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Submitted on 5 Jun 2020
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Effets de stimuli externes localisés (brûlure et flexion) sur la croissance longitudinale chez le peuplier
Florian Gautier
To cite this version:
Florian Gautier. Effets de stimuli externes localisés (brûlure et flexion) sur la croissance longitudinale chez le peuplier. 2014, 30 p. �hal-01268933�
MASTER II Biologie et Environnement SPECIALITÉ : GEPV
RAPPORT DE STAGE PRESENTE PAR:
Florian GAUTIER
SUJET:
Effets de stimuli externes localisés (brûlure et flexion) sur la croissance longitudinale chez le peuplier
Responsable du Stage: Jean-Louis JULIEN
Coencadrants : Nathalie LEBLANC-FOURNIER et Eric BADEL
juin 2014
UFR Sciences et
Technologies UFR
Sciences et
Technologies
Résumé
La thigmomorphogénèse se définit comme l’ensemble des réponses physiologiques, biochimiques, et morphologiques des plantes aux perturbations mécaniques. La réponse morphologique typique est une réduction de la hauteur au profit d’une augmentation du diamètre de la tige. La croissance longitudinale de trois espèces de peuplier, Populus trichocarpa, Populus deltoïdes et Populus nigra, a été analysée suite à des sollicitations mécaniques lésante (brûlure) ou non (flexion). Une réduction de la croissance longitudinale est détectée le jour de l’application dans le cas d’une brûlure, cette réponse est retardée de deux jours lors d’une flexion. Au niveau moléculaire, des analyses de RT-QPCR montrent une induction des gènes Pt-JAZ5 et Pt-ACS6 au niveau de l’apex, révélant un transfert rapide de l’information en cas de brûlure. Le profil d’expression des gènes impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire, tels que Pt-AIL1, Pt-CYCD1.4, suggère que la diminution de croissance longitudinale induite par la brûlure est due à un ralentissement de la division cellulaire. Aucune régulation de l’expression de ces gènes n’est détectée après flexion. Ces résultats morphologiques et moléculaires, démontrent qu’une diminution de la croissance est présente dans les deux stress, mais que les mécanismes et la cinétique de réponse mis en place sont différents.
Mots clefs : Thigmomorphogénèse, Populus trichocarpa, Populus deltoïdes, Populus nigra, flexion, brûlure, croissance longitudinale, facteur de transcription, cycle cellulaire
Abstract
Thigmomorphogenesis is defined as the set of physiological, biochemical and morphological responses of plants to mechanical perturbations. Typical morphological responses are a reduction in plant height and an increase in stem diameter. The longitudinal growth of three poplar species, Populus trichocarpa, Populus deltoides and Populus nigra, was analyzed in response to mechanical wounding stress (burning) or non-injurious stimulus (bending). A longitudinal growth reduction is detected the day of burning application but two days later for bending. Moreover, RT-qPCR analyses showed an increase of Pt-JAZ5 and Pt-ACS6 transcripts at the apex of plant stem, indicating a rapid burn-induced transfer of information.
Expression analyses of genes involved in cell cycle control, Pt- AIL1 and Pt- CYCD1.4, suggested that the burn-induced longitudinal growth decrease could be due to a slowdown of cell division. No significant difference of these genes expression was observed in response to bending. Taken together morphological and molecular approaches point out a decrease in growth for both stresses, yet kinetics of the response and involved mechanisms are different.
« Les espèces qui survivent ne sont pas les espèces les plus fortes, ni les plus intelligentes, mais celles qui s’adaptent le mieux aux
changements. »
Charles Darwin
Liste des abréviations
ACO : 1-aminocyclopropane-1-carboxylique oxydase ACS : 1-aminocyclopropane-1-carboxylique synthétase ADN : Acide DésoxyriboNucléique
ADNc : ADN complémentaire AIL : AINTEGUMENTALIKE
ANOVA : ANalyse Of VAriance ARN : Acide RiboNucléique B : plante brûlée
CTAB : hexadecyltrimethylammonium bromide CYCD : Cycline-D
dNTP : déoxy Nucléoside triphosphate.
DO : densité optique DTT : DL dithiothréitol
EDTA : Acide Ethylène Diamine tétraacétique F : plante fléchie
GID : code pour un récepteur aux gibbérélines
IAA : Facteur de transcription induit par l’auxine.
J : jour du stress
JAZ5 : jasmonate zim domain protein 5
M : molaire Na : sodium nm : nanomètre
Oligo(dT) : oligodéoxythymine PCR : Polymerase Chain Reaction
Qr : quantité relative de transcripts d’un gène
RNase : ribonucléase
RNase OUT : inhibiteur de RNase RT : Reverse Transcriptase
SSTE : Sodium SDS TrisHCL EDTA T : plante témoin
Tm : Température d’hybridation
Tris : tris(hydroxymethyl) zminomethane
Remerciements
Je tiens en premier lieu à remercier Jean Louis Julien, pour m’avoir encadré et permis de réaliser mon stage de M2 dans l’UMR PIAF. Mais aussi pour la liberté d’action qu’il m’a laissée.
Mais aussi Nathalie Leblanc-Fournier, pour m’avoir coencadré, pour son implication lors de mes expériences de biologie moléculaire, ses conseils, sa bonne humeur, même à 3 heure du matin pour les prélèvements après flexion et brûlure. Mais aussi pour son implication dans la correction de mon rapport de stage. Ainsi que mon autre coencadrant, Eric Badel pour ses précieux conseils lors des analyses d’image.
Merci aussi à Sylvaine, pour ses formations et son aide lors de mes premiers gels et mes premières extractions, ainsi que ses réponses lorsque j’étais perdu pour trouver du matériel. Merci à Christelle et Stéphanie pour l’installation des peupliers dans les chambres de cultures, et pour l’entretient qu’ils ont eu. Merci encore à eux et à Céline Sac pour l’Azote quand j’étais pressé par les expériences.
Je remercie aussi Dominique Marcon, pour son aide et ses conseils sur la photographie et les analyses d’images.
Un grand merci à Jérôme Peyrot qui a partagé mon bureau pendant tout ce stage, avec qui j’ai pu rigoler, mais aussi pour l’entraide qu’il y a pu y avoir lors des problèmes d’expériences, de bibliographie, et de rédaction.
Merci aussi à Eric Goujon, Marie Garavillon, Razik Benouaret, Chaima Sta, Lise Pomies, Beatriz Muries, Kevin Tocquard, David Lopez, Romain, Benjamin, Pierrick (qui passait de temps à autre), pour la bonne humeur, les réponses aux questions posées et tout le reste, durant mon stage.
Mes derniers remerciements iront à toute l’équipe du PIAF, pour leur accueil et leur bonne humeur.
Merci à tous.
Sommaire
Introduction……….….1
Bibliographie I/ Réponses physiologiques à des stimuli externes localisés……...………2
a) Réponse à la flexion………...………..2
b) Réponse à la brûlure………...3
II/ La signalisation à longue distance………...…....4
III/ Les acteurs moléculaires de la réponse à distance………….………..6
a) Mécanoperception……….…..6
b) Régulation des gènes dans la zone fléchie………...……7
c) Le contrôle de la croissance par le cycle cellulaire………...….9
IV/ Objectifs du stage………...11
Travail expérimental A/ Matériel et méthodes………...12
I/ Matériel végétal et conditions de culture……….12
II/ Traitements………...……….….12
III/ Mesure de croissance……….…..13
IV/ Traitement et analyse d’image………....13
V/ Expression de gènes par Q-RTPCR………..…...14
VI/ Analyses statistiques………...15
B/ Résultats………...16
I/ Effet du stress non-lésant (flexion) sur la croissance longitudinale journalière des trois espèces de peuplier………16
II/ Recherche d’acteurs moléculaires impliqués dans l’arrêt de croissance suite à un stimulus à distance………...17
a) Choix des gènes marqueurs du cycle cellulaire sur Populus
trichocarpa………..……...17 b) Corrélation entre l’arrêt de croissance observée suite à une brûlure
chez Populus trichorcarpa et l’expression de gènes marqueurs du cycle cellulaire………...18 c) Test sur d’autres espèces de peuplier (P.deltoïdes, P.nigra) .……...19 III/ Expression des gènes candidats suite à un stimulus mécanique de
type flexion………...19
Discussion et perspectives
I/ Mise en évidence d’une réponse de croissance longitudinale suite à une flexion chez trois espèces de peuplier………...20
II/ Des gènes impliqués dans le cycle cellulaire……….23 III/ Conclusion et perspectives………...24
Bibliographie
Introduction
1
Les plantes terrestres sont des organismes fixés. De ce fait, elles subissent les facteurs biotiques et abiotiques, qui sont fluctuants et contraignants, et doivent y répondre afin de survivre. Elles produisent des structures leur permettant de capter la lumière, qui est leur source d’énergie. Dans le cas des arbres, ces structures ramifiées autour d’un seul tronc et maintenues dans certains cas pendant plusieurs siècles, doivent percevoir leur environnement mécanique direct. Ils perçoivent des forces mécaniques internes liées à leur poids et aux variations de poids induites par la charge des fruits (Almeras et al. 2004), qui contrôlent l’allométrie et les propriétés mécaniques des tissus (Telewski, 2006).
Les végétaux perçoivent également les facteurs externes liés à leur environnement qui peuvent varier au cours du temps. La compétition pour la lumière en forêt est, par exemple, cruciale pour la survie des arbres, mais elle doit être équilibrée avec le risque de devenir mécaniquement instable (Fournier et al. 2006). Le vent est le facteur de contrainte mécanique principal au développement des plantes (principalement les arbres), car l’impact de celui-ci augmente avec la taille et l’espace que prend l’individu (James et al. 2006). Avec l’augmentation des fréquences des tempêtes, l’importance de comprendre les réponses des arbres aux contraintes mécaniques constitue un enjeu majeur.
Les contraintes mécaniques perçues par les plantes sont d’origines multiples : blessures, vent, passages d’animaux, taille, éboulement (Telewski 2006). Certaines ont des effets non lésant qui préservent l’intégrité des tissus alors que d’autres provoquent des lésions cellulaires (Julien 1994). Afin de mimer l’effet du vent, les expériences en laboratoire consistent à appliquer des flexions aux tiges des arbres et les lésions cellulaires sont généralement induites par des écrasements ou des brûlures appliquées sur les feuilles.
La réponse morphologique des végétaux aux contraintes mécaniques consiste en une modification de croissance qui est locale (stimulation de la croissance en diamètre dans la zone où s’applique la contrainte (Coutand et al. 2009), inhibition de la croissance en longueur lorsque la contrainte est appliquée au méristème caulinaire, (Braam 2005) ou que l’on observe à distance de la zone où s’applique la contrainte (inhibition de la croissance en longueur lorsque la contrainte est appliquée dans une zone ayant terminé sa croissance). Ce dernier cas met en évidence un transfert d’information entre différents organes de la plante (Malone 1996).
La connaissance des mécanismes mis en jeu lors de la réponse des arbres aux contraintes mécaniques constitue un axe de recherche de l’équipe MECA de l’UMR PIAF et mon travail consiste à étudier la réponse de croissance en longueur du peuplier à distance de la zone où est appliquée une contrainte mécanique.
Bibliographie
Figure 1 : Effet du vent sur la croissance longitudinale de Medicago sativa. Le cadre mis en place autour des plants de luzerne (au centre de l’image) a limité la course des plantes sous l’effet du vent, au cours de leur croissance. Une augmentation de près de 50% de la croissance a été observée (Moulia et Combes, 2004).
Figure 2 : Cinétique de croissance longitudinale d’une tige de tomate (Lycopersicon esculentum) après flexion. La courbe verte représente la croissance du témoin, et la courbe noire celle du plant fléchi. La flèche noire représente le moment de la flexion, et les deux bandes noires délimitent l’arrêt de croissance de la tige (Coutand et al. 2000).
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La thigmomorphogénèse a été définie par (Jaffe 1976) comme étant l’ensemble des réponses physiologiques, biochimiques, et morphologiques des plantes aux perturbations mécaniques. On observe généralement une réponse morphologique globale de réduction de la hauteur au profit d’une augmentation du diamètre de la tige (Telewski et Pruyn 1998). Cela a pour effet de limiter la rupture d’un axe au vent, en réduisant la surface de frottement, et en augmentant la résistance mécanique (Pruyn et al. 2000). Elle entraine aussi des modifications dans les tissus conducteurs et une perte de surface des feuilles (Telewski et Pruyn 1998), ainsi que de multiples réponses moléculaires (Braam 2005; Kern et al. 2005).
La capacité à percevoir les stress mécaniques est fondamentale pour toutes les cellules de plantes. Au niveau des tissus, des sollicitations sont mises en place lorsque les couches de cellules adjacentes présentent une croissance différentielle (Nakamura et al. 2012). C’est le cas dans la formation des méristèmes apicaux, mais aussi dans la régulation de l’activité cambiale au cours de la croissance secondaire des tiges et des racines. Les cellules vasculaires du cambium sont repoussées vers l’extérieur contre l’écorce, elles subissent probablement des contraintes à la fois en compression et en traction. L’initiation des divisions anticlines peut être une réponse à un changement par rapport aux contraintes au cours d’une saison de croissance (Lintilhac et Vesecky 1981). Dans notre étude, nous nous sommes plus particulièrement intéressés à comprendre l’impact des sollicitations mécaniques externes.
I/ Réponses physiologiques à des stimuli externes localisés
a) Réponse à la flexion
Dès qu’une plante est protégée d’une stimulation mécanique naturelle comme le vent, celle–ci présente une croissance longitudinale augmentée (Figure 1). Ce genre de stimulation externe entraine donc une diminution de la croissance longitudinale, mais active aussi la croissance en diamètre chez Prunus avium (Coutand et al. 2008), Ulmus americana (Telewski and Pruyn 1998), Lycopersicon esculentum (Coutand et al. 2000), et Juglans regia (Leblanc- Fournier et al. 2008). Cet arrêt de croissance longitudinale serait dû au fait qu’un signal rapide serait transmis du point de flexion vers le méristème (Telewski 2006). Chez les herbacées, Jaffe (1976) a mis en évidence qu’une flexion, entraine un arrêt de croissance longitudinale dès 6 minutes après son application chez le haricot (Phaseolus vulgaris). Chez la tomate
Figure 3 : Réponse de croissance radiale suite à une flexion sur une tige de peuplier.
Avant la flexion, la croissance est stable. La flexion (flèche grise) entraine une augmentation de la croissance radiale pendant 3 jours. A partir du 4ème jour après la flexion (6 sur la figure), la croissance radiale diminue jusqu’à retrouver son niveau de base (d'après Catherine Coutand et al. 2009).
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(Figure 2) cet arrêt de croissance est observé dès 8 minutes après flexion de la tige (Coutand et al. 2000), avec une bonne corrélation entre la durée de l’arrêt de la croissance longitudinale et la somme des déformations appliquée à la tige. Chez les arbres l’augmentation de la croissance radiale (Figure 3, Coutand et al. 2009) associée à une augmentation de la rigidité en flexion, ainsi qu’à des changements des propriétés mécaniques des tiges (Telewski et Pruyn 1998), concerne et est limitée à la zone fléchie. On observe dans le nouveau bois mis en place suite à une flexion, appelé bois de réaction (Scurfield 1973), une modification de l’anatomie des vaisseaux, qui varie en fonction des espèces.
Les réponses de croissance sont couplées à des phénomènes comme la réallocation de la biomasse, la diminution de la surface des feuilles, une modification de la conductance hydraulique, et le blocage du phloème par des dépôts de callose (Telewski 2006). Les sollicitations mécaniques peuvent aussi modifier d’autres processus physiologiques, comme la floraison (décalage), la dormance (induction), la sénescence (stimulation), la résistance à la sécheresse et aux pathogènes (Braam 2005). Toutefois, une variabilité intraspécifique de la réponse de croissance longitudinale a été mise en évidence chez le peuplier (Pruyn et al.
2000).Ces auteurs ont étudié deux peupliers hybrides Populus trichocarpa x Populus deltoïdes, et ont montré que l’hybride 11-11 présente une diminution de croissance longitudinale en réponse à une flexion, alors que la croissance longitudinale de l’hybride 47- 174 est augmentée. Par ailleurs, des études préalables menées au laboratoire par Tixier et al (2014) n’ont pas permis de mettre en évidence une inhibition de croissance en réponse à une seule flexion de tige chez Populus tremula x alba.
b) Réponse à la brûlure
Parmi les stress biotiques, provoqués par les herbivores, les insectes et d’autres bioagresseurs, certains vont induire une blessure avec des effets dramatiques sur les plantes (Zhang et Turner 2008). Ces blessures se traduisent par des lésions cellulaires. Stankovic et Davies (1998) ont montré que la brûlure provoquait une blessure lésante, qui entrainait une baisse de croissance longitudinale chez la tomate. Des résultats similaires ont été trouvés sur Arabidopsis thaliana avec une réduction de la croissance longitudinale de 50% pendant 4 jours. Chez l’hybride de peuplier Populus tremula x Populus alba, une blessure entraine une extension de la phase d’arrêt de croissance diurne qui inhibe la prochaine phase de
Figure 4 : Cinétique de croissance longitudinale de Populus tremula x alba avant et après brûlure. La brûlure a été faite le jour D, sur une feuille pendant 10 secondes. Les plants brûlés (B, barres noires) présentent une diminution significative de la croissance longitudinale journalière le jour où a été appliquée la brûlure, en comparaison aux plants témoins (A, barres blanches) (d'après Tixier et al. 2014).
A
B
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circumnutation nocturne et le taux de croissance correspondant (Tixier et al. 2014) (Figure 4).
Comme dans le cas de la réponse à une flexion, cette diminution de la croissance longitudinale serait due à une transmission rapide d’un signal, depuis le point de brûlure, jusqu’au méristème apical et aux autre feuilles (Zhang et Turner 2008).
II/ La signalisation à longue distance
Les végétaux possèdent des mécanismes de communication à longue distance qui sont très importants, car ils permettent une adaptation de l’individu à l’environnement. Dans le cas des ligneux, ceux–ci sont encore plus importants étant donnée leur grande taille qui peut atteindre plusieurs mètres. Différents modèles ont été proposés pour expliquer cette communication à longue distance.
Comme premier candidat de cette signalisation à longue distance, il y a la sève xylèmienne. Il existe pourtant des limites, qui sont liées à la variabilité du flux xylémien, qui va dépendre de la transpiration au cours de la journée, et au cours de la nuit. Malone (1996) a montré qu’en pleine nuit, lorsque la transpiration est réduite, les signaux produits dans les racines mettent plusieurs heures pour atteindre le sommet de la plante. Le jour, la vitesse de déplacement de la sève xylémienne peut quand même largement dépasser le mm.s-¹ (Zimmermann et Brown 1971; Nobel 1991), et aller jusqu’à 200 mm.s-¹ chez certaines herbacées (Zimmermann 1983).
La sève phloèmienne permet le transport de nombreux messagers tels que l’acide abscissique, les jasmonates, l’acide salicylique et bien d’autres (Hall et Baker 1972), (Malone 1996, Kehr et Buhtz 2008). Le phloème est le seul système capable de transporter rapidement des solutés chimiques vers l’apex (transport acropète), et vers les racines (transport basipète).
La vitesse de circulation de la sève phloémienne est comprise en 0.1 et 4mm.s-¹ (Malone 1996). Il est toutefois difficile d’attribuer avec certitude l’origine de la signalisation à longue distance à un de ces systèmes de transport car il y a de nombreux échanges entre les sèves brute et élaborée, on ne peut donc pas savoir si une molécule présente dans le phloème a été uniquement transportée par celui-ci.
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Les flux phloémiens et xylémiens ne semblent pas pouvoir expliquer à eux seuls une signalisation à longue distance car aucune molécule organique ou minérale n’a été identifiée dans certains transports d’information à longue distance. C’est le cas de la propagation de variation de potentiel électrique transmembranaire qui présente des caractéristiques différentes selon la nature (lésante ou non) du stimulus (Frachisse et Desbiez 1989). Quand le stimulus ne provoque pas de blessure (toucher, transition lumière/obscurité), les plantes sont capables de générer des potentiels d’action qui se propagent à une vitesse de l’ordre de 1 cm.s-¹ (Roblin 1985). Quand le stimulus blesse la plante et lèse des cellules (écrasement, éclatement, brûlure…), il déclenche une onde lente qui se propage à une vitesse de l’ordre de 1mm. s-¹ (Sambeek et al. 1976).
Plus récemment, Malone et Stankovic (1991) ont proposé qu’une onde de pression hydraulique puisse être déclenchée par des blessures. Cette onde, qui est liée à des modifications de pression, se propagerait le long du continuum hydraulique de la plante (Malone 1993), et serait ainsi une source d’information rapide sur de longues distances.
Parkhurst et Loucks (1972) ont suggéré que la flexion de tiges de plantes peut induire une cavitation et une perte de conductance dans le xylème, résultant du stress hydrique et une baisse des taux de transpiration. L’implication possible d'un signal biochimique en suspension dans l'air, comme l’éthylène a également été écartée par Erner et al. (1980) dans des expériences sur les pousses de soja. Le signal longue distance acropète peut donc être de nature physique. Des changements transitoires de l'écoulement de l’eau dans le système de circulation de la sève suite à une flexion, ont permis d’émettre l’hypothèse qu’il existait un mécanisme destiné à transmettre le signal perçu à longue distance dans la plante (Lopez et al.
2014). Lorsque la tige est déformée, de l'eau est expulsée du symplaste et de l’apoplaste, et pourrait conduire à des variations de pression dans le xylème (Moulia et al. 2011). Malone et Stanković (1991) ont rapporté qu'une série de gonflements et retraits, fortement caractéristiques d'une impulsion hydraulique, pouvait se propager le long de la tige après stimulation mécanique. Lopez et al (2014) ont confirmé que la pression hydraulique dans le xylème et le volume de l’impulsion de l’écoulement augmentaient de façon proportionnelle à l’amplitude de la sollicitation mécanique appliquée.
La perception de cette variation hydraulique pourrait se faire grâce aux aquaporines, qui sont connues pour être en mesure de répondre aux variations de pression (Wan et al. 2004).
Néanmoins, les mécanismes impliqués dans la perception du signal hydraulique par les
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cellules vivantes et la transduction d’un signal physique à un signal chimiques, qui déclenche des réponses d’acclimatation restent à élucider (Christmann et al. 2013).
Actuellement, les mécanismes à l’origine de la signalisation à longue distance induite par une flexion de tige et/ou une brûlure ne sont pas clairement identifiés.
III/ Les acteurs moléculaires de la réponse à distance
Il existe chez les plantes, plusieurs acteurs moléculaires connus au niveau de la réponse locale, mais très peu d’études ont été faites sur la réponse à distance d’un stress lésant, et même mécanique. Dans le cas de la réponse à distance, la plus étudiée est la réponse systémique à une blessure par un herbivore, avec la mise en évidence du rôle des jasmonates (Zhang et Turner 2008). Chez le peuplier, Tixier et al (2014), ont démontré que suite à une brûlure de la feuille, un pic de l’expression de JAZ5, un gène de la voie de signalisation des jasmonates est observé au niveau du méristème apical, selon une cinétique en lien avec la diminution rapide de la croissance longitudinale.
a) Mécanoperception
De nombreux signaux intra et inter cellulaires, comme les hormones, les messagers secondaires et les potentiels électriques ont été mis en évidence dans les modifications de morphogénèse suite à un stress mécaniques (Braam 2005).
En premier lieu, la mécanoperception se situe au niveau de chaque cellule, à l’interface que l’on appelle CPMCW (cytosquelette-membrane plasmique–paroi) (Telewski 2006).
Celle-ci crée une continuité structurale dans la cellule. La mécanoperception pourrait impliquer des canaux ioniques MS (mécanosensibles), qui sont des complexes de protéines membranaires. La force mécanique est directement transmise aux canaux par la bicouche lipidique dans laquelle ils se trouvent. La tension accrue de la membrane conduit à un amincissement de celle-ci et à une augmentation des forces de tractions exercées. Ces variations induisent un changement de conformation du canal, ce qui favorise son état ouvert (Monshausen et Haswell 2013). En revanche dans le modèle « trapdoor » (Figure 5), la force
Figure 5 : Deux modèles de fonctionnement de canaux mécanosensibles (MS). (A) L’ouverture d’un canal MS est favorisée par l’augmentation de la tension de la membrane. (B) Le modèle « trapdoor » qui propose que les modifications au niveau de la paroi et/ou du cytosquelette permettraient le déplacement d’une « porte » contrôlant l’ouverture du canal (d'après Monshausen et Haswell 2013).
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mécanique est transmise à un domaine du canal ionique par le biais d’autres structures telles que la paroi cellulaire ou le cytosquelette (Monshausen & Haswell, 2013).
En parallèle, les protéines transmembranaires de la famille des RLK comme les WAKs (Wall-Associated Kinase) sont également des acteurs potentiels de la mécanoperception. Ce sont des récepteurs des acides oligogalacturoniques qui jouent un rôle clef dans les réactions de défense des plantes, comme la blessure, ou l’attaque de pathogènes (Kohorn et Kohorn 2012), mais aussi dans le contrôle de la croissance, en cas d’inhibition de la régulation de leur expression (Lally et al. 2001). Les CrRLK1L, membres de la famille des RLK, possèdent un domaine extracellulaire malectine (Lindner et al. 2012), qui leur permet de se lier spécifiquement au mannose Glc2-N-glycanes, et joue un rôle dans le contrôle de la qualité des glycoprotéines dans le réticulum endoplasmique (Qin et al. 2012). Ces protéines pourraient donc se lier potentiellement à des polysaccharides ou des glycoprotéines des parois de cellule végétale, bien que cela n’ait jamais été démontré.
La perception est suivie par des variations de gradients électrochimiques de part et d’autre des membranes (Knight et al. 1992). Une augmentation de la concentration cytosolique du Ca2+, et la production d’espèces activées de l’oxygène (EAO ou ROS (reactive oxygen species)), participent à la transduction du signal, et conduiraient à l’expression de gènes mécanosensible (Telewski 2006). Un lien entre la signalisation faite à l’aide du Ca2+ et la production de JA (jasmonates) existe mais est fragile. Les JA joueraient un rôle possible dans la conversion du signal Ca2+ en une mécanoperception (Fisahn et al. 2004).
b) Régulation des gènes dans la zone fléchie
Une cinétique de cascade des réponses moléculaires au cours de la transduction du signal mécanique a été proposée par (Telewski 2006) et a été complétée par (Martin et al.
2009) (Figure 6). Les premiers gènes ont été identifiés chez Arabidopsis, suite au toucher des feuilles de la rosette par Braam et Davis (1990). Ces gènes, appelés TOUCH (TCH), codent des protéines de type calmodulines (TCH2, TCH3) ou des xylogucanes-endo- transglycosylases (TCH4) et sont régulés très rapidement par le toucher (< 30 min). Plus récemment, une analyse globale montre que l’expression de plus de 2.5% des gènes du génome d’Arabidopsis est modifiée dès 30 min après une sollicitation mécanique de type
« toucher » (Lee et al. 2005). Parmi les catégories fonctionnelles les plus représentées, on
Figure 6 : Cascade des réponses cellulaires et physiologiques, suite à une flexion contrôlée (d'après Telewski 2006, complété par Martin et al. 2009).
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retrouve des protéines de liaison au calcium, des facteurs de transcription, des protéines kinase et des transporteurs. Chez les ligneux, les études sont moins nombreuses. Au laboratoire PIAF, un facteur de transcription à doigt de zinc, Pta-ZFP2, a été découvert par (Martin et al. 2009) chez Populus tremula x alba. Ce facteur de transcription est rapidement et spécifiquement exprimé 10 minutes après une flexion de la tige, et possède une induction mécanosensible (flexion, gravitropisme, froid…).
Les gènes de la voie de signalisation de certaines hormones sont également régulés par les sollicitations mécaniques.
L’acide jasmonique et ses dérivés régulent énormément de processus biologiques, y compris la défense des plantes (Browse et Howe 2008), le métabolisme secondaire, le contrôle de la croissance, l’initiation des trichomes et la reproduction. Ils sont produits très rapidement (15min) et selon différentes cinétiques, lors d’un stress biotique et abiotique, incluant la blessure (Koo et al. 2009). Ils font partie d’un groupe de molécules de signalisation oxylipines, qui sont synthétisées à partir de l’acide linolénique des chloroplastes (Creelman et al. 1992 ; Turner et al. 2002). Chez Arabidopsis, Devoto et al. (2005) ont montré qu’une sollicitation mécanique de type flexion induisait une accumulation de JA.
Ceux-ci s’accumulent très rapidement (30 minutes après flexion) dans la hampe florale chez Arabidopsis thaliana (Chehab et al. 2012). Chez le peuplier, Lakhal (2010) a montré que plusieurs gènes de la voie de biosynthèse et de signalisation des jasmonates sont régulés rapidement après une flexion de la tige. En particulier, l’expression de JAZ5, un gène codant pour un régulateur négatif de la voie de signalisation et lui-même régulé par les jasmonates, augmente dès 30 minutes après la flexion d’une tige. JAZ5 fait donc partie des gènes mécanosensibles important à étudier.
L’éthylène est une phytohormone qui est connue pour être impliquée dans de nombreuses voies de réponse aux stress biotiques et abiotiques. Elle est issue de la méthionine, et est synthétisée via l’action successive de deux enzymes, l’ACC synthase (ACS) et l’ACC oxydase (ACO). Chez la tomate, la blessure et le toucher provoquent une expression rapide (dès 30 min) et transitoire du gène ASC6 (Tatsuki and Mori 1999). Chez le noyer, 30 min après une flexion de tige, une accumulation locale des transcrits d’ACO a été observée (Crouzet 2002). Ces observations se retrouvent aussi chez le peuplier, on observe une accumulation locale de transcrits Pta-ACS6 dès 10 min après flexion de tige (Martin et al.
2009). Ces résultats suggèrent un rôle important de cette hormone dans la réponse aux stimuli
Figure 7 : Régulation de la différenciation, du cycle cellulaire et de la croissance cellulaire (d'après Harashima et Schnittger 2010).
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mécaniques et font des gènes ACS et ACO de bons candidats pour l’étude de cette voie de réponse.
Toutefois, l’ensemble de ces études a été réalisé localement, c'est-à-dire dans la zone (ou l’organe de la plante) où est appliquée la sollicitation mécanique. Les données concernant les gènes régulés à distance ont été obtenues uniquement dans le cadre de sollicitations mécaniques lésantes telles que la blessure. Ainsi les gènes de la voie de biosynthèse de l’éthylène et de des jasmonates, précédemment présentés comme activés localement suite à un stimulus mécanique, sont aussi induits à distance dans le cadre de stimuli de type blessure. La blessure entraine une inhibition de la croissance, mais n’a pas d’effet sur la taille des cellules.
Chez le tabac, il a été montré sur des cultures cellulaires, que l’arrêt de la division cellulaire se faisait en phase G2, et qu’elle était associée à une réduction de l’expression de type dépendante kinase et à une réduction de l’expression de la cycline CYCB1.1. Zhang et Turner (2008) ont montré qu’en appliquant une blessure sur Arabidopsis thaliana, il y avait une activation de la synthèse des JA au niveau du méristème. Chez le peuplier, l’expression des gènes Pta-JAZ5 et Pta-ACS6 est stimulée dans l’apex dès 30 min après brûlure d’une feuille basale (Tixier et al. 2014). Ces résultats suggèrent que les voies de signalisation de l’éthylène et des jasmonates pourraient avoir un rôle lors de la signalisation à longue distance. Toutefois, chez l’hybride Populus tremula x alba, aucun de ces deux gènes n’est régulé dans l’apex 30 min après une flexion de la tige (Tixier et al. 2014).
c) Le contrôle de la croissance par le cycle cellulaire
Un des moyens d’appréhender les mécanismes moléculaires impliqués à distance serait d’identifier des gènes liés à l’arrêt de croissance. La croissance longitudinale résulte à la fois de la division cellulaire et de l’élongation cellulaire, qui peut être elle-même modulée par l’état de différenciation (Harashima et Schnittger 2010) (Figure 7). La division cellulaire se décompose en 4 cycles distincts, la phase G1 (phase de croissance), la phase S (réplication), la phase G2 (seconde phase de croissance) et la phase M qui est la phase de mitose proprement dite. Chez les plantes, les Cyclines D sont des protéines très importantes qui induisent le passage entre la phase G1 et S, permettant la division cellulaire (Figure 8). Cockcroft et al., (2000) ont montré que la surexpression d’une Cycline de type D (CYCD2) d’Arabidopsis
Figure 8 : Cascade de régulation du cycle cellulaire. G1, S, G2, M constituent les différentes étapes du cycle cellulaire (d'après Harashima et Schnittger 2010).
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thaliana chez le tabac, accélérerait sa croissance longitudinale. Une baisse de leur expression entraine donc une diminution de la croissance de la plante.
Les Cyclines D sont régulées par de nombreux facteurs de transcription comme les ANT (AINTEGUMENTALIKE) (Figure 8). Les facteurs de transcription de type ANT font partie de la famille des domaines APETALA 2/ETHYLENE RESPONSE FACTOR (AP2/ERF), et sont trouvés dans de très nombreux groupes de plantes (mousses, algues, gymnospermes et angiospermes) (Horstman et al. 2013). Les protéines de type AP2/ERF appartiennent à une famille de facteurs de transcription qui sont uniques pour les plantes (Riechmann et Meyerowitz 1998) et tous possèdent le domaine de liaison AP2 à l’ADN (Jofuku et al. 1994).
Ces gènes ont aussi été trouvés chez le peuplier (il existe 210 AP2), et servent dans le développement floral et la croissance (Rigal et al. 2012). Chez le peuplier, le fonctionnement du méristème caulinaire n’est pas totalement décrit. Toutefois, Karlberg et al. (2011) ont pu mettre en évidence chez le tremble (Populus tremula), que lors d’une exposition aux jours courts il existe une corrélation entre la diminution de l’expression des gènes de type AIL (AINTEGUMENTALIKE) et avec la diminution de croissance longitudinale. Chez Populus spp, le gène AIL1, un des homéologues du gène ANT d’Arabidopsis thaliana s’exprime dans les méristèmes et dans les nouvelles feuilles et se fixe sur les promoteurs des gènes codant des Cyclines de type D (Karlberg et al. 2011). Il pourrait donc être impliqué dans la régulation du cycle cellulaire au niveau du méristème du peuplier.
Comme le montre la figure 8, les cyclines D sont régulées par plusieurs phytohormones. Aida et al (2004) ont démontré que chez Arabidopsis thaliana, l’expression des gènes ANT est dépendante de l’action redondante de ARF5 (AUXINE RESPONSE
FACTOR/MONOPTEROS) et de celle de son homologue
NONPHOTOTROPICHYPOCOTYLE 4 (NAPH4/ARF7). L’auxine aurait donc un rôle dans l’expression de ces gènes. Chez le peuplier, un lien entre l’auxine et l’expression de ces gènes n’a pas été étudié. Toutefois, le rôle de cette hormone dans la division cellulaire est clairement établi. Parmi les gènes de réponse à l’auxine, le gène Pt-IAA1 qui code pour un facteur de transcription s’exprime dans les cellules en division (Moyle et al. 2002). De même, les gibbérellines sont des hormones qui sont liées à différents aspects du développement des plantes, comme la croissance longitudinale des tiges et la formation du bois chez le peuplier
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(Mauriat et Moritz 2009). Le gène Pta-GID1.1 code pour un récepteur de gibbérellines qui entraîne un accroissement des plantes et stimule l’activité cambiale. De manière intéressante, Péraudeau (2010) a montré que ce gène était réprimé dans la partie en croissance du peuplier après avoir soumis ces peupliers à une augmentation de la pression interne du xylème.
Il serait donc intéressant de savoir si lors d’un stress mécanique/lésant, il y a une diminution de l’expression de ces gènes dans le peuplier.
IV/ Objectifs du stage
Les mécanismes impliqués dans la réponse de croissance longitudinale sont mal connus, en particulier en réponse à une flexion, notamment chez les ligneux. Des études préliminaires faites par Tixier et al (2014) sur un clone de peuplier, Populus tremula x alba, ont pu montrer un arrêt de la croissance longitudinale en cas de brûlure d’une feuille à 20 cm de l’apex, mais pas suite à une flexion. Pruyn et al (2000) ont démontré qu’il existait une variabilité de réponse de croissance longitudinale chez les différentes espèces de peuplier.
Afin d’étudier cette variabilité, mon travail durant ce stage a été :
D’observer s’il existait ou non, un arrêt de croissance longitudinale chez trois nouvelles espèces de peuplier (Populus trichocarpa, P.deltoïdes et P.nigra) suite à une flexion.
De comprendre l’implication, au niveau moléculaire, des gènes impliqués dans le cycle cellulaire dans deux conditions :
o Brûlure : témoin positif de l’arrêt de croissance chez le peuplier.
o Flexion
Travail expérimental
Figure 9 : Matériel végétal et conditions de culture. Les expériences sont réalisées sur des Populus trichocarpa, deltoïdes et nigra. Les plants sont régénérées par culture in vitro à partir d’axes de tiges sur un milieu Murashige et Skoog (Murashige et Skoog 1962). Lorsque les plants ont atteint une hauteur d’environ 4 cm, ils ont progressivement été acclimatés sur une solution hydroponique (B) (ex : Populus trichocarpa) ou sur terreau (A). Les expériences sont réalisées une fois que les peupliers ont atteint une taille de 30 à 40 cm.
Figure 10 : Traitement appliqué. (A) La flexion est réalisée en enroulant sur 12,5 cm de longueur la partie basale de la tige autour d’un tube en PVC de rayon défini. (B) La brûlure est générée à l’aide d’une flamme émise par un briquet sur toute la face inférieure d’une feuille située à 20 cm de l’apex en la chauffant pendant 10 secondes. La feuille traitée (indiquée par la flèche) est laissée en place sur la plante durant toute l’expérience.
A B
A B
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A/ Matériel et méthodes
I/ Matériel végétal et conditions de culture
Les expériences ont été réalisées sur trois espèces de peupliers : Populus deltoïdes, Populus trichocarpa et Populus nigra. Les plantes ont été régénérées par culture in vitro à partir de scions sur un milieu Murashige et Skoog (Murashige et Skoog 1962). Lorsque les plants ont atteint une hauteur d’environ 4 cm, ils sont progressivement acclimatés (Martin et al. 2009) sur une solution hydroponique pour Populus trichocarpa, ou dans du terreau pour les 3 espèces (Fig 9). Ils sont ensuite cultivés dans une chambre de culture climatisée à une température de 22°C lors de la phase lumineuse, et de 18°C pendant la phase sombre, avec un régime périodique de 16h de lumière, et 8h d’obscurité. Les feuilles gênantes pour l’expérimentation de flexion sont éliminées à l’aide d’une lame de rasoir. Les plantes sont cultivées sans intervention pendant au moins une semaine afin de leur laisser le temps de s’acclimater aux nouvelles conditions de photopériode et de « récupérer » de l’ablation de quelques feuilles.
II/ Traitements
La sollicitation mécanique est réalisée par une flexion en enroulant la partie basale de la tige autour d’un tube en PVC de rayon défini sur 12,5 cm (Fig10 (A)). Connaissant le diamètre de la tige, on peut calculer la déformation appliquée d’après l’équation :
é 100 2 2
rtige : rayon de la tige au niveau de la zone fléchie rtube : rayon du tube PVC.
Le stress lésant est généré par une brûlure (Fig 10 (B)). A l’aide d’une flamme, toute la face inférieure d’une feuille située à 20 cm de l’apex est chauffée pendant 10 secondes, jusqu’à flétrissement du tissu. La feuille brûlée est laissée sur la plante tout le long de l’expérience.
Figure 11 : Installation pour les mesures de croissance par photographie suite à une flexion sur (Populus trichocarpa). Dans ce cas là, les plantes sont installées et fixées au dessus du collet en bac hydroponique. Les photographies sont prises par intervalles de 15 minutes pendant 5 jours, avec un fond noir et deux mires blanches de 20 mm de diamètre. Les mires représentent les échelles ainsi que des repères de position. Les sollicitations mécaniques sont quantifiées par l’apport d’une somme des déformations contrôlée en fléchissant la base de la tige de diamètre connu sur un tube en PVC de rayon connu (voir Figure précédente)
Figure 12 : Mesure de croissance par photographie. La croissance est suivie image par image à l’aide du logiciel ImageJ (W. Rasband, National Institutes of Health). Pour chaque photographie, le même point est suivi (point rouge) afin de voir l’évolution de la croissance.
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III/ Mesures de croissance
Afin d’estimer la croissance journalière (cm/jour), la hauteur de chaque plant a été mesurée les 3 jours précédant la flexion (J-3 à J-1), et pendant 3 jours après (J0 à J+3). Dans une première expérience, les plantes ont été mesurées manuellement à l’aide d’un mètre rigide, tous les jours à heure fixe (1h après le début du jour), afin de limiter les phénomènes liés au rythme circadien de la journée, et la flexion a été faite en milieu de phase d’obscurité (4h après le début de la nuit). La croissance des plants témoins non fléchis a été suivie en parallèle.
Dans une seconde expérience, la croissance a été suivie par analyse d’images, à l’aide de photographies, prises à intervalle régulier de 15 minutes pendant 5 jours (Figure 11). Pour limiter l’impact du flash lumineux sur la croissance durant la nuit, un filtre vert a été installé sur le flash des appareils. Le flash a été utilisé de jour comme de nuit, afin d’éviter de faire bouger l’appareil pendant l’expérience. Des mires blanches de 20 mm de diamètre ont été installées près des plantes, avec pour fonction de rendre compte des déplacements possibles de l’appareil photo. De plus, elles ont un rôle de mire de dimension pour les calibrations pixel-mm. Elles sont disposées dans l’axe de la plante afin de constituer l’échelle de taille la plus fiable possible.
IV/ Traitement et analyse d’images
Les images sont ensuite analysées à l’aide du logiciel ImageJ (W. Rasbet, National Institutes of Health) (Figure 12). La position de l’apex est déterminée pour chaque photo.
L’analyse de toutes les images permet ainsi de déterminer le déplacement de l’apex en fonction du temps. Le choix d’un point à suivre est important dans la mesure où il doit être représentatif de la croissance de l’apex, et être visible toute la durée de l’expérience. Les déplacements de la mire seront ensuite soustraits au mouvement de la plante. Un drap noir a été tendu derrière la plante afin d’automatiser l’analyse du déplacement de la mire.
Figure 13 : Photo de Populus trichocarpa. Les flèches rouges représentent les échantillons prélevés pour les études de biologie moléculaire.
Prélèvement apex biologie moléculaire
Prélèvement entrenœud biologie moléculaire
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V/ Expression de gènes par Q-RTPCR
L’étude d’expression a été réalisée sur les apex de chaque individu prélevés) différents temps après la sollicitation et plongés dans l’azote liquide afin de les congeler (Figure 13).
Les ARN sont extraits par la méthode CTAB (Chang et al. 1993), à partir des échantillons d’apex prélevés broyés dans l’azote liquide. Les ARN sont ensuite purifiés par un traitement DNase (10X) en présence de RNasine (40 unités, DNase RQ1, Promega) pendant 15 minutes. Après purification et précipitation, les ARN sont repris dans 15µl d’eau RNase Free et stockés à -80°C jusqu’à utilisation.
Les ARN sont ensuite dosés au Nano Drop (Thermo Fisher Scientific Inc) par spectrophotométrie par mesure de la densité optique à 260 nm. La qualité de ceux-ci est renseignée par des rapports de densité optique (DO). Ce dosage permet d’ajuster les concentrations en ARN de tous les échantillons. Les ARN sont ensuite dilués afin d’avoir une concentration finale de 0.5µg.µl-1. Leur qualité est ensuite vérifiée sur gel d’agarose à 2%, en raison de 1µg d’ARN par échantillon déposé.
Les ADNc simple brin sont synthétisés à partir des ARN extraits précédemment, grâce au Kit Superscript III Reverse transcriptase (Invitrogen). Les ARN (1µg) sont incubés en présence oligo (dT) (50µM) et de dNTP (10mM). Après dénaturation des ARNs pendant 5 minutes à 65°C, le refroidissement brutal à 4°C facilite l’hybridation des oligo(dT) sur les queues polyA. Ceux –ci sont ensuite incubés à 42°C pendant 60 minutes, en présence de la reverse transcriptase. Les fragments d’ARNs totaux sont éliminés par l’ajout de RNase H (2U/µl-1), lors d’une incubation à 37°C pendant 20 minutes. La qualité des ADNc est vérifiée par électrophorèse sur un gel d’agarose à 1%.
L’expression relative des gènes candidats a été étudiée par PCR semi quantitative en temps réel à l’aide du kit MESA GREEN qPCR MAsterMix Plus for SYBR (Eurogentec).
Pour chaque gène étudié, 2µl des ADNc dilués au 20ème ont été ajoutés à un Master Mix 1X final (dNTPs et polymérase thermostable), et au couple d’amorce sens (Forward) et antisens (Reverse) à 10 µM. Le volume final de la réaction est de 15µl.
Tableau 1 : Liste des gènes d’intérêts étudiés, leur fonction, et les amorces utilisées pour les amplifications d’ADNc. La température d’hybridation des amorces (Tm), l’efficacité du couple d’amorces et la taille de l’amplifiat sont spécifiques à chaque couple d’amorce. (Forward : sens, en rouge ; Reverse : antisens, en noir).
Gènes Nom Tm (°C) Taille amplification (pb) Fonction Séquences amorces (Forward/ Reverse) CATCGTTGGTGACCAGTTTG TGACGCTAGTTGTAGGGCTA CTGCAATCCCAACAAACCTT ACTTCAGTGGCATAACATGC AGGCTGTTGAGTGGATTCTA TCTTTCTGAAGGTGGACACT TTCTCGCAGTTGCTTGTGTC GCACCTCCATCTTTTGTATTGTTT GGGTCCAGCTTCTTGCAGTC CCCGGCTCTAACCATATCCA TCTTGCTGCAACCCTTTCTT GGTAAGGCCGAGGAGATCAT ACC-CAA-TGT-TTG-GTG-G ATA-CAT-GCT-GGA-TGG-TCC-CT TAC-GCC-TAG-GGT-TAC-CTG-GA GCG-AGG-AGC-AAC-AGT-TTT-CT ACT-ACA-GGA-AGA-TAT-TGA-ATG TGG-CTT-CGA-GCA-ATG-AAA-AGA
Pt-UBQ 52 146 Ubiquitine
Pt-AIL1 Potri.002G114800 58.4 120 Facteur de transcription se liant au domaine AP2
Pt-CYCD1.4 Potri.014G023000 54.9 115 Cycline D
Pt-AIL3
Pt-JAZ5 52 246 Jasmonate zim domain protein 5
Potri.012G033000 Potri.001G166200
Potri.007G007400 58.4 120 Facteur de transcription se liant au domaine AP2
Pt-CYCD6.1 Potri.019G118600 54.9 123 Cycline D
Pt-ACS6 Potri.001G099400 55.8 Voie de biosynthèse de l'éthylène 139
454
Pt-IAA1 Potri.005G053900 55.8 182 Facteur de transcription induit par l'auxine Pt-GID1 Potri.002G213100 50.6 Récepteur sensible aux gibbérellines
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Pour chaque couple d’amorce, un gradient de température a été effectué sur les trois espèces de peuplier en PCR classique afin de déterminer la température d’hybridation (Tm) des amorces (Tableau 1). L’efficacité (E) de celles-ci a été calculée à l’aide d’une gamme de dilution des ADNc de 1/20 à 1/160 réalisée par PCR en temps réel.
Les gènes étudiés sont Pt-JAZ 5, Pt-AIL1, Pt-AIL3, Pt-CYCD1.4, Pt-CYCD6.1, Pt- ACS6, Pt-IAA1, Pt-GID1 et Pt-UBQ. Le gène codant pour l’ubiquitine (Pt-UBQ), est utilisé comme gène de référence lors des PCR
Le thermocycleur Biorad-iQ5 détermine à l’aide de la fluorescence le Ct (Cycle threshold) correspondant au nombre de cycles à partir duquel la fluorescence mesurée sort du bruit de fond. La quantitée relative (Qr) de l’expression des gènes cibles est calculée selon la formule :
1 ^∆ è 1 ^∆ è éé
E étant l’efficacité de l’amorce.
La spécificité du fragment amplifié a été vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose et par séquençage (Beckman Coulter Genomic’s).
VI/ Analyses statistiques
Les données de croissance et d’expression relative des gènes sont traitées statistiquement à l’aide du logiciel R. Des analyses de variance paramétrique (ANOVA) ont été réalisées (en cas de validation d’application). Les différents groupes ont ensuite été identifiés par le test post-hoc de Tuckey HSD, et ont été identifiés par des étoiles. Si les conditions n’étaient pas remplies, le test non paramétrique de Kruskal et Wallis a été réalisé.
