cellules!de!Langerhans!:!...!20! 1!.2!Les!cDC!des!organes!lymphoïdes!...!20! 1.2.1!La!sousApopulation!CD8α+!...!20! 1.2.2!La!sousApopulation!CD11b+!...!21! 2.!Les!DC!plasmacytoïdes!...!22! 3.!Les!DC!inflammatoires!...!23! 3.1!Description!des!DC!inflammatoires!...!24! 3.2!Origines!des!DC!inflammatoires!...!24! 4.!Les!DC!de!culture!...!24! IIA!Capture!antigénique!par!les!DC!...!26! 1.!La!macropinocytose!...!28! 1.1!Présentation!générale!de!la!macropinocytose!...!28! 1.2!Mécanismes!moléculaires!impliqués!dans!la!macropinocytose!...!29! 1.2.1!Les!petites!GTPases!...!29! 1.2.2!Les!phosphoinositides!...!31! 1.3!Modulation!et!régulation!de!la!macropinocytose!chez!les!DC!...!32! 1.3.1!Régulation!en!fonction!de!l’état!d’activation!...!32! 1.3.1!Régulation!en!fonction!de!la!sousApopulation!de!DC!...!35! 1.4!Méthodes!d’étude!de!!la!macropinocytose!...!35! 2.!La!capture!antigénique!dépendante!de!récepteurs!...!37! 2.1!Les!récepteurs!à!lectines!de!type!C!ou!CLR!...!37! 2.1.1!Les!DectinA1!et!2!...!39! 2.1.2!Le!récepteur!du!mannose!ou!CD206!...!40! 2.1.3!CD205!...!40! 2.1.4!DCASIGN!...!41! 2.1.5!La!langerine!ou!CD207!...!42! 2.2!Les!Siglec!...!42! 2.3!Les!récepteurs!de!mort!cellulaires!...!42! 2.3.1!HMGB1/RAGE!...!43! 2.3.2!Hsp70!et!Hsp90/HspR!...!43!

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! ! ! ! ! ! ! ! 4! 2.3.3!Clec9a/DNGRA1!...!43! 2.4!Les!récepteurs!scavenger!...!44! 2.5!Les!FcR!...!44! IIIAActivation!des!DC!...!45! 1.!Les!mécanismes!d’activation!des!DC!...!45! 1.1!Les!TLR!...!46! 1.1.1!Diversité!des!TLR!...!47! 1.1.2!Signalisation!des!TLR!...!47! 1.2!Récepteurs!cytoplasmiques!...!49! 1.2.1!Les!NODAlike!récepteurs!ou!NLR!...!49! 1.2.2!Les!RIGAIAlike!récepteurs!(RLR)!et!les!senseurs!d’ADN!cytosolique!...!50! 1.2.2.1!Les!RLR!:!RIGAI!et!MDAA5!...!51! 1.2.2.2!Les!senseurs!d’ADN!cytosoliques!...!51! 2.!Conséquences!fonctionnelles!de!l’activation!des!DC!...!52! Partie+II:+Activation+des+lymphocytes+T+par+les+cellules+dendritiques+:+le+rôle+primordial+ des+cellules+dendritiques+dans+l’induction+des+lymphocytes+T+régulateurs.+...+55! IAPrésentation!générale!de!l’activation!des!lymphocytes!T!par!les!DC!...!55! IIALa!Polarisation!des!réponses!lymphocytaires!T!est!dictée!par!les!cellules!dendritiques!..!58! 1.!Les!lymphocytes!Th1!et!les!LT!CD8+!cytotoxiques!...!59! 1.1!Les!LT!Th1!...!60! 1.2!Les!LT!CD8+!cytotoxiques!ou!CTL!...!60! 2.!Les!lymphocytes!Th2!...!61! 3.!Les!lymphocytes!Th17!...!62! 4.!Les!lymphocytes!T!CD4+!folliculaires!...!62! 5.!Les!lymphocytes!T!régulateurs!ou!Treg!...!63! III!Les!lymphocytes!T!régulateurs!...!63! 1.!Développement!des!nTreg!et!des!iTreg!...!64! 1.1!Développement!des!nTreg!...!64! 1.2!Induction!des!iTreg!...!65! 2!Phénotype!et!marqueurs!d’identification!des!Treg!...!67! 2.1!Les!marqueurs!partagés!des!nTreg!et!iTreg!...!67! 2.2!Les!marqueurs!et!caractéristiques!spécifiques!des!nTreg!et!iTreg!...!68! 3.!Mécanismes!immunosuppresseurs!des!Treg!...!68! 3.1!Sécrétion!de!cytokines!inhibitrices!...!69! 3.2!Suppression!par!cytolyse!...!70! 3.3!Suppression!par!disruption!métabolique!...!70! 3.4!Ciblage!et!suppression!des!DC!...!71! 4.!Homéostasie!des!Treg!...!73! 4.1!Expansion!et!maintien!de!Treg!chez!l’individu!jeune!...!73! 4.2!Les!Treg!au!cours!du!vieillissement!...!73! IVALes!DC!tolérogènes!:!différenciation,!phénotype!et!fonction!...!74! 1.!Caractéristiques!des!tDC!...!75! 1.1!!Phénotype!membranaire!des!tDC!...!75! 1.2!Facteurs!sécrétés!par!les!tDC!...!75! 1.2.1!L’ILA10!...!75! 1.2.2!Le!TGFAβ!...!76! 1.3!Expression!d’enzymes!régulatrices!par!les!tDC!...!76! 1.3.1!L’Indoleamine!2,3Adioxygenase!ou!IDO!...!76! 1.3.2!La!retinaldehyde!deshydrogenase!ou!RALDH!...!76! 1.3.3!L’hème!oxygenaseA1!ou!HOA1!...!77! 1.3.4!L’inducible!nitric!oxide!synthase!ou!iNOS!...!77! 1.3.5!L’ILA4I1!...!77!

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! ! ! ! ! ! ! ! 5! 2.!Différenciation!des!tDC!...!78! 2.1!Les!tDC!in%vivo,!dans!des!conditions!physiologiques!...!78! 2.1.1!Les!tDC!dans!la!tolérance!orale!et!intestinale!...!79! 2.1.2!Les!tDC!induites!par!les!cellules!du!foie!...!80! 2.1.3!Les!tDC!dans!la!peau!...!80! 2.1.4!Les!tDC!induites!par!les!Treg!...!80! 2.2!!Les!tDC!dans!des!conditions!pathologiques!...!81! 2.2.1!Les!tDC!induites!par!des!pathogènes!...!81! 2.2.2!Les!tDC!induites!par!les!tumeurs!...!82! 2.3!Les!tDC!induites!expérimentalement!...!83! 2.3.1!Induction!de!tDC!par!des!cytokines!...!84! 2.3.2!Induction!de!tDC!par!des!vitamines!...!84! 2.3.3!Induction!de!tDC!par!des!facteurs!de!croissance!...!85! 2.3.4!Les!tDC!générées!par!traitement!pharmacologique!...!85! Partie+III+:+La+protéine+GILZ+et+ses+implications+dans+le+contrôle+de+la+réponse+ immunitaire+...+87! IAStructure!moléculaire!de!GILZ!...!87! IIADistribution!et!régulation!de!l’expression!de!GILZ!...!89! 1.!Régulation!de!l’expression!de!GILZ!par!les!corticostéroïdes!et!minéralocorticoïdes!...!89! 2.!Régulation!de!l’expression!de!GILZ!par!les!cytokines!...!90! 3.!Régulation!de!l’expression!de!GILZ!dans!un!environnement!physiopathologique!...!91! 3.1!Augmentation!de!l’expression!de!GILZ!...!91! 3.2!Diminution!de!l’expression!de!GILZ!...!91! IIIADécouverte!des!interactions!moléculaires!de!GILZ!...!92! 1.!Régulation!de!la!voie!NFAkB!...!93! 2.!Régulation!de!la!voie!APA1!...!94! 3.!Régulation!de!la!voie!des!MAP!kinases!...!96! 4.!Régulation!de!la!voie!PI3K/Akt!et!les!voies!de!signalisation!de!l’apoptose!...!96! 5.!Régulation!de!la!voie!mTORC2/Akt!...!97! 6.!GILZ,!un!répresseur!de!la!transcription!...!97! IVAInteractions!et!effet!de!l’expression!de!GILZ!dans!les!réponses!innées!...!98! 1.!Effet!de!l’expression!de!GILZ!sur!le!macrophage!...!98! 2.!Effet!de!l’expression!de!GILZ!sur!les!DC!...!99! 2.1!Sur!des!DC!in%vitro!...!99! 2.2!Sur!des!DC!circulantes!...!100! 2.3!Dans!des!modèles!pathologiques!expérimentaux!...!101! VAInteractions!et!effet!de!l’expression!de!GILZ!dans!les!cellules!de!l’immunité!adaptative !...!101! 1.!Effet!de!l’expression!de!GILZ!sur!les!lymphocytes!T!...!101! 2.!Effet!de!l’expression!de!GILZ!sur!les!lymphocytes!B!...!102! VIAEffet!de!GILZ!sur!les!cellules!nonAhématopoïétiques!...!103! 1.!Effet!de!GILZ!sur!la!spermatogenèse!...!103! 2.!Effet!de!GILZ!sur!les!cardiomyocytes!...!104! 3.!Effet!de!GILZ!sur!les!cellules!endothéliales!...!104! 4.!Effet!de!GILZ!sur!la!capacité!immunosuppressive!des!cellules!souches!mésenchymateuses! (MSC)!...!105! 5.!Effet!de!GILZ!sur!la!différenciation!des!ostéoclastes.!...!105! OBJECTIFS+...+108! RESULTATS+...+111!

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! ! ! ! ! ! ! ! 6! IE+L’expression+de+la+protéine+GlucocorticoidEInduced+Leucine+Zipper+dans+les+cellules+ dendritiques+promeut+l’expansion+des+lymphocytes+T+régulateurs+in+vivo.+...+113! IIE+La+protéine+GlucocorticoidEInduced+Leucine+Zipper+contrôle+la+capacité+de+capture+ antigénique+des+cellules+dendritiques.+...+117! DISCUSSION+...+153! REFERENCES+...+167! BIBLIOGRAPHIQUES+...+167! ANNEXE+...+185! !

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! ! ! ! ! ! ! ! 7!

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+

Table+des+illustrations+

Figure+1+:+Présentation+des+antigènes+par+les+DC+aux+LT+...+13! Figure+2+:+Schéma+récapitulatif+de+la+diversité+des+DC,+de+leur+phénotype+et+de+leur+ontogénie+chez+ la+souris.+...+18! Figure+3+:+Les+différentes+voies+de+capture+de+l’antigène+par+les+DC+...+27! Figure+4+:+Modèle+présentant+l’action+squentielle+des+petites+GTPases+et+des+phosphoinositides+ dans+le+processus+de+macropinocytose.+...+31! Figure+5+:+Les+récepteurs+de+types+C+lectine.+...+38! Figure+6+:+Présentation+des+PRR+et+de+leur+localisation.+...+45! Figure+7+:+Les+différents+PRR+et+leurs+pathogènes+et+PAMPs+associées.+...+46! Figure+8+:+Diversité+des+TLR+et+adaptateurs+de+signalisation+associées.+...+48! Figure+9+:+Conséquences+fonctionnelles+de+l’activation+des+DC+par+les+TLR.+...+34! Figure+10+:+Présentation+des+molécules+de+coEstimulation+et+de+coEinhibition+engagées+dans+les+ interactions+DC/T.+...+57! Figure+11+:+Profil+de+différenciation+des+LT+CD4+.+...+59! Figure+12+:+Mécanismes+de+présentation+croisée+par+les+DC.+...+61! Figure+13+:+Schéma+représentatif+de+la+génération+des+nTreg+et+des+iTreg.+...+66! Figure+14+:+Mécanismes+de+suppression+des+Treg+sur+les+LT+effecteurs.+...+71! Figure+15+:+Mécanismes+de+suppression+des+DC+par+les+Treg.+...+72! Figure+16+:+Schéma+récapitulant+les+principaux+mécanismes+d’actions+des+tDC+sur+les+réponses+ lymphocytaires+T+effectrices.+...+78! Figure+17+:+Les+TIDC+ont+un+rôle+central+dans+la+régulation+des+réponses+immunitaires+antiE tumorales.+...+83! Figure+18+:+Structure+génomique+du+gène+Tsc22d3.+...+88! Figure+19+:+Structure+de+GILZ+et+ses+interactions.+...+93! Figure+20+:+Interaction+de+GILZ+avec+différentes+voies+de+signalisation+intracellulaires.+...+95! Figure+21+:+Modèle+de+transfert+adoptif+utilisé+pour+étudier+la+capacité+de+stimulation+des+T+par+les+ DC+GILZhi.+...+115! Figure+22+:+Rôle+de+GILZ+dans+les+DC+...+165!

+

! ! !

(14)

! ! ! ! ! ! ! ! 8!

+

+

+

+

+

+

+

+

+

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+

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+

+

(15)

! ! ! ! ! ! ! ! 9!

Préambule+

! L’établissement!de!la!tolérance!immunitaire!est!primordial!au!maintien!et!à!l’intégrité! de! l’organisme.! Sans! elle,! les! signaux! de! dangers! reçus! par! les! cellules! du! système! immunitaire! et! les! réponses! associées! causeraient! d’importants! dégâts! et! dommages! tissulaires.! Son! émergence! est! notamment! nécessaire! au! contrôle! de! la! réponse! immunitaire!dans!un!contexte!pathologique.!L’un!des!acteurs!principaux!de!la!tolérance! immunitaire!est!une!cellule!lymphocytaire!CD4+!appelée!lymphocyte!T!régulateur!(Treg).!

Cette!cellule!possède!un!arsenal!varié!pour!contrôler!la!réponse!immunitaire!et!limiter! les! dégâts! tissulaires! en! agissant! notamment,! de! manière! directe! ou! indirecte,! sur! les! lymphocytes!T!effecteurs!et!les!cellules!dendritiques!(DC)!mais!aussi!en!contribuant!à!la! réparation!tissulaire.!!

Les!DC!sont!des!cellules!complexes!de!part!leur!position!à!l’interface!de!l’immunité!innée! et!adaptative!et!de!leur!rôle!primordial!dans!l’activation!des!lymphocytes!T,!effecteurs! ou! régulateurs.! L’issue! de! cette! activation! est! conditionnée! par! la! nature! et! l’état! de! différenciation! fonctionnel! de! la! DC.! De! ce! fait,! comprendre! la! régulation! des! fonctionnalités!des!DC,!tels!que!leur!capacité!de!capture!!et!de!présentation!antigénique! et!leur!réponse!à!divers!stimuli!est!d’une!importance!primordiale.!

!

Les!DC!ayant!la!faculté!de!promouvoir!la!réponse!Treg!sont!dites!DC!tolérogènes.!Elles! peuvent! présenter! ! des! phénotypes! variés! et! induire! /! activer! les! Treg! via! différents! mécanismes..! Les! DC! deviennent! tolérogènes! sous! l’effet! de! facteurs! endogènes! ou! exogènes.! Plusieurs,! que! nous! présenterons! dans! l’introduction,! sont! déjà! bien! caractérisés,!et!leurs!mécanismes!d’action!bien!connus.!Toutefois,!certains!des!facteurs! promouvant!la!tolérance!en!agissant!sur!les!DC!et!leurs!mécanismes!d’action!restent!peu! connus.!Durant!ma!thèse,!mes!travaux!ont!consisté!à!faire!la!lumière!sur!une!partie!de! ces! mécanismes! en! m’intéressant! à! une! protéine! immunosuppressive! et! à! son! expression!dans!les!DC,!la!protéine!GlucocorticoidAInduced!Leucine!Zipper!(GILZ).!Dans! ce!contexte,!je!me!suis!intéressé!à!la!capacité!d’induction!de!la!prolifération!et/ou!de!la!

(16)

! ! ! ! ! ! ! ! 10! différenciation!de!Treg!par!les!DC.!J’ai!ensuite!étudié,!le!rôle!physiologique!de!ce!facteur! sur!la!fonctionnalité!des!DC,!notamment!sur!leur!capacité!de!capture!et!de!présentation! antigénique,!et!sur!l’activation!des!voies!de!signalisation!par!les!récepteurs!de!dangers! des!DC.!! !

Afin! de! contextualiser! les! travaux! et! les! résultats! présentés,! je! commencerais! par! présenter! les! cellules! du! système! immunitaire! dans! lesquelles! nous! avons! étudié! l’expression!de!cette!protéine,!les!DC.!Je!parlerai!ensuite!!des!mécanismes!connus!pour! être!impliqués!dans!l’acquisition!par!les!DC!!de!la!capacité!d’induire!des!Treg.!Je!finirai! par! présenter! la! protéine! qui! nous! intéresse,! GILZ,! et! les! données! déjà! existantes! sur! cette! protéine! dans! les! divers! types! cellulaires! du! système! immunitaire.! Mes! travaux! s’appuieront! sur! l’étude! de! deux! modèles! murins! transgéniques! originaux,! le! modèle! surexprimant! la! protéine! GILZ! spécifiquement! dans! les! DC! et! le! modèle! pour! lequel! l’expression!de!GILZ!est!abolie!spécifiquement!dans!les!DC.! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !

(17)

! ! ! ! ! ! ! ! 11!

INTRODUCTION+

! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !

(18)

! ! ! ! ! ! ! ! 12! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !

(19)

! ! ! ! ! ! ! ! 13! Pour! faire! face! aux! agressions,! notre! système! immunitaire! dispose! de! deux! lignes! de! défenses!:! l’immunité! innée,! immédiate! et! stéréotypée,! essentiellement! dépourvue! de! mémoire,! et! l’immunité! adaptative,! retardée! mais! extrêmement! spécifique! et! dotée! de! mémoire.! Originaires! de! la! lignée! myéloïde,! les! cellules! dendritiques! (DC)! sont! des! cellules!présentatrices!de!l’antigène!(CPA)!de!l’immunité!innée.!En!réponse!aux!stimuli! qu’elles! rencontrent! dans! divers! contextes! d’inflammation! ou! de! danger,! les! DC! s’activent!et!deviennent!capables!d’activer!les!lymphocytes!T!(LT)!!naïfs!en!LT!effecteurs! et!d’orienter!leur!différenciation!de!sorte!à!favoriser!une!réponse!appropriée!au!danger! détecté.!Ainsi,!les!DC!sont!les!CPA!les!plus!efficaces!pour!activer!les!lymphocytes!T!!naïfs! in%vivo!et!assurent!le!lien!entre!les!immunités!innée!et!adaptative![1].!! ! !!!!! Figure+1+:+Présentation+des+antigènes+par+les+DC+aux+LT+ Les!antigènes!sont!capturés!par!les!DC!et!apprêtés!pour!être!présentés!aux!LT!sous!forme!de!complexes! CMHApeptides.!Les!peptides!antigéniques!présentés!aux!LT!CD4+!proviennent!principalement!d’antigènes!

dégradés! dans! les! phagolysosome! et! chargés! sur! les! molécules! de! classe! II! du! CMH! (CMHAII)! dans! les! endosomes.!La!dégradation!des!antigènes!par!le!protéasome!conduit!à!la!formation!de!peptides!qui!sont! transportés!dans!le!réticulum!endoplasmique!et!chargés!sur!les!molécules!de!classe!I!du!CMH!(CMHAI).!Ce! processus!permet!la!présentation!des!antigènes!aux!LT!CD8+.! ! CD80/CD86' CD40L' CD40'' CD28' CMH' TCR' CD4'ou'CD8'

Cytokines'

An9gènes'

Apprêtement'de'l’an9gène' '

DC#

LT#

(20)

! ! ! ! ! ! ! ! 14! Dans!certaines!conditions,!les!DC!peuvent!aussi!induire!l’anergie!des!LT,!leur!apoptose! ou!leur!différenciation!en!LT!régulateurs!(Treg),!processus!qui!contribuent!au!maintien! de! la! tolérance! immunitaire! [2,! 3].! C’est! sur! les! mécanismes! qui! contrôlent! la! fonctionnalité! des! DC! et! leur! capacité! à! induire! des! Treg! que! nous! porterons! surtout! notre! attention! dans! ce! mémoire.! Il! existe! différents! sousAtypes! de! DC! que! nous! détaillerons! dans! la! première! partie,! nous! verrons! aussi! que! les! sousAtypes! de! DC! présentent!un!certain!degré!de!spécialisation!pour!l’activation!des!LT,!dont!des!Treg!qui! nous! intéressent! justement.! Commençons! par! une! présentation! de! ces! cellules! à! l’interface!de!l’immunité!innée!et!adaptative,!les!DC.!! Sauf!indication!contraire,!les!phénotypes!et!mécanismes!décrits!seront!ceux!connus!chez! la!souris.!

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

(21)

! ! ! ! ! ! ! ! 15!

Partie+I+:+Les+cellules+dendritiques+:+plusieurs+sousEpopulations+de+

cellules+spécialisées+exerçant+des+fonctions+communes+++++

! Les!DC!sont!les!cellules!spécialisées!dans!la!présentation!de!l’antigène!aux!LT,!ce!qui!leur! confère!un!rôle!primordial!dans!l’interface!immunité!innée!et!immunité!adaptative.!Les! DC!forment!une!famille!de!cellules!très!diverses!en!termes!de!phénotype,!localisation!et! fonctionnalité.! Il! émerge! justement! de! diverses! études! que! nous! évoquerons,! que! la! polarisation!de!la!réponse!immunitaire,!notamment!lymphocytaire!T,!dépend!en!partie! du!sousAtype!de!DC!impliqué!et!de!leur!localisation!dans!l’organisme.!!!

!

I"#Ontogénie#et#diversité#des#DC# !!

Découvertes! à! la! fin! des! années! 1970! par! Ralph! Steinman! et! Zanvil! Cohn! [4],! les! DC! forment! une! famille! hétérogène! de! cellules! immunitaires! innées,! d’origine! hématopoïétique,! présentes! dans! les! organes! lymphoïdes! (OL)! ou! non! lymphoïdes! (ONL).! Deux! principales! populations! de! DC! ont! été! identifiées!sur! la! base! de! leurs! caractéristiques! morphologiques,! phénotypiques! et! fonctionnelles,! appelées! respectivement! DC! conventionnelles! (cDC)! et! DC! plasmacytoïdes! (pDC)! chez! la! souris! [5A7].!Le!marqueur!commun!à!toutes!les!DC!murines!est!une!protéine!d’adhésion!de!type! intégrine,!la!protéine!CD11c,!exprimée!de!façon!assez!intense!par!les!cDC!et!faiblement! par! les! pDC.! Au! fil! de! leur! étude,! ces! populations! de! DC! ont! été! subdivisées! en! sousA populations! sur! la! base! de! critères! anatomiques,! phénotypiques,! fonctionnels! et! ontogéniques![8].!Ces!sousApopulations!assurent!des!fonctions!complémentaires!dans!la! défense! de! l’organisme! en! surveillant! des! territoires! distincts! et! en! répondant! à! des! signaux!de!danger!différents.!Faisant!lien!avec!l’un!des!points!centraux!de!mon!étude,!les! cDC!comme!les!pDC!ont!été!décrites!comme!jouant!un!rôle!primordial!dans!l’induction! de!Treg![9,!10].!!

(22)

! ! ! ! ! ! ! ! 16! 1.#Les#DC#conventionnelles## ! Les!cDC!constituent!l’ensemble!des!DC!non!plasmacytoïdes!et!non!inflammatoires.!Les! cDC!peuvent!être!classées!en!fonction!de!leur!localisation!:!DC!des!tissus!non!lymphoïdes,! DC! des! organes! lymphoïdes! et! DC! circulantes.! Les! cDC! sont! des! CPA! professionnelles,! spécialisées! dans! les! fonctions! de! capture,! d’apprêtement! et! de! présentation! des! antigènes! aux! LT.! Elles! induisent! ainsi! l’immunité! contre! les! antigènes! exogènes! et! contribuent! à! la! mise! en! place! d’une! tolérance! contre! les! antigènes! du! soi,! via! notamment!l’induction!de!Treg.!!!

Leur!distribution!dans!les!tissus!nonAlymphoïdes,!notamment!au!niveau!des!interfaces! de! l’organisme! avec! le! milieu! extérieur! (eg! peau,! muqueuses,! pour! les! cDC! des! tissus! nonAlymphoïdes)! et! dans! la! zone! marginale! (pour! les! cDC! de! la! rate)! leur! confère! la! capacité!d’acquérir!des!antigènes!présents!dans!les!tissus!et!le!sang![8].!

Les!cDC!constituent!une!famille!hétérogène!de!part!leurs!caractéristiques!phénotypiques! et! fonctionnelles! spécifiques.! J’ai! choisi! de! vous! présenter! en! premier! lieu! les! cDC! des! tissus!non!lymphoïdes!puis!celles!des!tissus!lymphoïdes.!

1.1#Les#DC#des#organes#non#lymphoïdes## !

Les!cDC!des!tissus!non!lymphoïdes!assurent!la!surveillance!du!milieu!intérieur!au!niveau! des! interfaces! avec! l’environnement.! Elles! exercent! en! permanence! une! activité! de! capture! antigénique! selon! des! processus! qui! seront! décrit! plus! loin.! Chargées! des! antigènes! qu’elles! ont! ainsi! acquis,! elles! migrent! constamment! via! les! vaisseaux! lymphatiques! afférents! vers! la! zone! T! des! ganglions! lymphatiques,! ce! processus! s’accentuant! dans! le! cas! d’une! réponse! à! des! signaux! inflammatoires! [11].! Cette! migration,!principalement!contrôlée!par!CCR7![12],!est!accompagnée!d’un!changement! majeur! du! phénotype! de! la! cDC,! que! l’on! appelle! maturation.! Cette! maturation! est! caractérisée! par! une! augmentation! de! l’expression! des! molécules! du! CMHAII! et! de! coA stimulation! (e.g.! CD80,! CD86)! qui! sont! indispensables! pour! assurer! la! présentation! efficace! de! l’antigène! aux! LT.! Lorsque! la! migration! des! cDC! se! fait! dans! un! contexte! inflammatoire,!l’augmentation!de!ces!molécules!est!maximale!et!est!accompagnée!d’une!

(23)

! ! ! ! ! ! ! ! 17! production! de! cytokines! par! les! cDC,! traduisant! le! contexte! de! danger! associé! aux! antigènes!peptidiques!présentés![13].!La!maturation!des!DC!est!aussi!accompagnée!de! changements! morphologiques,! notamment! l’extension! des! dendrites,! prolongements! membranaires! caractéristiques! des! DC,! qui! maximise! la! surface! d’interaction! de! ces! cellules!avec!les!LT!dans!les!organes!lymphoïdes!secondaires.!

!

On!distingue!deux!principaux!types!de!DC!dans!les!tissus!nonAlymphoïdes,!sur!la!base!de! données!phénotypiques!qui!ont!été!renforcées!par!des!analyses!ontogéniques!:!les!cDC! CD103+CD11bA!et!les!cDC!CD11b+.!Dans!l’épiderme,!il!existe!de!plus!une!sousApopulation!

particulière! de! DC,! les! cellules! de! Langerhans! CD103ACD207+! que! l’on! trouve!

spécifiquement!dans!ce!tissu![14].!!(suite!!)! !

! !

(24)

! ! ! ! ! ! ! ! 18! ! Figure+2+:+Schéma+récapitulatif+de+la+diversité+des+DC,+de+leur+phénotype+et+de+leur+ontogénie+chez+ la+souris.++ Dans!les!encarts!rouges!figurent!les!facteurs!de!transcriptions!spécifiques!de!la!lignée!de!DC.!Les!encarts! bleus! clairs! énumèrent! les! divers! récepteurs! d’activation! ou/et! de! capture! exprimés! par! les! sousA populations!de!DC.!Ces!récepteurs!seront!détaillés!dans!le!chapitre!suivant.!+

PMC!:!Progéniteur!myéloïde!commun,!PMDC!:!Progéniteur!des!macrophages!et!des!DC,!PCDC!:!Progéniteur! commun! des! DC,! Mφ!:! macrophages,! ONL!:! organes! nonAlymphoïdes,! OL!:! organes! lymphoïdes,! TipADC!:! TNFAα/iNOSAproducing! DC,! GMACSF!:! Granulocyte! macrophage! colonyAstimulating! factor,! moADC!:! monocyte!derivedADC.!!

Mafb!:! VAmaf! musculoaponeurotic! fibrosarcoma! oncogene! homolog! B,! Cebpb!:! CCAAT/enhancerAbinding! protein!beta,!Irf8!:!Interferon!regulatory!factor!8,!E2A2!:!E!protein!2A2,!Tcf4!:!Transcription!factor!7*like%2%

gene,( Duxbl!:! Double! homeobox! gene,! Spib!:! Spib! transcription! factor,! Zbtb46!:! Zinc! Finger! And! BTB!

Domain! Containing! 46,! ID2!:! Inhibitor! Of! DNA! Binding! 2,! IRF4!:! Interferon! regulatory! factor! 4,! Notch2!:! Neurogenic!locus!notch!homolog!protein!2.!

Adapté!de!«%Re(de)fining!the!dendritic!cell!lineage!».!Satpathy!et!al.!2012.!Nat%Immunol.%[15]!%! !

1.1.1#La#sous6population#de#cDC#CD103+CD11b6## !

Les! DC! CD103+CD11bA!sont! retrouvées! dans! l’ensemble! des! tissus! nonAlymphoïdes,!

notamment!dans!le!derme!et!la!muqueuse!intestinale!où!leur!fonction!est!bien!décrite.! PMC$ PMDC$ PCDC$ Ma#$ Cebpb$ Irf8$ Zbtb46$ Moelle$ osseuse$ Pré-cDC$ Monocytes$ E232$ Tcf4$ Duxbl$ Spib$ $ Flux$ sanguin$ Tissus$

Tip-DC$ Mϕ$ cDC$dérivée$$par$GM-CSF$ Mo-DC$in#vitro# pDC$CCR9+$ cDC$CD8α+$ cDC$CD11b+$ CD11chiCMH)IIintCD11b). CD172a)XCR1+. CD11chiCMH)IIintCD8α). CD172a+XCR1)CD103). ONL$

PDCA1+CD11clowCMH)IIlow.

CD4+CD172alowB220+Ly6C+.

TLR1,2,3,6,9,11,12,13,.. CD36,Clec9a,.CD205,.CD207. TLR1,6,7,9,13,.CD205,.. CD209a,.DecHn)1,.DCIR2,.. CD209d,.NLRC4. TLR4,6,7,9,12,.Clec9a,.. CD209a,.CD209d. Cellules$de$Langerhans$

CD11cintCMH)IIintEpCAM+.

CD11b+F4/80+CD207++. TLR4,6,7,9,12,.Clec9a,.. CD209a,.CD209d. Peau$ ONL,$OL,$$ Flux$Sanguin$ cDC$CD11b-CD103+$

CD11cintCMH)IIintCD64).

CD172a)CX3CR1)XCR1+.

cDC$CD11b+CD103-$

CD11cintCMH)IIintCD64+.

CD172a+CX3CR1+XCR1). OL$ TLR1,2,4,6,7,8,9,13,.CD36,.. NLRC4,.CD209a,.CD209b,.. CD209c,.DecHn)1. TLR2,3,6,9,11,12,13,.CD36,. .CD205,.CD207,.Clec9a,.DecHn)1. IRF8$ ID2$ IRF4$ Notch2$ ONL$ OL$

(25)

! ! ! ! ! ! ! ! 19! L’expression!du!marqueur!CD103!par!ces!cellules!est!dépendante!de!la!production!locale! de! GMACSF! [16].! Elles! expriment! fortement! le! récepteur! Flt3! et! proliférent! donc! en! réponse!à!Flt3!ligand!(Flt3L)![17].!Elles!sont!originaires!d’un!précurseur!lui!même!issu! de! la! différenciation! du! Progéniteur! Commun! des! DC! (PCDC).! Les! facteurs! de! transcription!des!cDC!CD103+CD11bA!sont!IRF8!et!ID2!(figure!2).!

Outre!l’expression! de!CD103,!elles!sont!caractérisées!par!l’expression!du!récepteur!de! chimiokine!XCR1!et!n’expriment!pas!les!marqueurs!des!macrophages,!CD115,!CD172a,! F4/80! et! CX3CR1.! Dans! la! peau,! cette! population! peut! encore! être! subdivisée! en! DC! dermales!exprimant!ou!non!la!langerine!(CD207)![18].!Dans!la!muqueuse!intestinale,!on! retrouve!des!!CD103+CD11blow.!!! Ce!type!de!cDC!participe!notamment!à!l’établissement!de!la!tolérance!périphérique!en! induisant!des!Treg![19,!20].!De!plus,!dans!la!muqueuse!intestinale,!ces!cDC!migrent!aux! ganglions!drainants,!notamment!le!ganglion!mésentérique!et!promeuvent!l’induction!de! molécules!de!domiciliation!intestinale!comme!CCR9!et!l’α4β7!intégrine!sur!les!LT!avec! lesquels!elles!interagissent.!On!parle!de!«!tissue!imprinting!»,!processus!qui!permettra!la! migration!des!LT!vers!la!muqueuse!intestinale![8].!!

Les! cDC! CD103+CD11bA!sont! les! seules! cDC! exprimant! le! senseur! endosomal! de! l’ARN!

viral! double! brin,! le! TLR3.! Elles! expriment! CD36,! un! récepteur! scavenger! ainsi! que! Clec9A! et! CD205! que! nous! décrirons! plus! loin! (figure! 2).! ! Comparativement! aux! cDC! CD11b+,! les! cDC! CD103+CD11bA!! pulmonaires! et! du! derme! présentent! une! meilleure!

efficacité! pour! réaliser! la! présentation! croisée.! Il! s’agit! de! la! capacité! des! CPA! de! présenter!des!antigènes!exogènes!via!les!molécules!du!CMHAI!aux!lymphocytes!T!CD8+!

[21],!caractéristiques!qui!distingue!les!DC!des!autres!CPA.!

1.1.2#La#sous6population#de#cDC#CD11b+#:##

!

La! seconde! population! bien! caractérisée! dans! les! tissus! non! lymphoïdes! est! la! population! CD11b+! dont! le! développement! est! dépendant! de! facteurs! de! transcription!

(26)

! ! ! ! ! ! ! ! 20! On!la!retrouve!dans!le!derme,!où!elle!n’exprime!pas!CD103.!Dans!la!lamina!propria,!on! trouve! deux! sousApopulations! CD103+CD11bhi! et! CD103+CD11b+!;! le! statut! de! cette!

dernière! est! toujours! discuté! de! part! son! originalité.! Ces! cDC! migreront! vers! les! ganglions!mésentériques![22].!!

Ce! type! de! cDC! peut! acquérir! la! capacité! de! présentation! croisée! via! la! liaison! du! récepteur!au!Fc![8].!Néanmoins,!les!cDC!CD11b+!ont!une!grande!capacité!de!présentation! aux!LT!CD4+.!En!effet,!ce!type!de!cDC!est!la!sousApopulation!prédominante!pour!mener! l’accumulation!de!LT!CD4+!effecteurs!et!de!Treg!dans!un!contexte!de!vaccination![23].!! 1.1.3#Les#cellules#de#Langerhans#:# ! Présentes!dans!l’épiderme,!les!cellules!de!Langerhans!se!distinguent!de!tous!les!autres! types!de!cDC!de!part!leur!ontogénie!et!leur!homéostasie![24]!ainsi!que!leur!capacité!de! développement!indépendante!de!Flt3!et!Flt3L!mais!dépendante!de!CsfA1R!tout!comme! les!macrophages![25].!Contrairement!aux!autres!cDC,!les!cellules!de!Langerhans!ont!la! capacité! de! se! renouveler! in% situ,% grâce! à! la! présence! dans! la! peau! de! précurseurs! CXCR1+CD45+,! colonisant! l’épiderme! durant! la! dernière! phase! du! développement!

embryonnaire! [25].! Elles! forment! un! réseau! dense! et! détectent! la! présence! de! pathogènes!pénétrant!par!la!voie!cutanée.!Exprimant!faiblement!les!molécules!du!CMHA II,! de! manière! intermédiaire! le! marqueur! CD11c! et! très! fortement! la! langerine,! les! cellules!de!Langerhans!sont!toutes!CD11b+F4/80+!et!CX3CR1A![18].!Elles!possèdent,!des!

organites,!appelées!les!granules!de!Birbeck,!jouant!notamment!un!rôle!dans!l’endocytose!! des!antigènes![18].!Le!statut!même!des!cellules!de!Langerhans!comme!faisant!partie!à! part!entière!de!la!famille!des!DC!est!encore!controversé,!du!fait!de!leur!origine!et!de!leur! régulation!homéostatique!unique![26].!! 1#.2#Les#cDC#des#organes#lymphoïdes# 1.2.1#La#sous6population#CD8α+## ! La!grande!hétérogénéité!des!cDC!a!d’abord!été!montrée!par!l’existence!d’un!groupe!de! cDC!exprimant!le!marqueur!CD8α!conjointement!à!l’expression!de!CD205![27].!Les!cDC!

(27)

! ! ! ! ! ! ! ! 21! CD8α+CD205+!sont!présentes!dans!la!rate!et!les!ganglions!lymphatiques,!et!représentent! entre!20!et!40%!des!DC!résidentes!de!ces!organes!lymphoïdes.!Elles!sont!similaires!en! terme!de!phénotype!mais!aussi!de!fonctions!dans!ces!organes!lymphoïdes![7].!Les!cDC! CD8α+! ont! des! besoins! développementaux! similaires! à! ceux! des! cDC! CD103+CD11bA!

trouvées! dans! les! tissus! non! lymphoïdes! [28].! Elles! sont! donc! considérées! comme! l’équivalent!des!cDC!périphériques!CD103+![29].!

Les!cDC!CD8α+CD205+!plus!simplement!appelées!cDC!CD8α+,!expriment!peu!ou!pas!du!

tout!le!marqueur!CD11b!et!les!divers!marqueurs!des!macrophages.!C’est!un!sousAtype!de! DC!qui!exprime!fortement!Flt3!et!qui!est!donc!très!réactif!en!terme!de!prolifération!au! Flt3L![30].!Comme!leurs!consœurs!résidentes!des!tissus!non!lymphoïdes,!les!cDC!CD8α+! présentent!un!phénotype!immature!à!l’état!basal![31],!mais!peuvent!s’activer!et!maturer! suite!à!une!stimulation.!! D’un!point!de!vue!fonctionnel,!il!a!été!montré!que!les!cDC!CD8α+!étaient!très!efficaces!!

pour! réaliser! la! présentation! croisée! lors! d’infections! virales! et! lorsque! les! antigènes! sont! issus! de! cellules! mortes.! En! effet,! les! cDC! CD8α+! expriment! des! récepteurs!

scavenger! qui! leur! permettent! de! capturer! efficacement! les! débris! issus! des! cellules! mortes.!!

Nous!verrons!dans!la!partie!relative!aux!Treg,!que!dans!la!rate,!ce!type!de!DC,!de!part!sa! sécrétion!de!TGFAβ,!contribue!à!l’induction!de!Treg!périphériques![32].!!

1.2.2#La#sous6population#CD11b+## !

Population! majoritaire! dans! la! plupart! des! organes! lymphoïdes,! hormis! le! thymus,! les! cDC! CD11b+! prolifèrent! in! situ! en! réponse! au! Flt3L,! tout! comme! la! sousApopulation!

CD8α+![30].!!

Leur! différenciation! à! partir! des! PCDC! dépend! de! l’expression! des! facteurs! de! transcription!IRF4!et!Notch2.!

Dans! la! rate,! cette! sousApopulation! est! subdivisée! en! deux! sousAtypes! différents!:! une! forme!exprimant!fortement!la!molécule!«!Endotelial!cellASelective!Adhesion!Molecule!»! (ESAM)!et!la!forme!l’exprimant!plus!faiblement.!On!distingue!donc!parmi!les!cDC!CD11b+!

(28)

! ! ! ! ! ! ! ! 22! deux!sousAtypes!ESAMhi!et!ESAMlow.!Les!cDC!CD11b+ESAMhi!expriment!fortement!CD4+,!

CD11c! et! Flt3! et! de! manière! moindre! les! récepteurs! aux! cytokines! Csf! que! leurs! consoeurs! CD11b+ESAMlow.! Leur! origine! splénique! est! aussi! différente!:! les!

CD11b+ESAMhi! dérivent! de! précurseurs! spécifiques! des! DC,! la! voie! Notch! étant!

impliquée! dans! ce! processus!;! alors! que! les! CD11b+ESAMlow! seraient! dérivés! des!

monocytes!circulants!![33].!!!

Dans! certains! travaux,! la! sousApopulation! de! cDC! CD11b+! a! été! décrite! comme! plus!

efficace!que!les!DC!CD8α+!pour!activer!des!LT!CD4+!via!les!molécules!du!CMHAII!et!moins!

efficace! pour! réaliser! la! crossAprésentation! in% vivo.% Toutefois,! cette! spécialisation! fonctionnelle!n’est!pas!absolue!et!il!émerge!de!la!littérature!que!les!cDC!CD11b+!!peuvent!

dans!certains!cas!réaliser!la!présentation!croisée![34,!35].!!!

Dans! le! thymus,! cette! sousApopulation! exprime! fortement! CD172a,! présente! un! phénotype! plus! mature! et! produit! des! niveaux! plus! élevés! de! chimiokines! capables! d’attirer!les!LT!CD4+!que!les!cDC!CD8α+![36].!! ! 2.#Les#DC#plasmacytoïdes# ! Issues!d’une!lignée!distincte!des!cDC,!les!pDC!dépendent!de!la!présence!du!Flt3L!pour! leur!différenciation.!Elles!présentent!une!morphologie,!un!profil!d’expression!génique!et! de! sécrétion! cytokinique! bien! spécifique.! Elles! tiennent! leur! nom! de! leur! forme! sphérique!semblable!à!celle!des!cellules!plasmatiques!sécrétrices!d’anticorps.!Elles!sont! différenciées! des! cDC! de! part! leur! niveau! faible! d’expression! de! CD11c! et! par! l’expression!de!B220,!SiglecAH,!CCR9,!ScaA1,!CD45RA!et!pDCAA1[37].!

Elles! se! différencient! à! partir! des! PCDC.! Des! facteurs! de! transcription! spécifiques! de! cette!lignée!sont!E2A2!et!IRF8!!(figure!2).!!!

Principalement! présentes! dans! le! sang! et! les! tissus! lymphoïdes,! les! pDC! peuvent! être! recrutées! dans! les! tissus! inflammés! ou! infectés.! La! principale! caractéristique! fonctionnelle! des! pDC! est! leur! production! massive! des! IFN! de! type! I! lors! d’infections! virales,!ce!qui!en!fait!des!cellules!clés!de!l’immunité!innée!contre!ce!type!de!pathogènes.!

(29)

! ! ! ! ! ! ! ! 23! Par! ailleurs,! les! pDC! expriment! plus! faiblement! les! molécules! du! CMHAII! et! de! coA stimulation! que! leurs! consoeurs! conventionnelles,! et! se! distinguent! par! leur! faible! capacité!à!présenter!l’antigène!de!façon!basale.!Une!fois!activées,!notamment!lors!d’une! infection! virale! ou! par! un! ligand! de! TLR! approprié,! elles! deviennent! capables! de!! présenter! l’antigène! aux! lymphocytes! T! CD4+,! quoique! de! façon! assez! peu! efficace,! et!

d’activer! des! LT! CD8+! de! façon! directe! ou! croisée! [38A40].! Il! est! intéressant! de! noter!

qu’après!activation,!les!pDC!!présentent!des!caractéristiques!morphologiques!similaires! à!celles!des!cDC,!et!développent!des!dendrites.!!

Le! rôle! des! pDC! dans! l’induction! de! la! tolérance! a! aussi! été! étudié.! En! effet,! il! a! été! montré!qu’une!présentation!antigénique!restreinte!via!les!molécules!de!CMHAII!par!les! DC!résultait!en!une!protection!dans!un!modèle!murin!d’encéphalomyélite!autoimmune! expérimentale! [41].! De! plus,! dans! un! modèle! d’allogreffe! vasculaire! cardiaque,! il! a! été! montré! que! les! pDC! présentant! des! alloAantigènes! induisaient! des! Treg! FoxP3+.! Une!

déplétion! des! pDC! ou! la! prévention! de! leur! migration! dans! les! ganglions! abolit! le! développement!des!Treg!périphériques!et!l’induction!de!tolérance.!Un!transfert!adoptif! de!pDC!tolérogénisées!(par!traitement!avec!des!splénocytes!du!donneur!et!de!l’anticorps! antiACD40L! avant! ! et! durant! la! greffe)! rétablissant! cette! induction! de! Treg! et! ainsi! le! maintien!du!greffon![42].!!

!

3.#Les#DC#inflammatoires#

!

Les!DC!inflammatoires!sont!les!DC!qui!se!différencient!à!partir!de!monocytes!en!réponse! à! des! stimuli! microbiens! et! inflammatoires.! Ces! DC! disparaissent! une! fois! que! l’inflammation!est!résolue.!N’étant!pas!présent!en!dehors!d’un!contexte!inflammatoire,! le!rôle!de!ce!type!de!DC!dans!le!maintien!de!l’homéostasie!des!Treg!reste!encore!assez! obscur.!(suite!!)!! ! ! !

(30)

! ! ! ! ! ! ! ! 24! ! 3.1#Description#des#DC#inflammatoires# ! Le!phénotype!des!DC!inflammatoires!est!fortement!influencé!par!la!nature!des!stimuli!et! le!tissu!dans!lequel!elles!émergent.!La!plupart!des!DC!inflammatoires!sont!caractérisées! par! l’expression! de! Ly6C,! CD11b,! CMHAII! et! expriment! de! manière! intermédiaire! le! marqueur!des!DC,!CD11c![43].!!!

Les! DC! inflammatoires! qui! s’accumulent! dans! les! ganglions! drainants! suite! à! une! injection!de!LPS!expriment!DCASIGN!et!le!CD206!que!nous!décrirons!plus!loin.!!

Une! sousApopulation! de! DC! inflammatoires! induite! par! une! infection! par! Listeria%

monocytogenes,%produit!de!grandes!quantités!de!TNFAα/iNOS!d’où!leur!nom!de!TipADC!

pour!TNFAα/iNOSADC![44].!

3.2#Origines#des#DC#inflammatoires#! !

Les! monocytes! Ly6Chi! sont! considérés! comme! les! précurseurs! des! DC! inflammatoires.!

Toutefois,! sous! l’action! d’une! stimulation! TLR,! les! précurseurs! précoces! hématopoïétiques!tels!que!les!PMC,!les!PLC!et!les!PCCD!peuvent!se!différencier!en!DC,! outrepassant!la!voie!normale!et!les!éléments!nécessaires!à!la!différenciation![45].! ! 4.#Les#DC#de#culture# ! Dans!l’organisme,!que!ce!soit!l’organisme!murin!ou!humain,!les!DC!sont!dans!l’ensemble! très! rares! dans! les! OL! et! les! ONL.! Par! exemple,! les! cDC! spléniques! murines! ne! représentent! que! 2! à! 3%! maximum! des! splénocytes,! les! pDC! atteignent! moins! de! 1%.! Pour!faciliter!l’étude!des!DC,!des!outils!ont!été!conçus.!Ces!outils!permettent!d’obtenir! un! nombre! suffisant! de! DC! de! manière! efficace.! En! effet,! l’obtention! de! DC! à! partir! de! progéniteurs! de! la! moelle! osseuse! ou! de! monocytes! sanguins! est! possible! grâce! à! la! culture!de!ces!derniers!avec!diverses!cytokines.!!

(31)

! ! ! ! ! ! ! ! 25! Plusieurs! types! de! DC! peuvent! être! différenciés! à! partir! de! précurseurs! de! la! moelle! osseuse.!En!effet,!la!culture!de!cellules!de!moelle!osseuse!en!présence!de!GMACSF!permet! la! génération! de! DC.! Leur! profil! est! alors! très! similaire! de! DC! dérivées! de! monocytes! sanguins! humains! que! nous! détaillerons! un! peu! plus! bas.! Ils! présentent! un! profil! à! tendance! inflammatoire.! On! parle! alors! de! BMADC! pour! BoneAMarrow! derivedADC.! Ce! type! de! culture! à! l’inconvénient! de! ne! générer! qu’un! seul! type! de! DC.! Ce! qui! ne! représente!donc!pas!la!grande!diversité!des!DC!dans!l’organisme.!Toutefois,!une!étude! récente!a!montré!qu’il!était!possible!de!générer!des!DC!de!manière!plus!physiologique,! c’estAàAdire!représentant!plus!dans!leur!diversité!les!DC!de!l’organisme.!Ce!processus!est! possible! grâce! à! l’utilisation! de! GMACSF! en! complément! du! FLT3L.! Ainsi,! ce! type! de! culture! génère! des! cDCs! mais! aussi! des! pDCs.! Parmi! les! cDC! générées,! une! partie! est! semblable!aux!cDC!CD8α+!et!l’autre!non,!reflétant!davantage!la!compartimentation!des!

DC!à!l’état!physiologique!que!ne!le!fait!une!culture!employant!exclusivement!du!GMACSF.! En! l’absence! du! marqueur! CD8α+,! les! équivalents! des! cDC! CD8α+! et! CD8αA! sont!

discriminées!en!fonction!de!l’expression!de!CD24!et!de!Clec9A![46].! !

Des! DC! humaines! peuvent! aussi! être! générées! à! partir! des! monocytes! CD14+!grâce! à!

diverses! cytokines,! notamment! le! GMACSF! et! l’ILA4.! Le! résultat! de! cette! différenciation! est!une!culture!de!DC!immatures!CD14dim/A!qui!peut!être!poussée!à!maturation!à!l’aide!de!

facteurs! de! maturation! comme! le! TNFAα/CD40L,! l’IFNγ,! le! polyI:C,! le! LPS! et! le! PGE2.!

Selon!le!facteur!de!maturation!utilisé,!les!DC!initieront!la!différenciation!de!T!effecteurs! de!manière!diverse![47].! ! Les!DC!générées!à!partir!de!moelle!osseuse!de!souris,!à!partir!de!GMACSF!présentent!un! profil!semblable!à!des!DC!dans!un!contexte!inflammatoire![8,!48].!Néanmoins!ces!DC! sont!largement!utilisées!pour!différencier!des!Treg!ex*vivo%[49].! ! !

(32)

! ! ! ! ! ! ! ! 26! II"#Capture#antigénique#par#les#DC# ! L’une!des!fonctionnalité!principale!des!DC!est!de!capturer!et!d’apprêter!l’antigène!via!les! molécules!de!CMH!afin!d’initier!la!réponse!lymphocytaire!T,!CD4+!ou!CD8+.!Nous!verrons!

que! cette! fonction! passe! par! divers! processus! aux! mécanismes! bien! distincts,! et! impliquant! plus! ou! moins! spécifiquement! divers! acteurs! intracellulaires.! Nous! nous! poserons!ainsi!la!question!du!rôle!de!l’expression!de!la!protéine!GILZ!dans!les!DC!sur! cette! capacité! de! capture! antigénique! primordiale! à! sa! fonction.! Il! a! été! déjà! montré! qu’une! inhibition! de! l’expression! de! GILZ! dans! des! BMDC! par! siRNA! conduisait! à! une! augmentation!de!la!capacité!de!capture!de!l’antigène!ovalbumine![50].!Toutefois,!le!rôle! de! l’expression! de! GILZ! dans! les! DC! sur! leur! capacité! de! capture! de! différents! types! d’antigènes,!!in%vivo,!dans!différents!contextes!de!stimulation,!et!les!conséquences!sur!la! présentation!antigéniques,!n’ont!pas!été!étudiés.!!!

Lorsqu’elles! sont! immatures,! les! DC! sont! des! sentinelles! qui! internalisent! en! permanence,! de! façon! très! soutenue,! les! antigènes! qui! sont! dans! leur! environnement,! une! propriété! qui! est! le! fondement! de! leur! efficacité! en! tant! que! CPA.! Ainsi,! pour! internaliser! ces! antigènes,! les! DC! utilisent! plusieurs! modes! de! capture! :! la! pinocytose,! l’endocytose!médiée!par!des!récepteurs!et!la!phagocytose!(figure!3),!(suite!!).!

! ! !

(33)

! ! ! ! ! ! ! ! 27! !! Figure+3+:+Les+différentes+voies+de+capture+de+l’antigène+par+les+DC+

Les! DC! capturent! l’antigène! selon! trois! voies! d’endocytose.! La! phagocytose! est! un! procédé! permettant! l’internalisation! d’antigènes! particulaires! de! grande! taille.! Ces! particules! se! fixent! en! général! à! des! récepteurs! spécifiques! à! la! surface! des! DC! et! entrent! dans! la! cellule! par! des! phagosomes! dérivés! de! la! membrane.! Ces! phagosomes! peuvent! ensuite! fusionner! avec! les! lysosomes! CMHAII+!pour! générer! des!

phagolysosomes,! où! être! ciblé! directement! vers! les! endosomes! précoces.! La! macropinocytose! est! un! processus! de! capture! nonAspécifique! d’antigènes! solubles! via! les! macropinosomes.! Les! antigènes! ainsi! capturés!sont!alors!transférés!dans!les!endosomes!précoces!qui!fusionnent!ensuite!avec!le!compartiment! endosomes!tardifs/lysosomes.!Les!antigènes!sont!alors!dégradés!et!chargés!sur!les!molécules!de!CMHAII.!! L’endocytose!médiée!par!récepteur!permet!la!capture!antigénique!via!des!récepteurs!spécifiques!présents! sur! les! DC.! Les! antigènes! sont! alors! internalisés! dans! des! vésicules! couvertes! ou! non! de! clathrine.! Les! antigènes!sont!ensuite!délivrés!dans!les!endosomes!précoces!puis!dans!les!endosomes!/!lysosomes!où!ils! sont!dégradés!par!protéolytise.!Il!y!a!alors!formation!du!complexe!CMHAII/peptide.!!

Les! complexes! CMHAII/peptide! sont! adressés! via! le! cytoplasme! jusqu’à! la! membrane! plasmique! où! ils! peuvent!être!reconnus!par!les!LT.!!

«!Macropinocytosis!in!phagocytes:!regulation!of!MHC!classAIIArestricted!antigen!presentation!in!dendritic! cells!».!Liu!et!Roche.!2015.!Front%Physiol,![51]!

!!

De! façon! concomitante,! elles! détectent! les! éventuels! dangers! associés! aux! antigènes! qu’elles! ont! acquis,! afin! de! pouvoir! présenter! aux! LT,! de! façon! couplée,! des! peptides! antigéniques! et! des! informations! sur! le! contexte! de! la! capture! de! l’antigène.! Les! DC! reçoivent!des!signaux!de!maturation!de!nature!très!diverse,!via!des!récepteurs!appelés! Pattern! Recognition! Receptor! (PRR).! Les! PRR! reconnaissent! certaines! signatures!

Liu and Roche Macropinocytosis in dendritic cells

FIGURE 1 | Pathways of Exogenous Antigen Uptake in DCs. DCs internalize extracellular antigens using three main endocytic pathways. Phagocytosis is an endocytic process in which opsonized particles bind to specific receptors on the DC surface and enter cells in

membrane-derived phagosomes. Phagocytosed antigens (Blue) can fuse with MHC-II+ lysosomes to generate phagolysosomes (not shown) or can be directly targeted into late endosomal/lysosomal antigen processing compartments to generate pMHC-II complexes.

Macropinocytosis mediates non-specific uptake of soluble antigens into the cell via macropinosomes. Antigens in macropinosomes (Red) are transferred into early endosomes that eventually fuse with multivesicular

late endosomal/lysosomal antigen processing compartments. Macropinocytosed antigens are degraded and loaded on MHC-II in these compartments. Receptor-mediated endocytosis is a process in which small soluble antigens bind to specific receptors on the DC surface that internalize in clathrin-coated vesicles or in clathrin-uncoated vesicles (not shown). Following uncoating of clathrin, antigens in clathrin-coated vesicles (Purple) are delivered to early endosomes and eventually to antigen processing compartments for proteolytic degradation and pMHC-II formation. After formation in antigen processing compartments, pMHC-II complexes traffic to plasma membrane to initiate antigen-specific adaptive immune responses.

METHODS TO STUDY MACROPINOCYTOSIS IN DCs

Since foreign-antigen uptake and proteolysis are such impor-tant functions of DCs, a variety of tools have been devel-oped to study the mechanisms of antigen uptake in these cells. Quantitating the uptake of fluorescently-labeled molecules [often BSA, dextran, or ovalbumin (OVA)] or the fluorescent dye Lucifer Yellow (LY) is a standard method for measuring antigen uptake via macropinocytosis. However, in many of the studies per-formed to date it has been difficult to unambiguously distinguish between macropinocytosis and receptor-mediated endocytosis as the mechanims of “antigen” uptake in DCs. Whereas both fluorescently-labeled dextran and OVA have been used to mea-sure uptake via “macropincytosis,” partial suppression of uptake by pretreatment with the mannose receptor-agonist mannan demonstrates that dextran and OVA are also internalized by mannose receptor-mediated endocytosis (Sallusto et al., 1995; Burgdorf et al., 2006; Platt et al., 2010). Thus, the choice of solute

marker examined, and exact experimental protocol followed, are the key to knowing precisely which endocytic pathway is actually being assayed.

In addition, a number of inhibitors have been used to “specifically” study macropinocytosis. Inhibitiors of the amiloride family (amiloride, EIPA, HOE-694, and DMA) inhibit Na+/H+ exchanger activity that promotes actin polymeriza-tion during macropinocytosis. Sanglifehrin A and rapamycin are immunophilin-binding agents that exert immunosuppressive effects on DC functions including macropinocytosis (Sallusto et al., 1995; Hackstein et al., 2002, 2007). However, other stud-ies revealed that these compounds also inhibit receptor-mediated endocytosis (Hackstein et al., 2002, 2007; Sarkar et al., 2005; Koivusalo et al., 2010). The same issue occurs when using PI3-kinase inhibitors (wortmannin and LY294002) and cytochalasins as inhibitors of macropinocytosis. These inhibitors function by blocking actin polymerization and therefore they not only reduce

(34)

! ! ! ! ! ! ! ! 28! microbiennes!ou!de!dommages!tissulaires!génériques,!que!l’on!appelle!respectivement! les! PathogenAAssociated! Molecular! Patterns! (PAMPs)! et! les! DamageAAssociated! Molecular!Patterns!(DAMPs)![52].!Les!processus!de!capture!antigénique!et!de!détection! des!PAMPs!et!DAMPs!peuvent!être!couplés!et!dépendre!d’un!même!récepteur.!Les!PRR! sont!de!plusieurs!types,!ils!peuvent!être!membranaires!ou!!cytoplasmiques!et!impliqués! ou!non!dans!la!capture!antigénique.!Leur!liaison!avec!leur!ligand!conduit!à!l’activation! de!cascades!de!signalisation!bien!caractérisées,!leur!permettant!de!préparer!la!DC!à!sa! fonction!d’activation!des!lymphocytes!T.!!

Nous! allons! tout! d’abord! détailler! les! processus! de! capture! antigénique! puis! les! mécanismes!d’activation!des!DC.!

!

1.#La#macropinocytose##

!

Les!processus!de!pinocytose!se!distinguent!de!la!capture!médiée!par!un!récepteur!et!de! la! phagocytose! car! ils! sont! indépendants! de! récepteur.! En! fonction! de! ! la! taille! des! vésicules! qui! sont! formées,! on! distingue! la! micropinocytose! (80! nm)! et! la! macropinocytose! (0,2! à! 5! µm).! Les! DC! ont! pour! particularité! de! réaliser! constitutivement! une! capture! très! soutenue! par! macropinocytose,! qui! leur! permet! d’ingérer!l’équivalent!de!leur!propre!volume!en!une!à!deux!heures![53].!!

1.1#Présentation#générale#de#la#macropinocytose# !

La!macropinocytose!est!un!mécanisme!d’endocytose!dépendant!de!l’actine,!conduisant!à! une!ingestion!non!sélective!de!fluide!extracellulaire!contenant!nutriments,!antigènes!et! d’autres! molécules! par! les! cellules! [54].! La! macropinocytose! est! un! processus! d’internalisation! très! efficace! dans! les! DC! immatures,! qui! a! un! rôle! central! dans! l’acquisition!des!antigènes!par!ces!cellules!en!périphérie![54].!!

La! macropinocytose! se! caractérise! par! la! formation! de! protrusions! membranaires! appelées! «!ruffles»,! qui! se! circularisent! et! se! referment! pour! former! des! «!macropinocytic! cups!»! ou! coupes! macropinocytiques.! La! fermeture! de! ces! structures!

(35)

! ! ! ! ! ! ! ! 29! résulte! en! la! formation! de! vésicules! lisses! intracellulaires,! appelées! macropinosomes,! qui! font! en! général! entre! 0,2! et! 5! µm! de! diamètre! [55].! Ces! macropinosomes! entrent! ensuite!dans!un!processus!de!maturation!suivi!d’un!recyclage.!Les!antigènes!endocytés! par! les! DC! par! cette! voie! sont! apprêtés! et! présentés! à! la! surface! de! la! cellule! par! les! molécules!de!CMHAII!principalement![53]!mais!aussi!de!manière!moins!efficace!par!les! molécules! de! CMHAI,! via! la! libération! dans! le! cytosol! des! antigènes! issus! des! macropinosomes.!! Les!évènements!clés!de!ce!processus,!la!formation!du!macropinosome!et!sa!maturation! et!recyclage,!sont!dépendants!du!cytosquelette!d’actine!et!du!trafic!membranaire,!euxA mêmes!contrôlés!par!un!ensemble!de!molécules,!notamment!des!petites!GTPases!et!des! phosphoinositides![56].!Voyons!un!peu!plus!en!détail!les!molécules!impliquées!dans!la! macropinocytose.!! 1.2#Mécanismes#moléculaires#impliqués#dans#la#macropinocytose# ! Durant!notre!étude,!nous!avons!envisagé!un!rôle!de!la!protéine!GILZ!dans!les!DC!sur!leur! capacité! de! capture! par! macropinocytose! via! des! interactions! sur! les! acteurs! de! ce! processus.!!

1.2.1#Les#petites#GTPases# !

La!macropinocytose!est!un!processus!qui!nécessite!la!coordination!spatiotemporelle!du! recrutement!et!de!la!polymérisation!des!molécules!d’actine!ainsi!que!des!processus!de! fission! et! fusion! membranaire.! Plusieurs! petites! GTPases! sont! impliquées! dans! la! régulation!de!ces!différentes!étapes!(figure!4)!:!

A! Les! Arf! GTPases!:! ces! protéines! modulent! le! métabolisme! phospholipidique! et! le! cytosquelette!d’actine,!et!interviennent!principalement!lors!de!la!phase!de!ruffling![56].! A!les!Rho!GTPases!Rac1!et!Cdc42!:!elles!sont!essentielles!à!l’activation!de!PAK1!qui!régule! l’organisation! du! cytosquelette! d’actine! via! l’activation! de! WASP/WAVEAArp2/3! et! la! phosphorylation! de! CtBP1/BARS.! Cette! cascade! d’activation! régule! en! particulier! la! fission!du!macropinosome!de!la!membrane!plasmique![56].!!! !

(36)

! ! ! ! ! ! ! ! 30! A! Les! Rab! GTPases!:! plusieurs! protéines! Rab! sont! associées! aux! macropinosomes! à! différents! stades! de! leur! maturation.! La! protéine! Rab34! ou! Rah,! est! colocalisée! avec! l’actine!au!niveau!des!protrusions!membranaires!et!des!vésicules!naissantes!adjacentes! aux!ruffles.!!De!plus,!il!a!été!montré!qu’une!surexpression!de!Rah,!conduit!à!un!nombre! accru! de! macropinosomes,! et! que! la! présence! de! Rah! est! essentielle! à! la! formation! efficace!de!macropinosomes!à!partir!des!ruffles!membranaires.!Les!protéines!Rab5!sont! associées!aux!macropinosomes!précoces,!les!protéines!Rab7!étant!caractéristiques!des! endosomes!tardifs![57].!!

A!Les!Ras!GTPases!:!Les!Ras!GTPases!sont!impliquées!dans!le!«!ruffling!»!membranaire!et! la! macropinocytose! dans! de! nombreux! types! cellulaires.! Dans! les! cellules! HeLa! stimulées!avec!l’EGF!(Epidermal!Growth!Factor),!Ras!colocalise!avec!le!«!ruffling!»!et!les! macropinosomes! en! formation.! Dans! les! Mφ! RAW,! l’activation! de! Ras! a! été! observée! après! la! formation! des! «!ruffles!»!circulaires! et! en! quasiAconcomittance! avec! le! recrutement! de! Rab5.! Le! pic! d’activité! survient! après! la! fermeture! de! la! coupe! macropinocytique! [56].! Ras! agit! de! manière! dépendante! des! PI3K! et! de! la! PhospholipaseAC![58]!(suite!!).!

(37)

! ! ! ! ! ! ! ! 31! ! Figure+4+:+Modèle+présentant+l’action+séquentielle+des+petites+GTPases+et+des+phosphoinositides+ dans+le+processus+de+macropinocytose.++

Le! mécanisme! de! macropinocytose! implique! de! nombreuses! molécules.! Ces! molécules! agissent! de! manière! séquentielle! durant! ce! processus.! Certaines! sont! impliquées! dans! le! ruffling! de! la! membrane! plasmique,!dans!la!formation!de!la!coupe!macropinocytique!ou!dans!le!transport!du!macropinosome.!! ARF!:!ADP! ribosylation! factor,! Rac1!:! RasArelated! C3! botulinum! toxin! substrate! 1,! Rab,! Rah!est! aussi!

appellée! Rab34,! PI!:! Phosphoinosytol,! PI! (X,Y,Z)P!:! Phosphoinositol! (X,Y,Z)! phosphate,! PI(X)K!:!

Phosphoinositide! XAkinase,! DAG!:! Diacylglycerol,! SHIP!:! SH2Acontaining! inositol! phosphatase,! MTMR6!:! myotubularinArelated! proteins! 6,! IP3!:! inositol! triphosphate,! INPP4B!:! Inositol! polyphosphateA4A phosphatase,!type!II,!PLC!:!phospholipase!C.!!

«!Small!GTPases!and!phosphoinositides!in!the!regulatory!mechanisms!of!macropinosome!formation!and! maturation!».!Egami!et!al,!2014.!Front%Physiol.![56]!

1.2.2#Les#phosphoinositides#

!

Les! phosphoinositides! sont! produits! à! partir! de! la! phosphorylation! du! phosphatidylinositol!(PI)!au!niveau!des!positions!3,!4!et!5!du!groupement!inositol.!Seule! une! petite! fraction! des! phosphoinositides! est! membranaire,! mais! ils! participent! à! de! nombreux! processus! cellulaires! comme! la! transduction! du! signal! et! la! dynamique!

Egami et al. GTPases and phosphoinositides in macropinocytosis

FIGURE 1 | Proposed model for the sequential association of small GTPases and phosphoinositides with the processes of macropinocytosis. See text for explanations.

membrane phospholipids but are involved in many cellular pro-cesses, such as signal transduction and membrane dynamics (Di Paolo and De Camilli, 2006). Each phosphoinositide recruits specific proteins to the membrane domain where the phospho-inositide is enriched, then activates protein function and leads signaling cascades. The processes of macropinocytosis seem to be tightly regulated by a series of phosphoinositides with precise spa-tiotemporal patterns. In this section, we review the involvement of phosphoinositides in membrane ruffling, macropinocytic cup formation, macropinosome formation, and macropinosome maturation. Our recent observations of Caenorhabditis elegans, which revealed critical phosphatases that regulate phosphoinosi-tide metabolism in membrane ruffles (Maekawa et al., 2014), are also described.

PHOSPHATIDYLINOSITOL 4,5-BISPHOSPHATE (PI(4,5)P2) AND

PHOSPHATIDYLINOSITOL 4-PHOSPHATE 5-KINASES (PI4P5K) IN MEMBRANE RUFFLING

PI4P5K catalyzes the phosphorylation of phosphatidylinositol 4-phosphate (PI4P) to form phosphatidylinositol 4,5-bis4-phosphate (PI(4,5)P2). Live-cell imaging using a fluorescent protein–fused

PLC-PH domain demonstrated that the levels of PI(4,5)P2 are

markedly increased in membrane ruffles and macropinocytic

cups (Araki et al., 2007; Welliver and Swanson, 2012). Therefore, PI4P5K must be locally activated for localized PI(4,5)P2

syn-thesis from PI4P. In support of this finding, both Rac1 and ARF6, which activate PI4P5K activity (Honda et al., 1999), are known to be temporally activated at the same region (Zhang et al., 1999; Balañá et al., 2005; Yoshida et al., 2009). PI(4,5)P2

binds to activate various actin-binding proteins and initiates the actin polymerization and reorganization required for membrane ruffling, which is a prerequisite for macropinosome formation. Furthermore, PI(4,5)P2 is the most common physiological

sub-strate for phospholipase C (PLC), which produces two impor-tant messengers: diacylglycerol (DAG) and inositol trisphosphate (IP3). DAG activates a number of protein kinase C (PKC)

iso-forms and causes their translocation to the plasma membrane from the cytosol. PKC activation by phorbol ester is known to enhance membrane ruffling and macropinocytosis (Swanson, 1989). The PI(4,5)P2 levels in the membrane decrease upon

macropinosome closure. At that time, PI(4,5)P2 is hydrolyzed

to IP3 and DAG by phospholipase Cγ (PLCγ) or converted to

PI(3,4,5)P3by PI3K during the process of macropinosome

forma-tion. However, PLCγ and PI3K seem to function in distinct phases of macropinocytosis. The inhibition of PLCγ by U-73122 per-turbs macropinocytosis at the ruffle formation step, while PI3K

Frontiers in Physiology | Membrane Physiology and Membrane Biophysics September 2014 | Volume 5 | Article 374| 4

Figure

FIGURE 1 | Pathways of Exogenous Antigen Uptake in DCs. DCs internalize extracellular antigens using three main endocytic pathways.
FIGURE 1 | Proposed model for the sequential association of small GTPases and phosphoinositides with the processes of macropinocytosis
Figure S1. CD206 expression in GILZKO DC.
FIGURE 1. GILZ is constitutively and selectively overexpressed in DCs from CD11c-GILZ hi mice
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