Contribution à l'analyse post-génomique de l'interaction entre le peuplier et Melampsora larici-populina, le champignon biotrophe responsable de la maladie de la rouille foliaire

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Contribution à l’analyse post-génomique de l’interaction entre le peuplier et Melampsora larici-populina, le champignon biotrophe responsable de la maladie de la

rouille foliaire

Benjamin Petre

To cite this version:

Benjamin Petre. Contribution à l’analyse post-génomique de l’interaction entre le peuplier et Melamp-

sora larici-populina, le champignon biotrophe responsable de la maladie de la rouille foliaire. Biologie

végétale. Université de Lorraine, 2012. Français. �NNT : 2012LORR0110�. �tel-01751088�

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Résumé : Melampsora larici-populina est un champignon biotrophe qui infecte le peuplier et cause la maladie de la rouille foliaire, entraînant d’importants dégâts dans les peupleraies. Un des objectifs de l’UMR Interactions Arbres/Microorganismes est de caractériser les déterminants moléculaires de ce pathosystème. Au cours de cette thèse, des approches post- génomiques ont permis de mener à bien quatre projets de recherche. Premièrement, l’analyse du transcriptome des temps précoces de l’interaction peuplier/M. larici-populina a révélé un transporteur de sulfate de peuplier fortement induit par l’infection (chapitre II).

Deuxièmement, l’analyse phylogénomique de la famille des thaumatin-like proteins (TLP) a entre autres mis en évidence certains clades spécifiquement associés aux réponses aux stress chez le peuplier (chapitre III). Troisièmement, le gène codant la petite protéine sécrétée Risp de fonction inconnue est fortement induit lors des réponses de défense du peuplier et n’a pas d’homologue chez les autres plantes. La protéine recombinante est intrinsèquement désordonnée et présente une double activité de protéine antifongique envers M. larici- populina et d’éliciteur endogène des réponses de défense chez le peuplier (chapitre IV et V).

La combinaison de ces deux propriétés n’a jamais été rapportée chez une protéine de plante.

Enfin, les gènes MlpP4.1 et MlpH1.1 de M. larici-populina codent des petites protéines sécrétées riches en cystéines et de fonction inconnue, considérées comme des effecteurs candidats (chapitre VI). L’expression de MlpP4.1 et MlpH1.1 est très fortement induite lors de l’infection des feuilles de peupliers et des activités de virulence ont été observées chez Arabidopsis thaliana. Les analyses biochimique et structurale des protéines recombinantes sont en cours et ont déjà permis de démontrer la forte stabilité de MlpP4.1, probablement liée à la présence de plusieurs ponts disulfures. A l’aide des protéines recombinantes, plusieurs partenaires protéiques ont été identifiés chez les plantes permettant d’établir des hypothèses quant à leur rôle.

Mots clefs : arbre, basidiomycète, peptide de défense, protéine PR, effecteur

Abstract : Melampsora larici-populina is a biotrophic fungus that infects poplar and causes the foliar rust disease, leading to severe damages in plantations. A major aim of the Tree- Microbe Interactions department is to characterize molecular determinants of the pathosystem. During this thesis, four research projects were achieved through post-genomic approaches. First, transcriptome analysis of the early interaction between poplar and M. larici-populina revealed a fungal-induced host sulfate transporter (chapter II). Secondly, the phylogenomic analysis of the thaumatin-like protein (TLP) family uncovered some clades specifically associated with stress responses in poplar (chapter III). Thirdly, the gene encoding the small secreted protein of unknown function Risp is strongly induced during poplar defense reponses and has no homolog in other plants. The recombinant protein is intrinsically disordered and presents a dual activity as an antifungal protein against M. larici- populina and as an endogenous elicitor of defense responses in poplar (chapter IV and V).

The combination of both properties in a single protein has never been reported in plants.

Finally, M. larici-populina MlpP4.1 and MlpH1.1 genes encode cysteine-rich small-secreted proteins of unknown fonction, considered as candidate effectors (chapter VI). MlpP4.1 and MlpH1.1 expression is strongly induced during poplar leaf colonization, and virulence activities were observed in Arabidopsis thaliana. Biochemical and structural analyses of recombinant proteins are ongoing and already revealed the strong stability of MlpP4.1, likely due to the presence of several disulfide bridges. Several plant partners of the recombinant proteins were identified and have allowed for setting hypotheses about their role.

Keywords : tree, basidiomycete, host defense peptide, PR protein, effector

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Remerciements

Avant toute chose, je voudrais remercier :

les membres de mon jury de thèse, Sophien Kamoun, Thierry Rouxel, Olivier Lamotte, et Jean-Pierre Jacquot pour avoir accepté de lire ce manuscrit et d’évaluer mes travaux,

l’INRA pour m’avoir fait confiance avec ce Contrat Jeune Scientifique,

Pascale, Eric, Nicolas et Francis pour m’avoir permis d’effectuer ma thèse dans l’UMR et dans les équipes ‘redox’ et ‘écogénomique’, pour leur accessibilité et leur écoute,

Armand Séguin, pour m’avoir accueilli par deux fois dans son laboratoire à Québec,

Hugo Germain, pour les séjours exceptionnels passés à Québec, pour tes conseils et ton amitié,

les membres du laboratoire d’Armand à Québec pour votre accueil chaleureux, Thomas Kroj, pour avoir accepté de faire partie de mon comité de thèse.

J’adresse un remerciement particulier aux personnes suivantes:

Nico et Seb, beaucoup trop de choses à dire ici. Vous avez fait de ces trois années de thèse une expérience unique et inoubliable. Je mesure la chance que j’ai eu de tomber sur vous deux, ainsi que des conditions exceptionnelles de suivi, de formation et de conseils dont j’ai bénéficiés. L’aisance avec laquelle vous assaisonnez professionnalisme, passion et décontraction au travail crée un cocktail efficace et agréable dont je mesure la rareté et que j’espère retrouver dans ma vie professionnelle future. Je vous suis reconnaissant pour votre réactivité et votre application à améliorer chaque partie de ce manuscrit. J’espère avoir répondu à vos attentes. Dans un registre plus personnel, merci en vrac pour les nombreux BBQ et soirées arrosées, pour votre goût prononcé pour mes blagues de mauvais goût. Nico, merci pour les jorky, les fléchettes, les soirées (nuits) à jouer au tarot, les sorties VTT, les KFC. Seb, merci de m’avoir fait découvrir le capitaine et pour tous les mails intitulés

‘genomics’ quelquechose.

Stéph, tu as accompagné mes premiers pas au labo, j’ai entre autre découvert avec toi le mot

‘effecteur’, la RT-qPCR, comment faire de la biblio, annoter un gène, et tant d’autres choses.

Nos discussions quotidiennes durant mon M2 ont fortement contribué à mon envie de continuer en thèse. Merci pour les collaborations fructueuses et j’espère que l’on aura l’occasion de retravailler ensemble dans le futur. Merci également pour les parties de ping- pong, les jorky, et les soirées BBQ-bières-cocktails avec les olives qui flottent. Un grand merci à toi, à Delphine et à tes parents pour les nombreuses randos dans les Vosges qui sont toujours des grands rendez-vous.

Arnaud, merci pour ton regard nouveau sur les méthodes et approches du labo. Tes corrections sur ce manuscrit ont également été très utiles.

Calypso, merci de m’avoir fait confiance pour superviser ton M1, pour ton efficacité et ta curiosité.

J’aimerais aussi remercier quelques collègues de bureau que j’ai pu côtoyer au jour le jour ces dernières années, aussi bien à l’INRA qu’à la faculté des sciences

Edgar, mon pote et compère de thèse avec qui on ne s’ennuie jamais. Merci pour toutes nos

séances de badminton, de foot, ou autre sport, ainsi que les parties de frisbee, les batailles

d’eau, le partage quasi-quotidien de vidéos douteuses ou de bandes annonces des chefs

d’œuvre du 7

art. Les soirées jeux, tarot ou autre, les parties de fléchettes avec Nico ou

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encore nos quelques sessions guitar hero autour d’une bière resteront de grands moments.

Merci aussi pour avoir ré-équipé avec moi le labo en arbalètes et pistolets en tout genre, pour avoir assumé la co-paternité de Twiggy et surtout pour avoir été le maître d’ouvrage de notre magnifique accomplissement architectural qui trône fièrement à l’entrée du laboratoire.

Yann, mon collègue mi-fac/mi-INRA. Je ne sais pas si je dois te remercier pour m’avoir fait découvrir ton univers musical… En tout cas merci d’avoir conservé les dinosaures sur ton ordi et pour ton humour trash.

Vincent, je pensais te raconter une blague sur un PMU mais tu les connais déjà toutes…

Continue à faire résonner ton rire communicatif dans les bureaux et prend bien soin d’Irina ! Ben, merci pour les innombrables parties de frisbee, basket-bureau, badminton et jorky ponctuées de discussion sur la physio et la bioch des plantes.

Cendrella et Nico, merci pour votre bonne humeur quotidienne et votre humour bien rodé sur les gens du nord et leurs travers.

Anne, merci d’avoir apporté une touche féminine au bureau de la fac. Prends bien soin de la voiture de ma sœur.

François, merci de m’avoir fait découvrir la finesse ‘circulaire’ du rap vendéen, et d’avoir si bien intégré le parler Lorrain. A bientôt Gros. !

Marlis, merci pour nos pauses capuccino et tes coups de pouce an anglais lors du M2. Ta soirée de fin de thèse restera un excellent souvenir, malgré les vidéos compromettantes qui en sont sorties.

Pete, thanks for your valuable advices in english and for the evenings at the bar, sharing opinions about royalty in UK.

J’aimerais également exprimer la gratitude aux autres membres du groupe redox à la fac.

Donc merci à :

PA, le p’tit dernier, sosie de John Lennon. Tu es aussi discret que gentil. Merci d’être autant disponible et agréable au jour le jour, tout en cachant un humour décapant. Avec Edgar, on te confie la charge de la pyramide de canettes. Prends en soin !

Henry, pianiste virtuose mais cuisinier perfectible. Tu détiens à ma connaissance le record de la plus longue migration d’un gel d’acrylamide. Si tu survis à ta traversée de la France en vélo, je te souhaite sincèrement de continuer à exercer ta passion pour la recherche en thèse.

Jean-Pierre, tes cours de DEUG font partie des rares qui m’ont donné envie de continuer mes études à la fac et pour cela je tiens vraiment à te remercier. En outre, merci pour ta simplicité et ton humour (évite par contre la blague de la guêpe qu’il faut noyer, elle ne passe pas très bien en amphi …)

Kamel, pour ton envie intarissable pour discuter des projets de recherche et pour ton profond sens collectif.

Jé, pour tes coups de main, que ce soit durant cette thèse ou avant, lors de mes premiers pas en labo.

Bruno, pour avoir laissé une trace indélébile de ton passage au labo sur la voiture de PA, pour ton goût pour la mirabelle (en lien avec cette fameuse trace) et ton infatigable tchatche.

Lionel, tu as été indirectement à l’origine de l’arrivée de la cible de fléchette dans la salle café et on te doit beaucoup pour ça !

Mélanie, pour tes petites blagues distillées à l’occasion et pour les nombreux BBQ à Laneuveville.

Tiphaine, pour ta bonne humeur inébranlable et tes efforts à décorer la salle café avec des poissons.

Karl-Josef, it was a pleasure to meet you and your communicative laugh.

Antoine, pour ton humour discret mais certain.

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Au sein du groupe d’écogénomique des interactions à l’INRA, merci à :

Francis, pour le livre sur les effecteurs qui m’a énormément servi durant la rédaction de ce manuscrit.

Claire, pour les manips avec Magnaporthe et avec les effecteurs de champignons.

Manue, pour les fichiers ‘popsamère’ et pour massacrer les certains thèsards avec une seule main. T’assures ! A bientôt sur wow ?

Alice, je suis fan de ton langage châtié et de ton combat de chaque jour pour la créativité orthographique. Quand tu manges une mirabelle, ca fait vibrer le labo! T’es définitivement une fille de la Lorraine.

Marc, pour ton calme, ta bonne humeur et ton humour décalé.

Emilie, pour les manips de bioinfo, ta gentillesse et ton miel.

Annegret, pour les analyses des microarrays et les conseils sur la préparation des échantillons pour le séquençage.

Stéph $, pour les petits coups de main avec les logiciels d’analyse d’image et les conseils pour mon orientation lors du M2.

Christine, pour toutes les RT-qPCR et les discussions sur les chats.

Patrice, pour ton aide lors des cultures de peuplier.

Annick, pour m’avoir permis de faire mes premiers pas dans le labo et pour m’avoir écrit une super lettre de recommandation pour le concours CJS.

Béa, ta franchise, ton excentricité et tes chansons ont agréablement rythmé mes journées lorsque nous étions voisins dans l’ancien bâtiment.

Angela et Adeline, vous avez apporté un peu du sud au laboratoire. Merci d’avoir gardé un œil sur Lucifer pour moi.

Valérie, pour ton humour et ta bonne humeur, ainsi que pour ton aide lors des TP de biologie végétale.

Panos et Josh, many thanks for your motivation to hang out around a beer and discuss about all strange things that french people do.

Nicole et Agnès, pour votre patience et votre efficacité pour la gestion à distance de mes ordres de mission que j’établis à la dernière minute.

Au sein des autres groupes du labo, merci à :

Pascal et Bénédicte, pour avoir toujours été prêts à fournir du matériel biologique et à discuter du peuplier et des rouilles. Merci également à vous de m’avoir embauché en job d’été et permis de découvrir l’univers de l’interaction peuplier/Melampsora bien avant que cela ne devienne mon sujet de thèse.

Jaime, pour les quelques soirées arrosées, les foots et jorky, pour ton impressionnante maîtrise du français et pour m’avoir fait découvrir le Pisco et surtout Dawkins ! A bientôt au Chili ou ailleurs ?

Laurence, merci à toi et Rémi pour les moments amicaux passés ensemble depuis le M1.

Jean-Pierre, merci pour ton soutien technique et ta réactivité.

Parmi d’autres collègues et amis de l’INRA et de la fac, merci à :

JB, pour ces 2 années mémorables rue des Fabriques, qui ont été une transition parfaite entre

la vie étudiante débridée d’avant thèse et la vie plus tranquille d’aujourd’hui. Merci en vrac

pour avoir partagé abondamment tes goûts musicaux, tes histoires de chasse, ta cuisine ‘à la

normande’, quelques gueuletons entre amis et tes meilleurs histoires sur la Moselle et ses

habitants (c’est valable pour les Vosges aussi). Encore merci d’avoir partagé l’appart avec

Lucifer, Cocaine, Kiki, Amageddon et Attila.

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PJ, garchon du nord, merci pour ton calme, ton amitié et nos discussions sur tout et n’importe quoi lors des sessions ski, dégustations bières ou autres. J’espère que toi et Aure-Amélie allez passer du bon temps à New-York.

Nico, pour toutes ces années depuis les bancs de la fac en DEUG, les bonnes soirées de fin d’exams et les discussions sur la recherche ‘qui vous gagne’. Peut-être à bientôt au Québec.

Renaud, je crois que si tu n’avais pas été là, je n’aurais pas pu passer le DEUG et ne pas finir ma thèse aujourd’hui. Un grand merci pour ces premières années de fac.

Jean, pour ton assiduité aux pots du labo à raconter comment tu envoies tes collègues en conseil de discipline, et pour tes vannes douteuses (et le mot est faible) dont tu as le secret.

M.-le-concierge-de-la-fac (et je ne doute pas que Nico et Mélanie se joindront à moi pour ce remerciement), pour avoir envoyé ma voiture à la casse deux mois avant la fin de cette thèse, alors qu’elle était gentillement garée sur le parking du labo.

Patrice (et la je remonte un peu plus loin dans le temps), pour m’avoir fait glisser un pied dans un labo avant l’heure et pour tes histoires imagés sur l’importance des directeurs de thèse.

Afin d’être sûr de n’oublier personne, je voudrais tout simplement remercier toutes les personnes avec qui j’ai pu interagir ces dernières années dans la cadre de ma thèse.

Pour finir, un énorme merci à mes parents qui, par leur soutien financier et moral permanent, m’ont permis de faire des études dans d’excellentes conditions, ce qui me permet aujourd’hui d’avoir un job passionnant. Merci pour l’intérêt porté à mes recherches, pour votre soutien logistique sans faille (comme par exemple m’apporter mon poster à l’aéroport en vitesse quand je l’oublie en partant en congrès) et pour tous les week-ends reposants à la campagne.

Merci également à ma sœur pour avoir partagé la fibre de la biologie (même si les poissons, ça pue!).

Enfin, Aurore, merci pour tout ce que tu représentes, tes petites aides sur R, pour m’avoir

rappelé si fréquemment le règlement du laboratoire et pour le bon millier de fautes

d’orthographe que tu as corrigé dans ce manuscrit. Merci enfin pour ton enthousiasme

communicatif, même si j’ai pu émettre quelques réserves lorsque ce dernier s’exprime avec

verve sur les listes de diffusion de l’UMR lors de mes retours de mission.

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Figure 1. Les maladies causées par les champignons, oomycètes et bactéries phytopathogènes

(A-G) Maladies causées par des champignons basidiomycètes. (A) Maladie du charbon causée par Ustilago maydis sur un épi de maïs. (B) Formation de spores (triangle blanc) et de structures mimant des feuilles (flèche blanche) dans un épi de maïs infecté par Sporisorium reilianum. (e) Pustules de la rouille brune du blé formées par Puccinia striiformis f. sp. tritici. (D) Gymnosporangium cornutum sur le sorbier des oiseleurs. (E) Atelocauda digita sur les feuilles de koa. (F) Urédies traduisant l'infection du lin par l'agent de la rouille du lin Melampsora lini. (G) Pseudo-fleurs induites par Puccinia monoica chez l'Arabis. (H- M) Maladies causées par des champignons ascomycètes. (H) Blé infecté par Mycosphaerella graminicola. (1) Maladie de la pyriculariose du riz causée par Magnaporthe oryzae. (J) Pourritures grises causées par Botrytis cinerea sur des framboises. (K) Orge infecté par Blumeria graminis f. sp. hordei. (L) Blé infecté par Fusarium graminearum. (M) Symptôme sur une feuille infectée par Colletotrichum higginsianum. (N-Q) Maladies causées par des oomycètes. (N) Phytophthora infestans sur une feuille de pomme de terre. (0) Hyaloperonospora arabidopsidis sur Arabidopsis thaliana. (P) Vue aérienne d'une zone boisée avec des arbres morts suite à une infection par Phytophthora ramorum. (Q) Dépérissement des aulnes dû à Phytophthora alni. L'insert présente un chancre sur une tronc d'aulne. (R-U) Maladies causées par des bactéries. (R) Galle engendrée sur une branche de cerisier par Agrobacterium tumefaciens. (S) Symptômes foliaires chez Arabidopsis thaliana dus à une infection par Pseudomonas syringae pv. tomato. Les bactéries sont visibles en fond par microscopie électronique à balayage (T) Fleurs de pommiers infectées par Erwinia amylovora. (U) Plant de tomate infecté par Ralstonia solanacearum.

Adapté de Dean et al., MPp, 2012/ Mansfield et al., MPp, 2012/ Schirawski et al., Science, 2010/ Grant et Jones, Science, 2009/

Ellis et al., Annual Reviews in Phytopathology, 2007 / Bolier et He, Science, 2009 / Coates et Beynon, Annual Reviews in

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Figure 2. Les types d'interactions possibles entre les microorganismes parasites et les plantes

Le gris désigne l'absence de colonisation ou une colonisation limitée des tissus de l'hôte par le parasite, tandis que le rouge désigne un succès de colonisation des tissus de l'hôte.

present Biotechnologies: from the lab to the crop Burst of effector biology

Post-genomic era

2000 Arabidopsis thaliana genome sequence / First PRR gene cloned (Bolier)

1950

1900

1850

First endogenous peptide elicitor discovered (Pearce, Ryan) First R gene cloned (Martin)

First Avr gene cloned (Staskawicz)

Agrobacterium tumefaciens as a tool for biotechnologies (Montagu, Schell) First PR proteins discovered

Plants possess inducible defenses

Melampsora lini as a model for the gene-for-gene (or R - Avr) theory (Fior) Plants possess chemical defenses

Puccinia graminis physiological races (Stackman)

Phytophthora infestans as the Irish potato famine pathogen (de Bary) Germ theory: diseases are caused by microorganisms (Pasteur, Koch)

Figure 3. Les événements majeurs en phytopathologie depuis le milieu du XIXème siècle

Adapté de 5taskawicz, 'Effectors in plant-microbe interactions~ 2012 / Herman, cours de phytopathologie

'The Plant Cell~ 2012

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