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Texte intégral

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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository

Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Pochet, R. (1979). Contribution à l'étude de l'interaction hormone récepteur (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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(2)

J) 5^-5

BIBLIOTHÈQUE DE CHIMIE

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES C(

FACULTE DES SCIENCES

Institut de Recherches Interdisciplinaires en Biologie Humaine et Nucléaire Dir. Prof. J. E. Dumont

CONTRIBUTION A L’ETUDE DE

L’INTERACTION HORMONE RECEPTEUR

O

R. POCHET

Mémoire présenté en vue de l’obtention du grade légal de Docteur en Sciences

[ 1 9 7 9 ]

(3)

THESE ANNEXE

L'HYBRIDATION IN SITU DU cDN/ju^joE PROLACTINE SUR DES COUPES DE CERVEAU DEVRAIT PERMETTRE DE DETERMINER SI CERTAINS NEURONES DE

L'HYPOTHALAMUS EXPRIMENT LE GENE DE LA PROLACTINE

R POCHET

(4)

THESE ANNEXE

L'HYBRIDATION IN SITU DU cDN/(lîl DE PROLACTINE SUR DES COUPES DE CERVEAU DEVRAIT PERMETTRE DE DETERMINER SI CERTAINS NEURONES DE

L'HYPOTHALAMUS EXPRIMENT LE RENE DE LA PROLACTINE

R. POCHET

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SI 8 U 0 THÉQUE DE CHIMIE

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

FACULTE DES SCIENCES

Institut de Recherches Interdisciplinaires en Biologie Humaine et Nucléaire Dir. Prof. J. E. Dumont

CONTRIBUTION A L’ETUDE DE

L’INTERACTION HORMONE RECEPTEUR

R. POCKET

Mémoire présenté en vue de l'obtention du grade légal de Docteur en Sciences

[ 1 9 7 9 ]

(6)

REMERCIEMENTS

c'est avec beaucoup de plaisir et de reconnaissance que j'exprime ici ma gratitude au Professeur J.E. DUMONT qui m'a permis d'entreprendre et de réaliser ce travail dans les meilleures conditions.

Ses qualités humaines et scientifiques hors du commun, son enthousiasme et son énergie à entreprendre ont été extrêmement profitables à ma for­

mation et m'ont toujours stimulé et guidé dans mes recherches.

Je suis reconnaissant au Professeur J.L. PASTEELS de m'avoir permis d'achever ce travail dans d'excellentes conditions alors que j'étais assistant dans son service.

Je suis reconnaissant au Professeur R. KRAM qui m'a permis de collaborer avec son équipe.

Il m'est également particuliérement agréable de remercier le Docteur G. DELESPESSE avec qui j'ai entrepris une fructueuse colla­

boration et qui n'a négligé aucun effort pour m'initier à l'immunologie et grâce à qui j'ai pu bénéficier pendant plus d'un an d'une aide techni­

que. Sa disponibilité et sa rigueur scientifique m'ont été très pré­

cieuses .

Je tiens à exprimer ma gratitude à ceux qui ont participé activement à la réalisation de mon travail.

- A Jacqueline VAN SANDE avec qui a été réalisée la partie qui traite de l'effet de l'iodure sur l'adénylate cyclase ainsi que l'effet de la choiera toxine.

- A Jean Marie BOEYNAEMS avec qui a été réalisée la partie théorique de l'activation de la cyclase thyroïdienne et qui a manifesté un intérêt soutenu tout au long du travail.

- A Henri SCHMITT qui a été beaucoup plus qu'un collaborateur et qui a réalisé toutes les cultures de cellules et avec lequel j'ai effec­

tué les premières caractérisations sur cellules intactes.

(7)

- A David MARTINS, responsable de la salle des Comptages de l'Institut, qui a témoigné de beaucoup de patience à notre égard.

- A Stéphane SWILLENS qui a effectué le programme à la Wang 2000 permettant d'automatiser le calcul des résultats de la cyclase.

- A Francis CANTRAINE qui a effectué les programmeide calcul par itérations successives permettant la détermination du nombre de Hill.

- A Christine DECOSTER et Gilbert VASSART qui m'ont aidé à couper au microtome de nombreuses tranches de thyroïde.

- A Szabo LAZLO et Jeanine VANDENBROEK qui ont participé à des nom­

breuses expériences.

- A Henri COLLET qui a préparé des milliards de lymphocytes d'amyg­

dales humaines.

Ma gratitude va également à Monsieur J.P. RIETHUIZEN de la firme Upjohn qui m'a fait bénéficier d'une recherche bibliographique ainsi que d'un crédit pour photocopies.

Et je réserverai une attention toute particulière à Mesdames LEEMANS et VERBIST qui ont réalisé avec beaucoup de patience et de gentillesse la partie dactylographique de ce travail.

Une grande partie de cette étude a été réalisée alors que nous bénéficiions d'une bourse de l'Institut pour l'Encouragement de la Recherche Scientifique dans l'Industrie et l'Agriculture (I.R.S.I.A.).

(8)

SOMMAIRE

P

ages

CHAPITRE T

I

ntroduction générale

... 5

CHAPITRE TI

M

éthodes générales

... 31

CHAPITRE III

L

a

TSH ACTIVE

l

'

adénylate cyclase en système

ACELLULAIRE ...■■... 30

CHAPITRE IV

C

aractérisation pharmacologique de l

'

adénylate

CYCLASE THYROÏDIENNE ACTIVABLE PAR LA THYRO-

TROPINE ... S5

CHAPITRE V

L

es

RÉCEPTEURS 1^-ADRÉNERGIQUES. CARACTÉRI­

SATION PAR

l

'

étude de laliaison

... 108

RESUME ... m

BIBLIOGRAPHIE

(9)

ABREVIATIONS

cAMP Adenosine 3':5' monophosphate ATP Adenosine 5'; triphosphate GTP Guanosine 5triphosphate

ITP Inosine 5triphosphate

GppNHp Guanosine -imido^ triphosphate PGEj Prostaglandine Ej

GMl Galactosyl-N-acetylgalactosami nyl-(sialyl)-galactosyl ceramide

MMI Methimazole (l-methylimidazol-2-thiol)

Ig Immunoglobuline

HYP Hydroxybenzylpindolol ((+)-3-indoloxy-l-(2-p-hydroxy- benzylpropyl-2-amino)isopropyl alcool

PPL Propranolol

ISO Isoprotérénol

EPI Epinephrine

NOREPI Norépinéphrine

IBMX Isobutylméthylxanthine

(10)

CHAPITRE I

Pages

ImODUCTION GENERALE ... ...

1. LES RECEPTEURS ET LEUR FONCTION ...

2. DEFINITION DU RECEPTEUR ...

3. LE MODELE DU MECANISME D'ACTION HORMONALE PROPOSE PAR SUTHERLAND ...

4. LA GLANDE THYROÏDE : UN MODELE POUR L'ETUDE DU META­

BOLISME DES NUCLEOTIDES CYCLIQUES ...

5. LES RECEPTEURS ^-ADRENERGIQUES ...

A. Généralités ...

B. Notation stéréochimique ...

C. Classification des récepteurs adrénergiques ...

D. Relation entre les récepteurs adrénergiques et

la formation de cAMP ...

6. LES RECEPTEURS ET LA REPONSE IMMUNITAIRE...

A. Introduction ...

B. Bases cellulaires de la réponse immunitaire ...

C. Différenciation des lymphocytes T ...

D. Modifications adrénergiques de la fonction des

lymphocytes T immunocompétents...

E. Modulation adrénergique de la réponse humorale ...

F. Modulation adrénergique de la réaction allergique immédiate ...

7. L'ADENYLATE CYCLASE ...

A. Généralités ...

B. Dimension moléculaire et caractéristique thermodyna­

mique de la réaction...

C. Effets du Fluorure ...

8. BUT et STRATEGIE ...

5 5 7

7

8 9 9 1 1 13 14 15 15 15 19 22 24 25 26 26 26 27 28

(11)

5.

I

ntroduction generale

1. LES RECEPTEURS ET LEUR FONCTION

La faculté que possède un grand nombre de cellules à répondre de manière très sélective à des signaux chimiques présents à l'état de trace est une donnée initiale de base de l'étude de la pharmaco­

logie.

L'hypothèse de l'existence au niveau de la cellule de récep­

teurs spécifiques à ces signaux a été émise à partir de l'observation de trois caractéristiques : la première est la sensibilité élevée de la cellule à ces signaux. Des effets produits à des concentrations de 10 M en signaux sont courants et des concentrations aussi faibles -9 que 10 ^ sont dans certains cas suffisantes pour induire une réponse.

La deuxième caractéristique est la spécificité chimique dont l'exemple le plus frappant est la stéréospécificité. Ainsi la sensibilité à 1'isoprotérénol de la cellule de muscle est différente de deux ordres de grandeur selon l'isomère optique utilisé. La troisième est la spécificité cellulaire. L'adrénaline, par exemple, a un effet très marqué sur le muscle cardiaque tandis qu'au niveau du muscle strié squelettique l'effet est beaucoup plus faible.

C'est la contraction des muscles volontaires provoquée par l'addition de nicotine en des endroits précis du muscle et l'antago­

nisme de cet effet par le curare observés par Langley dès 1905 qui conduisit celui-ci à suggérer l'existence de récepteurs spécifiques à la nicotine sur le muscle volontaire. Le concept de récepteur

désignait originellement le composant cellulaire impliqué dans l'action initiale d'une drogue. Un récepteur est donc doué de deux propriétés fondamentales : 1. reconnaître et se lier spécifiquement à une drogue;

2. transmettre un signal qui est le point de la réponse cellulaire à la drogue.

(12)

6.

Donc diverses macromolécules qui sont capables de lier spécifiquement une drogue mais qui ne produisent aucun effet, comme les protéines transporteuses du plasma, ne peuvent être considérées comme des récep­

teurs, et seront plutôt appelées accepteurs.

Les drogues ne sont pas les seules substances à exercer leurs effets par l'intermédiaire d'une interaction avec des récepteurs spé­

cifiques ; il en va de même pour tous les messagers et cofacteurs, intra- et extra- cellulaires, qui contrôlent l'activité des cellules : hormones^neurOtransmetteurs, nucléotides cycliques,etc... Donc, le concept de récepteur qui, historiquement, est d'origine pharmacolo­

gique, s'est étendu à la physiologie et en particulier à l'endocri­

nologie et à la neurochimie.

Les études pharmacologiques classiques définissaient les récep­

teurs de manière indirecte à partir d'une action terminale de la drogue en reproduisant cette action par des agonistes ou en l'inhi­

bant par des antagonistes. Ce type d'étude permit de différencier les récepteurs nicotinique et muscarinique de l'acétylcholine et les récepteurs oL et jj) des catécholamines (Ahlquist, 1948). Ces der­

nières années, l'étude des récepteurs a progressé grâce au développe­

ment de méthodes radioisotopiques permettant la mesure directe de la liaison d'une drogue, hormone ou neurotransmetteur, à ses récepteurs et à la possibilité de détecter des effets primaires, c'est-à-dire l'effet le plus proche de l'interaction avec le récepteur et dont découlent tous les autres. L'activation de l'adénylate cyclase par plusieurs hormones constitue jusqu'à ce jour et dans de nombreux tissus la première réponse biologique mesurable.

Dès l'introduction du concept de récepteur, il a été tenté de définir les lois mathématiques qui régissent d'un point de vue quantitatif l'action des drogues. Ces lois, dérivées de la loi d'action des masses et de la thermodynamique classique, ont été progressivement compliquées de manière à rendre compte des données

expérimentales. L'interaction d'une drogue avec son récepteur «

(13)

n'est pas différente en termes mathématiques de l'équilibre acide- base ou de la catalyse enzymatique.

2. DEFINITION DU RECEPTEUR

La définition du récepteur s'applique à une molécule (ou com­

plexe moléculaire) qui est capable de reconnaître et d'interagir sélectivement avec une hormone ou un neurotransmetteur et qui suite à cette interaction cause un signal responsable de l'initiation d'une chaine de réaction aboutissant à la réponse biologique.

3. LE MODELE DU MECANISME D'ACTION HORMONALE PROPOSE PAR SUTHERLAND.

C'est dans les années 50 que Sutherland, étudiant sur le foie l'effet byperglycémique des catécholamines, a découvert et identifié un facteur résistant à la chaleur et responsable de l'acti­

vation des phosphorylases dans l'homogénat d'hépatocytes : le cyclique AMP.

Cette découverte est le fruit d'une recherche où la question essentielle a été de savoir comment agit une hormone. Cette contri­

bution majeure à la compréhension du mécanisme d'action des hormones a permis à Sutherland de proposer un modèle général du mode d'action hormonal schématisé dans la fig. 1.

membrane cellulaire

cytoplasme

CAMP ---^

PDE

Fig. 1. Modèle de Sutherland

AMP

(14)

8.

Ce modèle postule que l'hormone interagit avec un récepteur spécifique situé sur la surface externe de la membrane. Cette interaction confère au récepteur une structure lui permettant d'activer l'adénylate cyclase situé sur la surface interne de la membrane plasmique et d'augnj&iiterr amsi la concentration intracellu­

laire de cAMP. Le cAMP active différentes enzymes et permet ainsi d'exprimer plus ou moins directement l'effet hormonal.

Pour qu'un tel modèle rende compte du mode d'action d'une hormone quatre critères doivent être satisfaits.

1. L'hormone doit augmenter le niveau de cAMP dans la cellule cible.

2. L'hormone doit activer l'adénylate cyclase en système acellulaire (homogénat ou fraction particulaire).

3. Les agents qui augmentent le taux de cAMP intracellulaire doivent reproduire l'effet de l'hormone.

4. Les agents qui diminuent le taux de cAMP des cellules doivent inhiber l'effet de l'hormone.

4. LA GLANDE THYROÏDE : UN MODELE POUR L'ETUDE DU METABOLISME DES NUCLEOTIDES CYCLIQUES.

La thyroïde est une glande endocrine structurée en follicule.

S'a fonction principale est de synthétiser les hormones thyroïdiennes, la thyroxine et la triiodothyronine. L'iodure est le substrat indis­

pensable à cette synthèse. L'ion est capté par un mécanisme actif localisé à la membrane basale des cellules folliculaires et est trans­

porté à travers le cytoplasme. Au voisinage de la membrane cellu­

laire apicale, là où se localisent les peroxydases, l'iodure est oxydé et fixé sur des résidus tyrosines d'une glycoprotéine spécifique : la thyroglobuline. Cette protéine est accumulée dans un compartiment extracellulaire clos représenté par la lumière des follicules thyroï­

diens. La thyroglobuline exerce au moins deux fonctions : c'est une forme de réserve de l'iode ainsi que le substrat nécessaire à la bio­

synthèse des hormones thyroïdiennes. Deux iodotyrosines d'une même

(15)

9.

molécule de thyroglobuline sont susceptibles de se coupler par un mécanisme oxydatif nécessitant une peroxydase. Les tri et tetra- iodothyronines ainsi formées restent partie intégrante de la thyro­

globuline, En fonction des besoins de l'organisme, la thyroglobuline est phagocytée par la cellule thyroïdienne qui l'hydrolyse complè­

tement grâce à ses lysosomes ce qui permet la libération des hor­

mones thyroïdiennes. L'ensemble de ces mécanismes qui conduisent à la synthèse de thyroxine et de triiodothyronine est soumis au contrôle hypophysaire par l'intermédiaire de la thyrotropine (TSH).

Cette hormone contrôle l'activité thyroïdienne en modulant le taux intracellulaire du cAMP. Il est aujourd'hui accepté que la plupart des effets rapides de la TSH sur la thyroïde soient médiés par le cAMP (Dumont, 1971; Field, 1971). Les critères classiques proposés par Sutherland qui valident son hypothèse sont aujourd'hui satis­

faits :

1) La TSH active l'adénylate cyclase en système acellulaire;

2) La TSH module le taux de cAMP dans les cellules intactes;

3) Les effets de la TSH sur la thyroïde tels, que la sécrétion et i' iodation de la thyroglobuline peuvent être reproduits par le cAMP exogène et son analogue le Bt^-cAMP. De même les effets de la TSH peuvent être reproduits par des agents qui augmentent le taux de cAMP dans la thyroïde tels que la PGEj et la choléra-

4) Les effets de faibles concentrations en TSH sont potentiés par les méthylxanthines qui inhibent les phosphodiestérases cAMP dépendantes.

les terminaisons nerveuses du système nerveux central et périphé­

rique. La sécrétion de norépinéphrine des nerfs adrénergiques provoque la modification d'une variété de processus cellulaires.

Les modifications postsynaptiques résultant de la sécrétion de la toxine.

5. LES RECEPTEURS -ADRENERGIQUES

A. Généralités

La norépinéphrine est synthétisée et stockée dans

(16)

10.

norépinéphrine sont le résultat de l'interaction entre l'hormone et ses récepteurs spécifiques. L'interaction de la norépinéphrine avec ses récepteurs spécifiques est la première étape d'une série compliquée et incomplètement comprise de réactions. La configuration moléculaire des récepteurs adrénergiques détermine la spécificité structurelle et l'activité des Unités et des antagonistes. Cette activité n'est pas seulement structurellement spécifique, elle est de plus stéréosélective.

Cette propriété a été mise à profit dans de nombreux cas tant en phar­

macologie qu'en enzymologie et de nombreuses informations quant à la géométrie du site de liaison des macromolécules réceptrices (par exemple une enzyme) ont été obtenues par l'utilisation des isomères optiques et des analogues. Cette approche indirecte est la seule possible tant que la structure tridimensionnelle d'un récepteur n'a pu être élucidée.

Il y a de nombreuses analogies entre l'interaction d'une hormone avec ses récepteurs et d'une enzyme ayec son substrat. Il n'est donc pas étonnant que l'utilisation de stéréoisomères de différents substrats de 1'o(-chymotrypsine a permis de définir le site actif de l'enzyme

(Alworth, 1972).

La propriété de stéréospécificité a été mise en évidence dès la découverte de la présence de 1'épinéphrine dans la médullaire surré­

nalienne. Cushny (1908) testa l'effet sur la tension sanguine de la (-) épinéphrine naturelle et du mélange racémique (^) de 1 ' épinéphrine sur des chiens anesthésiés. La (^) épinéphrine était deux fois moins active que la (-) épinéphrine. PLus tard Cushny (1926) compara l'effet sur la pression sanguine des deux stéréoisomères de 1 ' épinéphrine et trouva une activité 12 fois supérieure pour l'isomère (-) comparée à l'isomère (+). En 1948, Euler montra que le neurotransmetteur prin­

cipal du système nerveux orthosympathique était la (-) norépinéphrine.

C'est vers les années 1955 que la majorité des catécholamines et autres amines non phénoliques ont été découvertes ainsi que leur configuration et leurs effets pharmacologiques (Pratesi, 1963) et depuis les cinq dernières années, l'utilisation des stéréoisomères et des analogues a regagné un grand intérêt comme outil dans l'étude du mécanisme adré-

(17)

adrénergique et de son récepteur et permet de vérifier lors de l'étude de la liaison d'une drogue adrénergique un des critères les plus impor­

tants, celui de la stéréospécificité. Nous reviendrons plus en détail sur ce point lors de l'étude des critères d'identification des récep­

teurs fb (cf chap. V).

B. Notation stéréochimique

Une molécule chirale est une molécule qui est constituée d'énantiomères. La terminologie (+) et (-) où d et

I pour chacun des énantiomères a été utilisée pour spécifier le sens de la rotation de la lumière polarisée traversant une cellule optique contenant un des énantiomères. Ainsi une molécule faisant tourner le plan de polarisation vers la droite est dite d ( dextrorotatoire) et une molécule faisant tourner le plan de rotation vers la gauche est dite 1 (levorotatoire). La configuration absolue est définie selon l'arrangement relatif dans l'espace d'un atome ou groupe d'atomes par rapport à un carbone asymétrique ou une partie rigide de la molécule.

La configuration absolue d'antipodes optiques peut être représentée par la méthode de Fischer-Rosanoff (Alworth, 1972) ou D et L.

Ce système utilise comme référence arbitraire la glycéraldéhyde dextro­

rotatoire qui est désignée par D pour définir sa configuration absolue.

II n'y a pas de relation simple entre le signe de rotation et la dési­

gnation de la configuration. La nomenclature de Fischer-Rosanoff est encore utilisée couramment pour les acides aminés et les sucres. Mais cette méthode faisant appel à une référence arbitraire a été peu à peu abandonnée pour les autres classes de molécules et c'est l'utilisation de la règle des séquences de Cahn-Ingold-Prelog, plus rationnelle qui est de plus en plus utilisée (Cahn, 1964; Cahn, Ingold, Prelog, 1956).

Les groupes fonctionnels (a,b,c,d) sont affectés d'une priorité et le groupement qui a la priorité la plus basse (d) est orienté loin de l'observateur (cf fig. 2). Ensuite le sens de la rotation est défini par le sens de l'ordre décroissant des priorités.

(18)

12.

Si ce mouvement génère une rotation dans le sens des aiguilles d'une montre, alors la configuration est définie par la lettre R ou au contraire lorsque le sens de la rotation est opposé à celui des aiguilles d'une montre la configuration est définie par la lettre S.

La priorité la plus élevée est donnée au groupement fonctionnel qui a le nombre atomique le plus élevé. La fig. 3 illustre les deux énantiomères de la norépinéphrine.

(R)-(-)-Norépinéphrine (S)-(+)-Norépinéphrine Fig. 3

(19)

13.

C. Classification des récepteurs adrénergiques.

L'existence de plusieurs types de récepteurs adrénergiques a été suggérée pour la première fois par les résultats de Dale (1906).

Il démontra que certains des effets de 1'épinéphrine et de la stimu­

lation du nerf sympathique étaient bloqués par les alcaloïdes d'ergot alors que d'autres réponses n'étaient pas affectées. En 1948, Ahlquist divisa les réponses adrénergiques en deux classes basées sur les répon­

ses à une série de catécholamines. La première classe de récepteurs dénommée alpha (oC ) interagit avec les agonistes suivants :

épinéphrine norépinéphrine alpha-méthyl-norépinéphrine

> alpha-méthyl-épinéphrine isoprotérénol selon une potentialité décroissante. La stimulation de ces récepteurs provoque la contraction de la membrane nictitante, la vasoconstriction et la contraction du muscle lisse de l'utérus et de l'urètre. Le second type de récepteurs

adrénergiques appelé beta ( y?) ), répondent aux agonistes avec la spé­

cificité décroissante suivante : isoprotérénol 2!^ épinéphrine alpha- méthyl-épinéphrine alpha-méthyl-norépinéphrine norépinéphrine.

L'interaction avec ces récepteurs conduit à une chronotropie et une inotropie cardiaque positive à la vasodilatation et à la relaxation du muscle utérin. L'utilisation de techniques pharmacologiques classiques

a étendu cette classification à d'autres effets médiés par les catécho­

lamines. Les réponses caractéristiques faisant intervenir les récep­

teurs IX et^ont été définies de manière plus détaillée grâce à l'uti­

lisation d'antagonistes spécifiques (Furchgott, 1967). Lands et coll.

(1967) montrèrent que le groupe des récepteurs /b devait être divisé en deux sous classes ^ j et Ainsi les muscles cardiaques possé­

deraient des récepteurs j et les muscles lisses bronchiques des récepteurs ^2' niveau des récepteurs 1 'épinéphrine et la norépinéphrine sont équipotentes et l'effet des agonistes est bloqué préférentiellement par le practolol (Dunlop et Shanks, 1968). Au ni­

veau des récepteurs ^2 1'épinéphrine a une potentialité supérieure à la norépinéphrine pour stimuler un effet qui peut être inhibé spéci­

fiquement par la butoxamine (Levy, 1966). D'autres antagonistes et

(20)

14.

notamment le propranolol, l'alprénolol et le pindolol ont la même affi­

nité pour les récepteurs j et jb^ (Moore et O'Donnell, 1970).

Il semble que l'interconversion entre ^ j et 2 soit possible, un cas dans la littérature le mentionne (Lacombe et coll., 1976).

D. Relation entre les récepteurs adrénergiques et la formation de cAMP.

Sutherland (1965) fut le premier à montrer que le cAMP pour­

rait servir de second messager aux catécholamines et que l'interaction entre les agonistes et les récepteurs Jt) activait l'adénylate cyclase.

Sauf dans le système nerveux central, la stimulation des récepteurs 0(

n'augmente pas le taux intracellulaire de cAMP (Daly, 1975).

(21)

15.

6

.

LES RECEPTEURS ET LA REPONSE IMMUNITAIRE

A. Introduction

Il est actuellement bien établi que les systèmes nerveux et endocrinien peuvent moduler la réponse immunitaire .

Des études récentes ont démontré que les hormones et les neurotrans­

metteurs influencent l'activité des cellules immunocompétentes par l'intermédiaire de récepteurs spécifiques situés sur celles-ci (revue cf Hadden et coll., 197 7).

C'est ainsi que l'on a décrit au niveau de la membrane cytoplasmique des lymphocytes l'existence de récepteurs pour des hormones poly­

peptidiques (insuline, hormone de croissance, calcitonine) des neuro­

transmetteurs (acétylcholine, catécholamine) et pour l'histamine.

Suite à l'interaction du récepteur membranaire et de son ligand, deux types de signaux peuvent être transmis au l3nnphocyte : un signal activateur dont le messager est le cGMP et un signal inhi­

biteur ayant le cAMP pour messager. Toute modification du rapport entre le contenu lymphocytaire de ces deux nucléotides cycliques résultera en une modification parallèle de l'activité de la cellule soit dans le sens d'une inhibition

cAMP cGMP

cAMP

cGMP) ou d'une facilitation

).

B. Bases cellulaires de la réponse immunitaire.

La réponse immunitaire est le résultat d'interactions cellulaire multiples, positives et négatives entre différentes sous populations de lymphocytes et entre les lymphocytes et les macrophages (figure 4).

La réponse immunitaire se présente classiquement sous un double aspect humorale (fabrication d'anticorps) et cellulaire (immunité cellulaire).

(22)

Figure 4. Schéma de la réponse immune.

(23)

17.

Les anticorps sont secrétés par les plasmatocytes provenant de la différenciation des lymphocytes B précurseurs. Ceux-ci expriment à leur surface des immunoglobulines (Ig) qui constituent les récepteurs à l'antigêne et qui sont identiques aux Ig secrété® par les plasmato­

cytes. Cinq classes d'Ig sont actuellement reconnues chez les mammi­

fères et chez l'homme en particulier : les Ig G, A, M, D et E. Elles diffèrent entre elles par leurs propriétés biologiques et physico­

chimiques .

L'immunité cellulaire est due à l'intervention de lymphocytes T, déri­

vés du thymus et distincts des précédents. On distingue deux types de réactions cellulaires médiées par des sous-populations distinctes de Ijnnphocytes T effecteurs (fig. 5).

a) la réaction cytotoxique par laquelle le lymphocyte T cytotoxique détruit une cellule cible exprimant à sa surface un antigène auquel la cellule T est spécifiquement immunisée. Ce mécanisme intervient dans la desctruction de cellules infectées par des

yirus > de cellules cancérigènes ou de cellules étrangères (greffes) .

b) la réaction d'hypersensibilité retardée due à la libération par des lymphocytes T (distincts des précédents) de médiateurs chimiques suite au contact avec l'antigène auquel ces cellules sont spécifi­

quement sensibilisées. Ces médiateurs sont appelés lymphokines et agissent essentiellement en stimulant les différentes fonctions des macrophages dont ils facilitent le recrutement local. La réaction cutanée à la tuberculine constitue un exemple classique de cette réaction, qui intervient dans la protection de l'organisme contre des agents infectieux ayant une phase intracellulaire facultative ou obligatoire de leur cycle (virus, mycobactéries ...).

(24)

Fi6. 5

SCHEMA DE L ' IMMUNITE CELLULAIRE

Inhibiteurs cytotoxiques (prolifé­ ration. suppression).

Activateurs (mitoses des lympho. DES macrophages. CSF. etc)

Inflammatoires (ag. chemotactiques DES macrophages. DES NEUTROPHILES. DES ÉOSI­

NOPHILES. HIF. etc)

Destruction

(25)

18.

Ces deux types de lymphocytes T sont appelés effecteurs car ils constituent les facteurs directs de l'immunité cellulaire. En

plus des lymphocytes T effecteurs, on reconnaît l'existence des cellules T régulatrices constituées en fait de populations distinctes de lympho­

cytes suppresseurs (TS) et facilitants ou helper (TF). Ces cellules régulatrices conditionnent l'activation des T effecteurs à partir de leurs précurseurs inactifs et la transformation des B en plasmatocytes.

Le contrôle de la sécrétion d'anticorps par ces lymphocytes T régulateurs est non seulement quantitatif mais aussi qualitatif; les lymphocytes T contrôlent donc non seulement la quantité d'anticorps produits mais aussi leur qualité (affinité, type d'Ig). Les macrophages jouent un rôle essentiel dans l'induction et l'expression (stade effecteur)

de la réponse immunitaire. Ils induisent les lymphocytes T facilitants e leur présentant l'antigène de manière adéquate; en l'absence de macro­

phages, il est impossible d'induire in vitro une réponse cellulaire ou hormonale de bonne qualité. Bien que non immunologiquement spéci­

fique (absence de récepteurs à l'antigène) le macrophage est le prin­

cipal effecteur de l'immunité. En effet , aussi bien les anticorps que les lymphocytes T ont pour fonction de faciliter, d'amplifier et de focaliser l'action des macrophages sur un antigène donné. Les différentes sous-populations lymphocytaires sont morphologiquement identiques. Il est cependant possible de les identifier et même de les isoler. Elles ont en effet des marqueurs membranaires qui leur sont spécifiques. Les lymphocytes T et B ont une origine

commune, située au niveau de la moelle osseuse sous la forme d'une cellule lymphoïde primitive. Celle-ci se différencie in situ en

cellules pré-B et pré-T. Les premières vont continuer leur maturation au niveau de la moelle osseuse alors que les secondes vont migrer vers le thymus où elles vont acquérir les marqueurs et les propriétés fonctionnelles des lymphocytes T. La maturation intrathymique est un processus complexe résultant à la fois du contact des lymphocytes précurseurs avec l'épithélium thymique et de l'action d'hormones thy­

miques sécrétées par celui-ci. Il en résulte la formation et la

(26)

19.

libération vers les tissus lymphoïdes périphériques de plusieurs lignées de lymphocytes T différenciés.

En plus des lymphocytes et des macrophages, la réponse immunitaire fait intervenir les polynucléaires, les mastocytes et

les plaquettes. Les mastocytes et les polynucléaires basophiles sont le cellules effectrices de la réaction allergique de type réaginique

ou anaphylactique (figure 6). En effet ces cellules fixent à leur surface,par l'intermédiaire de récepteurs spécifiques,les réagines (IgE). Au contact de l'antigène liant deux molécules voisines d'Ige, la cellule est activée et libère les médiateurs chimiques de la réaction allergique (histamine, bradykinine, fac­

teur chémotactique pour les éosinophiles etc...).

Le système neuro-endocrinien est susceptible de contrôler non seulement la fonction des lymphocytes T et B immunocompétents mais encore d'interférer avec leur maturation et leur différen­

ciation au départ des éléments précurseurs.

G. Différenciation des lymphocytes T

L'incubation in vitro de cellules immatures, isolées de la moelle osseuse > dépourvues de marqueurs T ou B et fonctionnellement

incompétentes, en présence d'hormone thymique induit la différen­

ciation des cellules pré-T. Suite à cette incubation, on voit

apparaître des cellules présentant des marqueurs membranaires propres aux lymphocytes T.Le processus implique la synthèse de mRNA mais ne nécessite pas de réplication du DNA. Scheid et coll. (1973) ont démontré que cette maturation était accompagnée d'une

(27)

20.

MASTOCYTE ou BASOPHILE

Récepteurs IgE

Granules contenant les médiateurs

Antigène

Sécrétion des médiateurs

Histamine

S-RSA (slow reacting substance of anaphylaxis )

Bradykinine etc...

Figure 6. Schéma de la réaction allergique.

(28)

21.

augmentation de cAMP intracellulaire; de plus, tout agent pharma­

cologique capable d'augmenter ce taux de cAMP se comportait comme l'hormone thymique. C'est le cas du dibutyryl cAMP, de l'isoproté- rénol, de la théophylline et des PGE. Des concentrations faibles d'isoprotérénol (10 ^M, 10 ^M) sont suffisantes pour induire ce processus qui de plus est spécifiquement bloqué par l'alprénolol*- Ceci suggère la présence de récepteurs adrénergiques à la surface des cellules pré-T et rend plausible la notion d'un contrôle adré­

nergique in vivo de la maturation des lymphocytes T. Il est de plus important de noter que certains facteurs thymiques, capables d'in­

duire la différenciation des lymphocytes T sont antagonisés par le propranolol (Goldstein, G. et coll., 1976) ce qui suggère que les récepteurs adrénergiques sont proches ou identiques axix récep­

teurs de certains polypeptides thymiques biologiquement actifs.

Il est probable mais non démontré qu'un contrôle adrénergique puisse également intervenir au niveau de la maturation des lymphocytes B à partir de leurs précurseurs médullaires.

Au cours de leur différenciation intrathymique, les lympho­

cytes ont une réponse progressivement décroissante aux agents béta agonistes alors que leur réponse à l'histamine augmente (Bach, 1975;

Roszkowski et coll., 1977). C'est ainsi que les thymocytes corticaux, détruits par la cortisone et immunologiquement peu compétents sont plus sensibles à 1'isoprotérénol que les thymocytes médullaires, cortico-résistants et immunologiquement compétents. De plus, les Ijnnphocytes T périphériques sont dans l'ensemble moins bon répondeurs aux stimuli adrénergiques que les thymocytes. Notons que dans toutes ces expériences la sensibilité lymphocytaire à l'isoprotérénol a été mesurée en déterminant les modifications intracellulaires du taux de cAMP induites par cet agoniste, utilisé à de faibles concentrations

(10 10 ^M). De plus, les auteurs ont démontré la stéréospécificité de la réaction et sa réversibilité en présence d'antagonistes spéci­

fiques tels que le propranolol. Si l'on admet que la sensibilité du

(29)

22.

lymphocyte à 1'isoprotérénol est conditionnée uniquement par le nombre de récepteurs adrénergiques, les données rapportées ci-dessus suggèrent une réduction progressive du nombre de ces récepteurs au cours de

la matura,tion des lymphocytes T.

D. Modifications adrénergiques de la fonction des lymphocytes T immunocompétents.

La prolifération des lymphocytes T est un phénomène constant et indispensable, aussi bien in vitro qu'in vivo, pour l'induction d'une réponse primaire ou secondaire. Il est bien établi que cette réponse proliférative est induite par un signal délivré au niveau de la membrane lymphocytaire. Des données récentes indiquent que les nucléotides cycliques, cAMP et cGMP sont étroitement associés à ce

signal mitogénique. Peu de temps après l'interaction du stimulus lympho­

cytaire (antigène ou mitogène) avec son récepteur membranaire on observe une élévation de la synthèse de ces deux nucléotides. L'élévation du taux de cAMP est cependant de brève durée et est suivie d'une réduction progressive jusqu'à des valeurs inférieures à celles de départ.

A l'inverse, les taux de cGMP restent élevés durant la phase prolifé- rative. Toute augmentation du rapport cÂMP s'accompagne d'une diminu­

tion de la prolifération lymphocytaire. Les beta agonistes, le PGE, la choiera toxine, l'histamine ont ainsi un effet généralement inhibi­

teur sur la prolifération lymphocytaire induite in vitro par des mito­

gènes ou des antigènes et in vivo par des antigènes. Il faut cependant noter que prolifération lymphocytaire induite in vitro et in vivo est un phénomène complexe résultant de l'interaction de plusieurs lignées distinctes de lymphocytes et de macrophages. De plus, il a été établi que les différentes populations de lymphocytes T périphériques sont différemment sensibles à l'action de 1'isoprotérénol ou de l'histamine.

(30)

c'est ainsi que chez l'homme les l5nnphocytes T isolés du sang sont plus sensibles que ceux provenant des amygdales ou des végétations adénoïdes (Niaudet et coll., 1976). De même chez la souris, les lymphocytes T spléniques diffèrent de leurs homologues isolés des ganglions lymphatiques (Bach, 1975). Il faut ajouter également que la sensibilité d'un lymphocyte aux stimuli adrénergiques est proba­

blement fonction de son état d'activation. Ce concept a été clairement établi en ce qui concerne la sensibilité des lymphocytes T cytotoxiques à l'histamine. Plaut et coll. (1975) ont en effet démontré que l'inhi­

bition de l'activité cytotoxique des l3miphocytes T au cours de l'in­

duction d'une réponse allergique atteignait un maximum de 50 % 16 jours après l'injection de l'antigène tandis qu'au lOème jour l'inhi­

bition n'était que de 10 Z. Ces observations sont à rapprocher de travaux récents indiquant que les récepteurs à l'insuline ne sont

s

présents que sur les lymphocytes T et B activés par un antigène ou un mitogène, alors qu'ils sont absents des cellules non activement engagées dans une réponse immunitaire (Schwartz et coll., 1975;

Helderman et Strom, 1978). L'ensemble des données de la littérature indique que les agonistes beta adrénergiques ont un effet inhibiteur sur l'induction l'expression des deux types de réactions d'immunité cellulaire. Il a été démontré in vivo et in vitro que l'isoproté- rénol inhibait non seulement l'induction de cellules T cytotoxiques

(à partir de leurs précurseurs) mais encore l'activité de ces cellules T cytotoxiques (Strom et coll., 1973). Il en est probablement de même en ce qui concerne la sécrétion de l3nnphokines par les lymphocytes T responsables des réactions d'hypersensibilité retardée (Pick, 1977).

Les beta stimulants sont de plus capables d'inhiber l'activation des macrophages par les l3miphokines (Pick, 1977). Les polynucléaires neutrophiles considérés comme cellules accessoires de l'immunité sont également soumis au contrôle béta adrénergique. Celui-ci inhibe la sécrétion d'enzymes lysosomiaux (par ex. la glucoronidase), la phagocytose, la mobilité et la cytotoxicité de ces cellules vis-à- vis d'une cellule cible recouverte d'anticorps.

(31)

24,

En conclusion de cette revue de la littérature, il est permis de dire que les p> stimulants inhibent les différents types de cellules effectrices de l'immunité cellulaire.

E, Modulation adrénergique de la réponse humorale.

Des expériences réalisées in vitro et in vivo indiquent que -3 certains agonistes utilisés à des concentrations très élevées (10 ,

10 ^M) ont un effet inhibiteur sur la sécrétion d'anticorps tandis qu'à faibles doses ils ont un effet facilitant. Rappelons que la sécré­

tion d'anticorps au départ des lymphocytes B est contrôlée par les lymphocytes T régulateurs et les macrophages. Le contrôle adrénergique pourrait donc s'effectuer préférentiellement au niveau de l'une ou l'autre des sous-populations lymphocytaires concernées, La présence de récepteurs p) adrénergiques au niveau du lymphocyte ^ a été établi récemment par Roszkowski et coll, (1977) qui ont mis en évidence un

accroissement de la concentration cellulaire en cAMP induit par l'isopro- térénol et non par l'histamine. La prolifération et la différenciation des lymphocytes B (isolés de la rate de souris) induites par l'endotoxine de bactéries gram négatif (LPS) est inhibée par les béta agonistes.

Notons que le LPS induit la synthèse de cGMP au niveau du lymphocyte B et que le cŒP ajouté seul aux cultures de lymphocytes B purifiés est capable de les stimuler. L'effet facilitant des beta stimulants sur la sécrétion d'anticorps peut néanmoins s'observer dans certains conditions expérimentales in vivo et in vitro. Ces expériences indiquent en effet que les beta agonistes peuvent inactiver les cellules suppressives qui inhibent la synthèse d'anticorps (Teh et Paetkau, 1976).

(32)

25.

En réstimé, les données actuelles de la littérature indiquent que les lymphocytes B sont sensibles à l'action inhibitrice des ^ago­

nistes mais que dans certaines conditions expérimentales les ago­

nistes facilitent la sécrétion d'anticorps en inhibant l'action des lymphocytes T suppresseurs.

F. Modulation adrénergique de la réaction allergique immédiate.

Cette réaction résulte de la libération de médiateurs chimiques par le mastocyte tissulaire ou le basophile circulant. Elle est due à la présence d'anticorps IgE fixés à la surface de ces cellules et sera déclenchée lorsque l'antigène aura lié deux molécules voisines d'IgE. Dès 1968, Lichtenstein et Margolis ont démontré que l'épi- néphrine et la théophylline inhibaient la dégranulation des basophiles et la sécrétion d'histamine et d'autres médiateurs. Il a été démontré ultérieurement que cette inhibition était due à un accroissement de la concentration intracellulaire en cAMP et que des substances telles la PGEj, la choiera toxine, l'histamine, le dibutyryl-cAMP avaient les

mêmes propriétés. D'autres expériences ont de plus établi que les agents favorisant un accroissement du taux de cGMP intracellulaire favorisaient le processus de dégranulation. Le concept actuel, dans ce domaine, est que la réactivité de ces cellules (quantité de médiateurs libérés pour un stimulus donné) est conditionné par le rapport cAMP.

In vivo au niveau de l'arbre respiratoire, les médiateurs libérés par le mastocyte provoquent une réaction inflammatoire locale, une con­

traction des muscles lisses bronchiques et une stimulation des cellules glandulaires de la muqueuse. Les effets périphériques résultant de l'ac­

tion de ces médiateurs sont eux aussi inhibés par les sympathicomimétiques.

Cet effet inhibiteur est très important au niveau des muscles lisses bronchiques à tel point que les^ ^ stimulants constituent un des trai­

tements de base de l'asthme allergique. Un effet inhibiteur analogue a été rapporté au niveau de la peau et les stimulants ont été utilisés avec succès dans le traitement de certaines formes dallergies .

Le système béta adrénergique est donc susceptible de moduler non seulement la libération des médiateurs de la réaction allergique mais en outre d'in­

hiber la réponse des organes cibles à ces médiateurs.

(33)

26.

7. L’ADENYLATE CYCLASE

A. Généralités

La conversion enzymatique de l'adénosine triphosphate (ATP) en adénosine 3',5'-monophosphate (cAMP) (fig. 1) a été décrite pour la première fois en détail par Sutherland et Rail et leurs colla­

borateurs dans une série d'articles en 1962 (Revue cf. Perkins 1973).

Il a été montré que l'enzyme, qu'ils ont appelée adenyl cyclase exigeait de l'ATP et du Mg^"*^, qu'elle était particulaire et existait

dans les tissus d'au moins quatre phyla. Dans tous les cas testés, l'activité enzymatique était stimulée par le NaF et selon une spé­

cificité tissulaire par différentes hormones. Leur hypothèse (Sutherland and Rail, 1960; Rail and Sutherland, 1961; Sutherland, Oye and Butcher, 1965) selon laquelle l'action des hormones pouvait être médiée par le cAMP«résultat de l'activation de 1'adenyl cyclase, a été largement confirmée et développée par des milliers de travaux.

Notre but ne sera pas de faire ici une revue exhaustive de la litté­

rature mais de nous limiter à quelques généralités afin de permettre une meilleure compréhension d'une enzyme qui est à ce jour loin d'avoir livré ses secrets.

B. Dimension moléculaire et caractéristique thermodynamique de la réaction.

L'adénylate cyclase non stimulable par des hormones c'est-à- dire l'unité catalytique du complexe récepteur enzyme semble être une molécule asymétrique. Neer (1974) qui solubilisa l'adénylate cyclase

de rein de chien par le triton-XlOO ou le lubrol-PX trouva deux formes de l'enzyme avec comme poids moléculaire respectif 158.000 et 38000 daltons. Une adénylate cyclase naturellement soluble, insensible aux hormones, celle de Brevibacterium liquefaciens a été crystallisée (Takai et coll., 1974). L'enzyme diffère de celle des mammifères par le fait qu'elle n'est pas stimulable par le NaF mais est stimulable par le pyruvate. Cette enzyme peut être séparée par

(34)

27.

le sodium dodecyl sulphate en deux sous unités de 46.000 daltons.

A partir des déterminations des enthalpies de formation de 5'AMP à partir de cAMP et de 5*AMP à partir d'ATP (Kurashina et coll., 1974; Greengard et coll., 1971; Hayaishi et coll., 1971) il a été établi que l'hydrolyse du lien phospho ester est associé à une variation d'énergie libre d'approximativement 12 kcal/mol. Donc le cAMP pourrait éventuellement servir de donneur énergétique, comme l'ATP.

C. Effets du Fluorure.

Presque tous les systèmes adénylate cyclase de cellules eukaryotes décrits jusqu'à aujourd'hui sont stimulables par le NaF.

L'anion aurait un effet direct sur l'enzyme et n'agit pas par son effet inhibiteur des ATPases. Son mode d'action est mal connu. Ses effets décrits pour la première fois par Rail et Sutherland (1962) exigent du Mg^'*' (ou du Mn^"*^) et sont faiblement réversibles (Schramm and Naim, 1970). L'activation par le NaF est beaucoup moins dépen­

dante de l'environnement lipidique de la cyclase que celle induite par hormones. Ainsi toutes les adénylates cyclases à l'exception de

celle du cerveau (Johnson and Sutherland, 1973) sont encore stimu­

lables par le fluorure après solubilisation par des détergents (Levey, 1970; Neer, 1974).

Le mécanisme d'action de la stimulation hormonale et du NaF ont des propriétés très différentes (Birnbaumer et al., 1969, 1971;

Manganiello et Vaughan, 1976).

L'hypothèse selon laquelle le fluorure activait de manière maximale 1'adénylate cyclase a été adoptée pendant de nombreuses

années. Cependant en améliorant les milieux d'incubation utilisés pour mesurer la réponse hormonale, en particulier par l'addition de de certains nucléotides, il a été possible d'obtenir des activité supérieures à celles obtenues en présence de fluorure (Birnbaumer et coll., 1971). De plus, Rodbell et coll. (Rodbell et coll, 1974;

(35)

28.

Rodbel 1975) ainsi que d'autres laboratoires (Spiegel et Aurbach, 1974; Lefkowitz, 1975) ont montré que la guanosine 5'-/^ , -imido -triphosphate (GMP-P(NH)P) l'analogue imidodiphosphate du GTP est capa­

ble dans certaines conditions d'augmenter l'activité cyclasique à un niveau loin au-dessus de celui obtenu par le fluorure. Ceci suggère que l'activité de fluorure ne doit pas être considérée comme repré­

sentant l'activation maximale de l'unité catalytique comme précé­

demment suggéré. En outre des travaxix récents (Sahyoun et coll., 1977) ont montré qu'il était possible de solubiliser un ou plusieurs composants responsables de la régulation par le fluorure et que ces entités moléculaires étaient physiquement distinctes de l'enzyme elle-même.

8. BUT et STRATEGIE

Le but général de notre travail a été d'étudier dans une perspective physiologique l'interaction d'un signal hormonal et de son tissu cible.

Nous avons d'abord choisi comme objet d'étude l'adénylate cyclase thyroïdienne. En effet, J_°) l'activation de l'adénylate cyclase par un signal extracellulaire est l'un des principaux mécanismes bio­

chimiques de modulation cellulaire, ce qui conférait à notre sujet un caractère très général.

^°) la thyroïde est relativement homogène ce qui permettait d'espérer des résultats clairement interprétables.

^“) des travaux antérieurs du laboratoire avaient montré que la plupart des effets de la TSH sur la thyroïde sont causés par le cAMP.

^°) les travaux poursuivis par d'autres au laboratoire permettaient d'espérer que l'on pourrait mettre en relation les données obtenues en système acellulaire et les données obtenues sur cellules intactes.

(36)

29.

Les travaux menés sur l'adénylate cyclase thyroïdienne sont complémentaires à l'étude des récepteurs hormonaux eux-même.

Pour des raisons diverses (complexité de la TSH, manque d'analogues, ignorance de la structure, etc..) les résultats obtenus sur les récepteurs de la TSH risquaient d'être ambigus.

La nécessité méthodologique de posséder un ligand de choix (qui n'existe pas encore pour les récepteurs à la TSH) nous a poussé à choisir un modèle expérimental plus simple pour cette partie du travail : le récepteur adrénergique. L'état des connaissances de la pharmacologie des récepteurs ^adrénergiques et plus particu­

lièrement l'existence d'agonistes, d'isomères optiques et d'anta­

gonistes à haute affinité pouvant être radiomarqués ont orienté

notre choix vers ce système pour la caractérisation d'un récepteur par l'étude de la liaison de ligands. Notre but a été de mettre au point ue

méthodologie permettant de caractériser et de quantifier les récep­

teurs Jh adrénergiques sur cellules intactes. L'étude sur cellules intactes a l'avantage d'être physiologique et offre un outil de qua­

lité qui devrait permettre de compléter et d'étendre l'étude des récepteurs faite essentiellement sur des préparations membranaires.

Nous avons abordé cette étude sur des cellules C 6 de gliome de rat en culture. Cette lignée est aisée à obtenir, à cultiver et

à manipuler. De plus des études pharmacologiques avaient montré la présence sur ces cellules de récepteurs /^-adrénergiques (Gilman et Nirenberg, 1971) présentant la propriété très générale de désensibi­

lisation ou réfràctorité (de Vellis et Brooker, 1974). C'est sur cette lignée cellulaire que nous avons mis au point la méthodologie de la mesu­

re de la liaison de ligands et la caractérisation des récepteurs padréner giques sur cellules intactes. Nous avons ensuite applique cette

méthodologie aux cellules de muscle squelettique en culture. Un tra­

vail récent (Atlas, Hanski et Levitzki, 1977) suggérait que ces cel­

lules auraient une densité extrêmement élevée de récepteurs ^ et pour­

raient être un système de choix pour aborder la purification et l'iso-

(37)

30.

lement du récepteur. Notre étude a infirmé cette hypothèse

(cf chapitre V). Le succès de la méthodologie utilisée a suscité des collaborations avec d'autres groupes de recherche de notre Université (R. Kram, département de Biologie Moléculaire et G.

Delespesse, département d'immunologie. Hôpital St Pierre).

Nous avons pu, en collaboration avec le premier groupe, carac­

tériser les récepteurs ^ des cellules érythroleucémiques de Friend.

Cette étude ne sera pas développée dans le présent travail.

L'intérêt d'une extension en immunologie de nos travaux nous a conduit à étudier les récepteurs /4 sur les lymphocytes amygda- liens humains et sur leurs, sous populations cellulaires.

Des études biochimiques et pharmacologiques ont démontré (cf Intro­

duction) l'existence de récepteurs yS adrénergiques sur les lympho­

cytes ainsi que le rôle que ceux-ci jouent dans la modulation de la réponse immune •

Le système des leucocytes constitue , spécialement chez l'humain, un modèle facilement manipulable pour l'étude d'une pathologie

(l'asthme) dans laquelle serait impliquée une altération au niveau des récepteursy^ adrénergiques (Szentivanyi, 1968). En effet, chez l'homme le lymphocyte et le parench3nne pulmonaire possèdent

le même type 2^ récepteuradrénergique (Conolly et

Greenacre, 1977). De plus la réponse physiologique et pharmacologique des muscles lisses bronchiques aux catécholamines joue un rôle clé dans l'asthme (Conolly et Greenacre, 1976). Il était donc raison­

nable de considérer le lymphocyte humain comme un bon modèle pour étudier une éventuelle altération chez les asthmatiques de leurs récepteurs adrénergiques.

(38)

CHAPITRE II

Pages

M

éthodes générales

... ...

3i 1. PRELEVEMENT DES GLANDES ... 31 2. HOMOGENEISATION ... 31 3. INCUBATION DES TRANCHES ... 32 4. PREPARATIONS MEMBRANAIRES A PARTIR DES HOMOGENATS

DE thyroïde ... 32 5. MESURE DE L'ACTIVITE DE L'ADENYLATE CYCLASE ... 33 6. SYNTHESE DE L'^^^I lODOHYDROXYBENZYLPINDOLOL, ^^^I-

(+^)-HYP ... 33 7. MESURES DE LA LIAISON DE ^^^I-HYP SUR CELLULES

INTACTES ... 34 8. DOSAGE DES ACTIVITES ENZYMATIQUES CHOISIES COMME

MARQUEURS ... 38 9. DOSAGE DES PROTEINES ... 38 10. MILIEUX ... 38bis

(39)

1. PRELEVEMENT DES GLANDES

Les glandes thyroïdes ont été prélevées sur l'animal (généralement le cheval) dans les cinq minutes qui suivent l'abattage et transportées au laboratoire, à 0°C, dans du NaCl 9 %o. Les glandes ont été disséquées avec soin des parathyroïdes éventuelles, de leur capsule et des tissus conjonctif et adipeux avoisinants.

2. HOMOGENEISATION

Deux techniques ont été employées selon qu'il s'agissait de tranches de tissu après incubation ou de tissu frais utilisé à des fins préparatives. Dans le premier cas, les tranches de thyroïde étaient finement hachées au moyen d'un hachoir automatique (Mc Ilwain- Tissue Chopper). Dans le second, les glandes sont d'abord émincées au moyen de ciseaux avant d'être hachées manuellement au moyen d'un

hachoir ménager multilame ("hache-vite"). Dans les deux cas, la bouillie tissulaire obtenue est homogénéisée dans un homogéneisateur teflon-

verre dont le piston est animé d'un mouvement rotatif. De 5 à 10 passes sont habituellement réalisées. Cette méthode d'homogénéisation particulièrement peu agressive est la seule qui nous ait donné de bons résultats. Toutes ces opérations se déroulèrent toujours entre 0 et 4°C.

Le milieu d'homogénéisation est constitué par 0.25M sucrose, 25 mM Tris-

(40)

32.

3. INCUBATION DES TRANCHES

Les glandes nettoyées ont été coupées en tranches d'environ 0,5 mm d'épaisseur au moyen du microtome de Stadie-Riggs. Les tran­

ches ont été incubées à 37°C sous carbogène (95 % O2, 5 % CO2) dans du tampon Krebs Ringer bicarbonate enrichi avec 8 mM glucose et 0,5 g/L d'albumine bovine sérique. La proportion entre le poids humide des tranches et le milieu d'incubation a été de 100 mg par 40 ml de milieu.

4. PREPARATIONS MEMBRANAIRES A PARTIR DES HOMOGENATS DE THYROÏDE

Un milieu aqueux à deux phases a été préparé préalablement de la manière suivante : à 190 ml de Dextran T 500 (22 % w/v) sont mélangés 100 ml de polyéthylène glycol 6000 (30 % w/v), 200 ml Tris- HCl 0.2 M pH 7.4 et 100 ml d'eau bidistillée. Le mélange est intime­

ment mélangé, décanté dans une ampoule pendant 48 heures et les 2 phases séparées. La phase supérieure est enrichie en polyéthylène glycol

alors que la phase inférieure l'est en dextran.

L'homogénat de thyroïde filtré sur deux couches de gaze est centrifugé à 800 g pendant 5 minutes (Sorvall rotor HB4, 2200 rpm) Le culot est lavé deux fois avec le milieu d'homogénéisation et resus­

pendu dans la phase supérieure du milieu à deux phases. Un volume égal (^ 15 ml) de la phase inférieure est ajouté et le tout intimement mélang Le mélange est centrifugé pendant 15 minutes à 12.000g

(Sorvall rotor HB4,860Grpm)et la fraction enrichie en membranes plasma­

tiques est recueillie à l'interphase, resuspendue dans le milieu d'homo­

généisation et centrifugée à 10.000 g pendant 10 min. L'ensemble des opérations a été réalisé à 4°C. Cette préparation a pu être stockée pendant 15 jours dans l'azote liquide sans modification sensible de l'activité adénylate cyclase.

(41)

33.

5. MESURE DE L'ACTIVITE ADENYLATE CYCLASE.

L'activité enzymatique est mesurée par la conversion de ATP-0(-P32 en cAMP^^. Le milieu réactionnel (200 ul)tamponné à pH 7.4 contient de

' 32

l'ATP 3 mM, du MgCl2 5 mM, du cAMP 2 mM, du Tris-HCl 50 mM, de l'ATP-ov-P 2^Ci, 0.1 % albumine bovine sérique,de la créatine phosphate lOmM et 60 de créatine kinase de muscle de lapin.Les membranes 200^g de protéines)ou l'homogénat (+^ 1 mg protéines) sont incubés dans le milieu réactionnel pendant 20 min. à 30°C. Lorsque la mesure de l'activité enzymatique a été effectuée sur de l'homogénat de l'IBMX 1 mM a été ajouté au milieu réactionnel pour inhiber l'activité phosphodiestérase. A la fin de la réaction 100 ^1 d'une solution contenant de l'ATP 50 mM, du cAMP 20 mM et du cAMP H 20.000cpm sont ajoutés au milieu réactionnel qui est cen­

trifugé à 5.000rpm pendant 15 minutes et le surnageant est ensuite passé sur colonne d'oxyde d'aluminium neutre. L'oxyde d'aluminium neutre (+^ 2 g) a été préalablement activé à 100°C pendant 3 heures et conditionné à sec dans des colonnes de verre. Le surnageant (+^ 300 ^1)

déposé au sommet de la colonne estélué par 6 ml de tampon tris HCl 50 mM pH 7.4. Les 3 premiers ml de l'éluat sont écartés et les 3 suivants collectés dans des fioles à scintillation auquel 15 ml de

. . ^ 3 liquide de Bray sont ajoutés avant comptage de la radioactivité ( H et 32P) dans un compteur à scintillation liquide Packard.

6. SYNTHESE DE L'’^^IODOHYDROXYBENZYLPINDOLOL, ^^^I-(+)-HYP

L'iodure est oxydé par la Chloramine T et peut sous cette forme attaquer le noyau phénol du groupement hydroxybenzyl de la molécule de HYP. La réaction est arrêtée grâce à un réducteur^ le métabisulfite.

La réaction est effectuée dans un volume final de 45 ul pendant 3 min et à 21°C de la manière suivante . 5 ^1 de HYP (5.10 gf (10 mM)—9 dissout dans l'acétate d'éthyle sont déposés et évaporés sous azote dans le tube réactionnel en polypropylëne (Falcon). On y ajoute 30 ul

de tampon phosphate pH 7.4 et 10 ul d' I (1 mCI) (Amersham 1850 Ci/mmole)

—9 — ^

(0,3 10 grd'I ). La réaction est initiée par l'ajoute de 5 pi de Chlo­

(42)

34.

ramine T 0,75 mM (3,8 10 gr). Apres 3 min. 500 jil de métabisulfite .-9 de soditim (1 mg/ml dans l'acide acétique 1 M) sont ajoutés. Les pro­

duits hydrophobes à savoir le HYP en excès, les HYP mono et diiodés sont ensuite extraits 4 fois par 500 ;ul d'acétate d'Ethyle contenant 10 M de phénol fraîchement distillé. Le volume d'extraction est réduit 10 à 20 fois par évaporation sous azote et ensuite déposé sur papier Whatmann 3 MM et soumis à une chromatographie dépendante .

pendant 12 heures, par du formiate d'ammonium O.IM pH 8.5 et du-phénol O.lmM.

Ovv . C

1 O C , V 125

L' ^I-HYP monoiodé (Rf = 0.07 >est ainsi séparé de l'iodure I (Rf=l' du HYP (Rf=0.6) et du HYP diiodé (5% de la radioactivité totale) (Rf=0).

,125,

L'“■ I-HYP monoiodé est élué du chromatogramme par le mélange acé­

tate d'éthyle, diethylamine (98/2) et stocké à - 80°C en présence de 0.1 mM phénol à une concentration de lOO.OOOcpm par yl. Le rendement de la réaction est d'environ 30 %. L'ensemble des opérations est ef- fectué à l'abri de la lumière. L'activité spécifique de 1' I-HYP est125 celle de l'iode 125 utilisé (+ 2000 cpm/10 mole).-15

7. MESURES DE LA LIAISON DE '^^I-HYP SUR CELLULES INTACTES.

a. Sur cellules en_culture adhérentes aux boites de Pétri.

Les souches utilisées ont été les cellules C6 de gliome de rat et les cellules L8 de myoblaste de rat. Ces cellules ont été cultivées par H. Schmitt (actuellement Département de Biologie Molé­

culaire, U.L.B.) et fournies par D. Yaffe et l'Institut Weizmann (Israël).

Les C6 sont cultivées sur des boites Falcon dans du milieu DMEM (Gibco) additionné de sérum de veau foetal ( Gibco) sous une atmos­

phère contenant 95 % d'air et 5 % CO^. Les cellules en phase expo­

nentielle de croissance sont détachées par trypsinisation et distri­

buées en boite de Pétri de 3.5 cm de diamètre. La mesure de la liai­

son est effectuée 48h au moins après cette sous culture.

(43)

35.

Chaque boite contenant environ 2.10 cëllules est lavée avec 5 ml de PBS (Phosphate Buffered Saline) et incubée 30 min. à 37°C avec 0.8 ml de

125 -5

PBS contenant différentes concentrations de I-HYP et 5.10 M de phentolamine. Après incubation le milieu est aspiré et les boites

lavées 5 fois avec 2 ml de PBS à température ambiante, suivie par 6 lavages de 10 minutes chacun. Les cellules sont ensuite détachées des boites par 1 ml de trypsine 0,1 % dans un milieu isotonique D-1 et comptées au compteur gamma. La culture et la mesure de la liaison des cellules L8 de muscle sont identiques à celles des C6.

^• Sur lymphocytes amygdaliens humains.

1. Préparation des lymphocytes amygdaliens.

Ces préparations ont été effectuées par H. Collet ( dépar­

tement d’immunologie de l'Hôpital St Pierre).

1.1. Lymphocytes totaux

Les amygdales palatines de. patients généralement jeunes (8 à 16 ans) ont été prélevées stérilement et transportées dans du milieu RPMI 1640 à 0°C (Flow Laboratories, Rockville, Md) contenant de la pénicilline 1000 Unités/ml, de la strçtomycine 500 yug/ml,de l'amphoté- ricine B 1 ;ug/ml (Grand Island Biological Co., Grand Island, N.Y.) et

1 pg/ml de gentamycine. Le tissu a été coupé et pressé pour en extraire le "jus" lymphocytaire. Les fragments de tissu et de cellules sont

alors éliminés et la siispension de cellules est lavée 3 fois avec du Hank' (milieu isotonique et tamponé HBSS) sans calcium et magnésium

(Grand Island Biologicals) puis resuspendues à la densité désirée (^ 50 10^ cellules/ml) dans du Hank's contenant du Mg"*^^ 10 mM et du tris HCl pH 7.4 50 mM. Les lymphocytes totaux amygdaliens sont constitués dans ces conditions de préparation par environ 42 % de lymphocytes T, 43 % de lymphocytes B et 15 % de cellules non identifiées (Delespesse et coll., 1976).

(44)

36.

1.2. Préparation des rosettes (E-RFC) de_globules rouges de^mou|gng 1SRBCi.

0.2 ml de SRBC 2 % dans du HESS ont été mélangés à 0.2 ml de lymphocytes amygdaliens (4.10 cellules/ml et incubés à 37°C pen­

dant 15 min. (méthode de Jondal et coll., 1972). Le mélange a ensuite été centrifugé à 100 g pendant 3 min. à température ambiante et incubé à 0°C pendant 16 heures. Le culot est ensuite resuspendu délicatement par agitation mécanique et le pourcentage de lymphocytes ayant liés plus de trois érythrocytes est alors déterminé.

i ■i

1.3. Purification des lymphocytes T et B.

1.3.1. Par la technique des rosettes : 1°) Lymphocytes B

-o-o-o-o-o-o-

Les lymphocytes B sont obtenus en séparant les cellules ayant formé des rosettes des autres lymphocytes. Le culot de lymphocytes préparé en 1.2 est délicatement resuspendu et centri­

fugé (30 min., 450 g à 20°C) sur un coussin de Ficoll-Hypaque (d=l,077) . Les cellules à l'interphase (enrichies en B) sont récupérées et lavées deux fois dans du milieu Hank's. Le culot est conservé pour préparer les lymphocytes T. Dans ces conditions sur 100 cellules de l'interphase moins de 5 sont des lymphocytes T et environ 30 sont des cellules non identifiées, c'est-à-dire n'ayant ni IgG ni IgM ni IgA détectable sur leur surface et 60 % ont des Ig détectables.

2°) Lymphocytes T -o-o-o-o-o-o-

Les rosettes (lymphocytes + globules rouges) sépa­

rées par centrifugation sur Ficoll sont lavées 2 fois dans du HESS.

Les globules rouges de mouton sont lysés en incubant les rosettes dans du NH^Cl (0,83 % pH 7.3) 5 min à 37°C et les lymphocytes sont récupérés par centrifugation (300 g 5 min). Dans ces conditions, la préparation contient en moyenne 81 % de lymphocytes T, moins de 5 % de cellules B et 1,6 % de monocytes (Pochet et coll., 1979).

Figure

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Références

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