Les gels d’agarose et de polyacrylamide
Applications à la biologie moléculaire
L’agar-agar
Agar-agar est un mot d'origine Malaise qui désigne en extrême-orient la gelée obtenue à partir de diverses algues rouges
gélidium
gracilaria
Au XVIIème siècle par un cuisinier Japonais. Une industrie dont le Japon conserva Une découverte accidentelle
le gel d'agarose
De l’agar-agar à l’agarose
16 to 38 US$ /Kg
Purified Agar 38 to 60 US$ /kg 535 to 5 400 US$ /kg
agarose
Purification plus ou moins importante
Caractéristiques principales: Forme un gel à 34-43°C après ébullition Ne se re-solubilise qu’à 85°C
L'agarose est un polymère d'un diholoside (120 000 Da)
C4 C3
C1 C1
1,3- links are more easily hydrolysed by enzymes (Pseudomonas atlantica) 1,4- links are more easily hydrolysed by acid catalysts
1,4- links make the polysaccharide chain particularly compact and resistant to breakage, as is found in the peptidoglycan of bacteria.
Organisation en double hélice
ZOOM -
Structure d’un pore du gel
Selon la concentration d’agarose l’empilement des pores est plus ou moins important Simulation de la taille des pores
en fonction de la concentration du gel
Concentration d’agarose
Le gel d’acrylamide
C'est un gel réticulé, obtenu par polymérisation :
acrylamide bis-acrylamide
Pourqouoi ces 2 composés sont ils nécessaires à la polymérisation ?
2)La propagation de ce radical enclenche alors la polymérisation:
M + I* -> M*
M* + M ->M-M*
M-M* + M -> M-M-M*
…
Notez la présence du double lien C-C à l'extrémité de la molécule.
Quand un des carbones impliqués dans le double lien prend, sous l'influence d'un initiateur, une forme radicalaire (radical libre), il peut attaquer le double lien C-C d'une autre molécule
1) formation spontanée ou induite d'un radical au niveau l'initiateur:
I -> I*
seul site de formation de radical par molécule
2 sites de formation de radical par molécule
Bis-acrylamide ponte les chaînes d'acrylamide
Formation d’un gel
Agent réticulant
Principaux agents réticulants
le N,N'-méthylène bisacrylamide est l'agent réticulant le plus utilisé
Le diacrylamide de piperazine gels un peu plus solides et résolution améliorée.
D'autres agents réticulants peuvent être utilisés si on veut des gels "resolubilisables"
gels plus fragiles
Le BAC (N,N'-bisacrylylcystamine) a des liens disulfures qui peuvent être détruits par un réducteur de liens disulfures.
Le DATD (N,N'-diallyltartradiamide) a des liens diole, donnant un gel solubilisable à l'acide périodique,
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Structure du gel d’acrylamide/bis-acrylamide
La quantité d'acrylamide
Du rapport bisacrylamide/acrylamide Quantité d’acrylamide et/ou bis acrylamide
La porosité du gel
Plus fine que le gel d’agarose
Principes physiques de l’électrophorèse
Applications des gels à l’électrophorèse
Du fait de leurs caractéristiques propres et en fonction des conditions de l'électrophorèse ces ions auront des vitesses de migration différentes, ils vont donc se séparer les uns des autres.
Les molécules anioniques migrent vers l'anode et les molécules cationiques se déplacent vers la cathode.
La méthode de l'électrophorèse est basée sur le déplacement d'ions sous l'effet d'un champ électrique.
Ce support peut être liquide : on parle alors d'électrophorèse en veine liquide (mise au point par Tisélius en 1937).
Mais les principales applications utilisent un support poreux (gels) qui va stabiliser la phase liquide : on parle alors d'électrophorèse sur support ou d'électrophorèse de zones.
Le champ électrique est obtenu par un générateur de courant continu. Le support de ce champ est constitué par un tampon de pH et de concentration convenables dont les ions conduisent le courant d'un pôle à un autre.
L’électrophorèse des molécules d’ADN
Eléments nécessaires:
Un support Gel d’agarose ou polyacrylamide Tampon d’électrophorèse
Marqueur de poids moléculaire Tampon de charge
colorants
Les acides nucléiques macromolécules polyanioniques uniformément chargées. (pH 7,5-8) De ce fait sous l'effet d'un champ électrique ils peuvent migrer sur un support solide, un gel et être séparés.
La charge relative étant constante, le système de discrimination entre les molécules est : l'effet de filtration du gel utilisé « Tamisage moléculaire »
leur masse moléculaire ou nombre de paires de bases pb
Le gel d’agarose support le plus utilisé.
Les tailles de fragments qu'il est possible de séparer sont comprises entre 0,5 et 20 kb.
Les gels sont coulés à l'horizontale dans des appareils transparents aux UV de manière à pouvoir suivre périodiquement la migration.
La migration est horizontale
Vocabulaire:
Cuve d’électrophorèse
Dépôt d’échantillon dans les Puits du gel
La concentration d’agarose
ANODE CATHODE
+ -
Migration Brin d’ADN de tailles différentes
ANODE CATHODE
+ -
Migration Brin d’ADN de tailles différentes
Faible concentration en agarose
ANODE CATHODE
+ -
Migration Brin d’ADN de tailles différentes
Forte concentration en agarose
Meilleure séparation des brins de petites tailles
Correspondance tailles des brins d’ADN/ concentration d’agarose
% d’agarose Éventail de taille d’ADN (bp)
0,75 1 1,25 1,5 2 2,5
10000-15000 500-10000 300-5000 200-4000
50-1000 100-2500
Cas du gel de polyacrylamide
Utilisé pour la séparation des fragments d’ADN de moins de 1000 pb à la base près.
Le gel est coulé entre deux plaques de verre à l'abri de l'oxygène.
La migration est verticale.
Ses utilisations majeures :
Purifier des oligonucléotides de synthèse et éliminer des nucléotides libres Déterminer des séquences d'ADN.
Séparer des petits fragments d'ADN
L’importance du tampon d’électrophorèse
La mobilité électrophorétique Composition du tampon (pH 7,5-8) Résistance ionique du tampon
En absence d’ions la conductance est nulle L’ADN ne migre pas
Résistance ionique élevée
Conductance élevée Migration rapide Augmentation de la température
Exemples: Tris Borate EDTA (TBE) Tris Acetate EDTA (TAE)
Le tampon de charge
Tampon de charge : bleu de bromophénol et/ou xylène cyanol - glycérol - tampon d’électrophorèse.
Les 2 colorants permettent de suivre la migration des fragments d'ADN :
La migration du Xylène cyanol est "comparable" à celle d'un fragment d'ADN de 4000 pb
La migration du bleu de bromophénol est "comparable" à celle d'un fragment d'ADN de 300 pb
Xylène cyanol
bleu de bromophénol
Augmentation de la densité de l’échantillon évite que l’ADN sorte du puit Ajout de couleur à l ’échantillon simplifiant le dépôt.
Le marqueur de poids moléculaire
La distance de migration d’un fragment d’ADN dépend de:
Du temps La tension Du gel
Des concentrations de tampon De la cuve utilisée
De nombreux facteurs plus ou poins contrôlés Mauvaise reproductibilité
Nécessité des marqueurs à chaque expérience tailles connues
mêmes conditions de migrations que l’échantillon Détermination des tailles des fragments dans l’échantillon Indépendante des conditions expérimentales
Indicateur de reproductibilité de l’expérience
La visualisation des brins d’ADN
Le bromure d'éthidium se lie à l'ADN bicaténaire par intercalation.
Le bromure d’éthidium
Le bromure d'éthidium est extrèmement dangereux mutagène/carcinogène Ils occupent un site interbase sur deux jusqu'à saturation.
Ce type de liaison est dit "par exclusion du voisinage".
B.E.T
Les intercalants sont séparés les uns des autres par des intervalles de 10,2 Å.
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La comparaison visuelle de la fluorescence d'un échantillon avec celle d'une quantité d'ADN connue (le marqueur de taille) permet d'estimer la quantité d'acides nucléiques déposée.
UV
Le BET émet une fluorescence orange lorsqu'il est éclairé par des UV courts (200-300nm).
Le seuil de détection est de quelques ng.
La détermination de la taille d'un fragment se fait par rapport à la migration d'un marqueur approprié contenant des fragments de tailles connues.
Utilisations: Dans le gel d’agarose avant la migration
Gel est placé dans un bain (10 min) après la migrationOU
Il existe des méthodes de coloration de l'ADN qui ne nécessitent pas l'emploi d'UV ni de BET le bleu de méthylène
l'azure A
le bleu de toluidine Limite: moins sensibles
La coloration au bleu de Nile semble une méthode à la fois sensible et non dangereuse
La durée de coloration estimée à 15 h !!!
Limite:
Application : détermination de la taille exacte de fragments d’ADN
Réalisation de l’expérience
Détermination des distances de migration
Tracé de la droite : log (taille) = f(distance de migration)
Permet de déterminer la taille en paires de base d'un fragment d'ADN inconnu
Cas particulier des plasmides
Autres applications et cas particuliers
pGLO
M
5371 pb
Plasmide est circulaire
différentes configurations influence sa migration La forme la plus abondante 4350 pb
stucture superenroulée
La forme la moins représentée 9416 pb structure circulaire, non superenroulée
Plasmide non coupé
Toutes les formes
d’un plasmide non coupé
D’un peu plus près…
relaché
1 vrille
2 vrilles
Encombrement diminue Vitesse augmente
« Supercoil »
Migration des plasmides non coupés ne dépend pas que de leurs taille mais aussi de leurs structures
Migration d’un plasmide coupé (double coupure par topoisomérase II)
Forme linéaire très majoritaire, relâché et supercoil minoritaires Autres formes enroulées en dessous su seuil de détection
L’électrophorèse en champ pulsé (PGFE)
Séparation des fragments de taille supérieure à 20 kb.
Principe
Changer l'orientation et/ou la polarité du champ électrique alternativement au cours du temps A chaque modification du champ, la molécule d'ADN doit se réorienter parallèlement au nouveau champ. Le temps nécessaire à la réorientation est proportionnel à la longueur de la molécule.
Lorsque le champ est rétabli dans son sens initial, la molécule doit une nouvelle fois se réorienter Ces temps de réorientation provoquent un retardement de la migration nette qui est
proportionnel à la taille de la molécule.
Le support de migration est un gel d'agarose à 0,8 % et la taille des fragments séparés est de l'ordre de 50 kb à quelques mégabases.
Application de la PGFE
Typage de souches bactériennes Utilisation d’enzymes de restriction reconnaissant des sites de coupure "rares", Générant un nombre restreint de fragments d’ADN de très grande taille.
La difficulté de cette technique:
Manipulation de molécules de grande taille qu’il faut éviter d’endommager
« empaquetage »
Pour récupérer l'échantillon :
la bande est découpée et l'acide nucléique est obtenu Après diffusion dans un tampon adéquat.
OU
Par extraction par kit commercial.
Electrophorèse préparative :
Les principes et conditions techniques sont identiques à ceux de l'électrophorèse analytique
Après migration, on repère les bandes correspondant à l'acide nucléique à purifier.
