Caractérisation d'un modèle d'étude de l'hypoxie sur les neurones centraux en culture : évaluation du rôle des radicaux libres et des acides amines excitateurs

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Caractérisation d’un modèle d’étude de l’hypoxie sur les neurones centraux en culture : évaluation du rôle des

radicaux libres et des acides amines excitateurs

Jean Oillet

To cite this version:

Jean Oillet. Caractérisation d’un modèle d’étude de l’hypoxie sur les neurones centraux en culture :

évaluation du rôle des radicaux libres et des acides amines excitateurs. Médecine humaine et patholo-

gie. Université Henri Poincaré - Nancy 1, 1996. Français. �NNT : 1996NAN12152�. �tel-01753661�

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http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm

Ph ^Al ~fJ/.J~

~btA..

UNIVERSITE HENRI POINCARE - NANCY 1 1996

ECOLE DOCTORALE "BIOLOGIE ET SANTE"

Présentée et soutenue publiquement le 14 novembre 1996

pour obtenir le titre de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITE HENRI POINCARE - NANCY 1

Mention Pharmacologie

par

Jean OILLET

Titulaire du Diplôme d'Etudes Approfondies

Caractérisation d'un modèle d'étude de l'hypoxie sur les neurones centraux en culture.

Evaluation du rôle des radicaux libres et des acides aminés excitateurs

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Membres du jury (* ^NI' _C~y ^:.;;:

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Dr.Hemi DREYFUS, Strasbourg, rapporteur ~ - -- Pr.Tobias HEVOR, Orléans, rapporteur

Pr.Paul VERT, Nancy

Dr.Alain MINN, Nancy

Dr.Jean-Luc DAVAL, Nancy

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sOlmallte eg~llelne)lt ...,... ~' ...'""... avec 1n3ltlnlae

aSS.OCJle à ses travaux

et pour soutenu

assurant

au m().a.e~le in

ses J"'l>n... C'lo.. IC'I

et

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lJlenv~el1lan(~e et ce octeur _tl~~nn DREY17Urs

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et Dh'VSICl!021QUes

3

r onse et nV~~lOJlO~laUes

4

araCnIlQOIUalle

5

.""" • .lJLI...LLL",""'I,... '-,..LL de la recapture du glutamate

IV. BUT DE L'ETUDE

1) Cadre de l'étude et objectifs

V. S CTION EXPERIMENTAL

1) Mise au point d'une méthode d'évaluation de la production du radical superoxyde nerveuses soumises à .verses conditions culture: à

1. 1. objectif de l'étude

1.2.approche expérimentale

6

51

L.. jl . DIlliC:ID éllUX résultats

2.4.conclusion de l'étude

61

3.l.objectif de l'étude

...""1"'1-1'..&..'-" ..._ expérimentale

3.3.principaux résultats

7

DISCUS ION

e 1.

cerveau Imnlature

1

8

1

nro'von:l1er OU

1

w . . . . .

,,,.1L, consiste en une réduction de l'apport d'oxygène du sang vers les tissus.

Dans un cadre clinique, elle survient essentiellement lors de l'asphyxie où une difficulté, un arrêt de la respiration, se traduit par une privation en oxygène (anoxie) et une baisse de la

v .... ..L""...._ ..._ de dans sang (hypoxémie).

path e apparaissant généralement à la suite d'un trouble circulatoire et caractérisée par une diminution de la quantité de sang perfusé vers l'organe, se traduit également par une hypoxie au niveau tissulaire. Le terme d'hypoxie/ischémie est utilisé pour

ue~;lgJler deux processus étroitement associés et produisant des effets s· . . en particulier au niveau cérébral (fig.l). L'ischémie s'accompagne en outre d'une privation de glucose, tandis que l'hypoxie perturbe le métabolisme énergétique sans altérer l'apport en glucose.

2) L'hYIJoxie/ischémie périnatale

2.I.un cas particulier

li a établi depuis Ion emps que le cerveau du nouveau-né mieux à une en que celui de l'adulte. Cette observation a confirmée par de .a..a.."-'LLL"-'JL _ _ U _ U

re(llUS~~es chez plusieurs espèces, une telle tolérance diminuant avec l'âge. Ainsi, par opposition à l'adulte, l'e t d'une hypoxie sur l'homéostasie ionique neurones du

nOll]Ve~~n]··ne est en peu marqué, avec une période de latence relativement plus longue avant que n'apparaissent premiers troubles (Haddad & Jiang,

e sont en

cerveaux nOlI1Vf~~11··ne et adulte ..."'·.... 'T'n ...

à

ences entre

~ll\ir~ntj~~ (Volpe,

faible avec un taux

nn.:3nrkrt'\t31ntll étant 1JrC)lJ(llJl(~mlent seconClall~e à une

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9

ance

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à en

aOclutlt à

glVCO~~eDllauC~s c_...

locallsees Pl1J[lCl1pa14~mc~nt.,

e

au neurone

est ^eVéJ,lue à

et va se

en ncepl1Lalo,pat:nte nWJOXIQULe/lJSCnemlQU

défici1:: l'h'moxémie

et comme

est cause

mecanlSnle patJllog;eDJLques à .·"'...

ce

l'm~;ufjt1sance car<JLlaClue comme rac;tellI

mtlect]leu:~ ou encore

ou à une ma,laa:le

ou cerveau

sont pa]tlc'U1l(~re]ne]lt s€~ns:U)l~~S

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neurones :srurtrulaa et

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ue mort

th3JLamus. E est

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et14J10gte: V~lne:e mlClu,ant en

une tnrJom.tJo~;e vemleuse.

unilat~;rale., avec

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C,

démontréte dans aSS.OClee à et sur Son ~~ffiC~lcité

...,v... "_", ou O}CV2em.otne~ral)le"l

pr(~mature., souv

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14

• 3.2.modèles in vitro

Des modèles expérimentaux in vitro ont été mis au point à partir de préparations tissulaires ou de cellules dissociées puis mises en culture.

Permettant un meilleur contrôle des conditions expélimentales, ces techniques ont rendu possible l'étude plus fine et plus poussée des mécanismes de la mort neuronale consécutive à une agression hypoxique/ischémique. Deux types principaux de modèles in vitro peuvent être distingués, les coupes de cerveau et les cultures cellulaires.

3.2. 1. coupes de celveau

Des tranches de celveau sont maintenues en survie dans mIe chambre d'immersion et peuvent être soumises soit à une hypoxie seule, par modification de la composition gazeuse de l'atmosphère d'incubation, soit à la combinaison d'une hypoxie et d'une aglycémie en supprimant le glucose dans le liquide de perfusion (ischémie simulée).

Ce modèle est très adapté pour la caractérisation de l'activité électrique des neurones en réponse à une hypoxielischémie puis au cours de la phase de réoxygénation car l'organisation des réseaux neuronaux est conservée (Takata & Okada, 1995; Rice et al, 1981). il est aussi utilisé pour des études biochimiques et morphologiques à comi terme (Paschen & Djmicic, 1995), mais demeure de pratique moins aisée que les cultures de cellules du fait de l'hétérogénéité des populations cellulaires subsistant dans les coupes de celveau.

3.2.2.cultures cellulaires

Les cellules du système nerveux central de mammifère peuvent être cultivées par dissociation de types cellulaires embryonnaires peu différenciés. Les cultures ainsi réalisées sont dites primaires, une seule population de cellules ne selvant qu'une fois pour une durée limitée et ne pouvant pas être repiquée du fait de la différenciation des types neuronaux. Selon les conditions de culture, elles compOlient un seul type cellulaire, neuronal ou glial (culture pure), ou une combinaison des deux (culture mixte). Dans le second cas, de même que pour les coupes de celveau, il est impossible d'attribuer tel ou tel mécanisme à un phénotype paliiculier.

Cependant, bien qu'il soit admis que les cellules gliales en co-culture avec les neurones protègent ces derniers des conséquences délétères de divers types d'agression, il a également été montré que la microglie pouvait participer à la mort neuronale retardée induite par

15

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celllue,le calciuln étant Ull1JJ1QU

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ala"'LTn"t'..

.t"I."""" _reaU1tc~s et transItoires

svs:telJrles eruwnlatloues et soutenue est aOJmnla1J~eaDle

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ael)Olan~sat]lOn accrue l'

ent mort celll11a:rre.

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celllllalres au.I."',l.v.lU."I1 U...13.., à

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et canaux CO\lDl~~S

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sont

ailleurs, l'au ntation du calcium libre cytosolique pendant l'hypoxie active oxy ses intracellulaires au nombre desquelles la xanthine oxydase, considérée comme source majeure anions superoxydes dans les lésions tissulaires post-ischémiques.

cette est initialement sous forme de xanthine déshydrogénase, forme sous laquelle ne possède pas le pouvoir de transfert d'électrons au niveau de la molécule d'oxygène et est donc incapable de former des radicaux libres dans le tissu sain. Dans une cellule en état stress hypoxique, suite à l'accumulation du calcium cytosolique et sous l'effet d'une protéase, l'enzyme déshydrogénase est rapidement transformée en oxydase. La xanthine oxydase ainsi formée va oxyder l'hypoxanthine accumulée au niveau cytosolique sous l'effet de l'anoxie- ISC.nelme et produire des radicaux libres oxydants

J.l.lésions cellulaires produites par les radicaux libres lors de l'hypoxie

1.peroxydation des lipides membranaires

L'interaction des espèces réactives dérivées de l'oxygène avec les acides gras polyinsaturés des

Il'lIIA1i"'l''''l'''Jol'l induit radicaux et CI'J1VCllfO.l1nO'De]?OXlC1e~s"l

operoxydation étant par aeurs auto-entretenue par l'effet des radicaux peroxy lipides sur ces mêmes · ides. La propagation de ces réactions provoque une altération structure et de la perméabilité membranaires. De plus, la disparition des acides insaturés diminue la fluidité de la bicouche lipidique.

mesures directes dans le cerveau de rat soumis au cycle lsc.nelme~ ..re'1Je:rtuSl0fn ont

~"""~~"' ... _ l'apparition produits de la lipo.peroxydation en -a..a._..L.v....,-a..a. avec la

~·a]~an(lOIJlO et

~~'i4- ^... ra';lQ.C)Se cellulaire en conditions hypoxiques provoque la dissociation du ses

~"'''''!~V''''''''' ' ..._ ..

..L"'.. ~_Oj transferrine), la de libre aux ~"'-l"~""'I,.la,u.-f~

à la propagation de la lipoperoxydation (Siesjô et al, 1985).

23

S'alltOjz;enèrent en une .1. WCllWI"JlV.u.

.... n ... L"'ft··.... ent eg~llelnellt à

eX(~mPle en a02l1ssant

es et canaux lOIltlQl1eS me:mt)rallaJ]res~

notaSSJLaU€~S a' If (u-o!cJJtla01er

canaux ^1.1' ou

en reCllUlsant ra(~tIV7Jte à

r

meCatlUSD(1eS cellul~lrrt:~S a S à

aOJmn(18~~es accrus

car C_.-....__

en

re

1l a]tlc'ul1(~re]ll1ent

un

OXVclatlI

rellrOnl(lfe au racltlV11ce d'emWDles

llVILlV"U.WI _v''''''.L ....'.. ...,A'VJL.L~ entre autre en mttlOWllt

lDll:0CJU-OIlO11Lale et rédullSelrlt

svsterrles 1llo.LoJtla é le I"Ole eXCItateur

caI·acl:ert~S l'4()nt: C1c;~Sl~Ole comme un neurotransmetteur.

tamate est un a ·

nTf~mleTe~s ellla~~s rrlen~ees en èlelctr()pJ1.YSlologle ont

au _"'f'ltTt:Jt.n,.. du sv~;tè]me nerveux cen

TI est comme con

hb~~rat:lon et

ce

au 1

agIs~;ant

aux

~utan18te ressort des étlLldt~S

du aux

V\ol\o"'I13I13I...113

I."... e.

dudévelol)pelnent céré~bral en cODmlé:me][lt d

rOl)O~~e comme SU1J~non

une

comme le :SlgJnal

crO'lSSan(~e nenro neuronaux

il a

vlastlcate A.L_~""'" "".JLL..._ et p S pa]rtlcul1«~rement

tenne

enc~et'hal01)atllle~s mLte(~tleuses ou

d·Al2fienner"l

"",,,,,,JI.\oJVJl.UJI. ou à une

-m!Qel)eDcaaJIlIS et

ts ts

glu1tamate ,__, ___

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dejtm1tlVe, est reconnue

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), t

OnOl)ent~moa.te (

svs:relJnes nelLlr().mt~01.~teurs canaux lOlJl1Qlles

ens~em.Ole comme anl:a~onlst€~S

montrent antag()ills.-tes non COJmpetllttts mt(~raJnss~ent

comme un

CV(~la2~oc:me et ce

ou

antJlCOllvulSIV

ant à P.L_ v .

nleurOD1~ot~~etIlces ..

e, est

2;1v(~me (Rt~vnolds

mtert1LglS;Sallt au

avec en

ant:a~~oru,ste non- r'l i~'11 ^{j A}

xaJlneôlonles C

s antag()IDsltes et

C01LlDJlee aux courants lOIlll1111eS

mo

onses et

eS5.entleJlleInellt uemLlea,llle au '-oIU.I.'-'.U,,,lu...l..l..

courants es Rt"'... ·1"I:TI:.~C"I

f,. n,'. 1.""'" sont ma.euc~n(]lanlrS

es

ons

otentic~l <le -

et au-

N1\IUJ.f\ est uratlQllemlent

maf2~eS]Lum. Ceueltldatlt~

a eg~llelne]lt ,-gJlut~lmflte au receuteur ·'"' ·

en avec sa

il ~e

re(~enltellfS ms.enslbles aux eur

de le (listinguer

agotustc~s eur

Do:sseamlt une

4- t~ro][I1o"nO]rno:lbot

et

anl:agoruLst~~s assez couramment ut1JL1se's.

SO(llUln et U01CaS!;lWn une

et

teurs non et

__..._ ..._..., CO][J.Q1[lOnS ""'V.I.l.J..l-LL"'"

pOlJLlTailent être

en

sont souvent

k

concen1:ra1:1011-dlépenc1aJJlte.

k ate

structure sm:U1aJl.fe~ en erses

en

ence un

ou

~nll1V~lpntQ aux

canaux lOlJ110l1eS

onses Al\1Pl\ e:t k.afuate ~ ... ^_+.... ~+

(X-

et ont une a

KallD1(]IUe à son all()Ka:ID1(lue et

anta20:mstes C01(illtIS

e

an1:ag'ODJlste~s non- ont

neurones en cUlture.. Kamate

ou aux

on inhibitJrice

amate.

cortex 0

ate r onses

SVIlaV1tlQues

s

namLes et neluev

comme et a:L··aareD.erl1~Ql1eS.,

teurs et aWLSS4~nt au ....

n"~T'nh1r~ni-::n.,,~ en

sous

W1 autre

'""... 1i...,,...,..L~L""une

tenne

neurotransmetteurs ou

ft11:",_h,.,o>t:"' à avec

canaux ont ce1J€~naant

1Jr(~ce:ae]f]les. re2!()u{)es

avec ces

rec:enl:ewrs nlet:aO()tr4)n€~S C4JU1jtleS à

l'ele'v~tl0n

h te attl1111te uet,enClan-re

n

_><:3..'...

à une eXl)OSlrl(J~n D:rOlI0n~!ee

va

eXIsteJralt Dlulsle-urs meCarUSIlrleS 1>O~;Sl[)lleS à '"-_.--..-

~""~"'U.l..LI.UI"\,,f eittraLCeJlultUre au

une """''''''''''01-._'''''''_''''''' UU1!1U

(lVlaSSleu et ila

nt

contenu

neurones

~ll'v:nlt l'

eX1;ra(~ellUl~llfe va et

AA._...

_lL7 au glultarnate,

ement ID1 me:Q13ltetlr

tamate.

N]ID~Aen ..·dessous en

re"::oosltllon et rannaIltl(Jtn

rlS(~ne]tn1e pr()JvotiUeralt une retour en C01!ldJtlons norm

mort nPllrnrn~ilP

CO]!lcc;'nt]~atl.ons

extracaU"I"lln'l'l'"a aUgrrlen'ter

SerlSl()1l11~e n"f)v'.. ~n l a au Nl\IInA

ceux

neurot

in

e et cette

_ 1 1 1 ' 1 1 1 1 " _

à

neUl~oeX4~ltot,oXlC]Lte (Mislrra

un meCaIlllSDle Dlotellltie modttlcatlon nt\ll"'{J!l11't

ont

en C re

Cal)aC~lte à mOlUll~e une CV1:ottll)Q.Cltle.. 1·"'-r'\...,~n...,fT~n,..,

1

en neurones :utamater~\.~U\;"'13 ,·exleID1~letvPe est

ra~ne~sSlc~n ftVO()Xl(lUe et

tamate ses re(~e1JftellfS sernOlent C'n,11nlA1rtl'

neuronaux

survenue

mort

en

neurones J.LU.JJU'-"VU"Ll..U.1aux en ex:act:enlenLt.. comme

extraCeJluta1ft~; ou encore

ne

travaux elIc~CtllleS in vivo a con "t à reE~va.IUE~r (1u~ll1ltaJJnatie., notamment cas

une eX(~lt()toX1c;lte

stm(lUl~ltlon

une VJ.'.n..' .. "'''''''''''J.. ^VJ.J.

rn'rooX1e co

eüet étant ega.1errlent ces __

agJlss~~nt sur

·exclt(ltoXIC:lté

dé~~a(lation

ext:raCelllJL1alJre et

taux amate

Ll..V''"'''.LU' ....LVJ.J. accrue

cette a.ei!:ellLert~SClen(~e (JjulSSOtn

nr()vo;ouent une

à l'in~!ctjvation Q1f

ectem.ent au ...,_.... _.... J._e d'h'vdr'O~4~ne

ces svstenlles rec re du 2111ta:mate:

a~rrO(~vrE~~ v''''... ''''....

en ~11Itl1T~ eXl)Jos(~S au svstenle

est letaoli cerveau

",,,,,"M~.L"''''''',, sa m(]Jmelre vutnerat)1ll1:e à

à une ~""""I( T",,'f-'1l"llft en e

xiej/isc:hélnie a à un me·[aOIOllS~me

meïJlleur!es capacit:és d';adal)tation. Toute1tois, l'en.cépJl1alop

~hé:mt(lue aelnelLlfe une ca malc~lLlfe de Dlorb:idité périn~Ltale. blle~ entrame drvers

l'inte:rprétatÎ()n

celllilalres et condl111s;ant

~tJl""''1ftn1~nIQ sont en(~or~e hYP4lthéti(lue:s.

e difficile: pa es celllilalres J)re~seIltatlt

ateurs pérÎJ)hé:riqlleS., au onse ceret)raJLe CepellClaIlt" oDs~e1Vatl(.ns efiè~ctu.ées sur

p rs hvt)otllesc~s

dér~;gulation

calc:luln pJréccéditnt :la Jlnort nelLlfon~:lle re'tar~dée~. C:OllSé1cutivement amInes excltatelLlfs part]~Clperalt

paltlcllÙ1e~r" llUle proOluctlon accrue de radicaux reS;OO][lSaOle CraJlter'atlclns membran.a1fc~s à l' e

celltulalre en

faC,CUInutatlc.n extracelltuaire cie jglu1tan:18te

a

neurones centraux en cUlltUl~e et d'aIlal"Vrser les meCaIUSI1nes mOleC1LU3JtreS

travaux au cours cette se vr4()V4JSalleIlt

la en ent

son

a am.orulQue.

ae,rel<lpper une eu

cont

\01\01.1. \oIUJL UJu....'" notamment en ... a ... ""E'lla

.a... .a... jOlr.... au travers nous avons au

SUSlpec1tés

me

SUlVenue

sp~~ctro1Jlnotome'tn(lue

ate

amater

entes l'IOCC''t:.''C

ous avons eg~llelneJlt

r et ael)0J11nsant

notre mo e

neurones

ces

et

..I.'IW-:lt... "'""'~ VV"''IW"IJl"~ sont resum.es~

contexte

conCIUS,IOlJLS

Ct·t) ... 1l"\·'''II~ autour

1.

c e à e

notre ne

ot e d et d en extrace r

ns neurones en ous avons

st- ue

au lab,oratol1re au

sélil1D1 de veau neurones ont été: place;s <ians illl trans~ltOlfe]llle](lt eILncJtu ~m

5

aecnte en détiil dans ranne}(e te~cJlIuQu.e.

neurones a co

neurones ont

s a

s ons

C 1 p

et

a

dtin.cubtaticln (les celll11es.

ont

ue en contraste

cel1U1t~S a

aucune 3 comme

2 est e1eIneU.ree mCnaIlge1e"l

aomrnaJ~es celll11~'urf~S

neurones en atmo

nota à ragr'ess~on

amnntle à

en Ac'r1I1Ac"t·""'~ une nrll11111Cfl

tenlOU1S sans à

taux sont à ceux

cultIvés

ente en tOllctllO CnnmQ1L1errlent d

neurones

a accru

rè<J.xv;gèIlatl.on., ce Dn~~nc.mc~ne pouvant

suJ)er~()~rdes Œ3lLS lC~ mille

neurones lllilillltenlUS

es neuronales clùtrvéc;~s en Drf~sellce

Cllillnt.Quement

INSERM Nan /. and * INSERlYl

J Cereb Flow Metab. Vol. 1995

Neuronal cultured cells

•

•

100 r---'::f

90 SO 70 60 50 40 30 20

o

0 ...

Aeaults are eXIJre:SSEtd sured with

was repeated two or three times.

J Blood Flow Metab. Vol~ 15. 1.1995

••

..

10 15

*p < 0.01 (Dunnettts t test for eXtl!resseà as mean values ::!: 5D from 12 r'epr1eseJrlta-

cor.res~)Oncls to the normoxia-normoxia

Cereb Blood Flow .Vetab, 1'10. 1995

J Cereb Blood Flow Metab. Vol. 15. No. 1. 1995

J Cereb Blood Flow .\Ierab, Vol. 1, 1995

mun 65:597-607 Borg J, Sptitz :B, fiam

neurons from ization, glutamlate uration

Bottenstein JF" Sa~to 'G (1979)

brain. 1V~",.n"'r'"

'-''''.1.&'''''1.11..'''''''''';' DE, Parks DA, Patterson G, Roy R, McCord lM,

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Wc

Pin IP, Sebben M, Kemp Bockaert J (1986) :>yrlapt:Oge:neS,lS

rons in serom-free metrp)noi

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consequences. Brain

Sies of antioxidant

215:213-219 Rh

ner-

Suzuki J (1984) Cbemiluminescence Correlation between energy

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lscherma-re~perfuslon injury?

MurplllY El,

GoldbergWJ, Ka(iing() ~(,

LTnerSI-~llea JF, Livertoux MH, Minn Perrin

mediated formation initi-

eX()RenOI1S molecules in rat brain preparations.

Blood Metab. No. l, 1995

l'

neurones llf()QtlctlLon neur()nale 1* ortance

'1T\t:... nv1~ tra:nS11COll~e à

s <lo:mn1a~;es

CO]mDart~S à ceux ^00t,0011S nous avons

orpnOl

O)Ut:Jue et fon.cti()nn,elle

~'n,n~T1~1l=lo l'aU~gmlen·tatLonL et

~""''''''''Y'''''''''.I..l.U'''jlV.l.Jl sur rm.te~tnt

nous avons caux

TI est

ctate destlvdro~!èn

tecnnJlQue.

l'utilis.atictn est nec:ess:me neurones

mOfDJ10IOWlQ

ta on l\IeOfi- ~Jn,~er

neurones en __

es à

mesure 1-

ra

nV[)enl1lel:aO~Dnsme ceJJlU1a,rre.

ael1~enc~re~;ceIlce41 q

a aUp;lllleJnte

modttièslgmtlcatlV1ement

S neurones C""".L~'V.LI.4"",(:II.

st er une

u.~''''.J.V'.LI.

OnLET" VIOLETIE KOZlEL, PAUL

INSERM U.272, 54013 France

Brain and/or reoxyge:natlon im'OOI:tarlce in of neuronal ischemic insuit in neonntes"

S.P.

Santé Recherche Médicùe and. a

p r i t I1~m œeJ::uropem1J~JflODlllC <:ol1llmumlY, Bioœch.nology Programme. Coattac:t No.

Abbreviations

~-etn3ne~iUU:on,lc acid

w,,,,,..

y . The

nonnoxia and

been inv'estutated on the consequences of a severe ^eDl,SOC1C

598

nmin

reduced was eXt,ressed

hyt:»OX1lque/lSCne1J(].lQlle

mouvements lOIUQlue~:;.,

modifiications· de

d'un é:pîsode une

SUf1Cnarge va active]r d(~s

structure

COlnpalree:s à

ev~uuc;~e en

ont 8

on

ceDltrifùg~ltions

et

a non

me~mt}r3J[lalreS ont

ou non

neurones ou

tbrebmin.

Animt:d.t.

the observation of smears.. ""m~C'!I.tf!:-tJ~lI1t,.'N

Janvier.. Le Genest-St-Isle. FnmecJ were housed tagether males we:e œ= ^mainmined separ:ue =.gcs..

rB]G.:umm,1Zt1t rcma1 =li C'.ùtures

wlm mi of mM

sodium acemœ and

V'iU'O.. DC',J-

0.07 tagprctteiJaiditsh) wen: rinsed. twic=

co mM.

and wen: then incJ.baœd 30

Table

cultures md culture membranes:

.""cmt difference between culture md newbom membranes (Bomêrroni

33..3 :!:

49.1 :!:

and Comum.. C. W. 1982. Chloride ions ta rat brain membranes.

10. MeuLE.

enhance

Brain Res. _-r..,'_.. ç...-...

Il. Foster. A.. sites in

mammaiian membranes: ^their characteristics and rela-

ta synaptic receptors. ^Brain Res.

Mcthods in N~

New-York.

29.

con'~entra1tioIlS to

pa]~alllèlelneJlt aux att

rea.nSt~e sur

tamate

une mort cellul~lire

e

à une

.... lI.&lLl'ILf"tJ"lL ...

aux L\O;.LJLl.V.lll\:)...

neurones taux

lOIJl~èie avec une mc_me1re

helLtres.. narallelement à une

qu'un eflfet deDrt~SSel11r .... "'-...,.~._ ...""

.... _ L i ' L I " ' - I l L L

aux ternOlns.

Qe~~en.ert~SClenc:e à

r a'rre~;Sl()~n n~VD()Xl(]Ue reslstt~nt

,·eXlcltc.to,aclte ne senlble

e lesefft~ts (lélétère~s de l'lrVPclxie DOU.rrallentetre

cette Cytot(.Xl(~lte

à teurs du ~lutalIllilte.,

neurones

s neurones

(Frandst~n & S

pelturllatlons

être le refl.et (l'une

rn'ro()lX1e~/lStCne~nne"t mlett~lnt en

~aJlcneZ-t'T1leto

au ~1JLtalnal:e

neurones SOllmlS vitro

e

au tamate

dO:lD11na~~es neuronaux

en

non-r~MUA

neurones ml)DC,camt)aULX Tou1terC)lS.. cette n'1'I-.",.... noc'lO a

a COI1UUlt

cours

gOIUst(~S u1:1I1sc~s sont

a20Jn1stes

neurones centraux rat en t'ullnu"p

eurs

Bethe:sda., :MD,

e

rates

tenlellc~s ont oe

en acc:oulPlelme11t Dlena.ant

ou steJnu~;e

s

es à court

ourvu

zeux

~t~nS]LOn est nasse~e au

l'h~ùoithane, son aOCLonlen une

une ";'''''''''''''V..lJl'''''''''' no:m(J'~e]r1ellsat]lOn

e COIllten"ant

su~;oenSl.on cellllUllre est TP~11QI='P

dtllLltl()nap)lrOpnée, P{lUf tm~tlleltIlent ensemencer

en conâltllons StaJllQ~lra.

ne sera sont ~ft':'I'1'1'11'~ rc~lacc~es

neurones se

sans un

ou neurones au cours

m

CUjttu]~e est mtc:grlalellD.elllt

et ~lmé~liorent

len.d.etnaIll~ le~ mmeu

en rmones et mlcrc.el(~mlents~

cours GrlowthF a4~tor ou

500 ~tM) ..

maintif~n de la conca_+...n+"iIC'- in~tiale (le

ont 1 un nouveau ement

eu extracelllllalre. U~~S

kalnat:e ou au tranl.:7 s.lL"""'",1L A-'

mune(llatement utll1:sees.

cnêm~~en(leIlt en neurones au

COIlcentr:atl()nS en nr()te:mes..

nh~::!l3>nu::J.{:a au nnc~rosc(.ve

et ence.

u ramifications en

encore

hOlno~~ène

neurones se sontmalmtenus en un es. Au st~ld

ne

inte~rce~nulJlire:s. L,a p:rés~mce

tec~bni~~ue' dt(;~xc]~usion au bleu trvnarL

du g!lltamate

de ~)l~es de de;~éJ]lér(;~sc~mce.,

CWm.t1l1er à

IiW,,'\..L/V\3.I.L..

U.J'1.I. au tamate contre aucun au

A.A""' .... u.""'..::J au,x <1ttJ:erents a1!:{)D1SP'tes SDc;~C1IlaULes:

neurones ne nrt~Se11telllt

IL leglu·taltlate nrl1f\ln.'111P égalemlent une mét:ab()~lisn1e à

ort aux tenlonlS

Dr()VO~au;ant une et

s ag()lliSJ'tes ^1'"

1"

neurones

n

ences sign:itilca1Civ€:s

sur re"OllltlOrn tr H

ort

24H

te ps

s au tamate

72H

7 H

emp

&A

au amate 1

alutaIJnate", en nT'E~s:el1ce rmbIbltellr (le sa ^1. \.f""4U I.U..I.. '""

l'évojluti(~n (lu neurones

6H

mp

*

E. S.M. obtenu1es à

teRlom au

7

A../.V' • .J.Y..L. Obl:enlLles à

1: trai1:emt~nt <iéu()larisant Gll11: 1:raitement au

NNlDll: t]~aitt~me:nt au NMCDA

t

24 7 H

à une àel)ol;an~;atllon

ecnantUlons.

7 H

t

au Kaltlate

.MJ..l'J.rl"\.., au Lla.l.l:S-i~vru

SDeCID~C1ue et <ie l'mcorporatlc.n dlu l-dès,oX)'glu.cos.e d.ans

72H tem

lUUUM) sur

réswtats sont ate

enues à

JL:&._....'"-"'-_"-'" à l'Al\1I)~ au ans-PlCJtJU ou au

tr A.. C]~D: tra:ltelnellt au trans-

24

m

7

au _Nl\ID.i~ ('100

GIlll: trait:em.ent au ~u1tamate,

mp

Slgn:r.tJlca1tIV€~S avec

à une ae1POJansatJLOn

upc~ té~mc)m au me;mf~ Ie:mt:tS

GIll: traitement au ~u1tamate, en aDS~en(:e

NI\'ID i\: tl'alté~m(;~nt au en

1

2 H H

e eXlJO~;Itl0n

moyennes

l'Al\iPl~ au ua.u~·l"\.\,..IrJV ou au

l-d.esc~XY~f41ucose

ternOln au

neurones

tr~4CP]D: tr~riternent au traIlS-~lCPID

ate: t t à

72

s

partir' de :30 le ~~()~upe

au

ItNV1Pl~ au "..,.."...._...

tr ACP]I):. traitelnent

te: traitellLent à racide _ka:mi~lue

ranes nelLlre.naies e exp()Sltl()n tr;msÎ1:oire: de

cer1tam. de· letlf ll111pll,catJLOn <lW1S une excltotoXIlclte pot1enti1elle.

réc:ep1:eUlrs elles

neurones

sont nnl12es"l

e de rh'vpO~X1e eV()Quant une nellro'toxlCl1ce

6 à ^U '1rt'l'l1r-C"

glutalJnate comme mecanlSnle

l.tnI)J1Quant une

1 1

1

1 1 ,

un

alC1Que à travers

la accrue _·ft"".... _ ... araicmclODlQU.e.

ac· e et aUJ;!mente

OU MtlPJ~ ^C()nalUr

une m()mc1re

SelJLslt)1JI1:e ou

neurones

l·n'rrt~·V"tA et une mort

une

mort neuron

ou Se(~OrLa.alrre~m(~nt en

une Dr(~Ceae:Jrlte

mû

1.

s nellrOJneS nous avons I.J1l1~j'lIl1ILJI

""""""A..I....

~

en

sont mC'uot~S

te,"I""t"11t ^n1'r.au::!

_ n ... ...,.~I ..

e à une _... ^{·lI:Tn-r1~ ...}

d'nlCtlbatlo~n sont

notre en vue

ae fli~utamate.

... _... ..,_... '" aux

une

c es et

comme

ortance

Cr()~lSSan(;e et

notre m()ae~ie.

ces

en

neurones en cas en neurones

contre

994~) et eIl dimiJJluant

COIlQ;U1SeJlt à en actlvall1t

calCiQues tranSlne]mbraIlall~eS.,

ceux Cl111r.1Vf~~

1 TI a e~alelILent

amate

neurones tmmatulres

s terme

eVt~nnlelle

_ _ ' ... _ '_ _ A

nous

neurones nytJO,rrQlleS

rlSCnt~IDlLe sur nlU.Sle'urs

CellU1(~S nelVeuses

aux. taux et en Dre~sellce

une eX10o:S1tl,On au ~""."U..Luu. .."". TI

notre mo~ae~Le

sec~on.(1a:lfement

en

neurones Y_J~""''''' __ ·.c:.. eJmorv()IlJ]lalI'es..

mort

Of()Ce:SSlLS 0 avec ~""'jL1""'..t.U""'.V..u..

en et

en(;~rgt~tlQlue.

une

e

e ~

ceIVeau nous

lW_a.' _... .JI~_~ .. _ aux C01[lCt~nt]rat:lOlJlS '-.,L_V'~ ~""_lW

SchOl1Sb()~e~

a_a.. a L V U U U L / " " _

il senLDle

neurones ceIltraLUX nmtnal:ur€~S

réc:ep~teur, co:m:m.e

rec:enl:eUJrs muscanm.qu~~s ltLllltterBllt

Lasynlfuè:se 'protél(lue seraIt: ég;ale:mellt piertllrb~~e {_ar!'!

- êii

maJ,gré son

nous co:mtJ~arler()nS

correS04[)nCleI1I en

à travers un n""I,\{'lO~,C'm'IC!

celLul~l1re retar

celluIa](fes. Cepe~na~mt"J nos result~~t

mort

celVeau nnmatUI~e

sv~;te]ll1e nelVeux ns

neurone cont uent

un me~larlge

calracterlstJlQUes

amma,uxut

e étéiso~lées, iUS'QU'~IU

enlectue~~s en C011Œl1:10I1S

no]nO~g;e]]le allautel le:s (~ellUle~s at1h~~l"PJ1'1"t rest:ent accroché~estollt

amas sont

""""""'''''''_1ii.J' de _:leUl~ place:nta et

tnllCr()tva:LSS(~au.x S~mll;mtlS sont _...-...'... une rate

_A.lL.Ic ..._.a.&.lL

en

me:nm.:ges et

neJmatO(~vtl0ItLet]~e et à

nnale~m~~nt ensemencer v ...""

rmlcu.oatetlr en ",,",VJLL1I.I-Jl".I.""'JUl..J' Stano.arCl.

difiëre]l1tes

.... L&.lU'LI''''-I ...

aux teruOllllS.

125IDM.,

cette soJlltit()nsalin,e.

SOJutl.on ta on

cel~eb:ral lSjcht~1lllla on

tamate omam~~

the~ unmw.nrre rat:

tamate

"""",.1.'-'..., ... me01a"tea neuroto

currents

e

f'111Ihl1r&&rI rat __... "'..._... neurons.

terme

Nl\ID.A rec

llil)JuoCatnD.fll neurons:

nellro·toxlC11V at

tamate

rat en

on __""._...

cts

tamate on

ra(llCalS on

en concurrent

denrlVatlon

., J. amate

1.

B

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.1. . . . .,.&&.&, Prénom : o ILL E T Jean

Doctorat l' niversité He · Poin Nancy 1

en Biologie et Santé

VU,APPROUVE PE~RlW:S lD'1MP.&"'-L...,..."..

Nan :3 FiV 1997 ,,'! o

J

UNIVERSI É HENRI POl A É CY 1

24-30, rue lionnois B.P.3069 54013 Nancy cedex Tél 83 32 81 Fax 83 32 95 90

1

Résumé:

Il est établi que le cerveau du nouveau-né résiste mieux à une privation en oxygène que celui de l'adulte.

Cependant, l'encéphalopathie hypoxique/ischémique demeure une cause majeure de morbidité périnatale. Les évènements conduisant à la mort retardée des neurones soumis à une privation d'oxygène ont été étudiés sur l'animal entier dans des modèles in vivo, mais les mécanismes impliqués demeurent hypothétiques. La perturbation du métabolisme énergétique pendant l'hypoxie/ischémie serait à l'origine d'une dérégulation des fonctions cellulaires, aboutissant à la perte 'de l'homéostasie ionique, une surcharge cellulaire en calcium précédant la mort neuron5Ùe retardée et une accumulation extracellulaire de glutamate. L'activation des récepteurs des acides anlinés excitateurs participerait à l'influx calcique et provoquerait l'activation de systèmes enzymatiques aux effets délétères. Par ailleurs, des évènements se produisant pendant la période de réoxygénation pourraient également être impliqués dans la survenue des dommages, avec en particulier une production accrue de radicaux libres dérivés de l'oxygène.

Afin d'étudier les effets de l'hypoxie/réoxygénation au niveau cellulaire, il a été mis au point au laboratoire un modèle in vitro de neurones centraux de rat en culture. En vue de mesurer la production de radicaux libres dérivés de l'oxygène par les cellules, nous avons développé une méthode spectrophotométrique pour détecter et quantifier le radical anion superoxyde dans le milieu de culture, en mesurant la réduction spécifique de l'acétyl- cytochrome c. Cette technique a été appliquée à l'hypoxie pour montrer l'évolution des taux de radicaux libres à l'issue de l'hypoxie et au cours de la phase de réoxygénation, et pour analyser l'impact de l'hypoxie sur le métabolisme énergétique et la production de radicaux libres en relation avec les conditions de réoxygénation.

Afin d'évaluer la possibilité d'un mécanisme excitotoxique de l'hypoxie, nous avons étudié l'expression des récepteurs des acides anlinés excitateurs par l'analyse de la liaison du glutamate et son déplacement par les agonistes spécifiques des différentes classes de récepteurs du glutamate: NMDA, AMPA, kaïnate et métabotropes. Nous avons ensuite analysé la sensibilité des neurones en culture au glutamate et à ses analogues en relation avec le degré de maturité des cellules.

Ces travaux montrent que les neurones expriment les différentes classes de récepteurs du glutamate après 6

jours en culture et que l'activation de ces récepteurs par le glutamate dépolarise les cellules. A ·ce stade,

l'hypoxie provoque une mort neuronale retardée corrélée à une production accrue du radical superoxyde et à

une altération du métabolisme énergétique, mais ne semble pas impliquer un mécanisme excitotoxique. En

effet, les neurones après 6 jours en culture sont encore immatures et résistent à l'action de doses toxiques du

glutamate, alors qu'après 13 jours le glutamate provoque une neurodégénérescence retardée principalement en

activant le récepteur NMDA. Ainsi, les effets délétères de l'hypoxie pourraient être médiés par différents

mécanismes selon le degré de maturité du neurone.