Sylvie BIAU
E T U D E
de la matière colorante
des vins blancs de Bordeaux.
G R A N D P R I X 1 9 9 6
PRÉFACE
Le Groupe Amorim, né du liège en 1870 au Portugal, a fondé les bases de son développement sur cette extraordinaire matière première, à t ravers la production de cet humble mais i n s é p a rable compagnon du Vi n : le bouchon de liège.
Notre volonté de servir la cause du vin s’est t oujours exprimée dans la rech e rch e t e chnologique sur la filière liège, base de notre activité.
En 1992, nous avons souhaité aller plus loin et nous engager davantage aux côtés des chercheurs en œnologie en créant l’Académie Amorim, un lieu de rencontre et d’échange entre œnologues, ingénieurs, professeurs, sommeliers, auteurs, artistes… tous animés d’une même passion du Vin.
Chaque année, notre Académie encourage et soutient la rech e rche en œnologie par la remise d’un Prix à un ch e rcheur ou à une équipe de ch e rcheurs ayant fait paraître des trava u x significatifs qui concourent à la défense et à la promotion de la qualité du Vin. Que soient ici saluées les personnalités, membres de cette Académie, qui contribuent si généreusement à cette mission.
Je formule le vœux que cette collection, dédiée aux Lauréats du Grand Prix de l’Académie, devienne, au fil des ans, une référence et la mémoire vivante des effor ts et des trava u x engagés dans le monde entier pour servir la noble cause du Vin.
Americo Ferreira de AMORIM
Président du Groupe Amorim
LAURÉATS DE L’ACADÉMIE AMORIM
Grand Prix 1992 Pascal CHATONNET Institut d’Œnologie de Bordeaux
"Incidence du bois de chêne sur la composition chimique et les qualités organoleptiques des vins,
applications technologiques".
Grand Prix 1993 Pierre-Louis TEISSEDRE Centre de Formation et de Recherche
en Œnologie de Montpellier.
"Le plomb, du raisin au vin".
Grand Prix 1994 Ziya GÜNATA INRA Institut des Produits de la Vigne de Montpellier
"Etude et exploitation par voie enzymatique des précurseurs d’arôme du raisin,
de nature glycosidique".
Grand Prix 1995 Samuel LUBBERS
Institut de la Vigne et du Vin Jules G U Y O T, Université de Bourgogne
"Etude des interactions entre les macromolécules d’origine levurienne du vin et les composés d’arôme".
Mention d’Honneur du Jury 1995 P . L . TEISSEDRE - A.L. WATERHOUSE R . L .W A L Z E M - J.-B. G E R M A N E.N. FRANKEL - A.J. CLIFFORD
Université de Californie, Davis
"Composés phénoliques du raisin et du vin et santé".
Grand Prix 1996 Sylvie BIAU Faculté d’Œnologie
Université Victor SE G A L E N de Bordeaux 2
"Etude de la matière colorante des vins blancs de Bordeaux".
Prix Chêne-Liège 1996
Guillem ROIG I JOSA - Héctor RIU SAVALL Josep SANCHO I VALLS
Département d’Industries Agro-Alimentaires Escola Superior d’Agricultura de Barcelona
Universitat Politecnica de Catalunya
"Traitement des résidus de l’industrie du liège
N os grandes régions viticoles sont aussi le vivier de la recherche en oenologie.
Prenons en pour preuve les lauréats de notre Grand Prix : depuis cinq ans, l’Académie AMORIM récompense
les travaux de jeunes chercheurs dédiés à l’amélioration de l’expression du vin et de son bon usage, et chaque année, c’est une région toute entière qui se voit saluée.
Le Bordelais, le Sud-Ouest et la Bourgogne ont ainsi été à l’honneur, et, avec ces régions,
c’est le formidable travail des chercheurs qui se voit récompensé.
Aujourd’hui, c’est de nouveau le Bordelais et la Faculté d’Œnologie de l’Université Victor Segalen de Bordeaux 2
qui sont célébrés à travers les travaux de Sylvie BIAU.
Son “Etude de la matière colorante des vins blancs de Bordeaux” apporte une réponse, certes encore partielle,
à la bonne connaissance de la couleur des vins blancs et dénote une excellente maîtrise de l’outil
de l’analyse chimique le plus performant.
Merci aux membres du jury de l’Académie pour la pertinence de leurs observations, merci à l’Université du Vin de Suze-la-Rousse
qui nous accueille pour cette cérémonie, merci aux candidats de ce Grand Prix,
et bravo à notre lauréate 1996 !
Jacques PUISAIS
Président de l’Académie Amorim
E T U D E
de la matière colorante des vins blancs
de Bordeaux
Synthèse de la thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur à la Faculté d’Œnologie de l’Université Victor SEGALEN de Bordeaux 2
mention « sciences biologiques et médicales » option Œnologie - Ampélologie.
Sylvie BIAU
Da ns l e rè gne vég ét al, l es couleurs sont dues à la présence et à l’a cc umu la tio n de pi gme nt s q ui absorbent sélectivement une partie de la lumière visible, ou résultent d’un phénomène de copigmentation dans leq ue l l’ ass oc iat io n de pl us ieu rs mol éc ule s pr od uit ou m odi fi e la couleur propre d’un chromophore.
La couleur des vins blancs varie du jaune pâle des vins blancs secs au jaune doré, ambré, caractéristique le plus sou vent des vins bla ncs dits liquoreux, ceux-ci étant élaborés à partir de raisins botrytisés. Dans le cas des v ins b lancs secs, lorsque des défauts dus à l’oxydation surviennent, outre une profonde altération de leurs caractéristiques organoleptiques, on peu t o bse rv er u n p hén om ène de brunissement de leur couleur, pouvant aller parfois jusqu’à la formation d’un précipité brun.
La pr ése nt e ét ude a po ur objectif d’accéder à une meilleure connaissance de la couleur des vins blancs, afin de définir son origine exacte et d’expliquer son évolution au cours du temps. A cet effet, la mise au point d’un protocole d’extraction de la matière colorante des vins a permis d’isoler plusieurs pigments.
Mené en collaboration au sein de deux laboratoires implantés sur des
sites différents (Faculté d’Œnologie et Faculté de Pharmacie de Bordeaux), ces travaux de recherches constituent une expérience humaine enrichissante avec la rencontre de deux équipes distinctes et de l’interprofession viti- v i n i c o l e .
La gestion du projet d’étude fixé, représente également une expérience technique majeure avec la mise en œuvre de diverses méthodes physico- chimiques, deux d’entre-elles étant, jus qu ’à c e jo ur, peu u ti li sée s en œ n o l o g i e :
- la Résonance Magnétique Nucléaire apportant la preuve irréfutable et rigoureuse de l’identité structurale des pigments isolés,
- l’Electrophorèse Capillaire Haute Performance, technique d’analyse récente permettant de repousser les limites imposées lors de l’utilisation de la Chromatographie Liquide Haute Per fo rma nc e po ur l’é tu de d es phénomènes oxydatifs des vins.
La première partie de cette présentation concerne l’isolement et la caractérisation de pigments des vins b l a n c s .
Da ns la d eux iè me pa rti e, j’aborderai l’étude analytique de la couleur des vins par Electrophorèse Capillaire Haute Performance.
La synthèse de l’ouvrage que je vous propose concerne l’étude
de la matière colorante des vins blancs de Bordeaux.
Une étude bibliographique préalable montre que les travaux de recherches concernant la couleur des vins blancs so nt ess en tie ll eme nt mo tiv és pa r l’ ob ser vat io n év en tue ll e de son brunissement et visent à déterminer un traitement pour réduire ce phénomène d’ in sta bi lit é. Les obse r va ti ons effectuées au cours des divers essais mettent en évidence la participation de s pol yp hén ol s et so uli gn ent l’ imp or tan ce de l eur o xyd at ion chimique ou enzymatique dans la coloration des vins blancs. Cependant, quand plusieurs échantillons de vin blanc sont analysés par spectroscopie d’absorption UV-visible, la mesure des densités optiques à 280 nm (d280) pour estimer leur contenu phénolique et à 420 nm (d420) pour évaluer leur couleur, montre qu’il n’existe aucune relation directe entre ces deux valeurs
( F i g u r e 1). On note également une grande disparité de la coloration des vi ns b lan cs l iqu or eux q ui s ont toutefois plus colorés (en général d420
> 0 ,1) qu e le s v ins bl anc s s ecs ( g é n é r a l e m e n t d420 < 0 , 1 ) .
Quel que soit le type de vin blanc, leur couleur perçue par l’œil humain est jaune. Cependant, l’observation de leur spectre UV-visible ne présente qu ’u ne fa ibl e abs or pti on da ns le do mai ne du vi sib le et au cun maximum bien défini n’existe au delà de 400 nm (Figure 2 ) .
Vraisemblablement, la concen- tration des pigments dans les vins blancs est faible et ces substances ne présentent pas systématiquement un ma xim um d’a bs orp ti on d an s le do mai ne d u vi si bl e. Se ul es l eu r ex tra ct ion et le ur i den ti fic at ion structurale, qui jusque là n’avaient ja mai s é té env is agé es , pe uv ent permettre de s’en assurer.
Le s t rav au x d ’is ol em e nt des substances colorantes nécessitent un pré-fractionnement des vins blancs afin de mettre en évidence plusieurs substances majoritaires qui doivent alors être purifiées puis caractérisées.
Le pré-fractionnement des vins doit
Isolement et caractérisation de pigments des vins blancs
F i g u r e 1 .Densités optiques des vins blancs (à 280 et 420 nm)
* La densité optique à 280 nm est mesurée pour des vins blancs dilués au 1/20.
F i g u r e 2 .Spectres d’absorption UV-visible d’un vin blanc sec et d’un vin blanc liquoreux
per me ttr e d’é li min er le gl yc éro l, polyol majoritaire (5 à 20 g/l) dont la viscosité (19,9 cP à 25 °C) et le point d’ébullition (bp760 = 2 9 0 °C) sont tels qu’il est difficile d’évaporer à sec et de lyophiliser toute fraction contenant cet e sub st anc e. Or , ces de ux opérations sont indispensables avant tou te ét ude pa r Ré so nan ce Magnétique Nucléaire. Parallèlement, la perte de matière première doit être minimisée afin d’isoler les pigments en quantité suffisante pour réaliser leur identification structurale. A cet effet, deux modes d’extraction de la matière colorante sont envisagés : - l’extraction liquide/liquide des vins b l a n c s ,
- la Chromatographie Liquide Basse P r e s s i o n .
I . EXTRACTION LIQUIDE/LIQUIDE DE LA MATIERE COLORANTE DES VINS BLANCS
Trois types de vins sont étudiés : un vin b la nc se c a va nt et ap rè s s on oxydation manifeste et traduite par une au gm ent at ion de sa de nsi té optique à 420 nm, ainsi qu’un vin blanc liquoreux. Pour déterminer les solvants organiques les mieux adaptés à l’extraction de la couleur, divers d’entre eux ont été utilisés. Ceci a permis d’en sélectionner trois : l’éther diéthylique, l’acétate d’éthyle et le b u t a n - 1 - o l .
L’ext ractio n li quide/ liqui de d e la mat iè re co lor an te est dé so rma is réalisée par épuisements successifs de la p has e aq ue use du « v i n d é s a l c o o l i s é » avec ces trois solvants de polarité croissante. Pour chaque vin témoin et ses extraits, une lecture de la densité optique à 420 nm est effectuée et permet de déterminer le rendement d’extraction liquide/liquide de la couleur des vins.
Pour chaque vin, les taux d’extraction de la matière colorante augmentent avec la polarité du solvant (Figure 3 ) ;
les extraits successifs sont ainsi de plus en plus colorés. Cependant, étant donnée la miscibilité du glycérol dans les so lva nt s ut il isé s, l es e xt rai ts successifs sont également de plus en plus visqueux.
Le rendement global de l’extraction qui avoisine 60 % de la couleur des vins blancs secs, n’est plus que de 5 0 % après leur oxydation et n’atteint que 30 % de la matière colorante des vins blancs liquoreux.
L’extraction liquide/liquide n’est pas une m ét hod e de p rép ar ati on satisfaisante des colorants des vins bla nc s. En ef fe t, ce pr océ dé ne concerne qu’un faible pourcentage de matière colorante et ne permet pas l’é li m inat io n d u g ly cér ol . U ne nouvelle orientation de la méthode de fra ct ion ne men t des v ins b lan cs s’impose. La Chromatographie Liquide Basse Pression constitue une meilleure alternative à cette étude.
II. FRACTIONNEMENT DE LA MATIERE COLORANTE DES VINS BLANCS PAR CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE BASSE PRESSION
L’objectif de ce fractionnement étant l’élimination du glycérol et l’élution totale de la matière colorante sans perte excessive de matière première, plusieurs phases stationnaires ont été tes té es ( ge ls S eph ad ex G -10 0, Sep ha de x G- 50, Sep ha dex G-2 5, Sephadex LH-20, Fractogel TSK HW- F i g u r e 3. Rend ement s d’ extraction liquide/liquide de la couleur des vins b l a n c s
40 (S ), sil ic e C 18) , l es sol va nts d’ élu ti on é tant de s m élan ges hydroalcooliques. Les profils d’élution sont suivis à 420 nm (Figure 4 ) . Le tam is age mol éc ula ir e (g els Se pha de x d u t yp e G ) et la chromatographie sur gel de silice greffée C18 ne sont pas adaptés à l’isolement des pigments des vins blancs car l’efficacité de la séparation est médiocre (au maximum quatre fractions sont éluées sur Sephadex G- 25) et le glycérol n’est pas éliminé.
Au contraire, les gels Sephadex LH-20 ou Fr act og el T SK HW- 40 (S) permettent l’élimination du glycérol dans une première fraction légèrement co lo rée et l ’é lut io n to ta le d e la matière colorante résiduelle. Cette technique constitue donc un mode de pré-fr actionnement efficace de la matière colorante des vins blancs. La phase stationnaire choisie est le gel Sephadex LH-20 car l’élution est plus rapide qu’avec le gel Fractogel TSK HW-40 (S).
Le pré-fractionnement des vins blancs nécessaire à l’isolement des pigments
es t d onc dé so rma is ré ali sé pa r Ch rom at og rap hi e L iq ui de Ba sse Pr ess io n su r Se pha de x LH -20 , le solvant d’élution étant un mélange binaire eau/méthanol à concentration croissante en méthanol.
Dès lors, le f ractionn ement de la matière colorante d’un vin blanc en quantité conséquente est entrepris.
III. PRÉPARATION ET ISOLEMENT DE PIGMENTS DES VINS BLANCS
Le t ra ite men t d’ un e qua nt ité im por ta nte d e mat iè re pr emi ère s’impose afin d’isoler des pigments en quantité suffisante pour réaliser les différentes analyses indispensables à leur détermination structurale. Selon di ver s a ute ur s, u ne o xyd at ion enzymatique par la laccase serait à l’origine de colorants spécifiques des vins liquoreux. Dans l’espoir d’isoler de t els p igm en ts , l es tr av aux d’isolement sont réalisés à partir d’un vin blanc liquoreux (7,5 litres).
Le vin, désalcoolisé, est concentré par évaporation sous pression réduite à F i g u r e 4. Profils d’élution de la matière colorante des vins blancs par Chromatographie Liquide Basse Pression
2 5 °C. Un premier fractionnement par Chr om ato gr aph ie L iqu id e Bas se Pression sur colonne de Sephadex LH- 20 ( 90 c m x 2 ,6 c m) p erm et l’obtention de trois fractions :
- la première (GH 2 O), éluée par l’eau dis ti llé e, rep ré sen te 2 3 % d e la matière colorante du vin et renferme le glycérol,
- la deuxième (MCH 2 O), éluée par l’eau distillée, représente 47 % de la matière colorante du vin,
- la troisième, (MCM e O H), éluée par le mét ha nol , rep rés en te 30 % de la matière colorante du vin.
La p has e MCH 2 O es t à s on to ur frac tion née par Chr omat ogra phie Liq ui de Bas se Pr ess io n s ur u ne nouvelle colonne de Sephadex LH-20.
L’élimination préalable du glycérol favorise une meilleure résolution de la séparation. Le profil d’élution et un contrôle par Chromatographie sur Cou ch e Min ce ont pe rm is de déterminer huit fractions (Figure 5 ) .
En r ai son d’ un d eg ré d e p ure té insuffisant, les fractions II, III et IV sont à le ur t our tra it ées p ar Chr om ato gr aph ie L iqu id e Bas se Pression sur silice C18 ce qui permet d’isoler les produits A, B, C et D. L a difficulté de séparation des fractions V à V III pa r C hr oma to gra ph ie s ur Couche Mince conduit à les analyser par Chromatographie Liquide Haute Performance sur silice greffée C18. La fra ct ion V me t e n é vi den ce la pré se nce de q uat re p ro dui ts majoritaires (Figure 6) dont trois (E, F et G) sont isolés par Chromatographie
Liquide Haute Performance en mode semi-préparatif et sont colorés. Cette technique a permis également d’isoler un des trois constituants majoritaires (H, substance colorée) de la fraction VII (Figure 7). Un détecteur à barettes de diodes permet la vérification de la pureté des produits et confirme la val id ité d es gr ad ien ts d’ él uti on a p p l i q u é s .
Les profils chromatographiques des fractions VI et VIII n’ont montré aucun pic significatif.
Apr ès co nc ent ra tio n d e la pha se M CM e O H par distillation (pression réd ui te à 2 5 ° C ), on ob ser ve la for mation d’un précipité brun. Ce dernier est éliminé par centrifugation.
Une étude du surnageant (SM e O H) par Chr om ato gr aph ie L iqu id e Hau te Performance en mode analytique sur
F i g u r e 5. Profil d’élution de MCH2O sur Sephadex LH-20
F i g u r e 6. Profil chromatographique de la fraction V (280 nm)
F i g u r e 7. Profil chromatographique de la fraction VII (280 nm)
F i g u r e 8. Profil chromatographique de SMeOH (280 nm)
silice greffée C18 met en évidence la présence de neuf produits majoritaires (I à Q ; Fig ur e 8) . Se pt d e ces substances ont été purifiées en mode semi-préparatif (I à O), deux d’entre elles (M. et Q) sont colorées.
Ce s t rav au x m ont re nt que la Ch rom at ogr ap hi e L iq ui de Ba sse Pr ess io n sur S eph ad ex LH -20 constitue la méthode la mieux adaptée au pré-fractionnement de la matière colorante des vins blancs. L’isolement des pigments nécessite, cependant l a m i s e e n œ u v r e d ’ é t a p e s supplémentaires de purification par Ch rom at ogr ap hi e L iq ui de Ba sse Pression et Haute Performance semi- préparative. Toutefois, il est important de s ou li gne r qu e si le p rot oc ole d’isolement des pigments peut être appliqué à n’importe quel vin blanc, les conditions opératoires dépendent ét roi te men t d e l a c om pos it ion chimique du vin traité et en particulier de sa teneur en glycérol.
IV. CARACTÉRISATION DES PRODUITS ISOLÉS
La caractérisation des divers produits isolés est réalisée à l’aide de diverses techniques
physico-chimiques. Il s’agit, tout d’abord, de la Résonance Magnétique Nucléaire monodimensionnelle (spectres
1H et 1 3C) et bidimensionnelle homonucléaire (spectre COSY) ou hétéronucléaire (spectres HMQC et HMBC). Les résultats acquis sont alors confirmés par Spectrométrie de Masse, le mode d’ionisation étant réalisé par FAB ou en impact électronique. Chaque substance est ensuite caractérisée par spectrométrie UV-visible et par Chromatographie Liquide Haute Performance. Pour la première fois, certaines d’entre elles sont également caractérisées par Electrophorèse Capillaire Haute P e r f o r m a n c e .
C e s t e c h n i q u e s o n t p e r mi s d’identifier six pigments (Figure 9). Il s’agit de l’isomère trans de l’acide cafféoyl tartrique ou acide caftarique [E], de l’acide coumaroyl tartrique ou acide coutarique [F] ainsi que les acides phénols libres correspondant s o i e n t l ’ a c i d e c a f é i q u e [ M ] e t l ’ i s o m è r e c i s d e l ’ a c i d e p - coumarique [H]. L’utilisation de la Résonance Magnétique Nucléaire bidimensionnelle a permis de faire d e s a t t r i b u t i o n s c e r t a i n e s e t d e F i g u r e 9. Pigments isolés à partir d’un vin blanc liquoreux
c o r r i g e r a i n s i l e s d e s c r i p t i o n s a n t é r i e u r e s d e c e s s u b s t a n c e s relevées dans la bibliographie.
L ’ a c i d e D-glucosyl p - coumarique [G] qui, jusque là, n’avait jamais été mis en évidence dans les vins, a également été identifié.
Ces s ub st anc es s ont d es a cid es cinnamiq ues au sein desquel s, la délocalisation des électrons à travers le noyau aromatique, la double liaison conjuguée et la fonction carboxyle fait de ces molécules des chromophores par ti cip an t à l a c oul eu r de s vi ns blancs. A l’image des spectres UV- visible des vins blancs, ces produits présentent un maximum d’absorption ver s 31 0 n m ou 32 0 nm ma is la largeur de la bande d’absorption est telle qu’elle s’étend dans le domaine du visible.
Le 3- O-r ha mno sy lqu er cét ol ou quercitrine [A], extrait directement à partir d’un vin pour la première fois, est également identifié. Ce flavonoïde gly co syl é, au s ein duq ue l la délocalisation des électrons se fait à tra ve rs l es n oy au x ar oma ti que s, possède un maximum d’absorption à 351 nm et sa bande d’abso rption s’étend au delà de 400 nm.
Parallèlement, six substances non colorées ont été isolées (Figure 10). Il s’agit du tyrosol [D], du gallate d’éthyle [N] et des acides gallique [I], protocatéchique [J], p-hydroxybenzoïque [K] et vanillique [L].
Ces tr av aux mo nt ren t q ue la col or ati on d’ un v in bla nc est la rés ul tan te de p ig men ta tio ns élé me nta ir es tel le s qu e c ell es apportées par certaines des molécules i s o l é e s .
E t a n t d o n n é e l e u r s t r u c t u r e c h i m i q u e , l e s f l a v o n o ï d e s n e pe u ve nt e n a uc u n ca s in t er ve n ir dans le phénomène d’instabilité de la matière colorante des vins. De plus, ces polyphénols sont utilisés p o u r p r é s e r v e r l a c o u l e u r d e certains aliments. En dépit d’une f a i b l e c o n c e n t r a t i o n , l e 3 - O - rhamnosylquercétol pourrait donc être favorable à une stabilisation de la matière colorante des vins blancs.
E n c e q u i c o n c e r n e l e s a c i d e s hydroxycinnamiques et dérivés, et pl u s p a rt i c u li è r em e n t l es a c i de s c a f t a r i q u e e t c o u t a r i q u e , n o u s sa vo n s q u e, d an s l e s m o ût s, c es com posés sont engagés dans une réaction d’oxydation enzymatique.
A i n s i , c e s a c i d e s i n t e r v i e n n e n t dans le processus d’oxydation des polyphénols en quinones. Dans les v i n s , l a p r é s e n c e d e m é t a u x c a t a l y s e u r s ( f e r , c u i v r e ) e t u n e protection insuffisante vis à vis de l’ ox yg è ne po u rr ai t en ge nd re r un mécanisme analogue d’oxydation des com posés ph énoliques ; ceci p o u r r a i t c o n s t i t u e r u n é l é m e n t d e l ’ i n s t a b i l i t é d e l a m a t i è r e colora nte obs ervée pour ce rtains vins blancs secs.
F i g u r e 10. Autres substances isolées à partir d’un vin blanc liquoreux 7 - O - β
L’identification structurale des pigments isolés à partir d’un vin blanc liquoreux met en évidence leur nature ph én oli qu e. C ep end an t, l eu r caractérisation par Chromatographie Liquide Haute Performance ou par El ect ro ph orè se Cap il la ire Ha ute Performance dans les vins, montre qu ’a ucu n d’ en tre eu x n’ est caractéristique d’un type de vin blanc (sec ou liquoreux). Il est donc difficile de préciser la différence de coloration observée entre ces deux types de vins.
Au ssi , u ne ét ude an al yti qu e du contenu phénolique et de la couleur des vins blancs est envisagée.
L’ ob jec ti f de ce tte ét ude es t de préciser l’origine de la différence de coloration observée entre vins blancs se cs et vi ns li qu ore ux et d’appréhender la relation pouvant ex ist er en tre l’ ox yda ti on des po ly phé no ls et l’i ns tab il ité de la couleur des vins.
Jusqu’à présent, la Chromatographie Li qu ide Ha ut e P erf or man ce su r co lo nne d e s il ic e g re ffé e C18 constitue une méthode de choix très utilisée pour l’étude analytique du co nt enu phé no li que de s vi ns.
Toutefois, l’analyse de ces composés par inj ecti on direc te des vins est li mit ée pa r l es ph éno mè nes d’absorption de ces substances sur la phase stationnaire puisqu’une part non négligeable des polyphénols n’est pas éluée.
Ces dernières années, une nouvelle technique d’analyse s’est développée : l’Elect rophorèse Capillai re Haute Performance. Son principe est basé sur la séparation, sous l’influence d’un ch amp él ect ri que , d e pa rti cu les chargées ou neutres, injectées dans un tube capillaire rempli d’une solution tampon. Cette technique offre deux
modes d’utilisation : l’Electrophorèse Capillaire de Zone et l’Electrophorèse Capillaire Micellaire.
L’Electrophorèse Capillaire Micellaire permet la séparation d’espèces peu ionisées ou neutres. L’addition d’un tensio-actif dans le tampon conduit à la formation d’agrégats chargés : les micelles. La séparation de chaque mo léc ul e de so lut é s’e ff ect ue en fonction de son coefficient de partage entre la phase aqueuse et la phase micellaire qui se comporte comme une « pseudo phase stationnaire » . Le ur ré te nti on dé pe nd de l eu r
« s o l u b i l i s a t i o n » par les micelles.
Cette affinité, fonction du caractère hy dro ph ob e de la mo lé cul e, est mesurée par un temps de migration.
Le t em ps de mig ra tio n d’ une substance sera d’autant plus élévé que so n ca ra ctè re hyd ro pho be est i m p o r t a n t .
Les composés phénoliques étant peu sensibles à l’application d’un champ électrique, la technique d’analyse mise en œuvre est l’Electrophorèse Capillaire Micellaire. Celle-ci offre de nombreux avantages : une simplicité de mise en œuvre, un temps d’analyse réduit, la nécessité de faibles quantités d’échantillons, une grande efficacité de s épa ra tio n (≥ 10 5 pla te aux théoriques) et surtout l’élution totale des composés analysés.
L’appareillage utilisé ne permet pas une détection au delà de 280 nm ; la couleur des vins blancs ne peut donc pas être appréciée. Aussi, un suivi par spectroscopie d’absorption UV-visible (mesure de densité optique à 420 nm) es t sy sté ma tiq ue men t as so cié à l’analyse par Electrophorèse Capillaire Haute Performance.
Ces techniques sont successivement appliquées à l’analyse directe des vins
Etude analytique de la couleur des vins blancs
µ
bla nc s, à l ’ét ud e de fr ac tio ns phénoliques issues de ces vins après fra ct ion ne men t sur r ési ne de polyvinylpyrrolidone (PVP) ou par précipitations successives, ainsi qu’au suivi analytique d’essais d’oxydation chimique de substrats phénoliques en solution modèle dont la composition reflète globalement celle d’un vin.
I. ETUDE ANALYTIQUE DES VINS BLANCS
L’appareil d’électrophorèse capillaire uti li sé es t l e P /AC E S ys tem 21 00 Beckman. Les analyses sont réalisées avec un capillaire de silice (87 cm x 7 5 m I. D .), à 2 5 °C. La ten sion appliquée est de 30 kV. Le tampon de séparation est une solution aqueuse d’a ci de bor iq ue (5 0 mM ), de dodécylsulfate de sodium (50 m M ) , add it io nné e de 1 0 % vo l.
d’acétonitrile et ajustée à pH = 9 par addition de soude (N). L’injection des échantillons est réalisée par pression pendant 15 secondes.
L’analyse de plusieurs vins blancs liq uo reu x et se cs a pe rm is de m e t t r e e n é v i d e n c e u n p r o f i l électrophorétique particulier pour chaque type de vin (Figure 1 1 ) . P o u r d e s t e m p s d e m i g r a t i o n inf ér ieu rs à 14 mi nut es, l e p ro fil élec trop hor étiq ue d’un vi n bl anc liquoreux diffère de celui d’un vin bla nc se c, e ss ent ie lle me nt p ar la présence d’un pic [1] absent dans les vi ns b lan cs s ec s. A u de là de 14 m in ute s, o n r em arq ue une similitude des profils électro- phorétiques notamment au niveau la der ni ère f ra cti on [ 2] à c ara ctè re hydrophobe marqué.
Après oxydation chimique du vin blanc sec, aucune modification du pro fi l él ec tro ph oré ti que n’e st obs er vée . S eu les le s p rop or tio ns r el at ive s de ch acu n de s pi cs éle ct rop ho rét iq ue s v ar ien t et on
obs er ve e ss ent ie lle me nt u ne augmentation maximale de la dernière fra ct ion à ca rac tè re hyd ro pho be mar qu é. Au del à d ’u ne c er tai ne concentration, que l’on peut qualifier de « c r i t i q u e », l’augmentation de ce caractère hydrophobe peut inhiber tou te s olv at ati on d es mo lé cul es con ce rné es et e nt raî ne r le ur précipitation. Un tel comportement peu t ex pl iqu er l e phé no mèn e de
F i g u r e 11. Profils électrophorétiques de vins blancs secs et liquoreux (280 nm)
précipitation parfois observé au cours de l a dé gra da tio n de l a ma ti ère col or ant e de s vi ns bl ancs se cs oxydés.L’application de l’Electro- phorèse Capillaire Micellaire Haute Performance à l’analyse directe des vin s bl an cs p erm et d e re po uss er les limites rencontrées en Chroma- tographie Liquide Haute Performance.
Que l qu e s oi t l ’é tat d ’ox yd ati on d’un vin blanc, l’élution des composés est totale. Cette technique a permis de m et tre en é vi den ce un p rof il car ac tér is tiq ue d e ch aq ue ty pe de v in e t mon tre que l ’oxyd ation d’u n vin bl anc s ec se tra dui t par un e a ugm en tat io n de la co nc e n- tr a t i on d e s s u bs t a n ce s l e s p lu s h y d r o p h o b e s .
II. ETUDE ANALYTIQUE DE FRACTIONS PHÉNOLIQUES L’é tude dir ecte d es vi ns, mi li eux
co mpl ex es, pe rm et une an al yse globale du phénomène d’oxydation des vins blancs secs et l’observation d’une différence de constitution entre vins blancs secs et vins liquoreux sans toutefois pouvoir la préciser. Il est donc indispensable d’aborder l’étude de fractions phénoliques isolées issues de ces vins et obtenues :
- so it pa r fra ct ion ne men t su r p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e ,
- soit par précipitations successives.
Ces fractionnements sont effectués sur plusieurs vins blancs secs avant et ap rès leu r ox yda ti on (V BS NO et VB SO) a in si qu e des v in s b la ncs liquoreux (VBL) d’origines diverses.
Pour chaque vin témoin et ses fractions, une lecture de la densité optique à 420 nm est effectuée et permet de déterminer la contribution de chaque fraction à la couleur des vins.
Chaque vin a fait l’objet d’une analyse pa r Ele ct rop ho rès e Ca pil la ire Micellaire servant de référence pour suivre, par cette même technique, les différentes étapes des fractionnements envisagés. Les conditions opératoires sont identi ques à cel les mi ses en œuvre lors de l’analyse directe des vins (voir § I, page 9 ) .
II. 1. FRACTIONNEMENT SUR POLYVINYLPYRROLIDONE (PVP)
Le fractionnement des vins blancs sur ré sin e de PVP per me t de f ix er la totalité de leur contenu phénolique et de leur matière colorante.
Un lavage de la résine par l’eau distillée permet d’éliminer les sels, les sucres, les acides organiques et les composés azotés dans une fraction dite non phénolique, notée FNP. Les composés phénoliques sont alors désorbés successivement en deux fractions notées respectivement FP1 et FP2.
Quel que soit le type de vin étudié, la fr act io n ph én oli qu e (F P1 + F P 2 ) re pré se nte pl us d e 5 0 % d e l eu r mati ère colo rante (F igure 12) . La contribution de la fraction FP2 est to uj our s ma jor it air e. E lle s em ble favorisée par le développement de la po urr it ure n obl e p ui squ ’e lle représente 63 % de la couleur des vins blancs liquoreux. Elle augmente après l’oxydation d’un vin blanc sec ; ceci tr adu it , a in si, un p hén om ène de po ly mér isa ti on d es com po sés phénoliques car les substances les plus retenues sur PVP (FP2) possèdent un degré de condensation plus élevé que les molécules éluées dans FP1.
La caractérisation des vins témoins et de chaque fraction par Electrophorèse Capillaire Micellaire (Figure 13) montre que FNP est toujours éluée en début d’analyse suivie respectivement de FP1 et FP2. Sachant que l’oxydation chimique d’un vin blanc sec s’accompagne d’une augmentation de la concentration des substances les plus hydrophobes (voir § I, page 9 ) correspondant ici à la fraction FP2, l’utilisation de la PVP met donc en évidence qu’il s’agit de molécules c o n d e n s é e s .
Figure 12. Contribution des fractions non phénoliques et phénoliques à la couleur des vins blancs
Le fractionnement des vins blancs sur rés in e de P VP per met de r eli er l’oxydation chimique d’un vin blanc sec décelable par un brunissement de sa cou le ur à u n ph én om ène de pol ym éri sa tio n de s sub st anc es phénoliques et à l’augmentation du caractère hydrophobe des substrats f o r m é s .
II. 2. FRACTIONNEMENT
PAR PRÉCIPITATIONS SUCCESSIVES
D eux fractions phénoliques sont obtenues par précipitations successives des vins blancs. La première fraction, notée P1 est précipitée par addition d’un excès d ’éthanol à froid. La deuxième fraction, notée P2, est précipitée par un mélange binaire méthanol/chloroforme. Le surnageant résiduel est noté S.
Dans tous les vins blancs considérés, la participation de P1 à leur couleur n’est pas significativement différente et augmente après oxydation des vins blancs secs (Figure 1 4 ) .
D’une manière générale, la fraction P2 est peu colorée (< 30%). L’oxydation chimique n’intervient pas sur cette fraction. Par contre, la contribution de P2 à la matière colorante d’un vin liquoreux est plus élevée que celle d’un vin blanc sec. Ceci constitue la différence essentielle observée entre les deu x ty pe s de v in e t pe ut s ’ e x p l i q u e r :
- so it p ar u ne conce ntrat ion plus élevée des substances précipitables par le mélange méthanol/chloroforme dans les vins blancs liquoreux, - soit par l’absence de ces mêmes substances dans les vins blancs secs ; celles-ci seraient alors caractéristiques des vins liquoreux.
La fraction S représente 66 % de la couleur des vins blancs sec et sa contribution diminue (54 %) après oxydation chimique. Dans le cas des vins liquoreux, le pourcentage de matière colorante attribué à S est faible (36 %). Malgré ces différences, le rapport r = \F (d420 ; d280) est constant quel que soit le type de vin traité (rV B S N O = 1 , 8 ; rV B S O = 1 , 9 ; rV B L = 1,7). Ceci suggère que les sub st an ces c on sti tu tiv es d e cet te fraction sont du même type mais que leurs concentrations varient selon les v i n s ; elles sont vraisemblablement sensibles à l’oxydation chimique et vis à vis de Botrytis cinerea.
Quel que soit le type de vin blanc étudié, le profil électrophorétique de F i g u r e 13. Caractérisation des fractions FNP, FP1 et FP2 par Electrophorèse Capillaire Micellaire Haute Performance (280 nm)
Figure 14. Contributions des fractions P1, P2 et S à la couleur des vins blancs
III. ESSAIS D’OXYDATION DE COMPOSÉS PHÉNOLIQUES EN SOLUTIONS MODELES
Afin d’appréhender le phénomène de brunissement de la couleur des vins blancs secs, des essais d’oxydation de substrats phénoliques en solutions modèles sont entrepris. Les différents composés étudiés sont des flavonoïdes glycosylé ou non, des acides phénols (acides benzoïques et cinnamiques) et de s f lav an -3- ol s (c at éch in e et ép ica té ch ine ). C es su bs tra ts s ont ox yd és pa r l’ oxy gè ne de l ’a ir en présence de fer ou par le peroxyde d ’ h y d r o g è n e .
D’une manière générale, le suivi de ces essais d’oxydation montre que les flavanols monomères sont plus réactifs que les acides phénols, eux-mêmes plus sensibles que les flavonoïdes.
Seuls les résultats concern ant les flavanols monomères, substances les plus réactives, sont ici abordés.
Q ue l q ue s oi t l’ a g e nt d ’o x y d a - t io n , c e s e s s a is m on t r e nt q ue l’épicatéchine est plus réactive que la c at é c h i ne et c on d u i se n t à la f or m a t io n de c om p o s és p lu s ou m oi ns jau nes p uis br uns, d ont le caractère hydrophobe augmentent au P1 est identique et caractérisé par
deux pics notés P1a et P1b dont les temps de migration avoisinant les 1 6 minutes attestent de leur caractère hydrophobe (Figure 1 5 ) .
Dans le cas d’un vin liquoreux, P2 est caractérisée par la présence d’un pic élué à 12,5 minutes [1], déjà mis en évidence lors de l’analyse directe des vins et absent des vins blancs secs. Ce pic corres pondrai t à la mi gration d’une substance spécifique des vins l i q u o r e u x .
Après fractionnement des vins par précipitations successives, les analy- ses pa r E lec trop hor èse Cap ill aire Micellaire permettent de souligner une différence de constitution entre vin bl an c s ec et v in li quo re ux ; ces derniers renferment une substance détectée à 280 nm, précipitable par le mélange méthanol/chloroforme et possédant un caractère hydrophile marqué. Son absorption à 280 nm ne préjuge en rien de sa participation à la co lora tio n de ce typ e d e v in. De plus, en Electrophorèse Capillaire Micellaire, aucun des produits isolés au cours de l’extraction de la matière colorante d’un vin blanc liquoreux ne présente le temps de migration de ce c o m p o s é .
Figure 15. Caractérisation des fractions P1, P2, et S par Electrophorèse Capillaire Micellaire Haute Performance (280 nm)
cours du temps. A terme, ces produits p r é c i p i t e n t .
Lorsque l’agent d’oxydation est l’oxygène de l’air, les spectres d’absorption UV-visible des solutions mettent en évidence l’apparition d’un maximum d’absorption vers 450 n m , traduisant l’apparition d’un chromophore. L’évolution des spectres Infra-Rouge laisse supposer la formation d’un catéchine ortho-quinonique sur son cycle B. Le suivi de ces essais par Electrophorèse Capillaire Micellaire ( F i g u r e 1 6 : exemple de l’épicatéchine) montre une dégradation totale du composé initial et l’apparition d’un massif (I à t = 8 jours puis II à t = 11 jours) dont l’intensité et le temps de migration augmentent au cours du temps ; ceci témoigne de l’augmentation du caractère hydrophobe des substrats formés.
Lor sque l’agent d’oxydation est le p e r o x y d e d ’ h y d r o g è n e , l e b r u n i s s e m e n t d e s s o l u t i o n s e s t moin s i nten se, la for mati on d ’un p r é c i p i t é e s t r e t a r d é e e t a u c u n m a x i m u m d ’ a b s o r p t i o n n ’ e s t observé dans le domaine du visible.
Le processus chimique intervenant es t d on c d if fé r en t d u pr éc é de n t.
L e s u i v i d e c e s e s s a i s p a r Electrophorèse Capillaire Micellaire ( F i g u r e 1 7 : e x e m p l e d e l ’ é p i c a t é c h i n e ) m o n t r e u n e dégradation partielle du composé i n i t i a l , l a f o r m a t i o n d ’ u n p i c m a j o r i t a i r e A d e l ’ é t h a n a l , l a
f o r m a t i o n d e p i c s p a r f a i t e m e n t résolus entre 15 et 18 minutes (B) ainsi qu’un massif (C) caractéristique de molécules hydrophobes.
La nature des subtrats formés au cours des essais d’oxydation des flavan-3-ols mon om ère s dé pen d de l’ age nt d ’ o x y d a t i o n .
• Lorsque celui-ci est l’oxygène de l’air, l’oxydation des ortho-diphénols en or tho-quino nes se mble êt re la réaction principale ; celles-ci, très réactives, se condensent rapidement pour former des structures à caractère hydrophobe marqué.
• Lorsque l’agent d’oxydation est le peroxyde d’hydrogène, l’oxydation de l’éthanol présent dans les solutions modèles en éthanal parait favorisée au dét rim ent d e c ell e des fl ava no ls, d’o ù un e m oi ndr e in ten si té du brunissement des solutions. En effet, en mi li eu ac ide , l’é th ana l fo rmé pou rr ait ré agi r a vec le s so mme ts activés d’un flavanol et intervenir en tant qu’agent de liaison entre deux unités monomères au cours d’une polymérisation. Des composés d’une telle nature ont récemment été décrits dans la littérature après préparation en solution modèle.
Dan s l es v in s, é ta nt d on né e la présence de flavanols et la formation d’éthanal au cours de leur oxydation, la coexistence des deux processus peut être envisagée.
F i g u r e 16. Profils électrophorétiques (280 nm) des solutions d’épicatéchine au cours des essais d’oxydation par l’oxygène de l’air
F i g u r e 17. Profils électrophorétiques (280 nm) des solutions d’épicatéchine au cour s des ess ais d ’oxydation p ar le peroxyde d’hydrogène
Afin d’accéder à une meilleu re connaissance de la matière colorante des vins blancs et de préciser l’origine d’une différence de coloration entre vins blancs secs et liquoreux, l’extraction des pigments directement à partir des vins et l’étude an aly- tique de leur couleur ont été successivement réalisées.
• La mise au point d’une méthode de fractionnement de la matière colorante des vins blancs alliant les chromatographies liquides basse pression et haute performance a permis d’isoler et de purifier treize des dix sept constituants majoritaires mis en évidence.
• La détermination structurale de ces substances est réalisée p ar spectroscopie d’absorption UV-visible, par Résonance Magnétique Nucléaire bidimensionnelle et par Spectrométrie de Masse. Leurs caractéristiques chromatographiques sont définies par Chromatographie Liquide Haute Performance et par Electrophorèse Capillaire Micellaire Haute Performance.
Les arguments structuraux ont permis d’identifier avec certitude six substances phénoliques contribuant à la couleur des vins blancs :
- le 3-O-rhamnosylquercétol est extrait directement du vin pour la première f o i s ; ce flavonoïde glycosylé présent en faible concentration est reconnu pour ses propriétés colorantes et antioxydantes,
- les acides caftarique et coutarique, présents dans les vins blancs liquoreux à des concentrations inférieures à celles des vins blancs secs, sont décrits par RMN bidimensionnelle ce qui, jusque là, n’avait jamais été réalisé ; les
acides p-coumarique et caféique sont également isolés et identifiés,
- l’acide -D glucosyl p- coumarique, jusqu’ici, n’avait jamais été mis en évidence dans les vins blancs.
Pour la première fois, ces substances sont caractérisées individuellement et identifiées dans les vins par Electrophorèse Capillaire Micellaire Haute Performance.
Ces résultats contribuent à une meilleure connaissance des composés colorants entrant dans la constitution phénolique des vins blancs liquoreux.
Cependant, les substances isolées existent à la fois dans les vins blancs secs et liquoreux ; il était donc difficile de préciser l’origine de la différence de coloration entre ces deux types de vins.
Aussi, une étude des vins, p ar Electrophorèse Capillaire Micellaire Haute Performance, avant et après leurs fractionnements a été entreprise, ainsi que l’oxydation de composés phénoliques en solution modèle.
• L’application de l’Electrophorèse Capillaire Micellaire à l’analyse directe des vins permet de repousser les limites rencontrées lors de la mise en œuvre de Chromatographie Liquide Haute Performance. L’élution des divers composés analysés est totale. Leur caractère hydrophobe constitue désormais le paramètre prépondérant que nous devons considérer.
Cette technique permet de différencier les vins blancs secs et liquoreux par un profil électrophorétique caractéristique et montre que l’oxydation chimique d’un vin blanc sec se traduit par une augmentation de la concentration des composés les plus hydrophobes. Il s’agit de molécules condensées mises
Conclusion
7 - O - β
en évidence par l’utilisation de la polyvinylpyrrolidone.
Une substance détectée à 280 nm, absente des vins blancs secs, est insoluble dans le mélange binaire méthanol/chloroforme et pourrait être à l’origine d’une différence de coloration des vins liquoreux ; cependant, l’état actuel de nos connaissances ne nous permet pas d’établir s’il s’agit éventuellement d’un pigment.
• Les essais d’oxydation chimique de substrats phénoliques (flavonoïdes, acides phénols, catéchine, épicatéchine) en solutions modèles par l’oxygène de l’air ou par le peroxyde d’hydrogène conduit à la formation de composés plus ou moins jaunes puis bruns, dont le caractère hydrophobe augmente au cours du temps. A terme, ces produits précipitent, rappelant ainsi les phénomènes observés au cours de l’oxydation des vins blanc secs.
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