Thesis
Reference
Regulation of acetyl-CoA carboxylase gene expression by nutrients in the pancreatic β-cell
BRUN, Thierry
Abstract
Nous avons affiné un modèle métabolique proposant que le malonyl-CoA agit comme un facteur de couplage métabolique lors de la sécrétion d'insuline induite par les nutriments dans la cellule pancréatique β. La concentration intracellulaire de malonyl-CoA résulte de sa formation par l'acétyl-CoA carboxylase (ACC) et de son utilisation par l'acide gras synthétase (FAS) pour la synthèse des lipides. Nous avons étudié l'expression de ces enzymes dans la cellule β et, d'une manière plus approfondie, la régulation à court et à long terme de l'ACC.
Nous avons également cherché à mieux comprendre comment les nutriments, en particulier les hydrates de carbone et les acides gras, modulent l'expression génique d'enzymes-clés du métabolisme intermédiaire, impliqués dans le système de transmission de signaux de la cellule β et dans la régulation de la sécrétion d'insuline.
BRUN, Thierry. Regulation of acetyl-CoA carboxylase gene expression by nutrients in the pancreatic β-cell. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 1994, no. Sc. 2680
DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:104839
Available at:
http://archive-ouverte.unige.ch/unige:104839
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Division de Biochimie Clinique
Professeur Jacques Deshusses FACTJLTE DE MEDECINE Professeur Claes Wollheim Dr. Marc Prentki
REGULATION OF ACETYL - COA CARBOXYLASE GENE EXPRESSION BY NUTRIENTS
IN TIIE PAI\CREATIC B-CELL
TIIESE
présentée à Ia Faculté des Sciences de I'Université de Genève pour obtenir
le grade de Docteur
èsSciences, mention Biochimique
Thierry BRUN
de
Oulens / Echallens (VD)
Thèse No 2680
GENEVE
1994
par
codirecteurs de
thèse,J.
DESHUSSES, professeurordinoire et répondont devonf
lo Foculté des Sciences (Déportementde
biochimie) et J, GIRARD, professeur (Centrede
Recherche sur l'Endocrinologie Moléculolreet le
Développement-
CNRS, Meudon- Bellevue), outorise l'impressionde lo
présente thèse, sons exprimerd'oplnion
sur les propositlonsquiy
sont énoncées.Genève,le 25 moi i994
Thèse - 2680 -
Le DOyeî,
Pierre MoEsCHtERCe travail a été
réaliséà ta Division de Biochimie Clinique de la Faculté
deMédecine, et j'aimerais tout d'abord remercier son directeur, le Professeur
Claes Wollheim, dem'avoir
accueilli dans ses laboratoires.Mes
plusvifs
remerciements reviennentau Dr. Marc Prentki, mon directeur
de thèse,pour sa
confiance,sa
disponibilitéet
son soutienattefiif et
exigeant.Il a su
me ffansmettre son enthousiasmepour la
rechercheet a veillé
avecsoin à la
qualitéde
maformation
scientffique.Je remercie
égalementIe
Professeur Jacques Deshusses,du Dépanement
de Biochimiede la
Faculté des Sciencesde
Genève,d'avoir
acceptéd'être mon
répondant auprès d.ela
Faculté des Sciences et departiciper
aujury
de thèse. Son appui scientifiqueet
SeS conseils durant cette thèSe m'ont étéd'wte
grande utilité.Je remercie le Professeur Jean Girard
du
Centre de Recherche sur I'EndocrinologieMoléculaire et
le Développement, Centre notional dela
Recherche Scientifique, Meudon- Bellevue, France,d'avoir
accepté d'être membreduiury
de thèse.Je
tiens chaleureusementà
remercier les membres du groupedu Dr. Prentki,
quipar
leurs rtches personnalités ont su créer une atmosphère très agréable:
lefutur
docteurGny,
Blancheet
ses croissants,Blaise, Carine,
Isabelle,Luis,
Solangeet
Stéphane. Jeremercie particulièrement
Marie-HétèneBeuchat et Dominique Duhamel pour leur
excellenttravail
technique; leur contrtbutiona
été importante dans ceffavail
d'ëquipe. Je remerciele Dr.
Enrique Roche, monami, pour
ses conseils scientffiqueset spoftifs,
sa gentillesse et sa grande disponibilité.Je remercie tous les
membresde la Division de Biochimie Clinique et
duLaboratoire de
Recherches Métaboliquespour leur disponibilité et leur
assistance, enparticulier le Dr.
Françoise Assimacopoulos-Jeannet et leDr.
Romano Regaaipour
leur intérêt et leur collaboration scientifique enrichissante.Je remercie te Fond National Suisse
pour
la Recherche Scientifique etla
FondationSir Jules Thorn de leur support financier
qui
a permisla
réalisation de ce travail.A Nathalie
A
mesparents
CONTENTS
ABBREVIATIONS
RF"ST'MESIJMMARY
3. Carbohydrate
regulationof
gene expressionin higher eukaryotic
cellsA.
Carbohydrate controlof
gene transcriptionB.
Modificationof
mRNA processing by carbohydratesC,
Stabilizationof
mRNA by carbohydrates4. Fatty
acidscontrol ofgene
expressionin
bacteria and yeastA.
Transcriptional regulation of lipogenic genes in bacteriaB.
Inhibitionof
enzymes involvedin lipid
metabolismin
yeastC.
Induction of peroxisomal genes by fatty acids in yeastp.6 p.7
ORGAI{IZATION
OFTIIE
THESISp.22
AIMS OF TIIE INVESTTGATION p.23
INTRODUCTION
Part I : Regulation
of gene expressionby nutrients
:role of
carbohydrates andfatty
acids1. Introduction
A.
Nutrient receptors andmetabolism p.24
B.
Elementsof
genetic control by neuro-hormonal factors andnutrients p.26
2. Carbohydrate regulation of
gene expressionin
yeastA.
Carbohydrate controlof GAL
genes transcriptionB.
Glucose repressionof
other genesC.
Glucose inductionof
glycolytic genesp.
19p p.
p.
p.28 p.32 p.32
p.
p.
p.
34 39 39
42 44 45
5. Fatty
acidscontrol of
gene expressionin higher eukaryotic
cellsA.
Inhibitionof
hepatic lipogenesis by polyunsaturated fatty acidsB.
Induction of genes by fatty acids6. Nutrient regulation of insulin
gene expressionINTT,ODUCTION
Part II : Coupling
mechanismsin
the actionof nutrients
oninsulin
releasein
pancreatic f|-cell1.
The pancreatic R-cell andits
rolein fuel
homeostasisA.
The islet of LangerhansB.
The secretory PathwaYC.
Insulin action and glucose homeostasis2. Cetlular
signallingin insulin
release3.
The metabolic coupling factorsin
thefl-cell
4. Potential target
effectorsof
long chain acyl-CoA estersMATERIAI.S AND METHODS 1.
CeII cultures2. Inzulin
secretion3. RNA extraction
andNorthern blot
4. Protein extraction from rat
tissues and islet isolation5. Acetyl-CoA
carboxylase analysisA.
IntroductionB.
ACC mRNA analysis57 59 60 p.
p.
p.
p.
62p.46 p.54 p.
55p.
65p.
68p.70
p.
70p.7l p.7r
p p
72 73
C. ACC "run-on"
transcription assayD.
Short+erm transfectionE.
ACC protein analYsisF. ACC
enzymatic activity measurements6. Fatty
acid synthase analYsisA.
FASnRNA
analYsisB.
FAS enzymatic activity measurements7.
Glucose measurements8.
Glucose-Gphosphate measurements9. Fatty
acid measurementsRESULTS
I. Nutrient regulation of
pancreatic B-cell signaltransduction
:role of acetyl-CoA
carboxylase andfatty
acid synthaseII.
Glucose regulatesacetyl-coa
carboxylase gene expressionin
a pancreatic f!-cellline (INS-l)
III. Long chain fatty
acidsinhibit acetyl-coa
carboxylase gene expressionin the
insulin-secretingll-cell
line INS-1CONCLUSIONS
AIYD PROSPECTWESREFERENCF.S
p.73 p.74 p.74 p.75
p
p76 76
p.77 p.77 p.
78p.79
p.
111p.
128p.
132p.
103ABBREVIATIONS
ACC ATP bp BSA
CAT Caz+
cAMP CoA CPT
I
ENO FAS Glc Gln Hepes ICRE
ç*
KRB I-eu
ME NADH OLEl
PAGE PC PDH PFK PGKPMA
PKPOTl RIA
T3 Tris UASacetyl-CoA carboxylase 5' -adenosine triphosphate base pair
bovine serum albumin
chloramphenicol acetyl transferase calcium ion
cyclic adenosine
3'
5'-monophosphate coenzymeA
carnitine palmitoyl-transferase
I
enolase
fatty acid synthase glucose
glutamine
2-hydroxyp iperazine 2-ethanosulfonic acid inositol/choline responsive element
potassium ion
Iftebs-Ringer bicarbonate leucine
malic enzyme
nicotinamide adenine dinucleotide (reduced form) ô-9 fatty acid desaturase gene (yeast)
polyacrylamide gel electrophoresis pyruvate carboxylase
pyruvate dehydrogenase phosphofructokinase
phosphoglycerate kinase (yeast) phorbol l2-myristate l3-acetate pyruvate kinase
peroxisomal gene (yeast) radioimmuno assay
3,
5, 3'-triiodo-L-thyronine
tri(hydroxymethyl) methylamine upstream activation sequenceREST]ME
La
cellule pancreatique B possMeun
système de transmission des signaux unique carle
glucose et d'autres nutriments doivent être métaboliséspour induire la
sécrétion deI'insuline. D'autre part, le
glucoseet
les acides grasont
des effetsà long
terme sur lacellule
B. Iæ glucose stimulela
croissance etla
prolifération des cellules B et I'exposition prolongée des cellulesli aux
acides grasdiminue la
sécrétiond'insuline induite par
leglucose. [æs
facteursde
couplage métabotiqueliant le
métabolismedu
glucoseet
la sécrétion d'insuline sont méconnus, de même que les gènes impliqués dans les changements phénotypiques tardifs de la cellule 0 induits par les nutriments. Notre laboratoire a formuléune
hypothèse suggérant que certains dérivésdu
coenzymeA (CoA)
pourraient être des médiateurs intracellulaires dans I'action des nutriments surla
sécrétion deI'insuline.
Ainsi des résultats expérimentaux publiés nous ont permis de proposer un modèle, selon lequel le glucose augmente le malonyl-CoA, lequel en inhibant I'oxydation des acides gras provoque une augmentation des acyl-CoAsà
longue chaîne carbonée dansle
cytoplasme. Les acyl- CoAs seraient ainsi des facteurs de couplage métabolique effecteurs, permettant I'activationde la
protéine kinaseC via
I'augmentationdu
diacylglycérolou
induisantI'acylation
de protéines impliqufus dans l'exocytose de I'insuline.BUT DE LA RECHERCHE
I-e
premierobjectif
de cette recherche étaitd'affiner un
modèle proposant que lemalonyl-CoA agit comme un facteur de
couplage métaboliquedans la cellule B.
I-a' concentrationintracellulaire de malonyl-CoA
résultede sa formation par
l'acétyl-CoA carboxylase(ACC)
et son utilisation parla fatty
acid synthase(FAS)
pourla
synthèse deslipides.
Plus précisement, mes travaux ont consisté dans l'étude à court et à long terme de ces enzymes dansla
cellute B, en particulierI'ACC.
Iæ secondobjectif
de cetravail
étaitde mieux
comprendre commentles
hydratesde
carboneet les
acidesgras
modulentI'expression
d'enzymes-clésdu
métabolisme intermediaire dansla cellule B. Pour
les raisons citées auparavant, notre choix s'est porté surI'ACC.
INTRODUCTION
La
première partie de I'introduction est une revue dela
regulation de I'expression génique par les nutriments dans les cellules eukaryotes. Cette revue traite dela
régulation génique par les hydrates de carbone et les acides gras dans la levure et dans les eukaryotes supérieurs.Ia
deuxièmepartie de I'introduction
concernele rôle de I'insuline
dans l,homéostasiedu
glucoseet des
systèmesde
transmissionde
signaux dansla
cellule pancréatique B.Les facteurs de couplage métabolique dans
la
cellule pancréatique RL'activité
de la cellule pancreatique P est modulee par de nombreux agents tels des neurotransmetteurs, des hormones et divers nutriments.La
sécrétion d'insuline joue un rôle central dans I'homéostasie du glucose et des altérations fonctionnelles de la cellule0
sont lacause de désordres métaboliques, tels que les diabètes de types
I et2. L'llot
de Langerhans estun
microorgane de 0. L-0.2
mm de diamètre,qui
"mesure" constamment I'ensemble des nutriments circulants dansle
sangà un instant
donnépour
sécréterf insuline
enfonction
des besoinsde
I'organisme.I"e
glucoseest le
régulateur prédominantde la
sécrétiond'insuline,
mais d'autres nutriments,divers
acides aminés, acidesgras,
céto- acides et corps cétoniques sont aussi capables d'induire le processus de secrétion d'insuline.On
sait queles
nutriments doivent être métabolisésà I'intérieur
dela cellule B
dans le cytoplasmeet les
mitochondriespour induire la
sécrétionde I'insuline, alors que
les neuromodulateursfont varier la
sécrétiond'insuline suite à leur interaction avec
desrécepteurs membranaires spécifiques.
Ia
nature exacte des signauxou
facteursde
couplage métaboliquequi relient
le métabolisme du glucose au relâchement d'insuline par exocytose n'est pas encore connue.Une des questions centrales dans le champ de
la
sécrétion deI'insuline
est doncd'identifier
ces facteurs de couplage métabolique. Iæ mecanisme conduisant au relâchement d'insuline
le
plus accepté dansla
littérature est celui oùla
stimulation dela
cellule Bpar le
glucose augmentele flux
glycolytique et active des déshydrogénases mitochondriales, telles que la pyruvate déhydrogénase@DH).
L'activation de ces voies métaboliques augmente le niveaud'ATp
cytoplasmique, ce qui permetla
fermeture des canaux potassiques modulés par cesnucléotides, une
dépolarisationde la
membraneplasmique, I'ouverture des
canaux calciques dépendantdu voltage et enfin une
augmentationdu calcium 1Ca2+; tbre
cytoplasmique qui induit la'
sécrétionde I'insuline.
Cependant,différentes
étudespharmacologiques récentes
ont démontÉ que le glucose contrôle aussi la
sécrétiond'insuline par un
mécanismequi
est indépendant des changementsd'activité
des canauxpotassiques
et
del'élévation du Ca2* libre
intracellulaire. L'augmentationdu Ca2*
est certes nécessaire pourinduire la
secrétion partielle deI'insuline
mais n'explique en aucun casf
induction maximale de la sécrétion d'insuline par le glucose. Des facteurs de couplage métâbolique autres queI'ATP
et des messagers secondaires autres quele Caz+
sont donc nécessaires pour induirela
sécrétion maximale def
insuline.euels
sontles
facteursde
couplage métabolique potentiels impliquéslors de
la secrétion d'insuline induite par les nutriments ? Comme les nutriments sont métabolisés par desvoies
distinctes,il
est hautement probable que les facteursde
couplage métabolique soient des molfuules riches en énergie, communes à toutes les voies métaboliques et dontle niveau reftète l'état
énergétiquede la cellule B. Ceux-ci peuvent donc inclure
des nucléotides tels queI'ATP, l'état
rédox dela
celluleou
des dérivésdu CoA. En
ce qui concerneI'ATP et I'ADP, il n'a
pas encore été démontrequ'ils sont les
modulateurs physiologiquesdu
canal potassique. Quantà l'état redox, on
sait depuisde
nombreuses années quele NADH
total dela
cellule B augmente rapidement, suite àla
stimulation descellules B par divers
nutriments.Mais on ne sait pas si
I'augmentationde l'état
de réduction des nucléotides pyrimidiniques module directement des effecteurs de transductionou
simplement reflète l'étape nécessaire précedantà
I'augmentationdu
rapportATP
surADP de la
cellule IJ.La
troisième classe de composés riches en énergiequi n'a
pas été étudiée dansl'îlot jusqu'à
présent, maisdont on sait qu'elle joue un rôle-clé
dans le métabolisme intermédiaire, comprend les dérivés du CoA.Modèle métabolique
Le Dr Marc Prentki a
proposéen
collaborationavec le Dr
BarbaraCorkey
à Boston, d'ajouter une nouvelle voie au système de transmission métabolique de la cellule B.Dans ce modèle, le malonyl-CoA et les esters à longue chaîne carbonée du CoA pourraient
être,
commeI'ATP, d'importants
facteursde
couplage métabolique impliqués dans la sécrétion d'insuline induite par les nutriments. Quels sont les caractéristiques de ce modèle? I-e glucose est métabolisé dans la voie glycolytique pour produire de
I'ct-glycérophosphate et du pyruvate. Læ pyruvate est alors métabolisé dans
la
mitochondrie, cequi accélère la production, d'une part d'acétyl-CoA par la PDH, d'autre
partd'oxaloacéûate grâce à
I'action
de la pyruvate carboxylase(PC).
Iæ résultat de cette action anaplérotique consiste en une augmentation des intermédiairesdu cycle
de Krebs. Ainsi,une augmentation du glucose extracellulaire est signalée à
f
intérieur dela cellule,
dans la mitochondrie, par une accélération de la production d'acétyl-CoA pour fabriquer deI'ATP, et une
augmentationdu citrate. Le citrate, une fois
abondant,peut s'échapps de
la mitochondriepour participer à des
réactionsde
biosynthèse cytoplasmiques.Dans
lecytosol, le citrate libère de I'acétyl-CoA,
grâceà I'action de la citrate lyase, puis
est carboxylé en malonyl-CoA, suite àI'action
deI'ACC,
l'étape limitante dela
biosynthèse deslipides.
Dansce
modèle,le
malonyl-CoAjoue un rôle critique en inhibant
l'étapelimitante du
catabolisme des acides grasvia la
carnitine palmitoyltranferaseI (CPT
D, commecela a été
démontré dansle foie par McGarry et Foster. Par
conséquent, lemalonyl-CoA
causeraitune
diversiondes acyl-CoA à
longue chaîne carbonéede
leur oxidation dansla
mitochondrie vers des voies de biosynthèse tellesque la formation
delipides complexes ou I'acylation de protéines effectrices. Iæs lipides
complexes comprennentle
diacylglycérol etl'acide
phosphatidiquequi
agiraient comme des seæonds messagers et activeraient des protéines kinases impliquées dans I'exocytose. Ces processus concommittant avec I'augmentationd'ATP
pourraientêtre
impliquées dansla
sécrétiond'insuline.
Diverses predictionsde ce
modèleont été vérifiées et
publiéespar
notre laboratoire. Premièrement, les intermédiaires du cycle de Krebs sont élevés en présence de glucose. Deuxièmement,le
glucose et d'autres nutriments augmentent considérablement lemalonyl-CoA, cette
augmentationprécède la sécrétion d'insuline.
Troisièmement,I'oxidation
des acides gras est inhibee. Quatrièmement, les niveaux des acyl-CoA à longue chalne corrèlent avecla
secrétion d'insuline induite par les nutriments. Cinquièmement, les niveauxdu diacylglycérol et de l'acide
phosphatidique augmententet
sixièmement les acides gras saturés exogènes potentialisent la sécrétion d'insuline induite par le glucose.Ce
modèle présente I'avantage depouvoir
être testé expérimentalementet
intègreI'action
de tous les nutrimentsqui
stimulentla
cellule B, tels que les hydrates de carbone,les
céto-acides commele
pyruvateet
I'a-cetoisocaproate,les
acides aminés (leucine, glutamine)qui
sont directement métabolisés dans la mitochondrie et enfin les acides gras.RESTJLTATS
Rôle de |tacétyl-CoA
carboxylasedans le
système detransmission
dessignaux de
la cellule BNous pensons que
le
malonyl-CoA est un facteur de couplage métabolique dans la cellule pancréatiqueB.
Comme sa concentration résulte deI'equilibre
entre sa productionpar
I'ACC et
son utilisation parla
FAS pourla
synthèse deslipides,
nous avons souhaité caractériser ces enzymes dansla cellule fl.
Dansla
premièrepartie
des résultats, nous avons mesuréle
transcritou ARNm, la
protéine etI'activité
enzymatique deI'ACC
dans différents tissus derats,
ainsi que dans lesîlots
de Langerhanset
les cellulesfl
clonalesHIT.
Nous avons observé que['ACC
est expriméeà
des niveaux appréciables dans les cellulesIl.
Ce niveau est comparable à celui d'un tissu lipogénique comme le poumon et est plus élevé que celui d'autres tissus tels quele
pancréastotal, le
coeur etla
rate. De plus, nous avons montré queI'activité
de I'enzyme est activée à court terme par le glucose; cette augmentationprécMe ou
coincide avecI'initiation de la
sécrétiond'insuline. L'activité
enzymatiquede I'ACC
est contrôléede
façondifférentielle par le jeûne
dansles
tissus lipogéniqueset l'îlot
de Langerhans.En effet,
unjeûne de 48 h diminue
fortement les activités enzymatiques hépatiques et pulmonaires deI'ACC
alors que celle del'îlot
reste inchangée.Enfin,
nous avons observé que contrairement aux tissus lipogéniques,la
FAS est très faiblement exprimee dansl'îlot
de Langerhans. L'ensemble de cette première série de résultats montre quele
rôle principal du malonyl-CoA dansla
cellule B n'est donc pas de servir de substrat pour la biosynthèse des lipides, maisplutôt d'inhiber I'oxydation
desacides gras.
Induction
du gène deltacétyl-CoA
carboxylasepar
le glucoseComme
le
glucoseinduit
de façon prononcée à court termeI'activité
enzymatique deI'ACC,
nous avons cherché à savoir si cette enzyme est modulee aussi sur le long terme par |e glucose. Nous avons observé quele
glucose est un inducteur majeur du transcrit et de la protéine ACC dans une nouvelle lignée insulino-sécrétoire.Cette lignée
cellulaire
appeléeINS-I,
est dérivéede
tumeurs transplantables ou insulinomesde rats. Les
caractéristiques des cellulesINS-I
sontles
suivantes: a)
Ces cellules ont besoin de 2-mercaptoethanol dans leur milieu de culture pour semultiplier.
b)Elles sont bien
différenciéeset elles prolifèrent lentement. c) Ces cellules ont
descaractéristiques morphologiques typiques de la cellule B normale. Elles sont bien granulées et contiennent
20
% du contenu d'insuline présent dans les cellules B normales derat.
Cettevaleur
est très élevée,car en
comparaison, les lignéesRIN, HIT ou B-TC, qui
jusqu'à présentont été utilisées, ne
contiennentque lVo du contenu d'insuline des
cellules normales.d) Elles
synthétisentla
proinsulineI et 2 et
convertissent ces précurseurs en insuline. e) Mais surtout ces cellules répondent au glucose dans la zone physiopathologique de ce sucre, c'est-à-dire à des concentrations supérieures à 4 mM.Nous avons d'abord étudié par Northern
blot
I'accumulation deI'ARNm
deI'ACC par le
glucose. Une élévation du glucose de5 à 20 mM
augmentede
façon considérable (environ 15fois) le
niveau du transcrit deI'ACC.
Cette induction est détectée après4h,
le temps de latence étant d'environ3h, et
cette induction est maximale à24h. L'induction
alieu
entre5 et2} mM
glucose. Par conséquent, le glucose dans sa zone physiopathologique de concentration est un inducteur puissant du transcrit deI'ACC.
A
quel niveaule
glucoseagit-il ?
Une augmentationdu
niveaud'un ARNm
peut être dueà
une augmentation du taux de transcriptiondu
gène,à
une augmentation de la maturationdu transcrit ou à
uneinhibition de la
dégradationdu transcrit. Nous
avons mesuréle
temps de demi-vie deI'ARNm
deI'ACC
en présence d'actinomycinD
à bas et haut glucose.La
demi-viedu
transcrit est de4h et
n'est pas altéréepar le
glucose. Cerésultat
indique que la
stabilitédu transcrit n'est
pas modifiéepar le
glucoseet
nouspouvons en déduire que
I'effet du
glucose surI'ACC
est probablement transcriptionnel.Nous avons cherché
à
savoirsi le
glucose active directementle taux de
transcription du gènede I'ACC.
Nous avons mesuréle taux de
transcriptiondu
gènede I'ACC,
de la glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase et de I'actine parla
méthode de transcriptton invitro. Alors
que les taux de transcription de la glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase etde I'actine sont
détectableset ne sont pas modulés par le glucose, l'activité
transcriptionnelle
du
gène deI'ACC n'est
pas assez élevéepour être
détectéepar
cette méthode même à haut glucose.Afin
de déterminer si I'accumulation deI'ARNm
deI'ACC
induite parle
glucose a un rôle physiologique dans la cellule B, nous avons mesuré par immunoblot les niveaux dela
protéineACC
dans les cellulesINS-I à
différentes concentrationsde glucose'
Nous avonstrouvé
que l'accumulationde la
protéineACC
est identiqueà celle du
transcrit.L'augmentation
d'ARNm
correspond donc bien à une augmention dela
protéineACC.
Ce résultat suggère queI'effet
du glucose est prétraductionnel,voire
transcriptionnel comme nous I'avons mentionné ci-dessus.Afin de définir si le
glucosea
besoind'être
phosphoryléet
métabolisépar
la glycolyse pour induirele
transcritACC,
nous avons examinéI'action
de divers analogues du glucose. I-es analogues non mélabolisables du glucose comprennentle
2-deoxyglucosequi
est phosphorylé par la glucokinase mais qui n'est pas métabolisé,le
3-O-methylglucose etle
$-deoxyglucosequi
sont rapidement transportés dans les cellules maisqui
ne sont niphosphorylés
ni
métabolisés. Le 2-deoxyglucose induit le transcritACC,
tandis que le 3-O- methylglucoseet le
6-deoxyglucose sont sanseffet.
Ce résultat suggère quele
glucose-6- phosphate pourrait être le médiateur de I'induction du transcrit ACC par le glucose.Afin
de connaîtrela
spécificité deI'effet du
glucose sur I'expressiondu
gène deI'ACC,
différentes classesde
composésont été
testees.Des
acides aminéscomme
la leucine plus la glutamine, I'arginine ou I'acide carboxylique 2-isocaproatequi
sont de bons sécrétagogues sont sans effet sur le transcrit deI'ACC.
De même divers hexoses, pentoseset
disaccharidesn'induisent pas 1'ARNm de I'ACC. Parmi tous les
nutrimentsmétabolisables testés, seul
le
mmnose,qui
estun
épimèredu
glucose phosphorylépar
la glucokinase,induit I'ACC. L'induction par le
glucoseet
ses analogues montre donc un grand degré de specificité.Afin de
preciserquel
métabolite est responsablede
l'accumulationd'ARNm
deI'ACC,
nous avons testéle
mannoheptulose etla
glucosaminequi
inhibentla
glucokinase.Iæ mannoheptulose et la glucosamine suppriment
I'effet
du glucose, suggérant quele
sucredoit être
phosphorylépar la
glucokinasepour induire I'ACC. Le
glucose-6-phosphatepourrait donc être le
métabolite responsablede I'induction du transcrit de I'ACC.
En accord avecle
concept quela
phosphorylationdu
glucose est nécessairepour induire
le gène deI'ACC et
quele
glucose-6-phosphate pourrait êtrele
médiateur deI'induction
deI'ACC
par le glucose, nous avons observé quele
glucose augmente le contenu du glucose- f-phosphate dansles
cellulesINS-I. De plus, le
mannoheptuloseet la
glucosamine, qui tous deux suppriment I'induction deI'ACC
par le glucose, suppriment égalementI'effet
du glucose sur I' augmentation du glucose-6-phosphate.Afin
de trouver quel système de transmission de signaux est impliqué dans I'action du glucose, nous avons testé diverses substances. Une haute concentration de potassium qui augmente considérablement le calcium intracellulaire, l'ester de phorbolPMA qui
active laprotéine kinase C et la forskolin qui
augmenteI'AMPc
provoquentle
relâchement d'insuline mais ne modifient pas le niveau deI'ARNm
deI'ACC. L'action
du glucose n'est donc pas contrôlée par les systèmes de transduction impliquantle Caz+,
la protéine kinaseC ou l'AMPc.
L'ensemble des résultats démontrent queles
systèmes de transmission de signaux impliqués dansI'action
du glucose surla
sécrétiond'insuline et
sur I'expression génique deI'ACC
sont totalement différents. Eneffet, le
glucosedoit
être métabolisé parla voie
glycolytiqueet le
cycle de Krebs pourinduire la
sécrétiond'insuline
suiteà
uneaugmentation du
Ca2+
cytoplasmique, alors que le glucose nedoit
pas être métabolisé au- delà de 1'étape catalysee par la glucokinase pour induireI'ARNm
deI'ACC.
Est-ce que ces
changementsdans le contenu en ACC sont
associésà
desmodifications de
la
sécrétion d'insuline ? Iæs cellulesINS-1
ont été préincubées à5,
11 et20 mM
glucose pendant48 h,
puis incubées pendant30 min à 5,
10et 20 mM
glucose.Nous
avons observé quela
secrétiond'insuline
maximaleà 20 mM
glucosen'est
pas modifiee par la préincubation, mais quela
sé.crétion basaleà 5 mM
glucose augmente enfonction du
glucose présent dansle milieu.
Avec une préincubationà 5 mM
glucose, la réponseau
glucoseest optimale. A
cette concentration, I'augmentationde la
sécrétiond'insuline
entre5 et 20 mM
glucose estd'environ 6 fois. Au contraire, la
réponse au glucose est faibte dans les cellules préincubées à haut glucose. Ce résultat montre pour la premièrefois
qu'une lignée cellulaire insulino-sécrétoire peut relâcherI'insuline
dans la zone physiologique du glucose et de façon comparable aux îlots isolés.Enfin,
nous avons montré quela
sécrétion basaled'insuline à 5 mM
glucose est proportionnelle au niveau dela
protéineACC
dans les cellules préincubeesà
différentes concentrations de glucose. Cette relation linéaireoffre ainsi
une explication possible deI'effet à long
terme du glucose surla
secrétion deI'insuline
et est compatible avec notre modèle proposant queI'ACC
est, au mêmetitre
quela
glucokinase, une enzyme-clé dansle
contrôle dela
sécrétion d'insuline induite par les nutriments.Ainsi,
ces résultats vont dansle
sensd'un rôle pour I'ACC et le
malonyl-CoA dansla
transmissionde
signaux métaboliques de la cellule B.Régulation par
les acides gras delexpression
du gène del'acétyl-CoA
carboxylaseI-a
troisièmepartie
des résultats concernel'étude de I'effet
des acides gras sur I'expressiongéniçe
dansla
celluleB.
Iæs résultats déjà obtenus montrent que certains acides gras inhibentl'action
du glucose sur I'expression deI'ARNm
deI'ACC
et d'autres enzymes de la lipogenèse. En effet, le linoleate, qui est un acide grasde
18 carbones avec 2 double liaisons (C18:2), inhibe à toutes les concentrations de glucose testées (5 à a0 mM) I'accumulationdu transcrit ACC. L'inhibition la plus forte
estobservfu à 0.4 mM
delinoléate, alors que des
concentrations inférieuresà 0.005 mM sont
sanseffet,
cesconcentrations d'acides gras sont physiologiques. Cette
inhibition
est détectable après6
h(le
temps de latence étant d'environ4 h)
et est mocimaleà
12h. La
demi-vie du transcritACC
est de 4 h et n'est pas modifiee par le linoleate. Ce résultat indique quela
stabilité du transcritACC
n'est pas modifié par I'acide gras. Comme pour le glucose,I'effet
de I'acide gras est probablement transcriptionnel.CONCLUSIONS ET
PER.SPECTIVESNous avons apporté des évidences
supplémentairesau modèle
métabolique proposant quele
malonyl-CoA et les esters à longue chalne carbonée sont des facteurs de couplage métabolique dansla
cellule pancréatiqueB.
Nous avons montré queI'ACC
estexprimfu
à des niveaux appréciables dansla
cellule Bet
est activeeà court
termepar
le glucose.De plus,
nous avons observé quela FAS
est très faiblement exprimee dansl'îlot
de Langerhans. Cela suggère que Ie rôle principal du malonyl-CoA dans
la
cellule B n'est pas de servir de substrat pour la biosynthèse deslipides,
mais plutôtd'inhiber
I'oxydation des acides gras, cequi affine
notre modèle métabolique. Ces résultats expliquent d'autrepart pourquoi le
malonyl-CoA augmente rapidementet
considérablementen
réponse auglucose.
I-es
carbonesdu
glucose sont transformésen malonyl-CoA, le
glucose active rapidementl'activité
enzymatique deI'ACC,
enfinle
malonyl-CoA s'accumule caril
n'estque peu ou pas dérivé vers
la
synthèse des lipides. Ces résultats renforcent aussile
concept queI'ACC joue
unrôle
important dansle
système de transmission des signauxinduit
parles nutriments
dansla cellule B. Afin de
compléterle
modèle métabolique,il
seraitintéressant d'étudier le rôle du citrate dans
la
sécrétion d'insuline. Eneffet, le
citrate est le précurseurdu malonyl-CoA et est un
regulateur allostériquepositif de I'ACC. Afin d'étayer le
conceptque l'élévation du niveau des
intermediairesdu cycle de
Krebs(anaplérose) avec une accélération de
la
production d'acétyl-CoA est nécessairepour
la secrétiond'insuline,
différents nutriments seront testés etle
contenu en citrate des cellules B sera corrélé avec la sécrétion d'insuline.Ia
deuxième sériede
résultatsest celle qui a le plus d'implication pour
des recherches futures. Nous avons observé que le glucose dans sa zone physiopathologique de concentrationest un
inducteur puissantdu
gèneet de la
protéineACC
dansla
lignéeinsulino-secrétoire INS-I. L'action du sucre a. lieu probablement au
niveautranscriptionnel. Pour la suite du travail, il s'agira de montrer, en utilisant
desconstructions contenant des régions régulatrices
du
gène deI'ACC
dirigeant I'expression d,un gène contrôle, que le glucose active directementla
transcription du gèneACC.
Cette méthode est eneffet plus
sensible que l'essaide
transcriptionin vitro. Il
faudra ensuiteidentifier les
séquences régulatrices conférantI'induction par le
glucoseet identifier
les facteurs de transcription contrôlant cet effet. Ceci estd'un
interêttÈs
généralqui
dépassele
cadre deI'ACC
et dela
cellule B. Eneffet,
Shih andTowle
etle
groupe du ProfesseurAxel
Kahn ont étudié dansles
hépatocytes les regions régulatrices contrôlantl'action
du glucose surle
gènede la
pyruvate kinase@K) et de S14 (qui
codepour
une protéine impliquée probablement dansle
métabolisme deslipides). Shih et Towle ont
remarqué récemmentqu'il
existe une homologie frappante entreles
séquences5'
regulatrices des gènes PK et S14. Nous avons également remarqué deux séquences semblables dansle
2ème promoteur deI'ACC
et aucune dans le premier promoteur. Nous avons cherché à savoir si ces séquences étaient impliquées dans I'action du glucose surI'induction
del'ACC. Le Dr.
Kim
nous a envoyé plusieurs constructions contenant différentes regions5'
regulatrices dugène liées au gène rapporteur
chloramphenicol acétyltransférase.Ces
constructions contiennent des éléments couvrant 1000 paires de bases en amont du sited'initiation
de la transcriptiondu
gènede I'ACC. En
collaboration avecle Dr
Enrique Roche dans notrelaboratoire, nous avons transfecté les cellules INS-1 avec ces
constructions.Malheureusement, dans
un
système de transfection transitoire,un effet
du glucosen'a
pu être observé. Nous allons dans un proche avenir, tester d'autres constructions contenant de plus larges regions5'
régulatrices du gène deI'ACC ou
étudierI'effet
du glucose sur descellules
transfectéesde
manière stable,ce qui devrait être un
système beaucoup plus sensible.Une autre
observation intéressantequi a, êtê faite est que les
systèmes de transmission impliqués dansI'action
du glucose surla
sécrétion deI'insuline
etle
gène deI'ACC
sont entièrement distincts. Un dérivé non-métabolisé du glucose, le 2-deoxyglucose, qui est phosphorylé par la glucokinase mais qui n'est pas métabolisé au delà de cette étape,induit I'ARNm de I'ACC
mais pasla
sécrétionde I'hormone. Ceci
suggère fortement, mais ne prouve pas, quele
glucose-6-phosphatepourrait
êtrele
médiateur del'action
du glucose.La
prochaine étape est de comprendrele(s)
mécanisme(s) par lequelle
glucose contrôle I'expressiondu
gène.En
particulier,le rôle du
glucose-6-phosphate entant
que médiateur candidat deI'action
du glucose a besoind'être
étudié. D'autres possibilités sont aussi à considérer. Par exemple, les rôles du glucose lui-même, de la protéine glucokinaseou d'une protéine
associéeà la
glucokinasequi pourraient agir comme facteur
de transcription. Des expériences sont envisagées pour évaluer ces différentes possibilités.Il
est admis queles
nutriments apportentà la cellule
l'énergieet les
métabolites nécessairesaux
réactionsde
biosynthèse.Il
apparaîtdepuis
quelquestemps que
lesnutriments
peuvent égalementmodifier
dansles
organismes supérieurs I'expression de gènes codantpour
des enzymesdu
métabolisme.Une
exposition descellules B à
desconcentrations élevees de glucose pendant une longue durée
induit
divers effets, dont une augmentation de la biosynthèse d'insuline, une hypertrophie et une hyperplasie des cellulesÊ, ainsi qu'une sensibilité accrue au glucose pour le relâchement de
f
insuline. Les raisons sous-jacentesà
ces effets sont méconnues.Une
explication possiblede
ces phénomènesinduits par le
sucre est que I'expression de nombreuses enzymes-clésdu
métabolisme est contrôlée par le glucose. On a pu montrer sur les îlots en culture quele
glucose augmente les niveaux desARNm
dela
pyruvate déshydrogénase (sous-unitéEl-a)
et dela
pyruvate carboxylase et diminueI'ARNm
codant pourla
sous-unitéEl-ct
dela
déshydrogénase des cétoacides ramifiés. De plus,le
sucre cause l'accumulation de nombreuses protéines dontles fonctions
sont méconnueset
stimuleà long
termeI'activité de la
glucokinase. De même, nos résultats montrent queI'ACC
est considérablement induite parle
glucose dansla lignée cellulaire p INS-I. Ainsi,
I'ensemblede
nos résultatset ceux de la
littérature démontrent quele
glucose module I'expression de gènes codantpour
des enzymes-clés du métabolisme impliqués dansla
regulation dela
sécrétiond'insuline.
Une identification des protéines induites parle
glucose et l'étude des mécanismespar
lesquelsle
glucose exerce ses effets devraient apporter des éléments importants dansla
compréhension des défauts touchantles
cellulesg de
sujets diabétiqueset
des altérations empêchantune
réponse adaptative normale au glucose élevé,comme
l'hypersécrétion deI'insuline,
l'hyperplasie et I'hypertrophie des cellules P.I-a
troisièmepartie
des résultats concernel'étude de I'effet
des acidesgras
sur I'expression génique dans la cellule B. Nous avons étudié I'action des acides gras, car nous pensonsqu'ils
ont une implication dans le diabète de type 2 associé à I'obésité. Nous avons proposéun
mécanisme expliquantla
réponse altérêo, au glucose dela cellule
B observée chez certains diabétiques detyryZ
obèses. Nous avons montré que, suite à une stimulation dela cellule
Bpar le
glucose,le
malonyl-CoA augmenteet
peutinhiber I'oxidation
des acidesgras.
Ces acides gras pourraient s'accumuler dansle
cytoplasmeet
participer au processus de sécrétion d'insuline. Dans le cas du diabète de Type2
associé à I'obésité, les patients sont hyperlipidémiqueset ont
une réponse attéréeau
glucose.En effet, ils
ne sécrétent plus assezd'insuline.
Nous proposons I'hypothèse quele
taux d'acide gras élevécirculant
dansle
sang aLtèreI'activité
enzymatiqueet
I'expression géniquede
certains enzymes impliqués dansla voie
de synthèsedu
malonyl-CoA, tels quele
transporteur du glucoseGLIJT},la PDH,
la PC et['ACC. Ainsi,
suite à une hyperlipidémie prolongée, le glucosen'arriverait pas à
augmenter suffisamentle malonyl-CoA et n'inhiberait
quepartiellement
I'oxidation
des acides gras. Iæsacyl-coA ne
s'accumuleraient pas dans le cytoplasme et ne pourraient pas induire correctementla
secrétion d'insuline.Basé
sur
I'hypothèseque les
acides graslibres sont
responsablesde I'insensibilité
au glucose des cellules B de certains diabétiques de type2
en inhibant I'expression de gènes codantpour
des enzymes-clés impliquées dansla voie
de synthèse dumalonyl-CoA,
nous avons commencé l'étude del'effet
des acides gras sur I'expression génique deI'ACC
dansla
cellule B. I-es résultats déjà obtenus montrent que certains acides gras inhibentI'action du
glucose sur I'expression deI'ARNm
deI'ACC et
d'autres enzymes dela
lipogenèse.C'est à notre connaissance
la
premièrefois
qu'une action des acides gras sur l'expression génique dela
cellule B est démontrée. Ceci pourraitavoir
des implications dansle
diabète de type 2 et I'obésité où les acides gras et lipides circulants sont élevés.STTMMARY
The activity
of
the pancreatic B-celtof
the isletsof
Langerhans can be modulated by a varietyof
agonists, including neuromodulators and nutrientsto
releaseinsulin
accordingto
the needsof
the organism. Glucose is the pre-eminent regulatorof
B-cell function which promotesinsulin
releasewithin
physiological concentrationsof
sugar. Nonetheless' many additional nutrients, including some amino-acids, keto-acids, ketone bodies and fatty acids also induceinsulin
release.Thus,
the pancreaticislet is a
fuel-sensing micro-organ thatconstantly
"senses"all circulating nutrients. Nutrient
secretagoguespromote
secretionfollowing their intracellular metabolism in the 0-cell; this is different
fromneurotransmitters
that initiate
secretionfollowing binding of the
agonistto the
plasmamembrane receptor.
The precise biochemical nature
of
the signals thatlink
the metabolismof
nutrientsto insulin
releasein
the pancreatic B-cell remainto be defined. We
have proposed andprovided experimental evidence for a model of fuel sensing in which
acyl-CoA compounds,in
particular malonyl-CoA and long chain acyl-CoA esters serye as metabolic coupling factors when B-cells are stimulatedwith
glucose and other nutrient secretragogues.The
hypothesis proposesthat
glucose stimulationof the B-cell
leadsto an
elevationin ATP/ADP ratio with
a resulting closureof K*
channels and a risein
cytoplasmicC&+,
and also
to
an elevationin
malonyl-CoA, whichinhibits fatty
acidoxidation.
The model also predictsthat
the consecutiverise in
cytoplasmiclong
chainacyl-CoA
esters duringnutrient
stimulationis
causally linkedto
the generationof
diacylglycerol and phosphatidicacid that
activates protein kinases,protein
acylation andthe
modulationof ion
channel activities.Acetyl-CoA
carboxylase(ACC)
catalyzes the productionof malonyl-CoA
which may act as a metabolic coupling factorin
nutrient-induced insulin release. Malonyl-CoA isthe first
intermediatein the lipid
biosynthesispathway and also controls fatty
acidoxidation. Its
concentration resultsfrom
the balance betweenits
synthesisby ACC
and usageby fatty
acid synthase(FAS) fot
de novolipid
biogenesis.We
therefore studied the expressionof ACC
andFAS in
rat pancreatic islets and the clonal B-cellline HIT.
Islets andHIT
cells contain appreciable amountsof
ACC mRNA, protein and enzymatic activityrelative to
other tissues including heart, spleen and total pancreas.ACC
levelsin
the B- cells are close to thatin
lungs, a lipogenic tissue. Glucose addition toHIT
cells resulted ina rapid and marked activation
of
ACC, which precededinitiation of
insulin release. Fastingdid not alter the ACC
contentof islets
whereasit markedly
down-regulatedthat of
lipogenic tissues.In
contrast,FAS mRNA
and enzymaticactivity were
undetectable in islets whereas they were abundantin
lipogenic tissues. These observations demonstrate that de novolipid
biosynthesisis
not involvedin
B-cell signalling. The data suggest rather that malonyl-CoA formationin
the B-cellis strictly
involvedin
regulatingfatty
acid oxidation.The resurts
refine
the model and explainwhy
maronyr-coA rises markedly andrapidly in
islets upon glucose stimulation becausethe
glucose carbons are convertedinto
malonyl-coA,
glucose activates ACC andmalonyl-coA
is not diverted to lipids.In
addition to their short-term effect on insulin secretion, nutrients andin
particular glucose have long-term actionson B-cell
responsivenessboth in vivo
andin viffo
thatshould
imply
alterationsin
the expressionof
genes encoding metabolic enzymes implicatedin the
fuel-sensing process. Basedon the
hypothesisthat the
modulationby
glucoseof
metabolic enzyme expression plays an important role
in
insulin secretion, we have studied the long term regulationof
ACC by nutrients using the new insulin secreting cellline
INS- 1. Glucose,from
5 to 20mM,
eliciteda l5-fold
inductionof ACC mRNA.
The effect was detectedafter 4 h and was
maximatzt 24 h incubation. ACC protein
accumulationfollowed thar of ACC mRNA and
glucosedid not modify the half-life of the
ACC transcript, suggesting that the actionof
the sugar may occuf at the transcriptionallevel'
2- deoxyglucose,which is
phosphorylatedby
glucokinasebut is not further
metabolized, causedACC mRNA
accumulation.The
glucokinaseinhibitors
mannoheptulose and glucosamine abolishedthe
actionof
glucose.Activation of the Caz+-, cAMP-,
and C-kinase pathways
with
highK+,
forskolin and the phorbol esterPMA,
respectively, causedinsulin
releasebut not ACC mRNA induction.
Basalinsulin
release,at 5 mM
glucose,correlated
with
theACC
protein contentof INS-I
cells preincubatedfor 24 h at
various glucose concentrations. Several conclusions aredrawn.
Glucose,within its
physiological rangeof
concentration,is a potent inducer of ACC mRNA and protein'
Glucose-6-phosphate
may
mediatethe
actionof
glucose.The
signalling systemsimplicated in
theaction of
glucoseon insulin
releaseand ACC
gene expressionare entirely
different' Recently, evidenceis
accumulating that glucose modulates the expressionof
many B-cell proteins and regulates genes encodingkey
metabolic enzymes implicatedin fuel
sensing'Identification
of
these proteins and studyof the
mechanismsby which
glucose exerts its effects should be crucialin
understanding fl-cellsof
diabetic subjects and the defects that preventa normal
adaptive responseof the B-cell to high
glucosei.e',
hypersecretion, hypertrophy and hYPerPlasia.Finally,
basedon the
hypothesisthat
elevatedfree fatty acids are
causallyimplicated
in
pancreatic B-cell insensitivityto
glucoseby
down-regulating theactivity
andthe
expressionof
genes encodingkey
regulatory enzymesinvolved in the
pathwayof
malonyl-coA
and long-chainacyl-coA
productionfrom
glucose' we have begunto
study the effectsof
prolonged exposureof INS-I
cellsto fatty
acidson
glucose-induced ACCmRNA
accumulation. The preliminary data show that free fatty acids antagonize the actionof
glucose on ACC gene expression. To our knowledge,it
is thefirst
time that an actionof fatty
acidson
metabolic gene expressionin the
B-cellis
described. These observationscould
have implicationsin type 2
diabetes where B-cellsdisplay
reducedsensitivity
toglucose and where circulatory lipids and free fatty acids are elevated'
ORGANIZATION OF TIIE TIIESIS
This thesis is organized
in
thefollowing
sequences : The aims of the investigaion are exposed'Thefirst part
of the introduction provides state-of-the art information on the controlof
gene expression
by
carbohydrates andfatty
acidsin
yeast and higher eukaryotic cells. Thesecond.
patt of
the introduction concerns the coupling mechanismsin
the actionof
nutrients on insulin releasein
the pancreatic ll-cell.The
methodology and the experimental procedures are summarizedin Materials
and.Methods.
The results
of
this investigation iue presentedin
the chapter Results,which is
dividedin
three parts basedon
papers published, submittedor in
preparationduring this
period.The papers are referred to
in
the text by Roman numerals as indicated:I. Brun T.,
RocheE.,
Assimacopoulos-JeannetF., Kim K-H, and Prentki M'
Nutrient regulationof
pancreatic B-cell signal transduction: roleof
acetyl-CoA carboxylase and fatty acid synthase. submitted to The Journalof
Biological chemistry.II. Brun T., Roche E., Kim K-H., ild Prentki M.
Glucoseregulates
acetyl-CoAcarboxylase gene expression in a pancreatic B-cell line
(INS-l).
(1993)J" Biol.
Chem.268'
25,18905-18911.III. Brun T.,
Roche8., Kim K-H.,
and PrentkiM. Iong
chainfatty
acidsinhibit
acetyl- CoA carboxylase gene expressionin
the insulin-secreting B-cell lineINS-I. In
preparation.This thesis is completed by a general discussionin Conclusions and Prospectives.
AIMS OF TIIE ITWESTIGATION
The first objective of this
investigation wasto refine a model of nutrient
sensing proposing that malonyl-CoA acts as a metabolic coupling factorin
the B-cell. The secondgoal of our
study wasto
understand the process whereby nutrients,in
particular glucoseand fatty acids, modulate the
expressionof
genesencoding key metabolic
enzymesimplicated
in li-cell nutrient
sensing and the regulationof insulin
release. Three relatedaspects have been investigated.
1. Role
of
ACCin l]-cell
signalline.To
gain insightinto
the roleof
malonyt-CoA, a putative metabolic coupling factorin B-cell
signalling andto
determine whether malonyl-CoA controlsfatty acid
oxidationor
serves as
a
substratefor lipid
biosynthesisin islet
tissue,we
have studied the expression and regulationof
the two enzymes that regulate the concentration and fateof
malonyl-CoAi.e.,
acetyl-CoA carboxylase(ACC)
and fatty acid synthase(FAS).
Specifrcally,we
have measured ACC andFAS
mRNAs and enzymatic activitiesin
insulin-secreting cells relativeto
thatof
other tissues. We have determined whether the levelof ACC
enzymatic activityof
B-cellsis
alteredby dietary
manipulations (fasting, refeeding)known to
affect insulin releaseand ACC
gene expressionin
lipogenic tissues.We
have studiedthe action of
nutrient secretagogues on ACC enzymatic activity'2.
Inductionof
theACC
gene by glucose.Based
on the
hypothesisthat the modulation by glucose of metabolic
enzyme expression plays an importantrole in
insulin secretion, we thoughtto
study the actionof
glucoseon ACC
gene expression.We
have testedthe action of various
nutrients andsecretagogues
on ACC
gene expressionin a new
glucose responsivetumoral B-cell
line(INS-1). We
have investigatedthe
signal transduction systemimplicated in ACC
geneinduction by
glucose.\Me
have determined whetherthe cellular ACC protein
content correlates with insulin release.3.
Fatty acidt regulationof
glucose-inducedl ACC gêne expressionBased
on the
hypothesisthat
elevatedfree fatty
acidsare
causallyimplicated in
pancreatic Ij-cell insensitivity to glucose by down-regulating the activity and the expressionof
genes encodingkey
regulatory enzymes involvedin
the pathwayof
malonyl-CoA and long-chainacyl-CoA
productionfrom
glucose,we
have studied the effectsof
prolongedexposure
of INS-I
cells to fatty acids on glucose-induced ACC mRNA accumulation.û
INTRODUCTION
PATt
I : REGI,]LATION OF
GEI\,E EXPRF"SSIONBY NUTRIENTS
:ROLE OF CARBOHYDRATES AND FATTY ACIDS
1. INTR.ODUCTION
Many
genes are thought toplay a
fundamentalrole in
adaptationto
thevariability
infood
intakein
orderto
guarantee adequate essential dietary constituentsfor
the organism.More
than 40 nutrients, comprising amino acids, fatty acids, carbohydrates, metal ions andvitamins are essential to mammals for cellular metabolism, normal growth
andreproduction. Health may be impaired
by
adefîcit in
any oneof them.
Excessive intakescan also be damaging,
for
example excessof
total caloric input leads to obesity.Different
classesof
nutrients have been implicatedin
gene expression. These dietaryconstituents involve:
carbohydrates(glucose, fructose);
polyunsaturatede$y
acids(linoleate, arachidonate); metal
iS ( iron,
selenium,zinc);
fat-soluble vitamins (retinoicacid);
cholesterol.The
targetsof
thesenutrients include: nuclear proteins and DNA
S.U.9!!€S, which regulate transcription; nuclear mRNA processing events such as capping,splicing,
potyadenylationand
sequenceediting; cytosolic proteins that modify
mRNA stability and mRNA translation rates. The purposeof
this review is toprovide
state-of-the- art information on controlof
gene expressionby
carbohydrates andfatty
acidsin
yeast and higher eukaryotic cells.A. Nutrient
receptors and metabolismLiving
organisms cannotwork
correctly unless they are able to adaptto
the day-to-dayvariability in
nutrient supply (1-3). The nutrients foundin
food can be specifically detectedif
they interactwith
appropriate components, such as ligand binding proteins that may belinked to
processesfor their uptake and utilisation. The need to detect
nutrientconcentrations indicates that nutrients have