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Texte intégral

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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Portaels, F. (1978). Etude d'actinomycétales isolées de l'homme et de son environnement en Afrique centrale (Unpublished doctoral dissertation).

Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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(2)

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(3)

FACULTE DES SCIENCES

>

ETUDE D'ACTINOMYCETALES ISOLEES DE L'HOMME ET DE SON ENVIRONNEMENT EN AFRIOUE CENTRALE

Françoise Portaels ép. Antoine

fCtUVtJüU. en StLUléJLl

THESE PRESENTEE POUR L'OBTENTION DU GRADE DE DOCTEUR EN SCIENCES

1978

(4)

Etude d'Actinomycétales isolées de l'homme et de son environnement en Afrique centrale

Titre de la thèse annexe :

L'expérimentation avec les rongeurs exige que l'on

tienne compte du rythme circadien.

(5)

REÇU le 1978 Rèp;...

ETUDE D'ACTINOMYCETALES ISOLEES DE L'HOMME ET DE SON ENVIRONNEMENT ENAFRIOUE CENTRALE

Françoise Portaels ép. Antoine 5’9o,'^3 P «i

Qoh.Z.

THESE PRESENTEE POUR L'OBTENTION DU GRADE DE DOCTEUR EN SCIENCES

1978 ----

(6)

Le Professeur S. Pattyn nous a communiqué son expérience et son enthousiasme pour les mycobactéries. C'est dans son labo­

ratoire de l'Institut de Médecine Tropicale d'Anvers et sous sa direction que les souches de mycobactéries isolées au Zaïre ont été analysées. Nous tenons à le remercier pour ses précieux conseils et pour les facilités qu'il nous a accordées au cours de notre travail.

Il nous est agréable de remercier ici le Professeur P.G. Janssens, Directeur honoraire de l'Institut de Médecine Tropicale qui nous a permis de travailler en milieu tropical et qui nous a toujours encouragée dans nos recherches.

Nous remercions également les Professeurs L. Eyckmans, Directeur de l'Institut de Médecine Tropicale d'Anvers, M. Wery, Chef de l'Unité de Parasitologie de l'Université Nationale du Zaïre qui nous a accueillie dans ses laboratoires, les Docteurs W.M. Meyers, Kvernes ainsi que Mademoiselle Staple de l'Institut Médical Evangélique de Kimpese, qui nous ont fourni la possibilité de réaliser de nombreux prélèvements chez des lépreux, Monsieur M. Boursoit, Directeur de la Compagnie Sucrière de Kwilu-Ngongo, les Docteurs M. Goodfellow et D.E. Minnikin de l'Université de Newcastle upon Tyne qui nous ont appris la technique de chromato­

graphie en couohe mince et le Docteur F. Hébrant (Institut de Médecine Tropicale, Anvers) pour son aide précieuse dans nos

travaux statistiques.

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Kinshasa) et à toute l'équipe du laboratoire de Bactériologie - Virologie d'Anvers.

A tous moments à Kinshasa comme à Anvers nous avons pu faire appel à Monsieur G. Roelants, Bibliothécaire qui a répondu inlassablement à nos demandes de documentation; Monsieur J. Colans et J. Claes ont supporté l'impression et la reliure de cette thèse nous les en remercions très sincèrement.

Nous avons pu compter sur le dévouement constant de Madame L. Jespers, Secrétaire du laboratoire de Bactériologie - Virologie qui a mis en forme notre recherche. Nous la remercions de toute l'attention et la concentration qu'elle a mise dans la dactylographie de ce travail.

Que tous ceux que nous n'avons pas cités nommément et qui ont participé de près ou de loin à ce travail en soient aussi remerciés.

Enfin, je ne pourrais oublier le rôle compréhensif de mon mari et de mes enfants durant ces nombreuses années de

recherche.

(8)

TABLE DES ÎIATIERES

Introduction ... 2

Partie 1. LES MYCOBACTERIES ET LES NOCARDIAS : TAXONOMIE, PRESENCE DANS L'ENVIRONNEMENT, POUVOIR PATHOGENE ET TECHNIQUES DE MISE EN EVIDENCE ... 5

Chapitre I : Taxonomie des nocardias et des mycobactéries 6 Chapitre II : Présence des nocardias et des mycobactéries dans l'environnement... 51

Chapitre III : Importance des nocardias et de mycobactéries comme agents pathogènes ... 76

Chapitre IV : Techniques de mise en évidence des nocardias et des mycobactéries ... 116

Partie 2. LES MYCOBACTERIES ET LES NOCARDIAS ISOLEES AU ZAÏRE 139 Chapitre V : Rappels géographiques concernant le Zaïre en rapport avec les lieux de prélèvements 140 Chapitre VI : Isolement de mycobactéries de la peau et du mucus nasal dans des échantillons de population au Zaïre 153 Chapitre VII : Inventaire des mycobactéries de l'environnement au Zaïre... 194

Chapitre VIII ; Inventaire des nocardias de l'environnement au Zaïre... 283

Discussion Générale ... 312

Conclusions Générales ... 328

Résumé... 331 Illustrations : I. Tableaux, II. Figures, III. Photos .

Bibliographie

47S2:0

Index des milieux et des techniques

(9)

IMTRODUCTIOfi

L'existence en Afrique de foyers d'ulcères à Mycobac­

terium ulcerans dans des régions marécageuses ou faiblement

drainées, a amené de nombreux auteurs à considérer l'environnement comme réservoir de cette mycobactérie. Cette hypothèse nous a

conduite à rechercher la présence de mycobactéries dans l'environ­

nement au Zaïre et principalement dans les régions où les ul­

cères à M. ulcerans sont endémiques. Nous avons donc orienté

nos recherches vers l'eau et avons choisi d'examiner certains pois sons afin de déterminer leur rôle éventuel dans l'épidémiologie de la maladie.

Après avoir démontré, au cours d'un travail prélimi­

naire (PORTAELS, 1973), l'ubiquité de certaines espèces de myco­

bactéries dans l'environnement au Zaïre, il nous a paru indis­

pensable de vérifier ces résultats sur un plus grand nombre d'échantillons et de mettre en évidence les facteurs ayant une influence sur la flore mycobactérienne.

Au cours de cette première étude, nous avons isolé à plusieurs reprises des germes acido-alcoolo-résistants qui, du point de vue morphologique, n'étaient pas des mycobactéries mais semblaient appartenir au genre Nocardia. Comme les

techniques utilisées ne convenaient pas à l’isolement de nocardias nous avons, dans un second temps, recherché la présence des

nocardias dans l'environnement au Zaïre en employant une technique plus appropriée à leur isolement.

Parallèlement, nous avons analysé la flore mycobacté­

rienne cutanée de populations vivant dans les régions étudiées,

afin de voir si cette flore mycobactérienne se retrouve sur la

(10)

Mycobacterium leprae, germe que certains auteurs affirment avoir cultivé "in vitro,,. Cette affirmation n'a cependant pas encore été prouvée. Nous avons dès lors orienté nos recherchera vers l'étude de la flore mycobactérienne cutanée de lépreux et de non lépreux, dans le but de déterminer si ces flores sont similaires ou non.

Enfin, comme nous avons aussi recherché le réservoir de M. ulcerans, nous avons comparé la flore mycobactérienne cutanée de personnes vivant dans des foyers d'ulcères à

M._ _ ulcerans, à celle de personnes provenant de régions où la maladie n'est pas endémique.

La recherche des mycobactéries et des nocardias dans l'environnement nous oblige à définir ce que nous enten­

dons par le terme environnement.

A l'origine "environnement,, signifie "action d'en­

vironner,, ou plus simplement "ce qui entoure,,. Aujourd'hui, comme le souligne DUVIGNEAUD (1974), le mot "environnement,, peut prendre des sens très divers suivant les personnes qui 1 'utilisent.

L'environnement comprend deux aspects, l'un abio­

tique constitué de matériel non vivant, l'autre biotique constitué par les êtres vivants.

La signification du terme "environnement,, dépend

surtout des êtres vivants qu'on s'accorde à y insérer. En

(11)

effet, de nombreux auteurs considèrent l'environnement surtout d'un point de vue abiotique mais y incluent parfois les micro - organismes et les végétaux. En opposition à cette signification assez restreinte de l'environnement, d'autres auteurs y incor­

porent tous les êtres vivants y compris l'homme ainsi que l'ensemble des facteurs physiques, chimiques, biologiques et sociaux en interaction avec ces êtres vivants.

Nos recherches dans l'environnement se limitent à l'étude d'échantillons de sol, d'eau, plus rarement de plantes et de poissons dont nous isolerons d'abord des mycobactéries et ensuite des nocardias.

Notre travail est divisé en deux parties.

La première partie constitue une synthèse bibliogra­

phique de la taxonomie, de la présence dans l'environnement, du pouvoir pathogène et des techniques de mise en évidence des mycobactéries et des nocardias. Nos travaux personnels y sont

incorporés, principalement au niveau des schémas d'identifica­

tion. Bien que cette première partie soit relativement longue, nous estimons néanmoins qu'elle est indispensable pour situer nos travaux au Zaïre dans un cadre plus général. De plus, une telle mise au point n'a jamais été réalisée jusqu'à présent.

La deuxième partie est consacrée dans son intégralité aux résultats de nos recherches au Zaïre. Nous y rappelons d'abord quelques données géographiques qui permettent de défi­

nir les régions dans lesquelles nous avons travaillé. Les trois chapitres suivants concernent d'abord l'isolement de mycobac­

téries à partir de la peau et du mucus nasal, ensuite l'isole­

ment de mycobactéries et enfin de nocardias à partir de

1 'environnement.

(12)

PRE 11 1ERE PARTIE

LES MYCOBACTERIES ET LES ÎJOCARÛIAS :

1 A X Ü H O M I E . L' E H V 1 R O uR E M E N T . ET TECHNIQUES DE

PRESENCE DANS

POUVOIR PATHOGENE

MISE EN EVIDENCE

(13)

C hapitre Î ; TAXOMÛIllE DES NÜCARDIAS El DES MYCOBACTERIES

INTRODUCTION 8

I. CLASSIFICATION

1. LES ACTINOMYCETALES ... 10 2. LES NOCAHDIAS ... 15 3. LES MYCOBACTERIES ... 18 4. NOCARDIA FARCINICA ET MYCOBACTERIUM FARCINOGENES . 22

II. NOMENCLATURE

2. LES NOCARDIAS ... 24 2. LES MYCOBACTERIES ... 24

III. IDENTIFICATION

2. LES GENRES NOCARDIA ET MYCOBACTERIUM ... 27 A. Critères morphologiques

a. Examen microscopique après coloration ... 28 b. Morphologie des colonies ... 29 B. Critères physiologiques

a. la résistance au lysozyme ... 30 h. Utilisation de composés organiques comme source

de carbone ... 31 C. Critères chimiques ... 31 2. LES NOCARDIAS ... 32

A. Hydrolyse de la caséine, de la tyrosine et de la xanthine ... 32 B. Utilisation de produits organiques comme sources

de carbone ... 33

(14)

et mycobactéries à croissance rapide ... 34

a. Croissanoe sur gélose peptonée ... 34

b. L'hydrolyse de la putresaine ... 35

a. La réduatLon du citrate de fer ammoniacal ... 35

B. Les mycobactéries à croissance lente ... 35

a. Les douze tests courants ... 35

b. Les tests complémentaires ... 39

c. Distinction entre M. avium et M. scrofulaceum . 41 C. Les mycobactéries à croissance rapide ... 42

a. Les quinze tests courants ... 42

b. Les tests complémentaires ... 45

IV DISCUSSION 47

V. CONCLUSION 50

(15)

INTRODUCTION

Il nous paraît normal d'entamer un chapitre trai­

tant de la taxonomie des bactéries en mentionnant la réfé­

rence de base de tout microbiologiste, le "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology„, dans lequel se trouve détail­

lée toute la taxonomie des procaryotes. Dans sa dernière

édition datant de 1974 (huitième édition), le Bergey's divise les procaryotes en deux classes, la classe des Schizophycées

(les algues bleu-vert) et la classe des Schizomycètes (les bactéries).

La classe des Schizomycètes comprend plusieurs or­

dres dont celui des Actinomycétales auquel appartiennent les genres Nocardia et Mycobacterium. Pendant longtemps les

Actinomycétales furent l'objet de controverses entre bacté­

riologues et mycologues, les uns les considérant comme des bactéries, les autres comme des champignons car elles forment des filaments et peuvent produire comme certains champignons vrais, des grains dans les tissus qu'elles parasitent. Sig­

nalons cependant que le premier auteur qui décrivit une Acti- nomycétale, Streptothrix foersteri (COHN, 1875), la plaça parmi les bactéries.

Il est maintenant universellement admis que les Actinomycétales sont des bactéries. Parmi les raisons pour

lesquelles les Actinomycétales sont actuellement classées parmi les bactéries, citons les suivantes (VANBREUSEGHEM, 1966) :

- Les Actinomycétales sont des procaryotes alors que les cham

pignons sont des eucaryotes. Elles ne possèdent pas de vrai

noyau entouré d'une membrane nucléaire.

(16)

coup plus grand (de 3 à 20 y et plus).

- Les Actinomycétaies sont, en général, sensibles aux anti­

biotiques antibactériens et résistantes aux agents antifon­

giques .

L'ordre des Actinomycétales renferme de nombreux

genres groupés en familles qui dans la majorité des cas, ont

pour trait commun de former des filaments à certains stades

de leur développement. De nombreux auteurs appellent, à tort,

ces filaments "mycélium,, par analogie aux filaments mycéliens

rencontrés chez les champignons.

(17)

cle passé avec la thèse de LACHNER-SANDOVAL (1898) qui nous fournit une première ébauche de classification de la famille des Actinomycétaceae dans laquelle trois genres sont recon­

nus, le genre Actinomyces (HARZ, 1879) le genre Mycobacterium (LEHMANN et NEUMANN, 1896) et le genre Corynebacterium

(LEHMANN et NEUMANN, 1896). En 1918, BUCHANAN crée l'ordre des Actinomycétales dans lequel il place la famille des Actinomycétaceae.

Il existe de nombreuses classifications des Actino­

mycétales dont nous reprenons quelques exemples ci-après.

En 1919, WAKSMAN tente d'établir une première classification des Actinomycétales en étudiant un grand nom­

bre de souches saprophytes et parasites tant du point de vue morphologique qu'au moyen de tests physiologiques; mais ses

travaux n'aboutissent pas à des différences suffisamment im­

portantes pour subdiviser de manière précise les souches étu­

diées.

La première ébauche de classification des Actino­

mycétales est due à LANGERON (1922) qui les subdivise en trois sous-sections. Majores, Minores et Breviores d'après leur

mode de croissance "in vitron,la formation de hyphes aériens, la ramification des filaments, l'acido-résistance et l'odeur des germes.

A cette classification de LANGERON fait suite celle

de 0RSKOV (1923) qui, se basant sur des études microscopiques

détaillées, divise les Actinomycétales en deux groupes : le

(18)

groupe I, appelé Cohnistreptothrix, renferme des souches for­

mant des filaments qui ne se fragmentent pas et possèdent des hyphes aériens sur lesquels des spores peuvent se former;

0RSKOV place dans ce groupe Actinomyces madurae et Nocardia dassonvillei; le groupe II d'0RSKOV, appelé Actinomyces, est divisé en deux sous-groupes, le sous-groupe lia renfermant des souches produisant des filaments non aériens et des fila­

ments aériens qui peuvent se segmenter; l'auteur inclut

Nocardia astéroïdes et Nocardia rubra dans ce sous-groupe; le sous-groupe Ilb se caractérise par l'absence de hyphes aériens;

l'auteur insiste sur la parenté morphologique entre les souches de ce deuxième sous-groupe et certaines corynébactéries et myco­

bactéries; il y inclut Nocardia farcinica, Nocardia polychromo- genes et Actinomyces bovis.

En 1931, H.L. JENSEN propose de donner au groupe II d'ORSKOV le nom de genre Proactinomyces et ajoute â ce dernier les genres Mycobacterium et Corynebacterium pour les réunir dans lou famille de^ Proactinomycetaceae de LEHMANN et NEUMANN

(1927).

De nombreux changements se succèdent alors, toujours basés sur des données morphologiques, pour aboutir enfin à la classification de WAKSMAN et HENRICI (1943) qui sépare, tou­

jours d'après des critères principalement morphologiques, les genres Mycobacterium, Nocardia et Actinomyces. Cette classi­

fication est reprise ensuite en 1948 dans la sixième édition du "Bergey's manual,, et se présente de la manière suivante : II. Mycélium rudimentaire ou absent, pas de formation de

spores, acido-résistants :

Famille des Mycobacteriaceae : genre Myaobaaterium.

(19)

II. Mycélium vrai :

A. Mycélium végétatif se fragmentant par segmentation en éléments coccoïdes ou bacillaires. Certaines especes partiellement acido-résistantes :

Famille des Actinomycetaceae

1. Aérobiques obligatoires. Certaines especes partiel­

lement acido-résistantes : genre Nocardia.

2. Anaérobiques ou microaérophiliques, non acido-re- sistants : genre Aotinomyces.

B. Mycélium végétatif ne se fragmentant pas : Famille des Streptomycetaceae

En 1961, WAKSMAN ajoute une quatrième famille à la classification précédente, la feimille des Actinoplanaceae

(COUCH, 1954) caractérisée par la présence de spores formées dans des sporanges. Cette famille comporte deux genres : le genre Actinoplanes (COUCH, 1954) et le genre Streptosporangium

(COUCH, 1954).

En 1962, VANBREUSEGHEM modifie la classification de WAKSMAN afin d'y introduire le genre Dermatophilus (VAN SACEGHEM, 1915) placé dans une cinquième famille, la famille des Polyseptaceae (THOMPSON et BISSET, 1957).

De telles classifications sont encore utilisées actu­

ellement. Cependant, plusieurs auteurs démontrent que de nom­

breux germes font exception à cette classification essentiel­

lement morphologique; en effet, de vrais nocardias peuvent ne jamais présenter de mycélium aérien (ARAI et KURODA, 1959);

de plus la morphologie peut varier très fort d'une souche à

l'autre et dépend de conditions expérimentales telles que le

milieu de culture utilisé, la température, le pH et la lumière

(20)

(MARIAT, 1965). Une classification basée sur des critères autres que ceux utilisés jusqu'ici s'avère donc indispensable.

Viennent alors les études chimiques de la paroi cel­

lulaire qui permettent de réaliser de très grands progrès dans la classification des Actinomycétales. La recherche de certains sucres (arabinose et galactose) et acides aminés (lysine, orni- thine, acide aspartique, glycine et acide diaminopimélique) dans les parois cellulaires conduit M.P. LECHEVALIER et H.A.

LECHEVALIER (1970 b) à distinguer parmi les Actinomycétales divers types de parois allant du type I au type VI d'après leur composition en sucres et en acides aminés. Les nocardias et les mycobactéries appartiennent au type IV et contiennent de l'acide méso-diaminopimélique, de 1 'arabinose et du galac­

tose dans leurs parois cellulaires.

Ces études aboutissent à un remaniement de la clas­

sification avec la description de nouveaux genres tels que le genre Actinomadura (H.A. LECHEVALIER et M.P. LECHEVALIER, 1970a) dans lequel sont classés actuellement Nocardia pelletier! et Nocardia madurae, et le genre Oerskovia (PRAUSER, M.P. LECHE­

VALIER et H.A. LECHEVALIER, 1970).

Parallèlement aux sucres et aux acides aminés, des lipides sont aussi recherchés dans les parois cellulaires.

En 1966, ASSELINEAU publie un travail sur les lipides bacté­

riens et propose le nom d'acides mycoliques pour des lipides de structure particulière rencontrés chez certaines bactéries;

il définit ces acides mycoiiques comme étant des acides a-ra- mifiés, 3 -hydroxylés de structure générale suivante :

OH

I

R,-CH-CH-COOH

1 I

(21)

genre à l'autre suivant le nombre d'atomes de carbone qu'ils renferment; ce nombre varie de 80 à 90 atomes de carbone pour les acides mycoliques des mycobactéries, de 40 à 60 pour les acides mycoliques des nocardias (également appelés acides nocardomycoliques) et est d'environ 30 atomes de car­

bone pour les acides mycoliques des corynébactéries (également appelés acides corynémycoliques) (GOODFELLOW, 1973).

Outre les espèces du genre Rhodococcus, genre ré­

cemment décrit (GOODFELLOW et ALDERSON, 1977), aucune autre Actinomycétale ne possède des acides mycoliques.

Se basant d'une part sur les critères morphologiques et d'autre part par les données chimiques relatives à la pa­

roi cellulaire, CROSS et GOODFELLOW (1973) établissent une nouvelle classification des Actinomycétales dans laquelle ils distinguent 10 familles que nous énumérons ci-dessous :

- les Actinomycetaceae - les Actinoplanaceae - les Dermatophilaceae - les Frankiaceae

- les Micromonosporaceae - les Mycobacteriaceae - les Nocardiaceae

- les Streptomycetaceae

- les Thermoactinomycetaceae

- les Thermomonosporaceae

(22)

Trente genres se répartissent entre ces 10 familles.

Le genre Mycobacterium (LEHM/vNN et NEUMANN, 1896) se place dans la famille des Mycobacteriaceae et en constitue le seul et unique genre. Le genre Nocardia (TREVISAN, 1889) appar­

tient à la famille des Nocardiaceae ainsi que trois autres genres placés récemment dans cette famille, (GOODFELLOW et MINNIKIN, 1977) : le genre Micropolyspora (H.A. LECHEVALIER,

SOLOTOROVSKY et McDURMONT, 1961), le genre Rhodococcus

(GOODFELLOW et ALDERSON, 1977) et le genre Saccharopolyspora (LACEY et GOODFELLOW, 1975). Notons aussi que le genre Actino- madura appartient actuellement à la famille des Thermomono-

sporaceae (GOODFELLOW et MINNIKIN, 1977).

La position systématique du genre Nocardia et du genre Mycobacterium est indiquée dans le tableau n° 1.

2. LES NOCARDIAS

Le genre Nocardia est décrit à l'origine par TREVISAN (1889) dans le but de grouper plusieurs espèces dont le "bacille,, du farcin découvert par NOCARD en 1888, comme agent responsable d'une maladie (farcin) du bétail en Guadeloupe. TREVISAN inclut également dans le genre Nocardia, l'espèce Streptothrix foersteri, première Actinomycétale

jamais décrite (COHN, 1875) et Nocardia actinomyces qui n'est autre que 1'Actinomyces bovis de HARZ (1879) agent d'actino­

mycose du bétail.

Ces espèces ont en commun de former des filaments, parfois ramifiés, qui peuvent se fragmenter. Suite aux tra­

vaux de TREVISAN, de nombreuses bactéries se caractérisant

par cette fragmentation des filaments, sont classées dans le

genre Nocardia sans que d'autres critères ne soient envisagés.

(23)

De nombreuses espèces sont, de ce fait, mal classées et doi­

vent dans la suite être replacées dans d'autres genres.

GORDON et MIHM (1957, 1959 et 1962) et GORDON (1966) clarifient cette classification confuse du genre Nocardia.

Ces auteurs développent une importante série de tests d'iden­

tification autres que morphologiques basés principalement sur l'hydrolyse de composés organiques tels que la xanthine, la caséine, la tyrosine, la gélatine et l'amidon, sur l'uti­

lisation de certains acides organiques comme sources de

carbone et sur la production d'acide à partir de divers sucres.

Ces tests permettent non seulement de progresser dans

l'identification des espèces du genre Nocardia mais sont aussi d'une grande utilité pour l'identification de certaines

mycobactéries. Un bon nombre de ces tests sont d'ailleurs encore utilisés à l'époque actuelle.

Les études de parois cellulaires, bien qu'étant d'une grande importance pour la classification des Actino- mycétales n'apportent aucune donnée permettant de diffé­

rencier les nocardias au niveau de l'espèce. Signalons cependant que l'analyse de la composition en sucres et en acides aminés des parois cellulaires permet d'exclure du genre Nocardia certaines espèces telles que N. madurae, N. pelletier! et N. dassonvillei possédant une paroi cellu­

laire du type III, c'est-à-dire contenant de l'acide méso - diaminopimélique mais pas de galactose ni d'arabinose; les autres nocardias, ainsi que les mycobactéries, possèdent

en effet une paroi du type IV renfermant de grandes quantités d'acide méso-diaminopimélique, du galactose et de l'arabinose.

De même, certaines souches de N. farcinica peuvent être

(24)

retirées du genre Nocardia sur base de l'analyse de leurs acides mycoliques.

Plusieurs études sérologiques sont également réalisées dans le but d'identifier les nocardias au niveau du genre et de l'espèce. L'utilisation des techniques

d'immunodiffusion permet à STANFORD et WONG (1974) de distinguer diverses espèces de nocardias par leur compo­

sition antigénique.

La classification des nocardias se clarifie grâce aux études taxonomiques numériques. Un des plus importants travaux est celui de GOODFELLOW (1971) qui teste 283 souches au moyen de 241 caractères différents.

Cet auteur aboutit ainsi à la conclusion que le genre Nocardia renferme plusieurs espèces que l'on peut diffé­

rencier par des moyens autres que les analyses de parois cellulaires citées plus haut, et à la portée d'un grand nombre de laboratoires. Ces caractères sont entre autres, la production d'acide à partir de divers sucres, l'utili­

sation de produits organiques comme sources de carbone et l'hydrolyse de certains composés organiques; un grand nombre de ces tests sont basés sur les travaux de GORDON et MIHM

(1957, 1959 et 1962). Par cette analyse taxonomique l'auteur distingue dans le genre Nocardia trois groupes majeurs correspondant aux espèces N. astéroïdes, N. brasi-

liensis et N. caviae et insiste sur le caractère hétérogène du groupe correspondant à l'espèce N. astéroïdes. Il défi­

nit également des groupes mineurs correspondant aux

espèces N. gardneri, N. hydroxycarboxydans, N. vaccinii et

(25)

N. farcinica. Enfin, en 1977, GOODFELLOW et MINNIKIN remanient la classification des nocardias à la lumière des travaux de GORDON (1974), M.P. LECHEVALIER et H.A. LECHEVALIER (1974), et ORCHARD, GOODFELLOW et WILLIAMS (1977). Ces auteurs établissent

la liste des différentes espèces du genre Nocardia, liste que nous reprendrons dans le paragraphe consacré à la nomenclature des nocardias.

3. LES MYCOBACTERIES

Le genre Mycobacterium (LEHMANN et NEUMANN, 1896) comporte actuellement de nombreuses espèces, les unes patho­

gènes pour l'homme ou pour les animaux, les autres se rencon­

trant dans la nature. La description de nouvelles espèces s' i sm©

échelonne entre la fin du XIX siècle et nos jours. Les travaux de Robert KOCH (1882) qui découvre dans des lésions humaines, bovines et aviaires un même agent étiologique, sont à l'origine de la mycobactériologie : à partir de cette date, de nombreuses mycobactéries vont être décrites.

Au fur et à mesure de leur découverte, différents auteurs mettent au point des tests permettant de différencier ces espèces les unes des autres; citons entre autres les travaux de KONNO (1956) sur la production de niacine, de BONICKE (1958) sur la sensibilité des bacilles tuberculeux humains (M. tuberculosis) et bovins (M. bovis) à l'hydrazide de l'acide thiophène-2-carboxylique (communément appelé TCH dans la littérature anglo-saxonne) et de GORDON et MIHM (1959) sur l'utilisation par certaines mycobactéries d'acides

organiques comme source de carbone.

Le premier essai réel de classification des myco­

bactéries est dû à RUNYON (1959). Parmi les mycobactéries

(26)

autres que celles responsables de la tuberculose humaine et la tuberculose bovine, cet auteur distingue 4 groupes :

- le groupe I : réunit des mycobactéries dont la croissance est lente et dont les colonies se pigmentent en jaune-orange après exposition à la lumière.

- le groupe II : renferme des mycobactéries à croissance lente qui se pigmentent aussi bien à l'obscurité qu'en présence de lumière.

- le groupe III ; comprend des mycobactéries à croissance lente, non chromogènes.

- le groupe IV : rassemble toutes les mycobactéries à croissance rapide (poussant en 24 à 48 heures), colorées ou non.

Cette classification simple, bien que basée sur des critères souvent subjectifs, est le point de départ de nom­

breuses études ultérieures visant à définir les espèces au sein des divers groupes de RUNYON pour remplacer ensuite cette notion artificielle de groupes par la notion d'espèces myco­

bactériennes dont les caractéristiques sont bien définies.

Citons à ce propos quelques importants travaux tels ceux de BONICKE et LISBOA (1959) et BONICKE (1960) sur le

spectre amidasique des mycobactéries, les études de VIRTANEN (1960) sur la réduction du nitrate en nitrite par les myco­

bactéries, la détection de phosphatase acide (KAPPLER, 1965), et la mise en évidence de l'activité catalasique (KUBICA,

JONES, ABBOTT, BEAM, KILBURN et CATER, 1966) . Plusieurs schémas

de classification des mycobactéries sont proposés par divers

auteurs. Ces schémas ont avant tout pour but d'identifier

relativement rapidement, et au moyen de tests faciles à

réaliser les mycobactéries rencontrées dans les laboratoires

(27)

cliniques (PATTYN et PORTAELS, 1972; KAPPLER, 1973; KUBALA, 1973; KUBICA, 1973, MARKS, 1975).

Comme pour les nocardias, les parois cellulaires des mycobactéries sont étudiées afin d'y détecter certains sucres

et acides aminés (M.P. LECHEVALIER et H.A. LECHEVALIER, 1970 b).

Les acides mycoliques de diverses espèces de myco­

bactéries sont recherchés par MINNIKIN, ALSHAMAONY et GOOD- FELLOW, 1975); ces auteurs obtiennent, après analyse par chromatographie en couche mince, deux images distinctes, la première correspondant aux espèces M. avium, M. intracellu- lare, M. xenopi, M. scrofulaceum, M. phlei et M. paratuber- culosis, la seconde à M. tuberculosis et M. bovis.

En 1973, STANFORD propose une classification ration­

nelle des mycobactéries basée sur l'étude de leurs antigènes par immunodiffusion. Par cette méthode, l'auteur met en évidence

11 à 15 constituants antigéniques différents répartis en 3 ou 4 groupes, le premier groupe correspondant à 4 à 5 antigènes communs à toutes les mycobactéries, le deuxième groupe corres­

pondant à 2 à 3 antigènes communs aux mycobactéries à croissance lente uniquement, le troisième groupe étant spécifique des

mycobactéries à croissance rapide et enfin le quatrième groupe étant composé d'antigènes spécifiques des espèces, le nombre d'antigènes spécifiques pour chaque espèce allant de 2 à 8 .

Enfin, la classification des mycobactéries est principalement clarifiée grâce à la formation d'un groupe de travail international consacré à la taxonomie des mycobactéries et appelé IWGMT (International Working Group on Mycobacterial Taxonomy). Ce groupe organise plusieurs études taxonomiques

internationales. Soixante souches de mycobactéries appartenant

au groupe II de RUNYON sont analysées (WAYNE, DIETZ, GERNEZ -

(28)

RIEUX, JENKINS, KAPPLER, KUBICA, KWAPINSKI, MEISSNER, PATTYN, RUNYON, SCHRODER, SILCOX, TACQ

ü

ET, TSUKAMURA et WOLINSKY,

1971), 89 souches du groupe III de RUNYON (MEISSNER, SCHRODER, AMADIO, ANZ, CHAPARAS, ENGEL, JENKINS, KAPPLER, KLEEBERG, KUBALA, KUBIN, LAUTERBACH, LIND, MAGNUSSON, MIKOVA, PATTYN, SCHAEFER, STANFORD, TSUKAMURA, WAYNE, WILLERS et WOLINSKY, 1974) et

pour le groupe IV de RUNYON, testé à deux reprises, 60 souches sont étudiées dans un premier temps (KUBICA, BAESS, GORDON, JENKINS, KWAPINSKI, McDURMONT, PATTYN, SAITO, SILCOX, STANFORD, TAKEYA et TSUKAMURA, 1972) et 59 dans un deuxième temps (SAITO, GORDON, JUHLIN, KAPPLER, KWAPINSKI, McDURMONT, PATTYN, RUNYON, STANFORD, TARNOK, TASAKA, TSUKAMURA et WEISZFEILER, 1977).

Ces études taxonomiques numériques définissent des "groupes"

qui, d'une manière générale, correspondent aux espèces connues.

Elles permettent non seulement de mieux définir les espèces mais aussi de déterminer quelles sont les propriétés les plus représentatives de ces espèces.

C'est sur les résultats de ces études taxonomiques numériques que nous nous basons pour dresser la liste des

différentes espèces du genre Mycobacterium. Cependant, certaines espèces n'ont jamais été incluses dans de telles études pour des raisons diverses, les unes ne poussant pas "in vitro,, comme c'est le cas de M. leprae et M. lepraemurium, d'autres ne se cultivant que sur des milieux additionnés d'extraits de mycobactéries (M. paratuberculosis) ou à des températures

inférieures à 37°C (M. ulcerans), et d'autres enfin étant découvertes après que les études taxonomiques internationales

aient débuté, comme c'est le cas pour M. szulgai. L'"International Working Group on Mycobacterial Taxonomy,, (IWGMT) entame

également deux études destinées à tester la reproductibilité

de certaines techniques standardisées d'identification.

(29)

fréquemment utilisées en systématique mycobactérienne (WAYNE, ENGBAEK, ENGEL, FROMAN, GROSS, HAWKINS, KAPPLER, KARLSON, KLEEBERG, KRASNOW, KUBICA, McDURMONT, NEL, PATTYN, SCRÜDER, SHOWALTER, TARNOK, TSUKAMURA, VERMANN et WOLINSKY, 1974 et WAYNE, ENGEL, GRASSI, GROSS, HAWKINS, JENKINS, KAPPLER,

KLEEBERG, KRASNOW, NEL, PATTYN, RICHARDS, SHOWALTER, SLOSAREK, SZABO, TARNOK, TSUKAMURA, VERGMANN et WOLINSKY, 1976). Il

en résulte 11 tests hautement reproductibles, qui sont pour la plupart employés couramment dans les laboratoires d'identi­

fication de mycobactéries.

4. NOCARDIA FAHCINICA ST MYCOBACTERIUM FARCINOGENES

Nocardia farcinica est décrit pour la première fois par NOCARD en 1888 comme étant l'agent causal du farcin du boeuf en Guadeloupe. C'est TREVISAN (1889) qui donne au genre

le nom de Nocardia et à l'espèce le nom de farcinica.

La maladie est actuellement éradiquée en Guadeloupe et reste inconnue en Amérique du Nord et en Europe. Elle

existe cependant en Afrique et principalement au Tchad, au Sénégal et au Soudan.

En 1969 et en 1973, CHAMOISEAU isole de boeufs africains atteints de farcin, des mycobactéries qu'il nomme Mycobacterium farcinogenes et qu'il sépare en deux sous-espèces M. farcinogenes var. Tchadense et M. farcinogenes var. sene- galense.

Une étude internationale non encore publiée, à la­

quelle nous avons participé, qui porte sur N. farcinica isolée

par NOCARD et plusieurs souches isolées de farcin bovin en

Afrique, aboutit à la conclusion unanime que le farcin du

(30)

boeuf peut être causé par une nocardia (N. farcinica) et par des mycobactéries parmi lesquelles certaines sont voisines de M. fortuitum tandis que d'autres forment un nouveau groupe dont la position systématique n'est pas encore définie.

Dans la liste des espèces appartenant au genre

Nocardia, et au genre Mycobacterium, nous mentionnerons donc

N. farcinica en spécifiant que ce nom est uniquement réservé

aux organismes dont on a confirmé qu'ils appartiennent au

genre Nocardia et constituent une espèce distincte des autres

espèces de nocardias; par contre, M. farcinogenes ne sera pas

repris vu la position systématique incertaine de cette espèce.

(31)

II. NOMENCLATURE 1. LES NOCARDIAS

Comme nous l'avons indiqué plus haut dans le para­

graphe consacré à la classification des nocardias, la liste des espèces appartenant au genre Nocardia est basée sur

l'étude taxonomique numérique de GOODFELLOV? (1971) et sur une récente mise au point réalisée par GOODFELLOW et MINNIKIN (1977) sur la taxonomie des bactéries nocardioformes. Le genre

Nocardia renferme actuellement 9 espèces différentes :

1. N. amarae M.P. LECHEVALIER et H.A. LECHEVALIER, 1974.

2. N. astéroïdes (EPPINGER) BLANCHARD, 1896.

3. N. brasiliensis (LINDENBERG) CASTELLANI et CHALMERS, 1913.

4. N. carnea (ROSSI-DORIA) CASTELLANI et CHALMERS, 1913.

5. N. caviae (ERIKSON) GORDON et MIHM, 1962.

6 . N. farcinica TREVISAN, 1889.

7. N. salmonicida RUCKER, 1949.

8 . N. transvalensis PIJPER et PULLINGER, 1927 9. N. vaccinii DEMAREE et SMITH, 1952.

2. LES MYCOBACTERIES

La liste des espèces appartenant au genre Mycobacterium est établie en fonction des résultats des études taxonomiques numériques internationales. Nous y ajoutons les espèces définies par d'autres moyens que la taxonomie numérique et qui n'ont

jamais été soumises à une telle analyse. Il s'agit de deux

espèces non cultivables in vitro M. leprae et M. lepraemurium,

de M. paratuberculosis qui nécessite pour sa culture l'emploi

de milieux additionnés d'extraits de mycobactéries, de M. ulcerans

dont la croissance est optimale aux environs de 33°C et de

(32)

qu'il n'est pas indispensable de recourir à la taxonomie numérique pour définir une espèce. De nombreuses discussions ont déjà été soulevées à ce sujet par les "mycobactériologues,, et on peut prendre en considération trois groupes de méthodes pour définir une espèce ;

1) des études génétiques (homologie de l'ADN)

2 ) des études antigéniques (immunoprécipitation avec antigènes séparés).

3) des études taxonomiques numériques ou toute autre analyse phénotypique pour autant qu'elle englobe un nombre élevé de tests.

La liste des espèces appartenant au genre Mycobacterium comprend actuellement 31 espèces ;

1. M. asiaticiim WEISZFEILER, KARASSEVA et KARCZAG, 1971.

2. M. avium CHESTER, 1901.

3. M. bovis KARLSON et LESSEL, 1970.

4. M. chelonel BERGEY, HARRISON, BREED, HAMMER et HUNTOON, 1923.

5. M. chitae TSUKAMURA, 1966 a.

6 . M. diernhoferi BONICKE et JUHASZ, 1965.

7. M. duvalii STANFORD et GUNTHORPE, 1971.

8 . M. flavescens BOJALIL, CERBON et TRUJILLO, 1962.

9. M. fortuitum DA COSTA CRUZ, 1938.

10. M. gastri WAYNE, 1966.

11. M. gilvum STANFORD et GUNTHORPE, 1971.

12. M. gordonae BOJALIL, CERBON et TRUJILLO, 1962.

13. M. kansasii HAUDUROY, 1955

(33)

14. M. leprae (HANSEN) LEHMANN et NEUMANN, 1896.

15. M. lepraemuriuxn MARCHOUX et SOREL, 1971.

16. M. marinum ARONSON, 1926.

17. M. microti REED, 1957.

18. M. nonchromogenicum TSUKAMURA, 1965.

19. M. parafertuitum TSUKAMURA, 1966 b.

20. M. paratuberculosis BERGEY, HARRISON, BREED, HAMMER et HUNTOON, 1923.

21. M. phlei LEHMANN et NEUMANN, 1899.

22. M. scrofulaceum PRISSICK et MASSON, 1956.

23. M. simiae KARASSEVA, WEISZFEILER et KRASNAY, 1965.

24. M, smeqmatis (TREVISAN, 1899) LEHMANN et NEUMANN, 1899.

25. M. szulqai MARKS, JENKINS et TSUKAMURA, 1972.

26. M. terrae WAYNE, 19 66 .

27. M. thermoresistibile TSUKAMURA, 1966 c.

28. M. tuberculosis (ZOPF, 1833) LEHMANN et NEUMANN, 1896.

29. M. ulcerans MeCALLUM, 1948.

30. M. vaccae BONICKE et JUHASZ, 1964.

31. M. xenopi SCHWABACHER, 1959.

(34)

III. IDENTIFICATION

L'identification d'une souche inconnue se fait d'abord au niveau du genre, ensuite au niveau de l'espèce. Pour recon­

naître un genre, conune pour reconnaître une espèce^on peut se baser sur des critères morphologiques, physiologiques ou bio­

chimiques ou encore sur des critères plus modernes tels que les analyses chimiques des parois cellulaires que nous avons mentionnées dans les paragraphes précédents.

Nous exposerons dans le présent paragraphe les tests que nous utilisons.

1) Pour différencier les genres Nocardia et Mycobacterium (tableau n° 2 )

2) Pour identifier les nocardias au niveau de l'espèce (tableau n° 3)

3) Pour identifier les mycobactéries au niveau de l'espèce (tableau n° 4, 6 et 8 ).

Bien que les tests que nous avons choisis ne repré­

sentent qu'une partie des possibilités actuelles d'identification des nocardias et des mycobactéries, ils fournissent dans la

majorité des cas les caractères nécessaires et suffisants pour aboutir à l'identification désirée.

1. DISTINCTION EISITRE LES GENRES NOCARDIA ET MYCOBACTERIUM

La distinction entre les genres Nocardia et Mycobacterium,

basée principalement sur des critères morphologiques pose souvent

des problèmes difficiles à résoudre en raison du caractère trop

variable de la morphologie. Nous différencions les deux genres

par des tests physiologiques et biochimiques et lorsque ces tests

ne suffisent pas, nous recourons à la chromatographie en couche

(35)

mince afin d'analyser les acides mycoliques présents dans la souche étudiée.

L'identification des genres Nocardia et Mycobacterium implique également l'identification du genre Rhodococcus,

décrit récemment (GOODFELLOW et ALDERSON, 1977) qui groupe des souches parfois acido-résistantes, voisines des nocardias et des mycobactéries et anciennement appelées Mycobacterium rhodochrous.

A. Critères morphologiques

a. Examen mïaroscopique après coloration

La coloration de choix pour les mycobactéries et les nocardias est la coloration de Ziehl-Neelsen (voir chapitre IV).

Vu la structure complexe de leur paroi cellulaire, les mycobac­

téries et les nocardias sont des germes qui se colorent diffi­

cilement. Néanmoins, si l'on fait agir un colorant longtemps ou à chaud, ce colorant peut se fixer et il sera difficile de décolorer au moyen de solutions telles qu'un mélange d'alcool et d'acide, par exemple. La coloration de Ziehl-Neelsen se base sur cette qualité, c'est-à-dire sur 1 'acido-alcoolo-résistance de certaines bactéries. Certains auteurs parlent d'acido-résis­

tance au lieu d'acido-alcoolo-résistance; nous n'utiliserons pas cette expression car elle prête à confusion avec les résul­

tats d'une autre coloration, la coloration de Kinyoun où la décoloration se fait à l'acide uniquement, permettant ainsi de mettre en évidence l'acido-résistance des germes.

L ' acido-alcoolo-résistance s.e rencontre, parmi les

bactéries , chez certains genres appartenant à l'ordre des

Actinomycétales et en particulier chez les mycobactéries et

certaines nocardias.

(36)

L'acido-alcoolo-résistance constitue le premier critère important pour l'identification des nocardias et des mycobactéries.

Les mycobactéries sont en général fortement acido-alcoolo-résis- tantes alors que les nocardias ne le sont que faiblement. Cepen­

dant ces propriétés ne sont pas absolues car certaines nocardias ne sont pas acido-alcoolo-résistantes (GOODFELLOW, 1971) et dans une population de mycobactéries la proportion de bacilles acido - alcoolo-résistants par rapport aux bacilles non acido-alcoolo- résistants peut être très variable (DAVID, 1976).

L'acido-alcoolo-résistance tout comme la morphologie en général dépend du milieu de culture utilisé, de l'âge de la culture et de l'âge de la souche par rapport à son premier isolement (VELDKAMP, 1970, BERD, 1973). Outre 1'acido-alcoolo - résistance, on peut également observer la morphologie des bacté­

ries par examen microscopique après coloration (cet examen se fait en général avec l'objectif x 100). Les nocardias se pré­

sentent sous forme de filaments se fragmentant en éléments coccoldes ou bacillaires (PRAUSER, 1967) . Les mycobactéries ne produisent que très rarement des filaments et si c'est le cas, ils sont rudimentaires; elles se présentent généralement sous forme de bâtonnets (CROSS et GOODFELLOW, 1973). Les espèces appartenant au genre Rhodococcus produisent aussi des filaments mais sont rarement acido-alcoolo-résistantes.

b. Morphologie des colon'Les

La morphologie des colonies peut s'observer macros­

copiquement mais il est préférable d'utiliser un microscope

avec l'objectif x 10. D'une manière générale les colonies de

nocardias se caractérisent par la présence des hyphes aériens

en plus ou moins grande abondance (photo n° 1 ) alors que les

mycobactéries ne forment pas de hyphes aériens (photos n“ 2

(37)

et 3). Cependant, il arrive que certaines nocardias ne produisent pas d'hyphes aériens (GOODFELLOW, 1973) alors que Mycobacterium xenopi (photo n“ 4) forme des colonies portant de très courts hyphes aériens (RUNYON, 1968). De plus, la formation d'hyphes aériens est fortement dépendante de la composition des milieux de culture et des conditions dans lesquelles ces cultures sont réalisées (ARAI et KURODA, 1959; MARIAT, 1965). Le genre

Rhodococcus produit des colonies semblables à celles des myco­

bactéries, sans hyphes aériens.

L'identification des genres Nocardia et Mycobacterium basée sur des caractères morphologiques constitue un point de départ important car elle ne nécessite ni techniques ni matériel trop compliqués. Mais étant donné le caractère variable de la

morphologie, d'autres critères d'identification sont indispensables afin de confirmer la première orientation apportée dans l'iden­

tification par la morphologie.

Les caractères morphologiques permettant de différen­

cier les genres Nocardia, Mycobacterium et Rhodococcus sont repris dans le tableau n° 2 .

B. Critères physiologiques

Les résultats des tests physiologiques sont indiqués au tableau n° 2 .

a. La résistance au lysozyme

GORDON décrit en 1966 le test de résistance au lyso­

zyme permettant de différencier les nocardias résistantes au lysozyme des mycobactéries, sensibles au lysozyme. Ce test est repris par de nombreux auteurs et la technique en est simpli­

fiée par BERD (1973).

(38)

au lysozyme et GORDON (communication personnelle) observe des exceptions parmi les mycobactéries à croissance rapide,

M. fortuitum, par exemple, étant résistant au lysozyme.

b. Utilisation de composés organiques comme source de aarbone On peut également distinguer les trois genres d'après leur croissance sur un milieu de base additionné de certains composés organiques qu'ils utilisent ou non comme source de carbone. Le milieu de base est celui décrit par GODRON et MIHM en 1957; l'utilisation du sorbitol et du suce ^.nate de sodium comme sources de carbone sont des tests proposés par GOODFELLOW

(1973), le sucrose par GOODFELLOW, LIND, MORDARSKA et TSUKAMURA (1974) et la testostérone par GOODFELLOW et ALDERSON (1977).

C. Critères chimiques

Dans quelques cas, les critères morphologiques et physiologiques ne nous permettent pas de reconnaître à quel genre appartient une souche inconnue. Nous complétons alors

nos identifications par des analyses chimiques et en particulier par l'analyse des acides mycoliques.

Les mycobactéries, les nocardias et les rhodococci

contiennent différents types d'acides mycoliques qui peuvent

être distingués par diverses méthodes chimiques (MINNIKIN et

GOODFELLOW, 1976). Une des méthodes les plus simples, mise au

point par MINNIKIN, ALSHAMAONY et GOODFELLOW (1975) consiste

à comparer les différentes taches de méthanolysats de cellules

entières, obtenus après analyse chromatographique; la

(39)

chromatographie des méthanoiysats de mycobactéries donne une image avec plusieurs taches, tandis que les nocardias et les rhodococci ne produisent qu'une seule tache (photo n'^ 5); la situation de cette tache unique chez les nocardias et les rhodococci, révèle que les esters mycoliques des nocardias sont légèrement plus mobiles que ceux des rhodococci (MINNIKIN et al., 1975; GOODFELLOW, COLLINS et MINNIKIN, 1976).

Il est donc possible, par cette technique, de recon­

naître à quel genre appartient une souche inconnue. Pour plus de clarté, nous traduisons dans le tableau n° 2 les divers types de taches obtenues après chromatographie en couche mince de méthanoiysats de mycobactéries, nocardias et rhodococci, en utilisant la terminologie de GOODFELLOW (1973).

2. LES NOCARDIAS

Les tests que nous avons choisis pour l'identification des espèces appartenant au genre Nocardia sont tirés de l'étude taxonomique numérique réalisée en 1971 par GOODFELLOW. Pour trois espèces, N. carnea, N. transvalensis et N. vaccinii, non incluses dans l'étude de GOODFELLOW, les données proviennent d'une mise au point réalisée en 1974 par GORDON, Enfin, deux espèces, N. amarae et N. salmonicida, n'ont pas encore été incluses dans un travail taxonomique.

Les tests d'identification des nocardias sont indiqués dans le tableau n° 3 .

A. Hydrolyse de la caséine, de la tyrosine et de la xanthine

L'hydrolyse de la caséine, de la tyrosine et de la

xanthine sont décrites par GORDON et MIHM en 1962.

(40)

B. Utilisation de produits organiques comme sources de carbone La technique est décrite à l'origine par GORDON et MIHM (1957). Ces auteurs utilisent un milieu de base dépourvu de carbone auquel ils ajoutent du citrate de sodium comme

source de carbone. L'inositol et la testostérone sont additionnés par GOODFELLOW (1971) au milieu de base de GORDON et MIHM (1957).

C. Production d'acide à partir de sucres

La production d'acide à partir de divers sucres est décrite par GORDON et MIHM (1959). Le mannitol est utilisé par ces auteurs, le maltose et l'adonitol par GOODFELLOW (1971) avec toujours comme milieu de base, celui de GORDON et MIHM

(1959).

3. LES MYCOBACTERIES

En 1972, PATTYN et PORTAELS élaborent un premier schéma d'identification des mycobactéries basé sur les études taxonomiques internationales réalisées à l'époque (WAYNE et al., 1971, KUBICA et al., 1972) et sur les schémas d'identifi­

cation proposés par WAYNE, DOUBEK et DIAZ (1967) et par KESTLE, ABBOTT et KUBICA (1967) pour les mycobactéries scotochromogènes par WAYNE (1966) et KESTLE et al. (1967) pour les mycobactéries non chromogènes.

Dans le présent travail nous complétons le schéma de PATTYN et PORTAELS (1972) en y incluant les espèces nouvelles

et les espèces reconnues ultérieurement par les études taxonomiques numériques postérieures à l'élaboration de ce schéma.

Dans la plupart des cas les mycobactéries sont identi­

fiées au niveau de l'espèce au moyen de ce schéma mais dans

certains cas particuliers nous complétons les identifications

par des tests non décrits dans ce schéma. Nous exposerons ces

(41)

tests dans la deuxième partie de cette thèse étant donné qu'ils ne sont pas d'application courante pour l'identification des mycobactéries.

Notre schéma d'identification des mycobactéries comprend trois parties :

A. La première partie permet de faire la distinction entre les mycobactéries à croissance rapide et les mycobactéries à croissance lente (tableau n° 4).

B. La deuxième partie permet l'identification des mycobactéries à croissance lente (tableau n° 6 ).

C. La troisième partie est dèstinêe à l'identification des mycobactéries à croissance rapide (tableau n° 8 ).

A. Distinction entre mycobactéries â croissance lente et mycobactéries à croissance rapide

Le tableau n° 4 résume les caractères permettant de

distinguer les mycobactéries à croissance rapide des mycobactéries à croissance lente.

a. Croissance sur gélose peptonée

La vitesse de croissance des mycobactéries se détermine en ensemençant les germes sur un milieu gélose-peptone en tube, incubé à 37°C. Toutes les mycobactéries à croissance rapide se développent abondamment sur ce milieu en 2 à 6 jours. Seul M.

marinum fait exception en ne poussant ni sur gélose peptonée, ni à 37°C (ou difficilement). Certaines souches de M. flavescens et M. thermoresistibile, espèces intermédiaires entre les

mycobactéries à croissance lente et les mycobactéries à crois­

sance rapide, peuvent se développer sur gélose peptonée en 3

à 7 jours.

(42)

Vu l'existence d'exceptions concernant la croissance des mycobactéries sur gélose peptonée, la distinction entre mycobactéries à croissance lente et rapide est confirmée par deux autres tests ;

b. L'hydrolyse de la putrescine (BONICKE et NOTEE, 1967), réaction positive pour toutes les mycobactéries à croissance rapide y compris M. marinum et négative pour les mycobactéries à croissance lente.

G.

La réduction du oïtrate de fer ammoniaoal (SZABO et VANDRA, 1963), réaction positive pour toutes les mycobactéries à

croissance rapide, à l'exception de M. marinum et M. chelonei, et négative pour les mycobactéries à croissance lente.

Quelle que soit la vitesse de croissance des germes, on réalise ensuite une suspension homogène contenant 1 mg de poids humide d'organismes par ml d'eau physiologique; la suspension est rendue homogène en ajoutant de petites billes de verre et par l'agitation du mélange au moyen d'agitateurs électriques tels que le Vortex (pendant minimum 2 mn ) ou le Mickle (de 30 sec. à 2 min. d'après l'aspect lisse ou rugueux des cultures). De cette suspension on fait une dilution 10 ^ et l'on ensemence 0.1 ml de cette dilution sur chaque tube de la série I (série pour identification des mycobactéries à croissance lente) ou de la série II (série pour identification des mycobactéries à croissance rapide).

B. Les mycobactéries à croissance lente (série I) a . Les douze tests courants :

La série I se compose de :

1. un tube de milieu de Lôwenstein-Jensen (Lôw-J).

(43)

2. un tube de Lôw-J occulté par un papier.

3. un Lôw-J contenant 1 mcg/ml d'isoniazide (INH).

4. un Lôw-J contenant 5 mcg/ml d'isoniazide (INH).

5. un Lôw-J contenant 25 mcg/ml d'hydrazide de l'acide thiophène - 2-carboxylique (TCH).

6 . un Lôw-J incubé à 42°C.

7. un Lôw-J incubé à 44.5°C.

8 . deux tubes de Lôw-J contenant le milieu en culot, ensemencés avec OJl ml de la suspension non diluée.

9. un milieu gélose-acide oléique-albumine (milieu de Dubos) en boîte de Pétri ensemencé à l'anse à partir de la suspension non diluée.

Tous ces milieux de culture sont incubés à 37°C à

l'exception des tubes 6 et 7 qui sont placés dans des bains-marie réglés aux températures adéquates. Les cultures sont examinées chaque semaine jusqu'à apparition de croissance dans les tubes 1 et 2. On remplace ensuite les bouchons de caoutchouc par des bouchons d'ouate afin d'aérer les cultures. Après trois jours on ensemence à partir de ces cultures aérées 3 tubes supplémen­

taires.

10. un tube pour détection de phosphatase acide (KAPPLER, 1965).

11. un tube pour détection de nitrate réductase (VIRTANEN, 1960).

12 . un tube pour mise en évidence de production de niacine (KONNO, 1956).

Les tubes 1 et 2 permettent également d'observer

l'épreuve de photoinduction. En effet, en comparant la pigmenta­

tion des cultures ( 1 ) incubée à la lumière et ( 2 ) incubée dans l'obscurité on peut déterminer si les souches sont non chromo­

gènes (pas de formation visible de pigments), scotochromogènes

(44)

2 ° ^ 9 tivitê_catalasigue

Les tubes 8 sont aérés au 11 jour afin de pouvoir déterminer au 14 ièm© jour l'activité catalasique des germes à température ambiante et après chauffage à 68 °C pendant 20 min.

(KUBICA et al., 1966).

2° §ê 2 sibilitë_à_l^INH_et_au_TCH

Les tubes 3, 4 et 5 permettent d'évaluer la sensibilité des germes aux concentrations 1 mcg et 5 mcg d'INH (KESTLE et al.

1967) et à 25 mcg par ml de TCH (BONICKE, 1958), par rapport aux tubes contrôles 1 et 2 .

Ç£9i§§22Çi_l_i2l_§t_il^5°Ç

Les tubes 6 et permettent de voir si les germes poussent à 42°C et à 44.5°C.

5° Mor 2 hol 02 ie_de_la_colonie

L'observation des colonies isolées sur milieu gélosé de Dubos est importante pour deux raisons :

1 . elle constitue une vérification supplémentaire de la pureté de la souche examinée;

2 . elle nous permet de reconnaître la morphologie de la colonie typique pour certaines espèces mycobactériennes (KUBICA et W.D. JONES, 1965; PATTYN et PORTAELS, 1972).

Les différents types de colonies que l'on peut rencon­

trer chez les mycobactéries à croissance lente sont les suivants

- Colonie rugueuse (rough) R, avec parfois formation de "cordes"

(45)

(c) au sein de la colonie. On appelle alors ce type de colonie Rc.

- Colonie rugueuse, plus opaque (O) que la précédente, de forme plus ronde également et dont la périphérie s'épaissit avec l'âge pour donner un aspect cratériforme (c) typique. On appelle ce type de colonie Oc.

- Colonie plate, lisse ou parfois légèrement granuleuse, avec un mamelon central et des bords entiers très faiblement découpés.

On appelle ce type de colonie SmK (Smooth-Kansasii) car la

colonie est lisse et fut observée en premier lieu chez M. kansasii.

- Colonie plate rugueuse avec un mamelon central et des bords faiblement découpés ou parfois filamenteux. Ce type de colonie est intermédiaire entre la colonie R et la colonie SmK et

s'appelle pour ces raisons RK. Lorsque les bcrds sont filamenteux (f) la colonie est du type RKf.

- Colonie avec un épaississement central qui s'amincit graduelle­

ment du centre vers la périphérie; les bords sont fortement découpés et la forme est régulière. On appelle ce type de colonie SmS car il se rencontre très fréquemment chez les mycobactéries scotochromo- gènes (S). Avec l'âge, la colonie peut prendre la forme d'un

dôme; on l'appelle alors SmD.

- Colonie rugueuse dont les bords sont formés de très nombreux filaments (f) qui peuvent s'entrelacer. Cette colonie, typique

de l'espèce M. xenopl est dénommée pour cette raison Xf (photo n° 4).

- Colonie très transparente (T) au point qu'il est parfois difficile de la voir, dont les bords sont très découpés; la colonie est lisse

(Sm) et se dénomme SmT.

Les symboles que nous utilisons pour caractériser la morphologie des colonies sont ceux proposés par FREGAN et SMITH

(1962).

(46)

b. Les tests complémentaires

Aux 12 tests courants énumérés plus haut s'ajoutent quelques tests d'identification qui ne sont pratiqués qu'occa- sionnellement afin de confirmer une identification.

(BONICKE et LISBOA, 1959)

En 1959, BONICKE et LISBOA démontrent que les mycobac­

téries peuvent se caractériser au niveau de l'espèce, suivant le type d'amide qu'elles sont capables d'utiliser; c'est ce qu'ils appellent le "spectre amidasique" des mycobactéries.

Dix amides sont étudiées, numérotées de 1 à 10 :

1 . Acétamide 6 . Pyrazinamide

2 . Benzamide 7. Salycilamide

3. Urée 8 . Allantoïne

4. Isonicotinamide 9. Succinamide 5. Nicotinamide 10 . Malonamide

Pour l'identification courante des mycobactéries les amides les plus utilisées sont les numéros 3, 5 et 6 c'est-à-dire, l'urée, la nicotinamide et la pyrazinamide. On représente

d'ailleurs le spectre amidasique des mycobactéries par les chiffres correspondant aux amides utilisées par la souche testée.

Bien que ce test soit d'une très grande utilité pour l'étude de souches difficiles à identifier avec nos schémas classiques ou pour l'étude de nouvelles espèces, il présente cependant l'inconvénient d'être techniquement laborieux et long à réaliser.

2° Réaction_d^a 22 lutination (SCHAEFFER, 1965; 1967; 1968;

PATTYN, 1968)

L'identification des souches peut être complétée par

(47)

des réactions d'agglutination avec des immunsérums spécifiques.

Notre laboratoire possède les immunsérums suivants : kansasii, gastri, 5 sérums scotochromogènes et 18 sérums aviaires.

Les sérums aviaires et scotochromogènes déterminés par SCHAEFFER (1965) sont désignés par des noms propres, des chiffres arabes et des chiffres romains. Cette dénomination est actuelle­

ment remplacée par une nouvelle dénomination proposée par

WOLINSKY et SCHAEFFER (1973). Dans le tableau n° 5 nous mettons en parallèle l'ancienne et la nouvelle dénomination des sériams aviaires et des sérums anti-scrofulaceum.

M. kansasii et M. gastri étant des espèces réduites à un seul sérotype, ceux-ci, d'après la nouvelle dénomination, sont désignés par le nom de l'espèce précédé par le terme

"sérotype,,.

Les antigènes nécessaires à l'exécution de ces agglu­

tinations, proviennent d'un ou de plusieurs tubes de la série I montrant une croissance suffisante.

3° î 229 üi§tion_de_la_souris_blanche

Il est parfois nécessaire de confirmer un diagnostic en inoculant certaines souches à des animaux de laboratoire.

C'est le cas de M. ulcerans qui produit un gonflement visible local entre 3 à 6 semaines après inoculation dans le coussinet plantaire de la souris (PATTYN, 1965 a).

Les résultats des douze tests courants et des amidases

pour les espèces mycobactériennes à croissance lente sont résumés

dans le tableau n° 6 .

Figure

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Références

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