Thesis
Reference
Lymphocytes T et sclérose systémique
PAREL, Yann
Abstract
La sclérose systémique (SSc) est caractérisée par des altérations immuno-inflammatoires, une vasculopathie et une excessive déposition de matrice extracellulaire (MEC) qui aboutissent à une fibrose de la peau et des organes internes. Notre travail se base sur l'observation que la déposition de MEC est précédée et accompagnée par un infiltrat inflammatoire riche en lymphocytes T. Nous avons testé si les lymphocytes T présents dans cet infiltrat présentent des carcatéristiques phénotypiques et fonctionnelles spécifiques et si celles-ci ont un rôle pathogénique. Nous avons établi des lignées de lymphocytes T dermiques entre lesquels il y avait des cellules CD4+CD8+ double positives, oligoclonales, d'origine distincte des lymphocytes T simple positifs, capables d'activité cytolytique et auxiliaire. Nous avons confirmé leur présence dans la peau sclérodermique par microscopie.
Comparés aux contrôles, les lymphocytes T de SSc étaient capables d'une importante production d'interleukine-4, ce qui suggère leur rôle pathogénique puisque cette cytokine est très puissamment pro-fibrotique.
PAREL, Yann. Lymphocytes T et sclérose systémique. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2009, no. Méd. 10575
URN : urn:nbn:ch:unige-18605
DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:1860
Available at:
http://archive-ouverte.unige.ch/unige:1860
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UNIVERSITE DE GENEVE FACULTE DE MEDECINE
Section de Médecine clinique
Département de Médecine interne Service d’Immunologie et d’Allergologie Thèse préparée sous la direction du Professeur J-M.DAYER et du Docteur C.CHIZZOLINI
" Lymphocytes T et sclérose systémique "
Thèse
présentée à la Faculté de Médecine de l'Université de Genève
pour obtenir le grade de Docteur en médecine par
Yann PAREL de
Genève (GE) Thèse n°10575
Genève
2009
UNIVERSITE DE GENEVE FACULTE DE MEDECINE
Section de Médecine clinique
Département de Médecine interne Service d’Immunologie et d’Allergologie Thèse préparée sous la direction du Professeur J-M.DAYER et du Docteur C.CHIZZOLINI
" Lymphocytes T et sclérose systémique "
Thèse
présentée à la Faculté de Médecine de l'Université de Genève
pour obtenir le grade de Docteur en médecine par
Yann PAREL de
Genève (GE) Thèse n°10575
Genève
2009
Résumé
La sclérose systémique (SSc) est caractérisée par des altérations immunoinflammatoires, une vasculopathie et une déposition excessive de matrice extracellulaire (MEC) qui aboutissent à une fibrose de la peau et des organes internes. Notre travail se base sur l’observation que la déposition de MEC est précédée et accompagnée d'un infiltrat inflammatoire riche en lymphocytes T. Nous avons testé si les lymphocytes T présents dans cet infiltrat présentent des caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles spécifiques et si celles-ci ont un rôle pathogénique dans la SSc.
Nous avons établi des lignées de lymphocytes T dermiques parmi lesquels il y avait des cellules CD4+CD8+ double positives, oligoclonales, d’origine distincte des lymphocytes T simple positifs, capables d’activité cytolytique et auxiliaire. Nous avons confirmé leur présence dans la peau sclérodermique par microscopie. Comparés aux contrôles, les lymphocytes T de SSc étaient capables d’une importante production d’interleukine-4, ce qui suggère leur rôle pathogénique puisque cette cytokine est très puissamment profibrotique.
Références bibliographiques :
Parel Y., Chizzolini C., “CD4+ CD8+ double positive (DP) T cells in health and disease”, Autoimmun Rev. 2004; 3:215-20.
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Table des matières : 1. Introduction
1.1. Système immunitaire
1.2. Maturation thymique normale des lymphocytes T
1.3. Présence de lymphocytes T CD4+CD8+ double positifs matures dans plusieurs conditions pathologiques et chez le sujet sain.
1.4. Différentiation des lymphocytes T et leur production de cytokines 1.5. Sclérose systémique
2. Thèse
2.1. Rationnel
2.2. Objectif de la thèse 2.3. Matériel et méthodes 2.4. Résultats
2.5. Conclusion 3. Bibliographie 4. Articles de thèse
1. Introduction :
1.1. Système immunitaire :
Le système immunitaire est responsable de la défense de l’organisme contre les pathogènes qui présentent une extraordinaire diversité à laquelle l’hôte doit pouvoir faire face à chaque instant. A cette fin, le système immunitaire est composé de deux modes de réponse :
1.1.1. Réponse immune « innée » : elle est la première ligne de défense à l’arrivée d’un pathogène et n’évolue pas en fonction des expositions répétées à ce dernier.
Cette réponse est basée sur des barrières mécaniques (peau, cils, mucus), sur un système de reconnaissance par des récepteurs invariants qui reconnaissent des molécules spécifiques du pathogène (composant de la paroi cellulaire bactérienne), sur les phagocytes (neutrophiles, monocytes), les lymphocytes NK et sur de nombreuses molécules solubles (ex. protéine du complément).
1.1.2. Réponse immune « adaptative » : c’est une réponse spécifique et adaptative : lors de l’exposition à un pathogène, elle va évoluer, s’adapter et permettre ainsi une réponse plus spécifique, plus efficace et secondairement plus rapide. Cette réponse est basée sur les lymphocytes T et B qui grâce à la fine spécificité de leur récepteur (TcR / BcR) pour des détails moléculaires antigéniques, sont responsables d’une réponse dirigée, spécialisée, cellulaire ou humorale.
Cette réponse immunitaire nécessitant la reconnaissance d’un antigène, l’activation, la réplication et la différentiation des lymphocytes spécifiques ainsi que le recrutement/activation des cellules effectrices n’est pas immédiate et peut prendre plusieurs jours pour se mettre en place. Lors d’une réexposition au pathogène, la réponse pourra être rapide, grâce à la génération préalable de cellules mémoire qui seront réactivées.
1.2. Maturation thymique normale des lymphocytes T :
Les lymphocytes T sont issus de progéniteurs hématopoïétiques qui mûrissent dans le thymus. A leur arrivée dans le cortex thymique, les progéniteurs n’expriment ni le récepteur T (TcR) ni les co-récepteurs CD4 ou CD8; ils sont dits doubles négatifs (DN). Suite à leur passage dans le thymus, les progéniteurs hématopoïétiques se différencient en lymphocytes T CD4+ (T helper, Th) ou en lymphocytes T CD8+ (T cytotoxique, CTL) matures, capables d’interagir avec les autres cellules du système
immunitaire (sélection positive) et sont tolérant au soi (sélection négative).
1.2.1. Réarrangement, expression et sélection du TcR :
Nous allons nous intéresser plus particulièrement aux lymphocytes T avec un TcR α-β. La chaîne β est réarrangée puis exprimée à la surface de la cellule T. Dans un deuxième temps, c’est la chaîne α qui est réarrangée puis exprimée à la surface de la cellule T, associée à une chaîne β. Les réarrangements et l’appariement aléatoires d’une chaîne α et d’une chaîne β offrent une grande diversité de
« répertoire » au TcR, qui est nécessaire à la reconnaissance de la multitude de pathogènes auxquels un individu peut être exposé au cours de sa vie.
Le TcR est testé pour son affinité pour le complexe majeur d’histocompatibilité (MHC) exprimé par les cellules épithéliales du cortex thymique. Seuls les lymphocytes porteur d’un TcR dont l’affinité pour le MHC est suffisante pour recevoir un signal d’activation pourront survivre. Cette étape est dite de sélection positive. Les autres lymphocytes seront éliminés par apoptose.
Les lymphocytes T sont successivement exposés aux antigènes du soi associés aux molécules du MHC par les cellules dendritiques et les cellules épithéliales médullaires du thymus. Les lymphocytes dont l’affinité est trop forte pour le complexe antigène/peptide-MHC seront éliminés par apoptose suite à l’activation de leur TcR. Cette étape est dite de sélection négative et est fondamentale pour la mise en place de la tolérance centrale.
1.2.2. Expression des co-récepteurs CD4 et CD8 :
En entrant dans le thymus les précurseurs hématopoïétiques n’expriment ni le CD4 ni le CD8; ils sont dits doubles négatifs (DN). Entre le réarrangement de la chaîne β et de la chaîne α du TcR débute l’expression des deux co-récepteurs, le CD4 et le CD8, la cellule T devenant alors double positive (DP). Lors de la sélection positive, les lymphocytes CD4+CD8+ doubles positifs perdent l’un des co-récepteurs; ils deviennent CD4+ ou CD8+ simple positif (SP) et migrent au niveau de la medulla du thymus.
Trois modèles sont proposés pour expliquer comment les lymphocytes T CD4+CD8+ doubles positifs immatures perdent un de leur co-récepteur pour devenir des lymphocytes T CD4+ ou CD8+ simple positifs. Les voici dans l’ordre chronologique de leurs postulations :
• Le modèle stochastique : l’expression du CD4 ou du CD8 est maintenue au
hasard et seules les bonnes combinaisons CD8/MHC classe I ou CD4/MHC classe II permettent au lymphocyte de survivre.
• Le modèle instructionnel : le « bon » co-récepteur est maintenu pendant la sélection positive grâce à une reconnaissance par le TcR de la classe du MHC.
S’il s’agit d’un MHC de classe I, le co-récepteur CD8 sera maintenu. Au contraire, s’il s’agit d’un MHC de classe II, le co-récepteur CD4 sera maintenu.
• Le modèle asymétrique : la différentiation en lymphocytes CD4 ou CD8 simple positif est déterminée par l’intensité et la durée de l’interaction TcR- MHC. Une stimulation longue et forte engendrerait un lymphocyte T CD4+, un signal court et faible un lymphocyte T CD8+.
1.3. Présence de lymphocytes T CD4+CD8+ double positifs matures dans plusieurs conditions pathologiques et chez le sujet sain :
Selon le modèle de la maturation thymique des lymphocytes T, il ne devrait pas exister de lymphocytes CD4+CD8+ doubles positifs (DP) en périphérie. Cependant ils ont été identifiés dans le sang périphérique et dans divers organes chez le sujet sain ou chez des patients atteints de différentes conditions pathologiques. On peut donc formuler deux hypothèses principales. La première, qu’ils soient sortis du thymus en ayant retenu les deux co-récepteurs ; la deuxième, que soumis à des conditions particulières, les lymphocytes simple positifs réacquièrent l’autre co-récepteur.
Les lymphocytes T CD4+CD8+ DP sont hétérogènes en regard de leur expression des deux co-récepteurs. En effet, le CD4 est un co-récepteur fait d’un seul polypeptide codé par un gène dont l’expression est régulée principalement au niveau transcriptionel. Le CD8 est composé de deux chaînes, α et β et peut exister comme hétérodimère αβ (lymphocytes T CD8+ cytotoxiques), ou comme homodimère αα (cellules T γδ, cellules NK et lymphocytes intraépithéliaux). Les chaînes α et β du CD8 sont codées sur deux gènes séparés sur le chromosome 2 et la régulation de l’expression de ces deux gènes n’est pas complètement connue.
Parmi les lymphocytes T CD4+CD8+ DP décrits dans la littérature on observe donc les deux types d’expression du CD8. De plus on trouve une variabilité dans l’expression du signal du CD4 (forte/hi ou faible/lo). En résumé on observe :
• CD4hi CD8αα: il a été démontré que des lymphocytes T CD4+ SP activés peuvent exprimer de manière stable un CD8αα et que cette expression est associée à une fonction cytotoxique bloquée par les anticorps anti-CD8.
L’analyse de leur TcR a pu montrer qu’ils dérivent des lymphocytes T CD4+
SP. Par conséquent un lymphocyte T CD4+ SP peut, dans certaines circonstances, acquérir un CD8αα qui lui confère une activité cytolytique (propre aux lymphocytes T CD8+ SP).
• CD4loCD8αβ: il a également été montré que des lymphocytes T CD8+ SP peuvent exprimer faiblement un co-récepteur CD4 à faible densité d’expression lorsqu’ils sont activés. Cette expression du CD4 rend les lymphocytes T CD4lo CD8αβ susceptibles à une infection par le HIV.
• CD4hi CD8αβ : des lymphocytes T CD4+CD8αβ+ ayant les deux co- récepteurs à haut niveau d’expression ont été décrits dans le sang périphérique de sujets sains et associés à diverses pathologies auto-immunes (dermatite atopique, thyroïdite auto-immune, maladie de Kawasaki et sclérose systémique).
1.4. Différentiation des lymphocytes T et leur production de cytokines :
Les lymphocytes T matures post thymiques naïfs, ne sont pas programmés pour avoir une fonction effectrice préétablie. Notamment, ils ne sont pas capables de produire des cytokines. L’environnement et les circonstances dans lesquelles ils rencontrent l’antigène déterminent leur différentiation et leur capacité à produire de façon différentielle des cytokines, impliquant l’acquisition de fonctions effectrices différentes. Les lymphocytes T CD4+ peuvent se différencier comme suit :
• L’exposition à l’IL-12 et à l’IFN-γ induit une polarisation de type Th1. Ces lymphocytes produisent de l’IFN-γ et de l’IL-2. Ils sont principalement utiles pour contrôler les infections intracellulaires (bactéries intracellulaires, virus).
D’une part, ils favorisent la résistance des cellules infectées grâce entre autres à leur production d’interféron, et d’autre part, favorisent le recrutement de cellules effectrices : les lymphocytes B, T CD8+ cytotoxiques, les macrophages, les lymphocytes NK. Ils sont également impliqués dans le développement de certaines maladies auto-immunes.
• L’exposition à l’IL-4 et à l’IL-2 induit une polarisation de type Th2. Ces lymphocytes produisent de l’IL-4, IL-5, et de l’IL-13. Ils favorisent une réponse immunitaire de type humorale, principalement utile pour contrôler les infections parasitaires. Ils sont également impliqués dans l’induction et l’entretien de maladies allergiques comme l’asthme, suite entre autres, à l’induction de la production d’immunoglobuline de type IgE et au recrutement des éosinophiles. L’IL-4 et l’IL-13 sont des cytokines importantes pour la stimulation des fibroblastes et la production de collagène.
• L’exposition au TGF-β et à l’IL-6 chez la souris induit une polarisation de type Th-17. Ces lymphocytes produisent de l’IL-17, IL-21, IL-22. Ils sont impliqués dans la réponse immunitaire aux bactéries extracellulaires et aux champignons, grâce au recrutement de cellules et de molécules de la réponse innée. Ils ont été mis en cause dans l’induction de plusieurs pathologies auto- immunes.
• L’exposition au TGF-β et à l’IL-2 chez la souris induit une polarisation de type T régulateurs inductibles (iTreg). Ces lymphocytes produisent du TGF-β, IL-10. Ils jouent un rôle critique dans le maintien de la tolérance du soi et dans la régulation de la réponse immunitaire.
Les lymphocytes T CD8+, moins étudiés que les lymphocytes T CD4+, peuvent également produire un certain type de cytokines et être classifiés par analogie aux CD4+ :
• Les lymphocytes CD8 type1 produisent de l’IFN-γ et font partie des cellules effectrices de la réponse immunitaire cellulaire.
• Les lymphocytes CD8 type2 produisent de l’IL-4 et ont été décrits dans certaines maladies auto-immunes et dans l’infection à HIV. Bien que moins étudiés que les CD4 de type2, certains auteurs rapportent leur présence dans les lavages broncho-alvéolaires de patient atteint de sclérose systémique, dans le sang de patient asthmatique, et chez les patients atteints de sclérose en plaques.
1.5. Sclérose systémique :
La sclérose systémique ou sclérodermie, est une maladie du tissu conjonctif, probablement d’origine auto-immune. Elle est caractérisée par une augmentation de la
production de la matrice extracellulaire par les fibroblastes (fibrose) et par une atteinte vasculaire avec une fibroplasie des parois des vaisseaux. Tous les organes internes ainsi que la peau peuvent être atteints. Il existe deux formes majeures de sclérose systémique :
• La forme avec atteinte cutanée diffuse, qui est la plus sévère, est caractérisée par une progression rapide de l’atteinte cutanée et des organes internes et est habituellement associée aux auto-anticorps anti-DNA topoisomérase.
• La forme avec atteinte cutanée limitée, est caractérisée par une progression plus lente, une atteinte cutanée habituellement limitée aux mains et au visage, une atteinte d’organes moins sévère, souvent caractérisée par le syndrome de CREST (Calcinose, phénomène de Raynaud, trouble de la motilité Œsophagienne, Sclérodactylie et Télengiétactsie) et associée aux auto- anticorps anti-centromère. Une complication tardive de cette forme est l’hypertension artérielle pulmonaire.
La physiopathologie de la sclérose systémique n’est que partiellement comprise mais plusieurs pistes de recherche sont poursuivies. Les travaux les plus récents, proposent que chez les personnes génétiquement prédisposées une association d’événements immunologiques précoces avec des modifications vasculaires, induit l’activation des fibroblastes qui acquièrent un phénotype de myofibroblastes capables d’une synthèse plus importante de collagène et autres composants de la matrice extracellulaire.
Plusieurs hypothèses sont avancées quant aux différents facteurs impliqués :
• Une prédisposition génétique impliquant plusieurs gènes, pour l’instant mal comprise, pourrait contribuer à une dérégulation de la déposition de la matrice extracellulaire par les fibroblastes. Ceux-ci pourraient être soit primitivement soit secondairement altérés.
• Des facteurs environnementaux tels que les agents infectieux (par exemple le CMV ou le parvovirus B19,) ou des toxiques (silice, chlorure de vinyle) seraient le primum movens initiant l’activation de l’endothélium et le recrutement du système immunitaire.
• La présence précoce de modifications de la microcirculation, notamment des cellules endothéliales qui à travers la production anormale de facteurs de croissance, de chemokines et cytokines, l’expression de molécules d’adhésion,
vont favoriser le développement de la fibrose et le recrutement de cellules inflammatoires elles-mêmes impliquées dans l’activation des fibroblastes.
• Le système immunitaire, dont l’implication a été démontré à plusieurs niveaux. Les lymphocytes T sont présents aux stades précoces de la maladie, au niveau des organes où la fibrose se développe. Les fibroblastes proches des lymphocytes T ont une expression de collagène augmentée, suggérant que les lymphocytes T puissent directement ou indirectement déréguler le métabolisme des fibroblastes et ainsi participer à la fibrose. On observe la production d’anticorps spécifiques dirigés contre des antigènes nucléaires et nucléolaires, montrant également une implication des lymphocytes B dans la physiopathologie de la sclérose systémique.
2. Thèse :
2.1. Rationnel
Notre attention s’est focalisée tout particulièrement sur le possible rôle des lymphocytes T dans la pathogenèse de la sclérose systémique. En effet, l’IL-4 et l’IL- 13 produites par les lymphocytes Th2 sont capables d’augmenter la production de collagène et d’autres composants de la matrice extracellulaire par les fibroblastes. A l’inverse, l’IFN-γ, produit par les lymphocytes Th1, inhibe la synthèse du collagène par les fibroblastes. Il est donc possible que les lymphocytes, à travers leurs productions de cytokines, puissent grandement influencer les processus qui mènent à la fibrose. D’autres mécanismes éventuellement impliqués dans la régulation de la déposition de la matrice extracellulaire sont liés au contact direct entre lymphocytes T et fibroblastes (CD40L-CD40) et à des interactions tripartites dans lesquelles le lymphocyte T active le macrophage, lequel à son tour produit des médiateurs (TGF-β) agissant sur le fibroblaste.
2.2. Objectif de la thèse
L’objectif de la thèse a été la caractérisation fonctionnelle et phénotypique des lymphocytes T présents dans la peau de patients atteints de sclérose systémique.
Nous avons utilisé comme contrôle des échantillons similaires provenant d’individus sains.
Lors de l’analyse des lymphocytes T issus de biopsies cutanées, nous avons identifié des lymphocytes T CD4+ SP, CD8+ SP et des CD4+CD8+DP. La présence de cellules CD4+CD8+ doubles positives et les caractéristiques fonctionnelles de ces sous-populations lymphocytaires, a soulevé la question de leur implication dans la pathogenèse de la sclérose systémique. Après une revue de la littérature sur les lymphocytes T exprimant le CD4 et le CD8 (voir 1er papier de la thèse : CD4+CD8+
Double Positive (DP) T Cells in health and disease) nous avons étudié ces cellules et tenté de répondre à plusieurs questions concernant les caractéristiques de ces lymphocytes T DP en termes d’expression de marqueurs de surface et de production de cytokines. Nous avons également comparé les lymphocytes issus des patients atteints de sclérose systémique et ceux de donneurs sains.
Successivement nous nous sommes attachés à définir le niveau et le type d’expression des deux co-récepteurs CD4 et CD8, le mécanisme de leur expression,
et si cette expression était simultanément associée à la fonction « helper » (aide à la production d’immunoglobuline par des lymphocytes B) et à la fonction « killer » (capacité à induire la cytolyse de cellules cibles).
Nous nous sommes par la suite, posés la question de l’origine des lymphocytes T DP : sont-ils issues des lymphocytes T CD4+ SP ou des CD8+ SP, ou sont-ils d'origine distincte ?
Finalement, afin de déterminer si la présence des lymphocytes T DP pouvait être due à un biais de culture, nous nous sommes attachés à rechercher leur présence directement dans la peau des patients atteints de sclérose systémique et de donneurs sains.
2.3. Matériel et méthodes
Afin de déterminer les caractéristiques des lymphocytes T DP en termes d’expression de marqueur de surface et de production de cytokine nous avons généré des lignées de lymphocytes T, CD4, CD8 et DP à partir de la peau et du sang périphérique de patients et de donneurs sains. Nous avons étudié l’expression des marqueurs de surface et la production de cytokines intracellulaires par cytométrie de flux. La production de cytokine a également été évaluée par ELISA.
Pour étudier le type et l’intensité de l’expression des co-récepteurs CD4 et CD8, nous avons procédé par PCR pour évaluer la transcription du CD4, CD8α et du CD8β, et par cytométrie de flux (anticorps anti-CD4, anti-CD8α et anti-CD8β) pour évaluer l’expression des protéines à la surface cellulaire. Afin d’étudier les mécanismes d’expression des co-récepteurs à la surface cellulaire, nous avons effectué un test à la pronase (permettant la digestion des co-récepteurs ) puis nous avons étudié leur réexpression en condition de blocage de la transcription (4° C) ou à 37° C ; l’expression des co-récepteurs à été évaluée à chaque étape par cytométrie de flux.
Afin de tester la fonction des co-récepteurs sans risquer une contamination par une autre lignée CD4 ou CD8 SP, et afin d’évaluer l’hétérogénéité au sein des différentes lignées, nous avons travaillé au niveau clonal, en comparant plusieurs clones issus des CD4, les CD8 et les DP. Nous avons effectué un test de la fonction helper en évaluant la production d’immunoglobulines IgG par ELISA par des lymphocytes B en présence de lymphocytes T DP, et la fonction cytolytique dans un test de cytolyse mesurant le relargage de Cr51 par les cellules P815 exposée aux lymphocytes T DP activées par
des anticorps anti-CD3.
Afin d’étudier l’origine des lymphocytes T DP, nous avons procédé par PCR à une analyse des familles de la chaîne variable β utilisées pour la formation du TCR (TCRBV). Les analyses ont été effectuées à partir de 3 culots de 5000 cellules issues de lignées CD4, CD8 et DP d’un patient.
Afin de mettre en évidence la présence de lymphocytes T DP au niveau de la peau, nous avons utilisé des biopsies cutanées congelées de patients atteints de sclérose systémique et de donneur sains. Les biopsies ont été découpées en sections de 5-μm d’épaisseur et nous avons effectué un triple marquage par immunofluorescence (CD4, CD8α et ADN). Les coupes ont ensuite été analysées par microscopie confocale.
2.4. Résultats
Nous avons mis en évidence une population de lymphocytes T CD4+CD8+ DP dans les cultures issues du sang et de la peau de patients et de contrôles. Les lymphocytes issus de patients se distinguent par une plus importante production d’IL-4. Celle-ci était particulièrement évidente chez les lymphocytes T CD8+ et DP.
Nous avons pu démontrer que les lymphocytes T DP expriment les co-récepteurs CD4 et CD8 tant au niveau de l’ARN que de la protéine, que cette expression n’était pas due à une contamination par le transfert entre des cellules CD4 et CD8 SP. Nous avons pu mettre en évidence une activité helper et cytolytique des lymphocytes T DP au niveau clonal, démontrant la fonctionnalité des deux co-récepteurs.
Nous avons mis en évidence une distribution oligoclonale de toutes les lignées de lymphocytes T issues de la peau. De plus, les lymphocytes T DP utiliseraient des familles particulières du TCRBV qui n’étaient pas présente chez les lymphocytes T CD4+ et CD8+ SP.
Finalement, nous avons pu mettre en évidence la présence de lymphocytes T CD4+CD8+ DP directement dans la peau de patient atteint de sclérose systémique par microscopie confocale, permettant d’exclure un biais de culture.
2.5. Conclusion
Les lymphocytes DP ont été décrits dans plusieurs pathologies et chez les donneurs
sains par plusieurs auteurs. Les lymphocytes DP que nous avons étudié se distinguent par plusieurs aspects :
• Ils expriment les deux co-récepteurs à des hauts niveaux, alors que dans les autres études, l’expression d’un des deux co-récepteurs était faible.
• Ils expriment à la fois les chaînes α et β du CD8, suggérant que les lymphocytes DP présents dans la peau de patients atteints de sclérose systémique sont différents de ceux décrits antérieurement, qui n’expriment que l’isoforme α/α du CD8, comme les T CD4+ SP qui acquièrent un co- récepteur CD8.
• La double positivité, n’est pas due à un transfert passif des co-récepteurs entres lymphocytes SP.
• Nos analyses du TCR indiquent que les lymphocytes DP ont une origine différente de celles des lymphocytes T CD4+SP et CD8+SP.
L’origine des lymphocytes T DP reste toutefois à préciser. On pourrait spéculer qu’à l’origine, les lymphocytes T DP n’expriment qu’un seul co-récepteur, et qu’ils n’ont pas été sélectionnés négativement lors de la maturation thymique en raison de l’affinité trop faible pour l’antigène du soi de ce premier co-récepteur. L’expression secondaire du deuxième co-récepteur, intervenant après cette sélection, serait responsable de l’auto-immunité. Alternativement, la double positivité ne serait acquise qu’en périphérie après stimulation répétée. En effet la plupart des lymphocytes T DP ont été décrits dans des conditions d’inflammation chronique.
Quelle que soit leur origine exacte, la mise en évidence des lymphocytes T DP au niveau du sang périphérique et de la peau in situ par microscopie confocale permet de prouver l’existence des ces cellules in vivo et d’écarter le biais de culture. Leur présence au niveau des lésions cutanées, leur capacité unique à exercer à la fois une activité helper et cytolytique, de produire d’importantes quantités de cytokines profibrotiques comme l’IL-4 ainsi que leur capacité à inhiber la production de métalloprotéinases par les fibroblastes, suggère un rôle important dans le développement de la sclérose systémique.
De plus, chez certains patients atteints de sclérose systémique, on observe des auto- anticorps dirigés contre des protéines du soi générées lors de l’apoptose induite par les
granules cytolytiques. De part leur activité cytolytique, les lymphocytes T DP pourraient participer à une modification post traductionnelle des protéines du soi, qui favoriserait leur antigènicité.
Sur la base de ces découvertes, il serait possible d’envisager comme approche thérapeutique une immuno-modulation afin de favoriser une réponse de Th1 en diminuant la réponse de Th2. Cela pourrait aboutir à la diminution de la production et la déposition de matrice extracellulaire par l’effet négatif de l’INF-γ sur la synthèse de collagène. Une approche de ce type est couramment exploitée dans l’immunothérapie spécifique pour diminuer les symptômes de rhino-conjonctivite et de l’asthme vis-à- vis de plusieurs allergènes chez les patients atopiques. En effet, l’IL-4 semble être un médiateur commun à l’asthme et à la sclérose systémique. Il est cependant essentiel de considérer les importantes différences qui existent entre ces deux pathologies, et l’impossibilité à l’heure actuelle d’identifier un auto-antigène principal à utiliser pour l’immunothérapie de la sclérose systémique. Il est donc nécessaire que de futures investigations s’attachent à déterminer l’étendue exacte du rôle biologique des lymphocytes T DP dans la pathogenèse de maladies auto-immunes comme la sclérose systémique et leur relation avec d’éventuels auto-antigènes.
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Autoimmunity Reviews 3(2004)215–220
1568-9972/04/$ - see front matter䊚2003 Elsevier B.V. All rights reserved.
CD4 q CD8 q double positive ( DP ) T cells in health and disease
Yann Parel, Carlo Chizzolini*
Division of Immunology and Allergy, Department of Internal Medicine, Geneva University Hospital, 1211 Geneva 14, Switzerland Received 2 July 2003; accepted 3 September 2003
Abstract
The expression of CD4 and CD8ab co-receptors on mature T cells is generally considered to be mutually exclusive and reflects subset-related, specific functions (helper vs. cytolytic)and differences in major histocom- patibility complex-restriction for antigen recognition. However, double positive(DP)T cells expressing both CD4 and CD8 have been described in several pathological conditions as well as in normal individuals. DP T cells represent a heterogeneous population. Strong evidence indicates that in vivo terminally differentiated effector CD4 may acquire the a-chain of CD8. Reciprocally, in vitro activation of CD8qT cells results in the expression of low levels of CD4 that may mediate HIV entry and responses to chemotactic cytokines. Particularly intriguing, a subset of DP T cells expressing high levels of both CD4 and CD8ab heterodimer (CD4 CD8hi hi), has been identified in autoimmune and chronic inflammatory disorders. While no definitive proof exists, it could be speculated that CD4 CD8 T cells may be endowed with auto-reactivity due to faulty thymic selection.hi hi
䊚2003 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: Dual positive T cells; Auto-immunity; Inflammation; CD4; CD8
1. Introduction to CD4HCD8Hdouble positive T cells
Committed lymphoid progenitors that enter the thymic cortex do not express either the T cell receptor (TcR) or the CD4 and CD8 co-receptors.
Once productive TcRaandbchain rearrangement is achieved, the affinity of TcR for the major histocompatibility complex (MHC)is sequentially tested. First, the cells express both CD4 and CD8 and become double positive (DP). DP cells bear- ing TcR with appropriate affinity for MHC–pep-
*Corresponding author. Tel.:q41-22-372-9370; fax:q41- 22-372-9418.
E-mail address:
chizzolini@medecine.unige.ch(C. Chizzolini).
tide complexes presented on cortical epithelial cell are positively selected, differentiate into CD4qor CD8qsingle positive(SP) cells and migrate into thymic medulla. TcR affinity is tested again and cells whose affinity for MHC–self-antigen com- plexes on dendritic cells is too high are negatively selected and undergo apoptosis. Surviving cells then exit the thymus as mature, naive T cells.
Three models have been proposed to explain how immature DP thymocytes lose one co-receptor and become mature SP T cells: (i) The instructional modelproposes that the proper co-receptor is maintained during positive selection based on rec- ognition by TcR of class I or class II MHC molecules.(ii) For the stochastic modelimmature DP cells randomly extinguish the expression of
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Fig. 1.(A)Schematic representation of the origin of CD4qCD8qDP T cells.(B)Cytofluorimetric analysis of PHA-blasts showing the presence of cells coexpressing high levels of CD4 and CD8a(1)as well as of CD4 and CD8b(3). These cells correspond to the CD4 CD8 subset. The squarehi hi (2)gates CD4 CD8 cells. These cells express low levels of CD8ahi lo but not CD8b.
either CD4 or CD8 co-receptor and only cells with proper combination MHC-IyCD8 or MHC-IIyCD4 survive. (iii) Finally, the asymmetrical model pro- poses that the requirement for CD4 or CD8 lineage commitment may be different and the intensity and duration of TcR–MHC interaction will deter- mine which co-receptor is maintained. For a recent review see Ref. w1x.
While the principal pathways of thymic selec- tion lead to SP mature T cells, the demonstration in the periphery of T cells expressing both CD4 and CD8 (DP) raises the question whether DP cells may also leave thymus as mature cells.
Alternatively, SP T cells should acquire the other co-receptor in response to stimuli received during productive immune responses(Fig. 1A).
2. The CD4 and CD8 molecules
The CD4 receptor is made of a single polypep- tide. CD4 gene expression is mainly regulated at transcriptional level and controlled by a promoter, two enhancers (one proximaland one distal) and a silencerw2x. The lineage specificity of CD4 gene expression does not reside in the promoter but rather in the silencer region that is differentially regulated throughout T cell maturation and lineage commitment by severalcandidate transcription fac- torsw2,3x. In addition, epigenetic silencing of CD4
gene is required to extinguish CD4 gene in CD8 SP T cellsw4x.
In peripheral SP CD8 T cells, the CD8 receptor is expressed as an ab disulfide-bonded heterodi- mer, whereas gdq T cells, NK T cells and intra- epithelial lymphocytes express CD8 as an aa homodimer. Theaandbchains are coded on two different, physically linked genes on human chro- mosome 2. Although the regulation of CD8 genes is incompletely understood, it is known that CD8a mRNA can be detected in CD4 SP T cells upon activation, usually in the absence of protein expres- sion w5x.
CD4 and CD8 co-receptors participate in T cell activation by increasing the affinity of TcR for the MHC–peptide complex. In addition, CD4 and CD8a chains enhance intracellular signaling initi- ated by TcR engagement through recruitment of p56lck w6–8x. The role of CD8b chain is still debated, but evidence indicates that it may con- tribute to signaling by recruiting CD3yTcR com- plex into lipid rafts, i.e. into supramolecular, membrane-associated complexes poised to favor the intracellular propagation of signalsw9x. 3. Heterogeneity of mature DP T cells
Peripheral DP T cells are heterogeneous in their expression of CD4 and CD8 molecules. On the
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basis of cytofluorimetric data, DP T can be sub- divided into cells expressing high levels of CD4 (CD4hi) and CD8a, cells expressing CD8ab and low levels of CD4 (CD4lo), and finally cells expressing high levels of CD4 as well as CD8ab.
In CD4 CD8ahi cells, CD8 expression is usually of low intensity(CD8lo). Owing to this characteristic, they can be distinguished from CD4 CD8abhi in which the CD8 signalis of high intensity(CD8hi) (Fig. 1B). In vitro studies have provided elements to understand the origin of some of these cells.
Thus, purified CD4qT cells when cultured in the presence of interleukin-4 (IL-4) express at their surface thea-chain of CD8w10x. CD8aexpression appears to be stable and endows the cells with clonally distributed cytolytic capacity. Of interest, the cytotoxicity is blocked by anti-CD8 mAb, thus indicating that CD8a has functionalactivity in CD4 CD8hi lo DP cells w11,12x. The CD8a gene is normally transcribed but not translated in CD4 T cells undergoing activation. Thus, the expression of the CD8a protein on the cell surface requires activation of translation, a phenomenon that has not been experimentally documented. Two studies have attempted to investigate the in vivo origin of CD4 CD8hi lo DP cells in different clinical settings.
Both concluded that the terminally differentiated CD4q T cells may have stable expression of CD8aa w13,14x One of the studies identified 46 individuals, representing 0.1% of all FACS deter- minations over a period of 6 years with high numbers of CD4 CD8hi lo (aa) DP cells in periph- eral blood. The clinical presentation ranged from normal individuals to individuals with neoplastic, infectious and autoimmune disorders w13,14x. According to TcR analysis in T cell subpopula- tions, the authors concluded that DP T cells shared TcR with CD4 and not with CD8 SP T cells. The CD4 CD8hi lo (aa) DP cells were CD28 negative, an additionalproof of terminaldifferentiation.
Thus, it can be tentatively concluded that CD4 CD8hi lo (aa) DP cells represent a subset of terminally differentiated effector CD4qT cells.
When activated in vitro via TcR cross-linking, SP CD8ab T cells (CD8hi) may become capable of expressing low levels of CD4 expression (CD4lo) w15,16x. Upon CD4 acquisition, CD8 T cells become susceptible to HIV infection and, in
addition, become responsive to IL-16 a chemotac- tic cytokine whose receptor is the CD4 molecule w17x. While it has been proposed that CD4 mole- cule expression in CD8ab T cells is mediated by silencing of the CD4 gene silencer w16x, experi- mentalevidence in support of this hypothesis is still awaiting. Furthermore, no studies have addressed the in vivo origin of CD8ab T cells expressing CD4 .lo
An additionalintriguing subset is represented by T cells expressing high levels of both CD4 and CD8ab (CD4 CD8hi hi). These cells appear to be present at very low frequencies in peripheral blood of normalindividuals and at higher frequencies in some auto-immune diseases (w18–21x and Parel and Chizzolini, unpublished).
4. CD4CD8 DP T cells in pathological conditions
Severalpathologicalconditions are character- ized by the presence in the peripheralblood of DP T cells. Their frequency is particularly increased in autoimmune diseases and their specific charac- teristics are summarized in Table 1. Unfortunately, most investigators have not attempted to distin- guish between DP T cells expressing the CD8aa and those expressing the CD8ab co-receptors. Of interest, DP T cells are present in the target organ of severalauto-immune conditions, namely, the thyroid gland in auto-immune thyroiditis w22x, the skin in atopic dermatitisw19x, in systemic sclerosis w21x and in the fluid of joints from rheumatoid arthritis patients w23x. The presence of DP T cells in target organs may suggest their involvement in pathogenetically relevant events. Furthermore, the percentage of circulating DP T cells has been reported to inversely correlate with platelet counts in idiopathic thrombocytopenic purpuraw24x. Sim- ilarly, higher numbers of DP T cells correlated with poor prognosis in Kawasaki disease w20x. However, studies linking functional characteristics of DP T cells with physiopathology are lacking.
A distinct exception is the documented capacity of CD4 CD8hi lo DP T cells infiltrating a cutaneous T cell lymphoma to exert a tumor-specific MHC- class-I restricted lysis w25x. This result suggests that indeed DP T cells may recognize nominal
