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Texte intégral

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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Bollen, A. (1980). Génétique, structure et fonction du ribosome bactérien (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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(2)

GENETIQUE, STRUCTURE et FONCTION du RIBOSOME BACTERIEN

Mémoire présenté pour

l'obtention du grade légal d'agrégé de l'Enseignement Stç»érieur

BOLLEN, Alex 1980

(3)

SONWAIRE du NENDIRE

. REMERCIEMENTS . AYANT-PROPOS

. INTRODUCTION ŒNERALE

. EXPOSE DES RECHERCHES ET RESULTATS

1. Résistance aux antibiotiques— Fidélité de la traduction a) Résistance â la spectinonycine (spc )

b) Résistance à la néamine (nea ) r (1) les différents mutants nea

(2) fidélité de la traduction et mutants nea''".

2. Expression et régulation des gênes de protéines ribosomiales a) Le gène de structure de la protéine ribosomiale S 18 b) Unités de transcription ribosomiales

c) Mutants conditionnels létaux (1) thermosensibles

(a) nonsense

3. Structure et fonction du ribosone a) assemblage in vitro

b) fonction du ribosome

c) pontage chimique- réactifs bifonctionnels . RESUME

. EPILOGUE . BIBLIOGPAPHIE .. POSTFACE

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ABREVIATIONS DNA acide de^'soxyTibonucléique

RNA acide ribonucléique

tRNA acide ribonucléique de transfert rRNA acide ribonucléique ribosomial r-protéine protéine ribosomiale

GTP Guanosine triphosphate I

IF facteur d'initiation EF facteur d'élongation RF facteur de terminaison

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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DES SCIENCES

EPREUVE PUBLIQUE POUR L'OBTENTION OU GRADE D'AGREGE DE L'ENSEIGNEMENT SlFERIEUR

AU TITRE LEGAL

Monsieur BOLLEN, Alexis, ri;' •. Docteur en Sciences,

défendra en séance publique, tenue en la Grande Salle des Bâtiments de l'Université Libre de

Bruxelles, 67, rue des Chevaux - 1640 - Rhode-St-Genèse, le JEUDI 10 JANVIER 1980 A 16.00 HEURES,

une thèse d'Agrégation intitulée z

"GENETIQUE. STRXTURE ET FONCTION DU RIBOSOME BACTERIEN",

ainsi que des propositions annexées.

;> ' ^ t ' ' •

Il fera une leçon publique sur le sujet suivant :

•L'INGENIERIE GENETIQUE AU SERVICE DE LA MEDECINE : PRINCIPES. METHODES ET APPLICATIONS».

(6)

Enoncé des thèses annexes

1. Il est possible, par ingéniérie génétique, de cloner le gène d'un activateur du plasminogène. La disponibilité d'un tel clone

devrait étendre l'usage de cet enzyme en thérapeutique humaine.

2. Il est possible de construire un dérivé de la toxine de la ricine capable de tuer sélectivement des cellules tumorales,

3. Il est possible d'isoler et de caractériser des mutants bactériens affectés dans le transport et la sécrétion des protéines.

Bollen, Alex

(7)

REMERCIEMENTS

L'ensemble des résultats repris dans ce mémoire résulte de nombreuses collaborations. Je me dois de remercier vivement, non seulement les quelques personnes avec lesquelles j'ai travaillé au Département de Biologie

Moléculaire, mais aussi toutes celles qui m'ont aidé au cours de mes séjours à l'étranger. Je reprends, ci-dessous, la liste de tous mes collaborateurs occasionnels ou permanents.

CABEZON, Teresa HEDIARCK, Ronald PIERCE, Ross CANNON, Michael HELSER, Terry STOFFLER, Georg v^uKLnuEUJ, Maria uidra TN Ti m (7-1- \ f^n COZZONE, Alain HERZOG, Albert SUNDBERG, John CRICHTON, Alain KAHAN, Larry THIBAULT, Jean DAVIES, Julian LAVALLE, Robert THOMAS, René

DELCUVE, Geneviève LATHE, Rick TOPISIROVIC, Ljubica DENICOURT, Denise LECOCQ,Jean-Pierre TOUSSAINT, Ariane DESMET, Lucie LELONG, Jean-Claude TRAUT, Robert

DE WILDE, Michel MASCHLER,Re inhardt VAN GYSEGEM, Frédêrique FAELEN, Michel MIZUSHB1A, Shoji VILLARROEL, Raimundo FAVRE, Alain NOKIN, Pierre WITB1ANN, Heinz GHYSEN, Alain NOMURA, Masayasu YAGUCHI, Makoto GROS, François OSTE, Christian YAMADA, Takeshi GROS, Daniôle OZAKI, Makoto ZENGEL, Janice GROSJEAN, Henri PETRE, Jean

(8)

Je veux aussi remercier tout particulièrement. Monsieur le Professeur René THCMAS, pour la confiance qu'il m'a témoignée depuis mon entrée au laboratoire. Je désire, en outre, insister sur la joie que j'ai eue à travailler quotidiennement et à partager succès et échecs avec les "anciens" du groipe ribosome , Robert, Teresa, Michel, Nino, Jean et Geneviève.

Enfin, je remercie mes parents de m'avoir aidé à acquérir une formation et un métier que j 'aime et ma femme et ma fille pour leur patience quand la folie du laboratoire me saisit.

Toute ma gratitude enfin va au Fonds National de la Recherche Scientifique qui, dès 1963, m'a accueilli en son sein.

(9)

AYANT-PRÛPOS

En 1941, J. Brachet, d'une part, et Caspersson de l'autre démon- trèrent que, dans toute cellule, la vitesse des synthèses protéiques dépend directement du taux d'acide ribonucléique cytoplasmique (Brachet, 1941 ; Caspersson, 1941). Cette observation, associée à la découverte de particules riches en RNA (Claude, 1938 ; 1940 ; 1941) permit à Jeener et Brachet (1941 ; 1942) de conclure que ces granules, appelés microsomes, jouent un rôle essentiel dans la synthèse des protéines.

Ce n'est cependant qu'au cours des années 50 qu'il devint tout à fait évident que les microsomes, ou plutôt les particules débarrassées des fragments de reticulum endoplasmique, constituent le site d'assemblage des acides aminés en protéines (Borsook et al, 1950 ; Zamecnik and Keller, 1954 ; Littlefield et al, 1955 ; Pallade, 1955 ; Littlefield and Keller, 1957). Ces conclusions tirées de l'étude de cellules anima- les furent bientôt étendues à tous les types d'organismes (bactéries, plantes, levures) et dès 1958, la notion de RIBOSOME était introduite

de manière définitive dans le langage scientifique (Roberts, 1958).

Depuis cette date, l'étude des propriétés physiques, de la fonction et de la génétique du ribosome fut entreprise dans de nombreux labo- ratoires. En 1974, un livre consacré au ribosome fut édité par Nomura, Tissières et Lengyel (1974). Cet ouvrage offre une vue générale du domaine et illustre bien les énormes efforts consentis par de nombreux chercheurs pour élucider le rôle du ribosome dans la synthèse protéique.

Au cours de ce mémoire, je me limiterai à l'étude du ribosome bactérien et je présenterai, dans le cadre des connaissances actuelles, les

quelques contributions que j'ai pu y apporter.

(10)

1

INTRODUCTION GENERALE

k) Stnjcture et fonction du ribosome

Le ribosome bactérien se compose de àeux. sous-unités, 30S et SOS, dont l'association en particule 70S est requise pour la lecture du RNA messager. La structure de la particule dépend de l'assemblage cor- rect et coopératif de 52 protéines différentes et de 3 molécules de RNA distinctes, 16S, 23S et SS. On troiivera dans le premier tableau (tableau 1) les caractéristiques physiques principales du ribosome bactérien.

Toute l'information nécessaire à l'assemblage correct des particules ribosomiales est contenue dans leurs constituants. Les ribosomes 30S et SOS possèdent, en effet, la capacité de s'assembler in vitro de façon autonome. La réaction de reconstitution in vitro diffère probable- ment par quelques détails du processus in vivo ; mais, selon toute vraisemblance, elle suit d'assez près les grandes lignes des mécanismes cellulaires (voir aussi Nomura 1977 pour une analyse détaillée du

processus d'assemblage). Le succès de la reconstitution totale in vitro des ribosomes 30S a permis de dresser une carte d'assemblage dans laquel le l'ordre d'addition des protéines est déterminé (Figure 1). Les in- formations relatives à la reconstitution totale du ribosome SOS sont plus récentes (Nomura and Erdmann, 1970 ; Nierhaus and Dohme, 1974 ; Amils et al, 1978 ) et elles n'ont pas encore permis l'établissement d'une carte conplète de l'assemblage in vitro (Figure 2).

Ce type d'expériences offre la possibilité d'analyser le rôle de chaque conposant ribosomial, soit au cours de l'élaboration de la structure de la particule, soit pendant le cycle de la synthèse protéique. En outre, la substitution d'un conposant normal par un élément altéré (par exenple

(11)

Tableau 1,

Quelques propriétés physiques du ribosome d'E.coli.

- Ribosome 70 S : p.m. = 2,65 10^,

- Ribosome 30 S : p.m. = 0,9 10^.

o

dimensions : 55 x 220 x 220 A.

hydratation : 0,39 gr H2O / gr rib.

1 molécule de RNA : 16S = 1600 nucléotides.

p.m. = 0,56 10^.

21 protéines : p.m. moyen = 19.000 +(lx 65.000) (de 10 â 29.000) Nomenclature : S I — S 21

- Ribosome 50S : p.m. = 1,55 10^.

dimensions : 115 x 230 x 230 A°

hydratation : 0,58 gr H^O / gr rib.

2 molécules de RNA : 23S = 3.200 nucléotides.

p.m. 1,1 10^.

5S = 120 nucléotides.

p.m. = 40.000.

34 protéines : p.m. moyen = 16.300 (de 9 à 26.000)

Nomenclature : L l — ^ L 3 4

Notes . S20 est immunologiquement identique â L26.

. L7 et L12 sont identiques sauf pour la présence d'un groupe acétyl- sur la sérine N-terminale.

. L8 est un complexe contenant L7/L12 et LIO.

(1) d'après Van Holde et Hill (1974); Wittmann (1974); Monier (1974)et Fellner (1974).

(12)

3.

Revised assembly map of E.coli 30S ribosomal proteins. Arrows between proteins in- dicate the facilitating effect of one protein on the binding of another -a thick arrow indicates a major facilitating effect. The map may be used to indicate the following relationships. The thick arrow from 16S RNA to S4 indicates that S4 binds directly to 16S RNA in the absence of other proteins. The thin arrow from 16S RNA to S7 indicates that S7 binds weakly to 16S RNA in the absence of other ribosomal proteins. Thin arrows pointing toward S7 from SA, S8, S20, S9 and S19 indicate that the latter proteins ail enhance the binding of 87 to RNA. The arrow to S U from the large box with dashed outline indicates that S U binding dépends on some of the pro- teins enclosed in the box ; it is not known exactly which proteins. The binding of 82 takes place at a later stage in the assembly séquence and is stimulated by the présence of 83 and probably by several other proteins ; hence extra arrows are added toward 82 to emphasize the point. Proteins above the dotted line are those either required for the formation of RI particles or found in the isolated 218 RI particles

(see text). It should be noted that the arrows Connecting initial binding proteins to 168 RNA have no relationship to the actual order of the binding sites along the 168 RNA molécule.

Figure 1 Carte d'assemblage du ribosome 308, in vitro. (Held et al_, 1974)

(13)

4.

L 2 2 L 2 4

I t

5 ' - I3S

LZI

1

LA L 2 0

I L

5'-(5S 1^3'

I I I

L 7 / L I 2 L5 L i e t Z S L I O - L I I î

LI3 L23 L2 LI6

t t t t

L I 7 / L 2 7 L 2 8 L l L 3 L6 L I 4

[es

M t !

I 2 S - 3 '

1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0

Unmtigned P r o K i n t : L9, LIS, LIS, LZ9, L 3 0 , L 3 I , L 3 2 . L 3 3 , L 3 4

Partial reactions in 505 ribosomal subunit assembly. Heavy arrows repre- sent direct and spécifie interactions of proteins with the 5S and 23S RNAs. Assignment of proteins to the 13S, 8S and 12S fragments of the 23S RNA was carried out as prevously described. The approximate positions of binding sites for Ll, L20, L23 and L24 are indicated by solid bars. Inter- rupted bars marks possible locations of binding sites for LA and L16 at junctions between the major subfragments. Dashed line in 13S RNA indicates

the T, RNase cleavage site. L14 associâtes with the 18S RNA but not with intact 23S RNA ; it has not yet been assigned to either the BS or 12S subfragments.

The ordering of protein binding sites on the 5S RNA has recently been re- ported. Light arrows dénote coopérative interactions characterized by us in this and earlier communications, with the exception of the LU—»-L10-»-L7/L12 pathway which was described by Highland and Howard.

Figure 2 Assemblage du ribosome 508, in vitro (Spierer et al, 1979).

(14)

une protéine ribosomiale provenant d'un mutant) permet de reconstituer in vitro des ribosomes de type altéré et d'étudier l'effet de cette al- tération sur la fonction du ribosome. Ce genre d'approche fut utilisé notamment pour démontrer la présence de mutations dans les gènes de protéines ribosomiales chez des souches bactériennes résistantes à différents antibiotiques (voir plus loin).

Avant d'entrer dans l'étude détaillée du ribosome, il est souhaitable de schématiser le cycle que suit cette particule lors de la synthèse protéique. Sans chercher à détailler chaque étape, tâchons de poser les grandes lignes du processus. (Figure 3). Dans un premier temps, le

ribosome 30S, sous l'action concertée de trois facteurs protêiques d'ini- tiation (IF1, IF2, IF3) et du GTP, s'associe à l'extrémité 5' du RNA messa- ger, au niveau de son codon initiateur (AUG, GUG) et fixe le tRNA

initiateur chargé de fonnylméthionine (Fmet-tRNA met). Plusieurs compo- sants ribosomiaux sont inpliqués dans cette étape ; le RNA 16S par son extrémité 3' interagit avec une séquence complémentaire situé à l'extrémi- té 5 ' du RNA messager, la protéine SI intervient dans la sélection du RNA messager ; plusieurs autres protéines ribosomiales constituent un domaine réservé à la fixation du tRNA initiateur (ce domaine est appelé opérationnellement site P ).

La puronycine est un analogue de l'extrémité amino acyl-adény- late des tRNA chargés ; elle s'attache au même site que ceux-ci sur le ribosome et sert d'accepteur au foimylmethionyl tRNA et au peptidyl tRNA, entraînant dès lors la terminaison prématurée de la synthèse protéique. Les sites A et P sur le ribosome ont été définis en fonction du mode d'action de la puroraycine.

Site A : non réactif à la puranycine ; constitue le récepteur des amino- acyl tRNAs.

Site P : réactif à la puromycine; constitue le récepteur du tRNA initiateur et du peptidyl tRNA.

(15)

G D P GT P

Figure 3 cycle du ribosome (Cabezon, T ; PhD Thesis, 1975)

Initiation Elongation Terminaison

étapes 2 â 8 étapes 9 à 10 étapes 11 à 1

(16)

7.

A ce premier complexe, débarrassé de deux des trois facteurs d'initi- ation, vient alors se joindre la sous-unité SOS. Après hydrolyse de GTP et relâchement du dernier facteur d'initiation, le complexe d'initi- ation proprement dit est constitué et prêt à s'engager dans la phase d'élongation. Celle-ci nécessite une source d'énergie (GTP) et fait intervenir les facteurs d'élongation Tu et Ts, chargés de présenter les amino-acyls tRNA au site accepteur du ribosome (site A, défini lui-aussi opérâtionnellement), en face du deuxième codon sur le RNA messager.

La liaison peptidique entre la formyl methionine et le deuxième acide aminé est alors assurée par l'action du ribosome SOS (activité peptidyl transferase).Le transfert du peptidyl tRNA résultant de cette activité en- zymatique s'effectue par l'action du facteur d'élongation G et de GTP.

Dans cette réaction, plusieurs événements se passent de façon concommitante le tRNA déchargé de son acide aminé est éjecté du ribosome, le peptidyl tRNA passe du site A au site P et le ribosome avance d'un codon le long du RNA messager. Le site A étant libre, le processus d'élongation peut alors recommencer et cela jusqu'à la fin du message à traduire.

Différents composants ribosomiaux sont impliqués dans 1'élongation. Tout d'abord, il semble que les sites A et P soient constitués de protéines

(17)

8.

ribosomiales distinctes, ou tout au moins, que la participation de certaines d'entre elles soit davantage associée à l'un ou à l'autre des deux sites. La protéine L7/L12 (deux formes différentes d'une même protéine) constitue le site d'action du facteur G ; un ensemble formé du RNA 5S et de deux ou trois protéines constitue, au sein du ribosome 505, le récepteur des tRNAs.

A l'extrémité 3' du RNA messager se trouve le signal de fin de chaîne, constitué de codons particuliers, UAA, UGA, ou UAG (appelés ochre, opale ou amber, respectivement). Ces signaux non sensé ne sont normale- ment pas lus par les tRNAs habituels mais seulement par des tRNA dits

"siçpresseurs" (voir plus loin). Ils ne suffisent cependant pas à assurer la libération de la chaîne polypeptidique synthétisée sur le ribosome ; cette dernière opération requiert, en effet, l'intervention de deux facteurs protéiques, RI, R2 dont la spécificité est différente vis-à-vis des différents codons placés en fin de chaîne. Un troisième facteur, R3, stimule l'efficacité des deux premiers. Le rôle des fac- teurs R semble être de transformer l'activité peptidyl transférase du ribosome SOS en activité peptidyl hydrolase, avec pour conséquence, la libération du peptide. Le ribosome porte encore à ce moment le dernier tRNA déchargé ; celui-ci, sous l'action probable d'un autre facteur protéique, est relâché et le ribosome se dissocie en ses sous-unités

30S et SOS. A ce moment, le facteur IF3 agit en tant que facteur d'anti- association, c'est-à-dire qu'il prévient la formation spontanée de couples 30S-50S qui conduirait à des ribosomes 70S, inactifs dans la synthèse protéique. Tout ribosome 30S portant le facteur IF3 peut alors s'engager dans un nouveau cycle d'initiation. Le lecteur désireux de connaître l'ensemble des travaux relatifs au cycle du ribosome peut se

(18)

9.

référer à quelques revues récentes (Brimacombe et al, 1976 ; Grunberg- Manago et Gros, 1977 ; Richter et Isono, 1977 ; Weissbach et Pestka, 1977 ;Kurland, 1977).

Comme on l'a vu ci-dessus, la conçlexité structurelle du ribosome n'a d'égale que sa corçlexité fonctionnelle. Parmi les propriétés du ribo- some, relevons sa capacité de fixer spécifiquement et précisément des molécules aussi différentes que le RNA messager, les tRNAs, les facteurs protéiques de traduction (IF, EF, RF), des nucléotides (GTP), et d'assu- rer des fonctions enzymatiques spécifiques comme les peptidyl-transfé- rase et hydrolase. La caractéristique principale des interactions entre

W les conposants du ribosome réside manifestement dans leur coopérativitê . Ce concept doit rester à l'esprit si l'on veut assigner, par l'une ou l'autre méthode, une fonction â l'un des composants ribosomiaux. En effet, lorsqu'on observe la disparition d'une fonction à la suite d'une modification du ribosome (par mutation, modification chimique, etc...), on ne peut généralement pas distinguer entre deux possibilités : soit que le site inpliqué dans la fonction ait été effectivement modifié, soit que le composant altéré ne participe qu'indirectement à l'établis- sement du site actif. Pour illustrer ce qui précède, nous avons rassem- blé, dans le tableau 2, les principales approches expérimentales et les

conclusions obtenues par les recherches visant à l'identification des conposants ribosomiaux associés aux diverses fonctions du ribosome.

Depuis leur mdse en évidence, les ribosomes, ces petites boules ribonuclêoprotéiques, ont fasciné le chercheur. Comment tous les élé- ments ribosomiaux sont-ils organisés dans l'espace ? Plusieurs méthodes

ont été développées dans le but de préciser la place occipée par chaque composant au sein de la particule. Parmi les plus intéressantes techni- ques, citons le pontage chimique des constituants ribosomiaux à l'aide K Ce terme est utilisé ici au sens large, il indique que plusieurs composants

du ribosome participent simultanément à la formation d'un complexe ou dé- terminent ensemble un site fonctionnel.

(19)

10.

de réactifs bifonctionnels, le marquage d'affinité, la microscopie élec- tronique couplée ou non à l'utilisation d'anticorps spécifiques, le trans- fert d'énergie entre sondes fluorescentes fixées sur le ribosome et la diffraction de neutrons sur des particules deutérées dans leur constituant protéique ou nucléique. Au cours des dernières années, plusieurs modèles tridimensionnels ont été proposés puis rejetés tout aussitôt pour manque de conformité avec les données expérimentales. Il semble cependant que la méthode la plus fiable actuellement soit l'étude par le microscope élec-

tronique de complexes entre le ribosome et les anticorps dressés contre chacune des protéines ribosomiales. Deux groupes de chercheurs, employant la même méthodologie, ont proposé des modèles â trois dimensions très im- pressionnants mais aussi relativement différents ! (Lake et al, 1978 ; Stôffler et al, 1972). Visitons, à titre de curiosité une galerie de

"tableaux", où l'on peut apprécier le degré de raffinement auquel on est arrivé dans l'élaboration des modèles tridimensionnels. (Figure 4).

Aucun des modèles, repris dans cette galerie, ne considère la localisation du RNA. On peut seulement relever sur les modèles l'emplacement des

protéines qui interagissent avec le RNA (voir figures 1 et 2) et en déduire l'emplacement approximatif de fragments de RNA. La recherche de réactifs bifonctionnels capables de lier les protéines au RNA ou les molécules de RNA entre elles se développe activement ; il est clair que la possession de tels réactifs complétera l'étude topographique du ri- bosome .

(20)

Tableau 2

a) Fonctions des composants du ribosome 30S.

11.

Assemblage Topographie ^^^^^

ions Autres propriétés P. M. Com-

X 10~^

Présence dans -3 plexe 21S |T]

m

m avec RNA

16S

m

in vitro m vivo 1 / 2 sad/W.T.

CsCl cores

(a)

Pontage chimique

avec :

Œ] M

(b) (c)

Fixation de fmet phé

t-RNA t-RNA strep.

fixation du m-RNA néces- saire à la traduc- tion de MS2

65 S14,S21 +(f) (+)

(f)

proche de l'extr.3' du 16S 15,16

tiation,3'

ini-

"un- folding" ll7|,[ïî_ i- dentique au facteur i ^ XL à IF-2 et IF-3

28,3 S3 ,S5,

S8

+d + (d) + (h) + (i)

(+) (k)

Activité EF-T-GTP ase (m)

S3 28,2 _ _ _ _ - S2 ,S10 +(d) +(g) , . Fixation du m -

+ (h)

\l.

RNA (i) +(i)

26,7 ++ ++

62

Fidélité de la tra- duction. Fixât ion du triplât AUG (n)

XL au RNA 16S I2ÔI,

21,22,23

19,6 ++ S2,S4 +(d)

S8 ,S9

+ (k)

activité EF-G-GT Pase (m) (activité EF-T-GT Pase)(m) fidélité de la tra- duction. Sens ibili té â la spectinomycine différence entre K et B | 4 ] , ^

15,6 ++ ++ S4,(S7), +(d) +

(S9), (g) S18

22,7K

19,6B ++ (86),S8,

S9

XL à IF-3 15 dif- férence entre K et B.pas de di_ff.fonc- tionnelle

RNA 16S

26 XL au 2C,2] ,22 23

(21)

12.

Assemblage Topographie ^^^^^

ions Autres propriétés P.M^

X 10~3 Com- Présence dans Pontage "Fixation de plexe 21S [Â] CsCl chimique

avec in vitro in vivo cores avec : ^ 1 11 sad/W.T.

RNA 10 fmet phé strep.

16S [7] [s] (a) (b) (c) t-RNA t-RNA

S8 15,5 + ++ ++ ++ +

S2, S5 , + SA, S7

S9 16,2 ++ + + -

S5 ,S7 (S6), SA

+ (d) + (j)

activité EF-G-GT Pase (m)

activité EF-T-GT Pase (m)

SIO 12,4 S3 +(d) (+)

<d)

S U 15,5 ++ - - -

S18,(S19),

+ S21 + (d) (+)

(d)

XL à IF-2 et IF-3:

[5j fidélité à la traduction (e) XL à IF-2 et IF-3

17,2 SA

+ (e) + (d)

53 spécificité de l'initiation ambiguité de la traduction sensi' bilité à la strep' tomycine élonga- tion Wh

S13 14,9 + ++ ++ + + + S4,S19 + (e)

+ (d)

XL à IF-2 et IF-3 U

SIA

\

14,0 S1,S19 + (d) + (f)

+ (g) + (h)

(+) (f) (+)

(j)

S15 12,5 + ++ ++ ++ + +

11.7 ++ ++ requise uniquemenl

pour l'assemblage 27

10,9 ++ ++

ambiguité de la traduction, sensi- bilité a la néa- mine. changement

de conformation par fixation de polyU-aat-RNA-EF- Tu-GTP l28

(22)

13.

Assemblage Topographie

Fonctions •Autres propriétés Proté-

ine

a m

P.M^ Com- X 10 3 plexe

avec RNA

16S

J I L _

Présence dans Pontage 21S [Â] CsCl chimique

'in vitro "in vivo cores avec : 1 /2 sad/W.T. [9] ^

[HH] [3 m

(a)

(b)

(c)

Fixation de fmet phé strep, t-RNA t-RNA

S18 12,2 ++ + S6,S11,

S21 + (f)

+(d) (+) +(f) (d) + (g)

fixation m-RNA (polyU) |î|

XL à IF-3 63

fixation du triplt AUG (n)

S19 13,1 ( S U ) ,

S13,S14 + (d)

+ (d) + (f) + (g)

(+) (d)

fixation m-RNA (polyU) I H XL à IF-3 ^

fixation du tripl(

AUG (n)

S20 12,0 ++ + + (e) (+)

(d)

S21 12,2

S I , S U , S18

+ (d) + (e)

+ (d) + (f) + (g)

changement de con- (+) formation par fi-

(d) xation de polyU ( + ) [2^ .fixation de

(f) mRNA (polyU) |13 XL à IF-3 53 non nécessaire

(absente?) à l'initiation (o)

a) Donnée technique ne relevant pas de l'assemblage proprement dit ; + : présente, - : bsente des "cores" CsCl 5 M (29|,[3q|

b) Pontage covalent par réactif bifonctionnel : : pontage détecté par au moins deux éactifs différents ; ( ) : détermination non définitive.

c) Voir aussi : mesures de distance interprotéines par : transfert d'énergie entre sondes luorescentes 31 ;diffraction de neutrons 32

d) Inhibition par fixation de Fab spécifiques 33

e) Reconstitution avec omission d'un seul composant (n'est considéré comme significatif le lorsque la reconstitution mène à des particules 30S) [34

E) Inhibition par réaction préalable des SH avec la N-éthylmaléimide |35

(23)

14,

l ) protégé de la trypsine de Phé-t-RNA [33 •

ti) Stimulation par addition d'un excès de protéines purifiées dans un système de recons itution 37 .

l) Récupération d'activité par addition de protéines à des particules inactivées Q8]

i) Perte de la fixation après digestion ménagée à la trypsine |39

k) Récupération de l'activité par addition de protéines purifiées â des "cores" LiCl 1) XL par le mercaptosubérimidate : IF-2 41 ; IF-3 Heimark et Traut, non publié ; la éthode ne permet pas de distinguer les voisins directs (XL IF-pr^) des voisins éloignés XL I F - p r ^ - p r ^ .

n) Récupération d'activité par addition de protéines à des "cores" CsCl : EF-G ^Sj , F-T 42

n) Marquage d'affinité (analogue de AUG) |43j ; ces résultats dépendent fortement des Dnditions expérimentales ; selon les conditions, S18 et S21, S4, S18 et S21, ou encore 4, S U et S12 peuvent être marquées 44

o) Inhibition de la fixation de fmet-t-RNA par addition de S21 à des 30S "natifs" |45]

erieusement contesté par des expériences de reconstitution [46

XL : abréviation pour "cross linking" : pontage chimique.

(24)

Tableau 2 (suite)

b) Quelques fonctions des composants du ribosome 505

. Peptidyl transferase L2, L4, L16 47

. Récepteur de 1'erythromycine L15, L16

M

. Fidélité de la traduction L6

((•("'R i nt nncf î] 1 ;i p/Mit'iiiiyc i ne)

. Interaction avec RNA 5S L5, L18, L25

. Terminaison L U

US

(25)

16.

REFERENŒS (Tableau 2)

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(29)

Figure 4 Galerie de modèles des ribosomes 30S et 50S

F u i i RE 1. rhotogiaph of thc mcchanirally aotiiig mixlcl of ribosijinc with two hinged subparticlcs drawii apart.

Contactiiig surfaces of thc subparticlcs arc occupied by n i K X A , aininoacyl t K X A , aiul pepti(i.\ 1-tKNA. Peptidyl is hooki'd (in the largcr (upper) subiiartiel<' by magnct imitating pcptidyl traiisferase cciitcr.

a) Modèle du ribosome 70S (Spirin, 1969).

Conception libre du ribosome 70S basée sur les fonctions essentielles du ribosome pendant la synthèse protéique.

(30)

Figure 4 (suite)

b) Modèle du ribosome 30S (Morgan et Brimacombe, 1973)

Modèle préliminaire basé sur l'analyse de fragments ribonucléiques dérivés du ribosome 30S par digestion ménagée à la ribonucléase.

c) Modèle en 3 dimensions du ribosome 30S (Bollen et al, 1974).

Ce modèle repose sur l'analyse par ordinateur de l'ensemble des données de la littérature sur la structure et la fonction du ribosome.

(31)

Figure A (suite) 22.

Figure l A m o d e l ot~ t h e £ . coSi 3 0 S r i b o s o m a l s u b u n i t . T h e m o d e l w a s p h o t o - g r a p h e d f r o m ( A ) t h e t o p . ( 0 ) t h e b o t t o m , a n d ( C ) t h e s i d e . R i b o s o m a l p r o - t e i n s a r e r e p r e s e n t e d b y a p p r o p r i a t e l y l a b e l e d s p h è r e s . E v i d e n c e f o r p r o t e i n p a i r r c l a t i o n s h i p s is d e p i c t e d b y c o n n e c t o r s : g r e y — c r o s s - l i n k i n g ; s t i p f r f e d — i n v i t r o a s s e m b l y , b i n d i n g i n t e r d e p e o d e n c i e s and p r o t e c t i o n f r o m c b e m i c a l m o d i f i - c a t i o n ; b l a c k — i n v i t r o a s s e m b l y , i n t e r d e p e n d e n c i e s or p r o t e c t i o n .

d) Modèles des sous-unités 30S et 505 (Traut et al, 1974).

Ces modèles reposent sur l'analyse des relations de voisinage entre protéines (pontage chimique) et sur l'ensemble des données de la littérature concernant la structure et la' fonction du ribosome.

e) Modèle du ribosome 30S (Gaffney et Craven, 1978). Ce modèle dérive de l'ana- lyse par ordinateur des données de la littérature, il tient compte de la forme des protéines (allongées ou globulaires).

(32)

Figure 4 (suite)

23.

f) Modèle des sous-unités 30S, 505 et 705 (Lake et Kahan, 1975; Strycharz et al^, 1978).

Ces modèles découlent de l'étude du ribosome par microscopie électronique couplée à l'emploi d'anticorps spécifiques de chacune des protéines ribosomiales.

(33)

Figure 4 (suite) 24.

1SA7A

g) Modèles des sous-unités 30S, 508 et du ribosome 70S.(Tischendorf et al, 1975).

Ces modèles dérivent de l'étude du ribosome par microscopie électronique couplée â l'emploi d'anticorps spécifiques de chacune des protéines ribosomiales.

Remarquons la différence de formes entre ces modèles et ceux de Lake et Strycharz (f) alors que les deux groupes de chercheurs utilisent essentiellement la m ê m e approche expérimentale.

(34)

b) Génétique du ribosome

Tout comme le'ftiodêliste", le généticien,(certains du moins), ne peut manquer d'étudier le ribosome avec passion-. En effet, plus de 80 gênes

sont à identifier, ceux qui codent pour les 54 protéines ribosomiales, ceux qui déterminent la structure des RNA 16S, 23S et 5S et ceux qui codent pour les facteurs protéiques intimement associés au ribosome pendant son fonctionnement. L'étude génétique ne se limite pas, en réalité, â caractériser les gènes qui codent pour ces protéines et ces RNA ; elle peut conduire aussi â l'élucidation de leur organisation, à la mise en évidence de promoteurs ou de gènes régulateurs intervenant dans l'expression des gènes de structure. En outre, une bonne approche génétique devrait permettre de comprendre les mécanismes de régulation de la biosynthèse du ribosome au cours de la croissance cellulaire.

L'étude génétique du ribosome consiste surtout à isoler des mutants

bactériens porteurs de lésions dans l'un ou l'autre composant ribosomial.

L'analyse des effets de ces altérations sur la structure et sur la fonction du ribosome, ou encore sur le comportement physiologique du mutant, permet d'accumuler un grand nombre d'infoxiiations relatives à la

structure et à la fonction du ribosome et au rôle physiologique des gènes mutés. Pour une étude détaillée de la génêtirue du ribosome bac- térien, le lecteur pourra consulter les revues publiées par De Wilde et al, (1977) et Nomura et al (1977). Nous nous efforcerons ci-dessous de reprendre l'ensemble des connaissances sur la génétique du ribosome bactérien ; deux tableaux rassembleront les inforni£tions générales sur chacun des gènes du ribosome, y compris les données provenant de nos propres recherches.

(35)

(1) gènes_codant_pour_les_RM_ribosomia

Le génome bactérien porte au moins sept exeiiç)laires de chaque RNA ribosomial ; ceux-ci sont organisés en "unités de transcription" compre- nant , dans 1 ' ordre, les gènes des rRN^fe 16S, 23 et 5S. Chaque unité de transcription contient en outre un ou plusieurs gènes codant pour des tRNAs.(Kenerley et al, 1977 ; Nomura et al, 1977). Bien que les gènes de rRNA soient multiples, ils ne représentent toutefois qu'une petite fraction du DNA bactérien (0,6 à 0,8 %). Ces gênes doivent cependant assurer, au cours de la croissance optimale de la bactérie, la synthèse de près de 50 % du RNA total. Notons au passage que 4 opérons de

RNA ribosomiaux sont localisés près de l'origine de replication ; cette situation particulière pourrait être sans doute favorable à la synthèse rapide et abondante des RNA. En tout cas, il est probable que la vitesse d'initiation de la transcription soit exceptionnelle- ment élevée. Ce phénomène semble lié à la présence de plusieurs pro- moteurs situés en tête de chaque opéron de rRNA. (Spadari et Ritossa,

1970 ;Donini, 1972 ; Mueller et al, 1977 ; Glaser et Cashel, 1979).

Selon certains auteurs, les promoteurs de chaque opéron rRNA ne seraient pas homologues et l'expression de chaque unité de transcription pourrait

être contrôlée de façon différente (Oostra et al, 1977). D'autres sources d'information, au contraire, concluent à un processus de régulation

coordonnée (Morgan et Kaplan, 1976). Le tableau 3 rappelle la localisation et la structure des sept opérons rRNA identifiés à ce jour; le lecteur y trouvera aussi la bibliographie et un résumé des méthodes utilisées pour l'identification des opérons rRNA.

(2) gênes_de_structure_des_protéines_r^^

Dans ce chapitre, nous discuterons la localisation des gènes codant pour les protéines ribosomiales ( r-protêines chez E. coli. Deux régions

(36)

Tableau 3

Localisation et structure des opérons rRNA

Noms des opérons rRNA (a)

Localisation sur la carte d'E.coli (b)

Structure des opérons rRNA : produits des gènes connus (c)

Méthodes utilisées et références (g)

rrnA min 85 RNA16S-(tRNA^^^^-tRNA^g^)- RNA23S-RNA5S Localisation d'un gêne de rRNA5S (cqsA) produisant un oligonucléo- tide mineur (1)

metE-rHa Isolement d'épisomes F'(2,3,4) et

de plasmides colEl hybrides (5,6) rrnB min 88 RNAl6S-tRNa|^"-ENA23S-RNA5S Isolement d'épisomes F' (2,4) de pha-

ges transducteurs (7,8) et de plas- mides colEl hybrides (5).

r m C min 83 RNA16S-tRNAf^^-RNA23S-RNA5S-(tRNA^^^P-

ilv

tRNA asp

Localisation d'un gène de rRNA

(cqsB) produisant un oligomère mineur (1)

Isolement d'épisomes F'(2,4),de phages transducteurs (9,3)et de plasmides colEl hybrides (5).

r m D min 71 aroE

R N A l 6 S - t R N A ^ - t R N A ^ J ^ - R N A 2 3 S - R N A 5 S - tRNAX (d)

Localisation d'un gène de rRNA5S (cqsD) produisant un oligomère mineur (1).

Isolement de phages transducteurs (10) et de plasmides colEl hybrides (5).

(37)

Tableau 3 (suite)

Noms des opérons rRNA (a)

Localisation sur la carte d'E.coli (b)

Structure des opérons rRNA :produits des gènes connus (c)

Méthodes utilisées et références (g)

r m E min 89 metA-purB

RNA16S- t M A ^ ^ " - E N A 2 3 S - RNA5S . Isolement de phages transducteurs (11) (a)

r m F min 74

malA-aroB

RNA16S- tKNA?-RNA23S -RNA5S-tRNA ? . Localisation d'un gène de rRNASS (cqsC).

nroduisant un olisomère mineur (1) . Isolement d'un épisome F' (4)

r m G m m 5 6 rnaA-pheA

RNA16S-• tRNA? -RNA23S-ENA5S? -tENA ? . Isolement de nhaees transducteurs fl2)

rrnX (f) non localisé RNA16S

île ala

-(tRNA, -tRNA,„ )RNA23S-RNA5S-

^ tRNA^^P

. Isolement de plasmides colEl hybrides (5)

rrnY (f) non localisé RNAl6S-tRNA^ "-RNA23S - RNA5S . Isolement de plasmides colEl hybrides

(5)

(38)

Suite Tableau 3

(a) La nomenclature est celle proposée par Nomura et al (1977) .

(b) Les positions indiquées en minutes se réfèrent â la carte génétique de Bachmann et al (1976) .

(c) L'identité des gènes de tRNA dans les opérons rRNA a été établie par Kenerley et al (1977), Morgan et al (1977), Ikemura et Nomura (1977), Morgan et al (1978). L'ordre des gènes mis entre parenthèses n'a pas encore été établi.

ttir

(d) ce tRNA X pourrait être un tENA (Lundt, résultats non publiés, cités par Ikemura et Nomura, 1977). L'ordre des gènes des tRNA ile et ala dans cet opéron a été déterminé par Young et Steitz (1978) . (e) La localisation de rrnE à la min 89 fut d'abord suggérée par Hill et

Combriato (1973).

(f) rrnX et rrnY sont deux opérons différents et sont tous deux diffé- rents des opérons r m A , ]B, C, D, E^. Il est possible qu'ils soient identiques à r m F ou r m G (Kenerley et al, 1977).

(g) Références : (1) Jarry et Rosset, 1973b ;(2) Deonier et al,1974 ; (3)0htsubo et al, 1974 ; (4) Vola et al, 1977 ; (5) Kenerley et al, 1977 ; (6) Ikemura et Nomura, 1977 ; (7) Lindahl et al, 1977b ; (8) Yamamoto et al, 1976a ; (9) Jorgensen et al, 1976 ; (11) Yama- moto et Nomura, 1976 ; (12) Zurawski et Brown, 1979.

(39)

30.

principales du chromosome bactérien seront étudiées : la région spc-str (72 minutes sur la carte génétique'^) et la région rif (89 minutes sur la carte). La cartographie détaillée des gênes et l'analyse subséquente de leur organisation en unités de transcription fut réalisée essentiel- lement par l'emploi de phages transducteurs portant ces régions du chromosome. D'autres méthodes, cependant, ont contribué à l'identifica- tion des gênes de structure des r-protéines, notamment l'analyse de différents mutants bactériens. Nos connaissances actuelles sur la carte génétique du ribosome sont illustrées par la figure 5. Quelques commen- taires s'imposent au vu de la carte. Tout d'abord, remarquons que près de la moitié des gènes de r-protéines sont groupés à la minute 72.

De plus, on constate que les gènes des r-protéines ne sont pas ordonnés selon le type de produits pour lesquels ils codent, protéine ribosomiale 30S ou SOS mais plutôt sans canevas apparent. Enfin notons la présence parmi les gènes de r-protéines, de gènes codant pour les facteurs d'élon- gation EF-Tu et EF-G ainsi que celle du gène codant pour la sous-unité et de la RNA polymérase. L'existence de ce groupe de gènes dans la région spc-str est connue depuis longtemps ; les premières indications à ce

La carte génétique d'E.coli a été récemment révisée (Bachmann et al, 1977). Toutes les valeurs en minutes dans l'ancien système (0—^90') doivent être multipliées par 10 pour satisfaire ce nouveau système

9

(0 —»-100'). Certains des articles originaux rassemblés en annexe contien- nent encore des données cartographiques exprimées dans l'ancien système ; dans le texte du mémoire, nous utiliserons uniquement la nomenclature actuelle.

(40)

31

Lgure 5. Carte génétique des constituants ribosomiaux.

)ur des raisons de facilité, les gènes de r-protéines (et ceux des facteurs d'élon- ition et des sous-unités de la RNA polymérase) sont représentés par leur produit.

1 nomenclature des gènes de r-protéines est de SI à S21 : rpsA à rpsU, Ll à L26 : 'lA â rplZ, L27 à L34 :rpmA à rmpH. Les gènes codant pour les sous-unités de la RNA )lymérase sont les gènes rpoA ( a), rpoB ( 6), rpoC ( B'), rpoD ( CT ).Le facteur

elongation EF-G est codé par le gène fus ; EF-Tu est codé par les gènes tufA (min.72) : tufB (min. 88) (Bachmann et al, 1976).

îs flèches indiquent le sens de transcription, les carrés (•) représentent les promoteurs, îs groupes de gènes pour lesquels l'ordre n'est pas connu sont mis entre parenthèses ; land un seul gène est mis entre parenthèses, sa position n'a pas été démontrée mais est i plus probable.

(41)

32.

sujet remontent à l'identification de mutations conférant la résistance à certains antibiotiques (streptomycine, spectinomycine, erythromycine).

Par croisement intergénêrique ou interspécifique, plusieurs auteurs sont arrivés à la conclusion que plus de vingt gènes codant pour des r-

protéines sont localisés dans la région spc-str. En outre, l'emploi de phages A transducteurs de la région spc-str a fourni beaucoup d'infor- mations sur l'organisation des gènes dans cette région. L'anlyse géné-

tique et biochimique de ces phages transducteurs, combinée à l'étude de mutants polaires (insertions) a permis à Nomura et ses collaborateurs de déterminer la direction de la transcription des gènes (de strA vers spcA, c'-à-d. dans le sens inverse à celui des aiguilles d'une montre sur la carte génétique^) et de proposer l'organisation des gênes de r-protéines en quatre unités de transcription (appelées "opérons"

par analogie avec les structures classiques des opérons trp,lac, etc ,)•

a) Il était justifié, à l'époque, d'appeler "opérons" les unités de transcription ribosomiales dans la mesure où l'expression de plusieurs gènes situés en aval d'un site d'insertion (élément IS) était abolie par effet polaire. Par la suite, l'isolement et la caractérisation des promoteurs ribosomiaux ont confirmé l'appellation originale.

b) Notons cependant que la direction de la transcription a pu être établie auparavant en déterminant l'ordre relatif de plusieurs mutations dans les gènes spcA et strA et les positions de ces mutations dans les séquences en acides aminés des protéines correspondantes, S5 et S12 respectivement (Wittmann et al, 1975 ; Pieperberg et al, 1975).

(42)

On trouvera, dans la figure 6, la structure d'un phage X transducteur portant la totalité des gènes des r-protéines de la région spc-str.

Tout récemment, par l'analyse des séquences de fragments de DMA de phages (obtenus par digestion avec des enzymes de restriction), Nomura et collaborateurs ont identifié le promoteur des opérons spc et str (voir figure 6) et ont mis en évidence l'existence de séquences nucléotidiques typiques des promoteurs d'opérons classiques (Pribnow box). Tout compte fait, il n'est pas surprenant de constater que les gènes des r-protéines sont organisés en opérons : en effet, ceci rend compte, au moins partiellement, de leur régulation coordonnée. Les gènes des facteurs d'élongation font aussi partie d'opérons ribosomiaux et par conséquent leur expression doit être contrôlée de manière coordonnée avec celle des gènes des r-protéines. Moins évidente est la présence du gène de a (sous-unité de la RNA polymérase) dans un opéron ribosomial.

Ce fait suggère que la synthèse de a est coordonnée avec celle des ribosomes. Or la synthèse de a est aussi coordonnée avec celle des sous- unités 6 et B' de la RNA polymérase ; on peut donc en inférer que la biosynthèse du ribosome et celle de la RNA polymérase soient contrôlées de façon coordonnée. On trouvera plus de détails dans les articles de Nomura et al, 1977 ; Post et al, 1979 ; Jaskunas et al, 1977 ; Lindahl et al, 1977 ; De Wilde et al, 1977 et la thèse de doctorat de G. Delcuve, 1979.

A la minute 88 sur le chromosome bactérien, un second groupement de gènes a été étudié en détail. On y relève la présence des gènes codant pour les sous-unités 6 et 3"'de la RNA polymérase, ceux déterminant la structure de quatre protéines ribosomiales SOS et un second gène codant pour le facteur d'élongation Tu (TufB). L'organisation de ces gènes

(Figure 7) fut établie par l'analyse génétique et biochimique de phages

Figure

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Références

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