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(1)

HAL Id: tel-00815389

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Submitted on 19 Apr 2013

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Flexibilités et hétérogéneités structurelles de

biomolécules impliquées dans la transcription inverse du virus de l’immunodéficience humaine

Thomas Gelot

To cite this version:

Thomas Gelot. Flexibilités et hétérogéneités structurelles de biomolécules impliquées dans la transcrip-

tion inverse du virus de l’immunodéficience humaine. Sciences agricoles. Université de Strasbourg,

2012. Français. �NNT : 2012STRAE018�. �tel-00815389�

(2)

Flexibilités et hétérogénéités struturelles de

biomoléules impliquées dans la Transription

Inverse du Virus de l'Immunodéiene

Humaine

Soutenue publiquementpar

Thomas GELOT

Réalisée sous ladiretion de

Stefan HAACKE etLudger WOESTE

JURY

DimitraMARKOVITSI Rapporteur externe

Jean-Pierre WOLF Rapporteur externe

Yves MELY Examinateur

Jérémy LEONARD Membre invité

Stefan HAACKE Direteur de thèse

LudgerWOESTE Direteur de thèse

Institut dephysiqueethimiedesmatériauxdeStrasbourg(IPCMS)

Départementd'optiqueultrarapideet nanophotonique

(3)
(4)

Je tiensenpremierlieu àremerierlesmembresdemon jury:DimitraMARKOVITSI,Jean-Pierre

WOLF,YvesMELYpourm'avoirfaitl'honneurdejugeretravail.

Ensuite, j'aimeraisexprimerma plusprofonde gratitudeenversStefan HAACKE. Je luisuis reon-

naissantpouravoirfaitunjour lepariqu'unpetit biologistepourraitintégrersonéquipe.C'estgrâeà

sonsoutientquej'aipuentrevoirlemondedelareherhe,etpluspartiulièrementeluidelaphysique.Il

estàl'origine,diretementetindiretement,denombreuxbouleversementsdanslamanièredeonevoir

leshoses quim'entourent.Malgréuneativitésientique inessanteet toujoursenprogression,il sait

toujourssemontrerdisponiblepourlesmembresdesonéquipe,enesens,sesqualités demanagersont

toutbonnementinroyables.Cefutunplaisiret unexempledetetoyer.

Bien entendu, toute l'équipe de BIODYN n'est pas en reste, assurément. Je souhaite évidemment

remerierJérémyLEONARD,pourl'ensembledestâhesqu'ilpeutaomplirauseindel'équipe,pourson

eaité,soninter-omplémentarité,etaussilesnombreusesremarquesinstrutivesqu'ilpeutapporter

lorsdenosréunions.J'appréietout partiulièrementladynamiquequ'ilinsueauseindel'équipe.Un

grandmeriauxthésards et post-dotorantsatuels del'équipe: ThomasROLAND,pourm'avoirfait

leadeaudesapréieuseamitié,pourm'avoirouvertlesyeuxsurtout unpandegeekeriequim'étaient

inonnusjusqu'alors,SahaMAILLOT,poursonhumeuret sagentillesse,AlexandreCHEMINALpour

soninsatiableuriosité,PatriiaTOURONTOUCEDA,avequij'aipupartagertouteslesjoiesd'undur

labeursurlamanip,et JulienNILLONpoursonaidepréieusesur lemanusrit.Je souhaiteégalement

remerier lesmembres passés del'équipe, Julien BRIAND, Nhan LECONG, DivyaSHARMA, qui ont

eulapatienedemeformerpendantmespremiersmois.

Alalistedespersonnesauxquellesj'exprimemareonnaissanes'ajoute:OlivierCREGUT,indispens-

ableàtouteunegénérationdedotorants,poursonaideetsespréieuxonseilsenoptiquenon-linéaire,

Gauthier DEKYNDT et Jean-Pierre VOLA, pour leur ontribution àl'ensemble des minutieux détails

qui font que le setup est e qu'il est, Virginie STORTZ pour sonimpliation en tant qu'ACMO et sa

prévenaneentempsderise,Estelle BRUNETTEpoursadisponibilité.

A Berlin,je souhaite bien évidemment remerier LudgarWOESTE, pourm'avoirfait l'honneurde

m'aepterauseindesonéquipe.Outrel'opportunitésientiquedediversiermesreherhes,sonéquipe

aétépourmoiunquasi-foyer.MeriàTorstenSIEBERT,pourm'avoirenadrésurleprojetNCp7,efut

unplaisirdetravailleraveunepersonned'unesigrandequalitésientique.MeriàOliverGAUSEpour

toutesadisponibilitéetsonaidesurlespetromètre,àFranzHAGEMANNpoursonextrêmegentillesse,

pourm'avoirsupportéàlafoisauseindubureauetsurlamanip,àCristinaSTANCACAPOSTA,ainsi

qu'àFrauODEHpoursonextrêmedoueur.

(5)

inroyables,souventparl'entremisedutravail,etquiparlasuitesesontrévéléesdesamisindéfetibles.Je

leursuisreonnaissantd'avoirpartagédurantesannéesdethèsemesraintes,mesespoirs,mesidées,mes

délires.MeriàJeanBESBAS,monpetitfenouil.Jetedoisbeauoup,etjesaisquetupeuxfailementen

témoigner.MeriàBertrandYUMA,pourtapersonnalitéhorsduommun.MeriàThibautBERDOT

pour nos délires si partiuliers.Meri à Alex SOLE pour ton singularisme et ton véu. Meri à Aldo

MIRABAL, pour m'avoirfait déouvrir tantde hoses de Berlin, meri àWalter NAKAEMA pour ta

bonté. Ilserait riminel d'oublier mes ollègueset amisde bureaux, membres respetueux de l'Agene

TousRisqueetdesQuatreFantastiques:YannikHINSCHBERGER,DeborahPERSUY,RafalJASIAK,

ouenoreLaureen MANGOTainsi queMarZIEGLER. Votreprésene vamemanquer, maise n'est

quepartieremise.

Cette périodedemouvementsn'auraitpaspusefairesansunsoutientinonditionneldespersonnes

quejequalieommemesraines.JeremerieArmelleNGUYEN,ThomasJEANNE,RomainBOULIER,

ChristophePIERRET,JulienREBUFFAUD,EssamSHERIF,ClémentLAIGLEpourl'honneurdevotre

inaltérable amitié.Je n'oublie pasque 'étaitpourte voir,Thomas, queje suis monté la premièrefois

surStrasbourg.

A etinstant,mespenséesvontnaturellementenversma famille.Je remeriemesparentspourtout

e qu'ils m'ont apporté, sans eux je ne serais rien. En premier lieu ma mère, qui de toute sa bonté,

prend si bien soinde nous. Je lui suis reonnaissantpoursa fore dearatère et sonamourinni. Je

remeriemonpère, emodèlepourbiendeshommes, pouravoirtentédeme transmettreune partiede

sesonnaissanes etexpérienes.Jevoussouhaitedetout monoeurdesjoursmeilleurs.

Enn,jesouhaiteremerieretdédieretravailàmafemme,Yana,quim'asibiensoutenuetsupporté,

partiulièrementen période de rédation.C'est unbonheur indesriptible departager tonexisteneau

quotidien.

(6)

1 État de l'art du projet 1

1.1 Contextebiologique . . . 2

1.1.1 LaprotéinedeNuléoapside7duvirusHIV . . . 3

1.1.1.1 StruturedelaNCp7 . . . 3

1.1.1.2 NCp7:Uneprotéinehaperonned'aidesnuléiques . . . 5

1.1.1.3 Exemple derle : Impliation deNCp7 dansletransfert de brin(+) de latransriptioninverse . . . 7

1.2 Motivationsdelathèse . . . 8

1.3 ApproheA:Dynamiquestruturellede

(-)PBS-2Ap(6,8et 10) . . . 10

1.3.1 Utilisationd'unesondeextrinsèquedeuoresene:la2Ap . . . 10

1.3.2 Lequenhingdeuoresenedela2Ap . . . 10

1.3.3 Informationspotentielles apportéesparlequenhingdeuoresene . . . 11

1.4 ApproheB:CID-LIDdeNCp7[35-50℄sousformelibreourepliée . . . 12

1.4.1 Quelletehnique? . . . 12

1.4.2 Intérêtd'unefragmentationenphasegazeuse . . . 14

1.4.3 PourquoiNCp7? . . . 14

2 Approhe A :Montageexpérimental 15 2.1 Choixdumontage . . . 16

2.1.1 Motivationgénérale . . . 16

2.1.2 Conversiondefréquenes . . . 19

2.2 Aorddephaseendiérenedefréquene . . . 20

2.2.1 Conditionsd'aorddephase . . . 20

2.2.2 Expressiondel'angled'aorddephaseentypeII . . . 23

2.3 Aeptanespetrale . . . 25

2.3.1 EaitédeonversionenDFG . . . 25

2.3.2 Eetdesdiérentsparamètresd'interationsurl'aeptanespetrale . . . 26

(7)

2.4.1 Dispersiondevitessedegroupe(GVD) . . . 28

2.4.2 Désaorddevitessedegroupe(GVM) . . . 29

2.4.3 Désaorddufrontd'impulsion(PFM). . . 31

2.5 Élémentsdumontage . . . 32

2.5.1 SoureLaser . . . 32

2.5.2 Positionnementdel'éhantillonet olletiondelauoresene . . . 34

2.6 Caratérisationdumontageexpérimental . . . 37

2.6.1 Protooleexpérimental . . . 37

2.6.2 Performanes . . . 38

2.6.3 RésultatsetDisussion . . . 39

2.7 Conlusion . . . 44

3 Approhe A :Résultats 45 3.1 Conepts . . . 46

3.1.1 Tempsdeviedeuoreseneet rendementquantique . . . 46

3.1.2 Quenhingstatiqueetquenhingdynamique . . . 47

3.1.3 Dynamiquedequenhingetinformationsstruturelles . . . 50

3.2 Préparation

&

onditionnementdeséhantillons. . . 50

3.3 Résultatspréliminaires . . . 52

3.4 Cinétiquesdequenhing . . . 55

3.5 Anisotropiedeuoresene . . . 63

3.5.1 Prinipe . . . 63

3.5.2 Mesured'anisotropierésolueentemps . . . 64

3.5.3 Traitementdesdonnées . . . 65

3.5.4 Résultats . . . 65

3.5.4.1 2Aplibre . . . 65

3.5.4.2 2Apinorporéedans

(-)PBS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

3.6

(-)PBSetglyerol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

3.7 Conlusion . . . 72

3.8 Annexeauhapitre3. . . 74

4 Approhe B 78 4.1 Matérielsetméthodes . . . 79

4.1.1 Prinipauxélémentsd'uneexpérieneenphasegazeuse . . . 79

4.1.1.1 LasoureESI . . . 79

4.1.1.2 Lespetromètredemasseentandem . . . 82

(8)

4.2 Fragmentationdespeptides . . . 90

4.3 Résultats . . . 93

4.3.1 Spetredemasse

Q 1

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

4.3.2 SpetresCIDetLIDde[(35-50)NCp7℄,

3H +

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

4.3.2.1 Régiondefaiblerapportm/z:de100à300m/z . . . 95

4.3.2.2 Régionderapportm/zentral:de300à630m/z(Fig.4.17et4.18) . . . 104

4.3.2.3 Régionderapportm/zélevé: de650à1000m/z(Fig.4.19). . . 107

4.3.3 EetduZinsurlesspetresCIDet LIDde[(35-50)NCp7℄,

3H +

. . . . . . . . . . 107

4.4 Résuméetperspetives. . . 110

5 Conlusion 116

(9)

1.1 Illustrationduyleviral . . . 3

1.2 Les8prinipalesétapesdelaTransriptionInverse . . . 4

1.3 Composition delaprotéinedeNuléoapside7 . . . 5

1.4 Struturesseondairesdestiges-boules(-)PBSet

(-)PBS . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.5 Comparaisondesstruturesde

(-)PBS:(a)sousformelibre,(b)omplexéeave(12-55) NCp7 . . . 8

1.6 MéanismesproposésparGodet&Al. [1℄ pourl'appariementdesstrutures(-)/(+)PBS . 9 1.7 Séqueneduvariantsimpledoigt deZin(35-50)NCp7:. . . 13

2.1 Courbes d'eaité de transmission des éléments liés à la détetion (a) Caméra CCD, PrinetonInstrument (modèle:Spe10,bakilluminated,ourbeverteenpointillés).(b) Réseau:JobinYvon (modèle: 51018110) . . . 21

2.2 Indies de réfration ordinaire (noir) et extraordinaire (rouge) dans un ristal de BBO (uniaxenégatif)àlatempératurede20°pour

θ

=29°. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

2.3 Dénitiondesanglesd'aorddephase. . . 24

2.4 Représentationvetorielledel'aorddephase . . . 24

2.5 Courbesd'aorddephasepourlaDFGdetypeII dansunristaldeBBOenfontionde l'angle

α

pourunfaiseauporteà800nm.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.6 Eaitédeonversionrelativepourdiérentsanglesd'aorddephaseave

λ G

=800nm,

α = 4

°et

L

=400

µ

m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.7 Eaitéde onversionrelativepourdiérentes épaisseurs deristal ave

λ G = 800

nm,

α = 4

°et

θ = 40

°. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.8 Eaitéde onversionrelativepourdiérents anglesde non-olinéaritéet àprofondeur demodulationonstanteave

λ G = 800

nm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.9 Eaité de onversion relative pour une gate à 800 ou 1300 nm et à profondeur de modulationonstante. . . 28

(10)

2.11 GVDpourquelquesmatériauxoptiquesusuels(doumentMellesGriot).. . . 29

2.12 Augmentationdeladuréed'uneimpulsionde40fsauoursdesa propagationdansdela siliepourtroislongueurd'ondediérentes. . . 29

2.13 EetdelaGVD . . . 29

2.14 Dégradationdelarésolutiontemporellesousl'eetdelaGVM . . . 30

2.15 Evolutiontemporelledesfaiseauxuoreseneetgate . . . 31

2.16 Représentationdudésaorddufrontd'impulsionengéométrienon-olinéaire. . . 31

2.17 Dispositifd'aorddesfrontsd'ondedegateetdeuoresene . . . 32

2.18 ShémaGlobaldel'expérienedeFluoreseneUltra-rapideRésolueenTempsparDown- ConversiondeFréquenes . . . 33

2.19 Caratéristiquesdel'impulsiondélivrée parleNOPA . . . 35

2.20 Positionnementdel'éhantillondansleportoir . . . 36

2.21 Alignementdespointfoauxdesparaboles. . . 37

2.22 Superposition desaratéristiquesspetralesduPPOaveelle dudispositifdeDFG. . . 38

2.23 Performanesdumontagededown-onversionrésuméesautourd'uneexpérienefaiteave du2,5Diphényloxazole. . . 40

2.24 AnalysequalitativedessignauxDFGdelauoreseneémiseparlePPO. . . 41

2.25 CinétiquesdeuoreseneduPPO,mesurées à370nm. . . 42

2.26 Résultatsobtenusàpartirdesparamètresénonésdansleparagraphe2.6 . . . 43

3.1 Formationd'unomplexenonuoresententrelela2Apetlequenheràl'étatfondamental 47 3.2 Photoexitation dela2AP:intermédiairedeFrank-Condon . . . 49

3.3 Photoexitation dela2Ap:méanismedetransfertdetrou(oxydatif) . . . 49

3.4 Photoexitation dela2AP:méanismedetransfertd'életron(réduteur). . . 49

3.5 Rappeldesdiérentsomposésbiohimiquesutilisés . . . 51

3.6 Cinétiquededélin d'anisotropiedeuoresenepourla2Ap àl'étatlibre . . . 66

3.7 Comparaisondes inétiques de délin d'anisotropiede la2AP libre et introduiteau sein de

(-)PBS,enposition6(rouge),8(bleue)et10(verte). . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

3.8 Résultatsdelamesured'anisotropierésolueentemps . . . 69

3.9 Superposition desinétiques dedélindesODNs

(-)PBS-2Ap(8, 10)etdela2Ap libre, ensolutionsdansdel'HEPEsetduglyerol . . . 70

3.10 Histogrammesdesouples(tempsdeviedeuoresene/amplitudes)dansleglyerol . . 72

3.11 Élémentsd'anisotropiefondamentale . . . 74

3.12 Représentationdel'eetdephoto-séletionparuneexitation vertialeethorizontale . . 76

(11)

4.2 Agauhe: PhotographiedelasoureESIenation.Adroite:Élémentsdelasoure. . . 81

4.3 Méanismesdeformationd'espèeshargéesparESI . . . 82

4.4 Potentielséletrostatiques

φ

utiliséspourleguidagedesionsmoléulaires: . . . 84

4.5 Diagrammedestabilitédanslesystèmedeoordonnées(a

z

,q

z

). . . . . . . . . . . . . . . 85

4.6 Diagrammedestabilitédanslesystèmedeoordonnées(a

z

,q

z

): . . . . . . . . . . . . . . 86

4.7 Diagrammedestabilitédanslesystèmedeoordonnées(a

z

,q

z

): . . . . . . . . . . . . . . 87

4.8 Présentationdumontageexpérimentaldanssaglobalité: . . . 88

4.9 Fontionnementd'unpiègeioniquemultipolaire: . . . 89

4.10 Présentationdesfragmentslesplusprobablesdusquelettepeptidique :. . . 92

4.11 Analysedelaompositiondessolutionspulvérisées: . . . 94

4.12 SpetresCIDetLIDdiérentielde((35-50)NCp7)

3+

:zoomsur larégiondefaiblem/z:. 96 4.13 Méanismeséquentieldeprodutiondel'ion129m/z,d'aprèslesétapesesquisséesdans[2℄. 99 4.14 SpetresCIDde(35-50)NCp7àdiérentesénergiesinétiques : . . . 100

4.15 Un des nombreux méanismes possibles permettant l'obtention des fragments 129, 159, 668m/z: . . . 101

4.16 Storage-sandesions129et146m/z . . . 105

4.17 SpetresCIDetLIDdiérentielde((35-50)NCp7)

3+

:zoomsurlarégionentre300et600 m/z:. . . 106

4.18 SpetresCIDet LID diérentielde ((35-50)NCp7)

3+

: zoom surla régionautour de600 m/z:. . . 108

4.19 SpetresCIDetLIDdiérentielde((35-50)NCp7)

3+

:zoomsurlarégionderapportm/z élevé: . . . 109

4.20 SpetresCID et LID diérentiel de ((35-50)NCp7+Zn)

3 +

: zoomsur la région de faible m/z:. . . 112

4.21 Histogrammedesfragmentsdérivésdutryptophane: . . . 113

4.22 Histogrammedesfragmentsdérivésdesextrémitésdusqueletteet delalysine . . . 113

4.23 SpetresCIDet LID diérentielde ((35-50)NCp7+Zn)

3+

: zoomsur larégion entre 300 et600m/z . . . 114

4.24 SpetresCIDet LIDdiérentielde((35-50)NCp7+Zn)

3+

:zoomsur larégionautour de 600m/z . . . 115

4.25 SpetresCIDetLID diérentielde((35-50)NCp7+Zn)

3+

:zoomsurlarégionderapport m/zélevé . . . 115

(12)

2.1 Présentationdesdiérentsdispositifsdespetrosopiedeuoresenerésolueentemps . 17

2.2 Polarisationsdesfaiseauxpourl'aorddephasedansunristaluniaxe. . . 23

3.1 Paramètresdeuoresenestatiqueetrésolueentempspour2Apet

(-)PBS-2Ap(6,8et 10) . . . 52

3.2 Paramètresded'anisotropieuoresenepour2-Apet

(-)PBS-2Ap(6,8et 10) . . . 53 3.3 Dynamiquesd'anisotropiepourla2AplibreetlesODN

(-)PBS-2Ap(6,8et 10) . . . 69

4.1 Spetredemasse4.11:Comparaisonentre lesmasses théoriquesetlesfragmentsassignés 95

4.2 Fragments

b, y

observés,issusdulivagedesextrémitésdupeptide . . . . . . . . . . . . . 95

4.3 FragmentsspéiquesdérivantduTryptophane . . . 95

4.4 PrinipalesvoiesdefragmentationdeTrpH

+

parCID,d'après[3℄. . . 97

4.5 Desription des anaux de dissoiation du TrpH

+

, en fontion du site de transfert de

l'életronphoto-induitparexitationdel'indoleà266nm . . . 103

(13)

2Ap 2-Aminopurine(Enanglais:2-Aminopurine),46

A Adénine(Enanglais:Adenine),49

ADN AideDésoxyriboNuléique(enanglais:desoxyribonuleiaid),1

AN AideNuléique(enanglais:Nuleiaid),5

ARN AideRiboNuléique (Enanglais:RiboNuleiAid),1

ATP AdénosineTriPhosphate,6

BBO Bétaboratedebaryum (Enanglais:Beta-bariumBOrate),20

C Cytosine(Enanglais:Cytosine),50

CCD Dispositifàtransfertdeharge(Enanglais:Charge-CoupledDevie), 17

CID Dissoiationinduiteparollision(Enanglais:CollisionInduedDissoiation),2

CPA ChirpedPulseAmpliation,90

CT Transfertdeharge(Enanglais:ChargeTransfer),10

DC Convertionversleslongueursd'ondedefaiblesénergies(Enanglais:Down-Convertion),16

DFG Générationd'unediérenedefréquenes(Enanglais:DiereneFrequenyGeneration),16

Désaorddevitessedegroup(En anglais:GroupVeloityMismath) ),28

ESI Ionisationparéletrospray(Enanglais:EletroSprayIonisation),2

ET Transfertd'életron(Enanglais:EletronTransfer),11

FWHM Largeuràmi-hauteur(Enanglais:FullWidthat HalfMaximum),27

G Guanine(Enanglais:Guanine),49

GVD Dispersiondevitessedegroupe(Enanglais:GroupVeloityDispersion), 28

HEPES Aide4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique,51

(14)

HT Transfertdetrou(En anglais: HoleTransfer),11

IR Lumièredontlalongueurd'ondesesituedansl'InfraRouge.(Ononsidèrel'InfraRougemoyen

ommeétantomprisentre1.4et3

µ

m),20

IRF Fontion deréponseinstrumentale(En anglais:InstrumentResponse Funtion),18

LID Dissoiationinduiteparlaser(En anglais:LaserInduedDissoiation),2

LUMO Orbitalemoléulairebassevaante(En anglais:LowestUnoupiedMoleularOrbitals), 48

m/z Ratiomassesurharge,79

MALDI MatrixAssistedLaserDesorption/Ionisation,2

MS/MS Spetrométriedemasseentandem,79

NCp7 ProtéinedeNuleoapside7(Enanglais:NuleoCapsidProtein 7),2

NOPA Ampliateurparamétriqueoptiquenon-olinéaire(Enanglais:NonollinearOptialParametri

Amplier),34

OD Densitéoptique(En anglais:OptialDensity),18

ODN Oligodésoxyribonuléotides(Enanglais:OligoDesoxyrioNuleotides),52

PBS SitedeLiaisondel'amore(En anglais: PrimerBindingSite),50

Phe Phénylalanine(Enanglais:Phenylalanine),7

PMT Tubephotomultipliateur(En anglais: PhotoMultiplierTube),17

PPO 2,5-Diphenyloxazol,16

Q Quenher,47

QY Rendementquantique(Enanglais:QuantumYield),48

RMN RésonaneMagnétiqueNuléaire(Enanglais:MagnetiNulearResonnane),52

RRKM ThéoriedeRieRamspergerKasselMarus,90

RT Transriptioninverse(En anglais: ReverseTransription),2

S/N Rapport SignalsurBruit(Enanglais:Signalto Noiseratio),16

T Thymine(Enanglais:Thymine),50

T

m

Températuredefusion(En anglais:MeltingTemperature),52

TCSPC TimeCorrelatedSinglePhotonCounting,11

(15)

Trp Tryptophane(Enanglais:Tryptophan),7

TrpH

+

Tryptophaneprotonné,97

UV Lumièredontlalongueurd'onde sesituedansl'UltraViolet.(Ononsidèreiiuniquementl'UV

prohe,de200à380nm),16

VIH Virusdel'ImmunodéieneHumaine(EnanglaisHumanImmunodeienyVirus),2

(16)

Lesmoléulesbiologiquesseomposentd'unassemblaged'élémentsplusoumoinsréatifshimiquement

parlant. Il est de notoriété ommune que e qui fait laspéiité de es building bloks résidedans

l'adoption de strutures seondaires et tertiaires, permettant, par exemple, l'émergene de sites atifs

pourlareonnaissaned'éventuelssubstratsd'intérêts.Aumodèlelassiquerigidedetypelé-serrure,

introduitparFisheren1894[4℄,s'estprogressivementinsinuédesvisionstenantompted'unedynamique

struturelle,ommelanotiond'ajustementinduit,soulignéeparKoshlanden1958[5℄ouparexemple

l'allostérie.Les bio-moléules sonten eet exibleset dansl'évolutionde leur onformationréside une

partiedelaspéiitéet del'eaitédelaréationhimique.

La problématiquede laexibilité desbio-moléules prend tout sonsenslorsque l'on s'intéresseaux

méanismesd'interations entre protéines et aides nuléiques.Ces derniersformenttout un pan dela

biologiemoléulairearilsonernent,parexemple,desproessusaussiimportantsquelarépliation,la

transription oule stokagedel'ADNdans lesellules, soit autantde phénomènesqui néessitentàla

fois unespéiitéde reonnaissane,une liaison,unedéstruturation, etune libérationdusubstrat,le

toutaveunparfaitminutage.S'ilestlairquelaproximitédesenzymespeutinuersurlaonformation

desoligonuléotides(ODNs)d'intérêt[6℄, laséqueneintrinsèquedeesderniersjoueégalementunrle

dans lamanière dont lesbases serontprésentées àl'environnement[7℄. Cela onernebien entendu les

nuléotides simplesbrins (ARN/ADNs) maiségalementdoubles brins. De e fait, on nepeut parfaite-

ment appréhender une interation proteine-ODN sans égalementenvisager l'étude des aratéristiques

struturales et dynamiques intrinsèques des diérents protagonistes de la réation. Parmi les outils à

disposition de l'expérimentateur, la ristallographieaux rayonsX ainsi que la spetrosopie RMN ont

longtempsétédesappareillagesdehoixpourétudierlastruturedesmoléules.Cependant,lapremière

nefournit quepeud'informationssurladynamiquedesomposésexaminés,alorsquelaseondedonne

prinipalementaèsàdesinformationsloales,maispeineàdénirdesomportementsglobaux,tellela

ourburedesODNsouleursméanismessegmentaires.

Parexibilité,nousentendonslaapaitéinhérented'unemoléuleàposséderunpaysageénergétique

onformationnelomplexe.Onpeutvouloirdèslorsétudierledegrédepopulationet /oulesinétiques

d'inter-onversionentre diérents minimumloaux.Ce genre de tâhe est onfrontée àdeux obstales

majeurs,àsavoirl'éhelletemporelledesmouvementsmoléulaires(pouvants'étendredelamilliseonde

jusqu'àladizainedepioseondes,rendantlestehniquessus-mentionnéesomplètementobsolètespour

apter les phénomènes ultraourts) ainsi que la séparation entre les propriétés dues aux interations

intermoléulaireset ellesissuesdesaratéristiquesintrinsèquesdusujetd'investigation.

Lorsque l'on peut sepermettre de travailleren phase ondensée, les spetrosopies d'absorptionet

de uoresene résolues en temps se sont avérées de fantastiques outils pour apter les dynamiques

(17)

mophore uoresent, soit naturellement présent au sein de la moléule, soit artiiellement inorporé.

Les interations entre e dernier et son environnement loal aetent la durée de vie de l'état exité

duhromophore :si lamaro-moléuleauseinduquelest implémentée lasondeuoresente estsujette

àune hétérogénéitéonformationnelle, alorsle uorophore vaexpérimenter desenvironnements loaux

diérentsqui setraduirontpardesinétiques de relaxationde typemulti-exponentielles [10℄. Résoudre

es inétiques de la manière laplus préise possible tout en attribuant les aratéristiquesdes délins

àdes données dedynamiques struturellesreprésententles enjeux prinipaux de e typed'expérienes

[11,12℄.

Lorsque l'on désireaéder uniquement auxpropriétés propresde la moléule,parfois dans un but

deprédition,alorslaspetrosopieenphasegazeuseapportevraisemblablementlesmeilleuresdonnées,

permettant une omparaison ave la théorie [13℄. Le problème du transfert de protéines ou d'aides

aminés de grandes tailles en phase gazeuse a été résolu ave l'implémentation de soures telles que

l'életrospray (ESI [14℄) ou le MALDI [15℄. La prinipale méthode d'analyse utilisée en phase gazeuse

est la fragmentation. L'ativation peut se faire par hauage vibrationnel, notamment sous la forme

de ollisionsaveun gazneutre,ou parexitation életronique, telle l'absorptiond'un photonUV. En

fontion de la longueur d'onde du faiseau, diérentes transitions sont aessibles, allant des liaisons

peptidiquesen dessousde200nm,aux életronsontenus danslesyles aromatiquesdans ledomaine

UV-visible. Des moléules plus oumoins ontraintespar desions peuvent présenter spetresde photo-

fragmentation relativement diérents. Il a été invoqué que l'augmentation de la rigidité du système

pouvait aeterlapositionetl'intersetiondessurfaesdepotentieldesdiérentsétatséletroniques,et

donlesdynamiques derelaxationauxquellessontsensiblesesméthodes[16℄.

Le travailfaisant l'objet de e manusrit met en avant l'utilisation de es deux méthodes dans un

ontextebiologiquebien préis:eluidelarétro-transriptionduVirusdel'ImmunodéieneHumaine

(VIH). Le passage d'un ARN simple brin vers un ADN viral biaténaire, prêt à être inséré dans le

génome de la ellule hte, fait intervenir des méanismes d'interations protéines-aides nuléiques à

denombreusesreprises.L'uned'elle, appeléeseond sautdebrin, néessitel'assoiation d'uneprotéine

àdoigt dezin appelée Nuleoapside 7(NCp7) du VIHave une séquene ADN de type tige-boule

nomméePrimerBindingSite(PBS).D'unoté,unenouvelleexpérienedeuoresenerésolueentemps,

enutilisantleprinipedelagénérationdefréquenediéreneDFG,aétémiseenplae.Elleestadaptée

àl'étudedeinétiques dedélin deomposésbiologiques, exitéset émettantdansl'UV,et seramiseà

ontributionpourtenter demieuxaratériser,àl'éhellesub-pioseonde,lesdynamiquesloalesdela

boule.D'unautreoté,nousutiliseronslestehniquesdeDissoiationsInduitesparCollisionsetInduites

par Laser (CID et LID)en phase gazeuse, an d'évaluer leseets quepeuvent avoirle repliement de

NCp7surlesanaux defragmentationdelamoléule.

Lepremierhapitreévoqueunrappelsurleontextebiologiquedelathèse, néessaireandemieux

(18)

entempsdetypedownonversion.Samiseenplaeayantenomptépourunebonnepartiedeetravail

dethèse,sonfontionnementseradonexpliquéendétails.Letroisièmehapitrereprendlesrésultatsde

uoresenerésolue en tempsobtenussur PBS. Enn, le quatrième traitede manièreindépendante de

l'étudedurepliementdeNCp7enphasegazeuse.Unedesriptiondétailléedumontageseraétabliedans

unpremiertemps, suivied'uneanalysedesspetresdefragmentationobtenus.

(19)

État de l'art du projet

Sommaire

1.1 Contexte biologique . . . 2

1.1.1 LaprotéinedeNuléoapside7duvirusHIV . . . 3

1.1.1.1 StruturedelaNCp7 . . . 3

1.1.1.2 NCp7:Uneprotéinehaperonned'aidesnuléiques . . . 5

1.1.1.3 Exemplederle :ImpliationdeNCp7dansletransfertdebrin(+) delatransriptioninverse. . . 7

1.2 Motivations de lathèse . . . 8

1.3 ApproheA:Dynamiquestruturellede

(-)PBS-2Ap(6, 8et10) . . . . 10

1.3.1 Utilisationd'unesondeextrinsèquedeuoresene:la2Ap . . . 10

1.3.2 Lequenhingdeuoresenedela2Ap . . . 10

1.3.3 Informationspotentiellesapportéesparlequenhingdeuoresene . . . 11

1.4 ApproheB :CID- LIDde NCp7[35-50℄sousforme libre ourepliée. . . 12

1.4.1 Quelletehnique? . . . 12

1.4.2 Intérêtd'unefragmentationenphasegazeuse . . . 14

1.4.3 PourquoiNCp7? . . . 14

(20)

Lebutdeehapitreintrodutifesttriple.Dansunpremiertemps,ils'agitd'eetueruntourd'hori-

zonrapideduontextebiologiquedelathèse.Leleteurintéresséparplusdedétailspourras'orienter

versdesouvragesderéférenesenmirobiologie[17℄,ouspéialisés envirologie[18℄.Unpointdevue

graduellementtournéverslemirosopiqueseraadopté:àpartird'unetrèsbrèvedesriptionexterne

du virus,nousnousintéresserons àuneétapepartiulière duyleviralappelétransriptioninverse

(RT, pour ensuite sefoaliser surl'interation de la protéine NCp7 ave laséquene PBS du brin

d'ADN(-)auoursduseondsaut debrindelaRT.Noustenteronsensuited'aborderlesprobléma-

tiquesrelativesautravaildethèsepournirparunedesriptionrapidedesdiérentesapprohesmises

enplae.

1.1 Contexte biologique

Le VIH-1,ouVirus del'Immunodéiene Humaine1,appartientàlalassedesRetroviridae,sous-

familledes Orthoretrovirinae, et au genredes Lentivirus. Ilpossède donune enveloppe,entourantun

feuillet protéiqueque l'onappellematrie,ellemême ontenanten sonentre uneapsideprotéique. A

l'intérieur deette dernièresesitue songénome,omposéd'ARN monoaténaire, diploïde et àpolarité

positive.Cedernierestreouvertetprotégéparenviron1500à2000unitésdeprotéinesdenuléoapside

(NCp7).Ondénilanuléoapsideommeétantl'ensembleforméparlaapsideetdugénomeviral.Elle

renferme,entreautres,desenzymesviralesindispensablesàlarépliationduvirus,ommelarétrotran-

sriptase,laprotéaseet l'integrase,ainsiquedesprotéinesetARNtd'originesellulaire.

En tantque virus, leVIH-1 abesoin d'uneellule htedont il utilise lesonstituantspourse mul-

tiplier. Lagure 1.1représente son yleviral, àsavoirles diérentsstades permettant, àpartird'une

partiule infetieuse et d'uneellulehte, d'engendrerlaprodution de nouveaux virionsmatures[19℄.

Cettestratégie impliqueàlafois lapénétrationduviriondans leytoplasmede laellule, puislasyn-

thèsed'un ADNomplémentaire(ADN) proviralàpartirdelamatried'ARNgénomique(ARNg),au

ours d'unproessusappelé Transription InverseouRétrotransription(RT). Lerétro-transritADN

proviralseraensuiteintégréauseindel'ADNellulaire.Laphasepost-intégrativeomprendàlafoisla

transriptionde l'ADNintégréen ARNm,lasynthèsede protéinesviralesparlamahinerie ellulaire,

l'assemblageet lebourgeonnementdenouvellespartiules virales.

AuoeurduyleviralsesituedonlaRT.C'estunproessusomplexe,segmentéendiérentsstades

(fFig.1.2),atalyséparuneenzymeappeléerétrotransriptase(RTase)etfailitéparlaNCp7[20℄.La

onversionde l'ARNg en ADN proviral néessite deux transferts de brins. Le ontexte biologique de

notrethèses'artiuleessentiellementautour duseond:andepermettrel'élongationomplètedubrin

d'ADN(+) et d'obtenirunADNproviralbiaténaire,lesbrins(-)et (+) doivents'hybrider auniveau

de leur séquenePBS respetive. NCp7, depar son ativitéhaperonne d'aidesnuléiques (ANs), est

(21)

senséestimulerl'hybridationdesdeuxséquenes.

Figure 1.1Illustration duyleviral

1.1.1 La protéine de Nuléoapside 7 du virus HIV

1.1.1.1 Struture de la NCp7

La NCp7 est issue de la maturation du préurseur polyprotéique Pr55 odé par le gène Gag [22℄.

Elleestomposéede55aidesaminés[23,24℄.NCp7estuneprotéinedontlesdomainesN

term

etC

term

sontfortementbasiquesetestaratériséeparlaprésenededeuxdoigtsdeZindeséquene:-Cys-X

2

-

Cys-X

4

-His-X

4

-Cys-égalementappelésmotifsCCHC(Fig.1.3).Ii,Xsignielaprésened'autresaides

aminésàl'exeptiondeeuxdéjàmentionnésdanslaséquene.Cettestruturepermetdeoordonnerde

façontétraèdriqueunatomedezin(vialesgroupementsthiolsdesystéinesetaminodel'histidine)ave

une anitéélevée (10

−13

M) [25, 26,27℄, selonunméanismeprésentantplusieursétatsintermédiaires

[28℄. La région "linker" entre lesdeux CCHC, de séqueneRAPRKKGest égalementtrès basique. De

manièreparadoxale,le linkerainsiqueles régionsN

term

et C

term

sontsupposés présenter unaratère

désordonné[29℄,alorsquelaliaisonavelezinengendreune onformationdesdoigtsbien dénie[30℄.

Linker et motifs CCHC sont très onservés au sein des NCs de diérents rétrovirus [31, 32℄. Lorsque

l'on étudie e motif en y ajoutant des mutations pontuelles, notamment en remplaçant une histidine

parune ystéine, l'anité de NCp7pourl'ARNget pourl'ARN

Lys3

t

s'en trouvegrandementdiminuée

aboutissant à la formationde partiules non infetieuses [33, 24℄. Le résidu Pro

31

au sein du"linker"

semblejouer unrle ritiquedansle rapprohementdesdeux doigts dezin[34℄. Ces derniers peuvent

sereplierdetellesortequ'unplateauhydrophobesoitgénéréàlasurfaedesdeuxdoigts,impliquantles

résidusVal

13

, Phe

16

, Thr

24

,Ala

25

pourledoigt proximal,et Trp

37

,Gln

45

et Met

46

pourledoigtdistal.

(22)

Figure1.2 Les 8prinipales étapesde laTransription Inverse-Shémaissude[21℄.

1. HybridationdelaséquenePBS(PrimerBindingSite)aveunARNt

Lys,3

d'origineellulaire.

2. AssoiationdelaRetro-Transriptasevirale(RTase)auomplexeARN/ARNetinitiationdelasynthèse

dubrin(-)del'ADN,depuislaséquene PBSjusqu'àl'extrémité5'.Lebrind'ADN(-)rétro-transrit

est appelé ADN(-) strong stop ((-)ADN-ss). Dégradation de lamatrie ARN orrespondante par la

RTase,grâeàsonativitéribonuléaseH(RNaseH).

3. Transfert du brin d'ADN néo-synthétisé vers l'extrémité 3' du génome viral, nouvel appariement à

l'ARN(+) via leur séquene R omplémentaires. Cette étape est appelée premier saut de brin, ou

transfertdubrin(-).

4. ÉlongationdubrintransféréetdégradationdelamatrieARNparlaRtase.Alandeettephase,la

matrieARNestomplètementhydrolysée,àl'exeptiond'unerégionappeléePPT,riheenpurines.

5. PPTsertd'amoreàlasynthèsedubrinADN(+),ontenantlesodons(+)U3,R,(+)U5et(+)PBS.

6. HydrolysedeL'ARNt

Lys,3

,equipermetunappariementdel'ADN(+)versl'extrémité3'del'ADN(-

)vialaomplémentaritédeleurséquenePBS.Ils'agitduseondsautdebrin,outransfertdubrin(+).

7. Lesdeuxséquenesvontensuiteêtreomplétées:de(-)PBSjusqu'à(-)U3pourlebrin(-)etde(+)PBS

jusqu'à(+)U3pourlebrin(+).

8. Le résultat nal est don la présene d'unADN biaténaire, ave à haque extrémité une séquene

répétéetypeU5-R-U3de5'vers3'pourl'ADN(-)etU3-R-U5de5'vers3'pourl'ADN(+).

(23)

Parmiesrésidus,Phe

16

etTrp

37

peuventinteragirparinterationsd'empilementavedesguanines(Gs)

[35,36℄. Unemutationdeesrésidusprovoquelaformationdepartiules viralesnoninfetieuses[37℄.

Figure1.3 Compositiondela protéine deNuléoapside 7

1.1.1.2 NCp7 :Une protéinehaperonned'aides nuléiques

NCp7 appartient à la famille des protéines à ativité haperonne. Ces dernières possèdent la par-

tiularité de permettreà des systèmes possédant des ongurationsmétastables de seréarranger pour

atteindre lesonformations thermodynamiquement lesplus favorables [38℄. De nombreuxANs,notam-

mentlesARNsdits"fontionnels",ontuneativitébiologiquequidépenddeleurongurationseondaire

voiretertiaire.En eet,dufaitdeleurstruturemonoaténaire,esdernierspeuventsestruturerspon-

tanémentparlebiais d'hybridationsintramoléulaires.Laplupart dutemps,e repliementaboutit àla

formationdeongurationsénergétiquesintermédiaires,ie,desonformationsalternativesprohesdela

struturenative,maisdénuéesdefontionbiologique.Danslanomenlaturedespaysagesénergétiques,e

sontautantdeminimaloaux,véritablespiègesénergétiques,néessitantlefranhissementd'unebarrière

inétiquepoursereplierorretement[39,40℄.Conrètement,l'ativitéhaperonned'ANssetraduitpar

laapaitédelamoléuleàselierspéiquementounonàdesstruturesd'ANs variées,àdéstruturer

les ongurationsliéesaux minima loaux énergétiques,puis àfailiter l'hybridation destrutures na-

tivementomplémentaires.

La liaison de NCp7sur les ANs peut sefaire de manièrenon-spéique ouspéique. Lapremière

est prinipalementassuréegrâe auxdomainesbasiquesde NCp7,viades liaisonséletrostatiquesave

les ANs, fortement dépendantes desonditions salines[41, 42℄. En revanhe,la seonde est prinipale-

mentpermisevialesAAsPhe

16

et Trp

37

duplateauhydrophobe.Lesmotifsdeliaisonssite spéiques

sont la plupart du temps des séquenes rihes en UG, TG au sein de strutures simple brins, oubien

rihesenGXGauseindeboulessimplebrins.[43,44,45,46,47,48℄.Danslamajoritédesas,lerésidu

Trp

37

sembleavoirunrleprépondérantens'empilantpréférentiellementavelesguaninesdesmotifs[29℄.

(24)

L'ativité de déstabilisation de NCp7 est portée par les doigts de zin de la protéine [49℄. Cette

dernière, somme toute très modeste, est reliée à lastabilité intrinsèque desANs ibles, puisque NCp7

déstruture prinipalement les séquenes ontenantdes "bulges" où des mésappariements([50, 51℄) et

relativementpeu lesétats stables.Cei àpouronséquenes unlissagedupaysageénergétique,neon-

tenantplusqu'un seulpuits depotentielaliéaurepliementoptimal.Le modèlededéstabilisation qui

sembleprévaloir atuellementest un modèlequi ne dépend pasde l'ATP. Ilsebaserait surunméan-

isme d'éhange d'entropie [52℄ entre une protéine haperonne initialement désordonnée et la moléule

ible d'ARN , struturellement ordonnée, même sous une forme non-native. La liaison entre es deux

partenaires favoriserait un éhange réiproque d'entropie aboutissant àune transition désordonnée

ordonnée pour la protéine AN haperonne, et inversement pour la moléule d'ARN. Chaque yle de

liaison/libérationdeNCp7permettraitàl'AN desedéplaerlelongdesonespaeonformationnelet

ainsides'approherdesonétatstruturelnatif.

NCp7(prinipalementvialesaidesaminésbasiquesdesaqueueN

term

)peutagrégerdemanièrenon

spéiquelesaidesaminéspréalablementdéstruturésetfavoriserleurappariement.

LaonentrationdesaidesnuléiquesestpossiblearNCp7peutérantereaementlesharges

+

portéesparlesphosphatesdesANsetainsiminimiserleurrépulsion[53℄.

L'hybridationdesséquenesomplémentairesdépenddelaonentrationdeNCp7etestoptimale

àundegréd'oupationallantde(1:15nt)à(1:7nt)[29℄.Lorsqueeratioestplusfaible,NCp7

interagit ave les ANs de manière spéique et ne présente pasd'ativité d'hybridation. Lorsque

NCp7esttrèssaturante(1:5à1:1nt),elleentoureetompateomplètementlesANs,equiles

protège etlesge.Danse as,l'appariementdebaseesttrès limité[54℄.

L'ativitéhaperoned'aidenuléiquesearatérisedonparlaformationdeomplexesnuleo-protéiques

de hautpoidsmoléulaires àforte mobilité intrinsèque.Les inétiques rapidesde liaison/libérationdes

omplexesNCp7-ANs, ainsiquelamodulationdelaonentrationdespartenairesréationnelssontau-

tantdephénomènespouvantfailiter lesinterationsnativesd'hybridation[55,56℄.

Viasonativitéhaperone,NCp7oupedenombreuxrlesauseinduyleellulaire:ellepartiipe

notammentàlaséletion,dimérisationpuisàl'enapsidation dugénomeviral,etintervientauoursde

larétrotransription àdiérentes étapes (initiationet appariementde l' ARNt

Lys,3

, premieret seond

saut de brin,n de la RTen intervenantsur la formation de l'ADN entral ap) [57℄. La multipliité

de es rles est à lafois liée à saapaité d'interagirde manière spéiqueou non ave les séquenes

d'ANs,maisaussiàlanature etdurepliementdeesdernières.Cesontdesparamètresintrinsèquement

dynamiquesquifontquelesonstantesd'anitésdeNCp7sontspéiquesduontextedanslaquelleelle

(25)

estemployée,etpeuventvarierdeplusieursdegrésd'amplitude.

1.1.1.3 Exemple de rle : Impliation de NCp7 dans le transfert de brin (+) de la tran-

sriptioninverse

Lorsduseond sautdebrindelaRT(Cf :Fig.1.2,étape6), l'hydrolyse del'amoreARNt

Lys,3

dé-

lenhe l'appariement de (-)PBS à(+)PBS. Ce dernierest stimulé par l'ativitéhaperonne de NCp7,

qui,ommenousl'avonsvupréédemment,onsistepréalablementàlierpuisdéstruturerl'AN.Ilaété

démontréquelaliaisondeNCp7surPBSestspéiqueetqueleshangementsdeonformationsinduits

parlahaperonnesontàl'origined'unmodepartiulier d'hybridationentrelesdeuxPBS.

La séquene PBS seompose de18 aides aminés et présente,sous sa forme ARN ou ADNsimple

brin une struture seondaireen forme detige-boule aompagnée d'une extension simple brinen 3'.

Latige ontient4pairesG-C, laboule est forméepar5nuléotides tandisque 4onstituentlaqueue

3' (Fig.1.4). Notre étude se foalise sur un variant de PBS appelé

(-)PBS (Fig.1.4). Ce dernier est

identiqueàl'original,sien'estl'absenedelapartie protubérante-GCCA-en3'.

Figure1.4 Strutures seondaires destiges-boules(-)PBS et

(-)PBS

In vitro, (+)PBS peut spontanément se lier à (-)PBS par l'intermédiaire de leur tiges respetives

[38℄. Simplement,NCp7peutaugmenterdeprèsde60Xlerendementd'assoiationdesdeuxséquenes

omplémentaires[58℄. Il aété montré que NCp7haperonne l'assoiationdes deux PBSau traversdes

boules,souslaformedekissing-omplexesdetypeboule-boule.NCp7possèdedeuxsitesdeliaison

sur

(-)PBS, l'unsitué en5'de laboule, dansla partiehaute dela tige,le seond loaliséau niveau

10-CGG-12(ontre 3sites pour PBS, le dernierétant justement situé sur 5'-G(15)CCA(18)-3').NCp7

interagit prinipalementave lepremierviadeuxaidesaminés desonplateauhydrophobique,àsavoir

Phe

16

et Trp

37

.LastrutureduomplexeNCp7-

(-)PBSaétérésolueparRMN[21℄,ilaétémisen

évidenequelesdeuxaidesaminéspréédemmentmentionnéss'insèrententreT6etG7,dansunestru-

tureoùG7estfortementempiléeaveTrp37.Celaauraitpouronséquenesàlafoisunretournementde

T6etG7versl'extérieurdelaboule,unétirementdeettedernière,uneaméliorationdel'aessibilitéde

(26)

laséquene8-TTC-10etunedéstabilisationdelapairedebase5C-G11àproximitédelaboule(Fig.1.5).

Figure 1.5 Comparaison desstrutures de

(-)PBS :(a) sous forme libre, (b) omplexée

ave (12-55) NCp7-Obtenues àpartird'expérienesRMN-1H[21℄.Lesnuléotidesreprésentatifsdela

boulesontolorésenvert,avemiseenvaleur(vertfoné) desbasesT6etG7. Lespairesdebasesdela

tigesontenbleu(deC3àC5etdeG11àG14)etenjaune(G1etC14).

D'unpointdevuedynamique,ononstateunerestritiondrastiquedelamobilitéloaledesbasesau

seindelaboule[1℄.Demanièreintéressante,larestritiondemobilitédelabouledansuneonformation

déstruturéeestomplètementorréléesavelaapaitédeNCp7àorienterl'appariementvialesboules

(Fig.1.6).Une mutation pontuelle de NCp7 aetantl'intégrité duplateau hydrophobique empêhera

l'appariementdesdeuxPBSSparlesboules,maisNCp7pourratoutdemêmeaélérerl'appariement,

mais de manière non spéique, via les tiges [59℄; De façon surprenante, in vivo, ela onduit à la

formationdepartiulesviralesnoninfetieuses[37℄.Labaissedel'ativitéviralen'estpasliéeàl'absene

de synthèse d'ADNviral,mais plutt àunmauvaisontrledutiming du proessusde RTau seindu

yleviral,engendréparlapertedelaspéiitédel'appariementdesdeuxPBSs.NCp7agitdonomme

unalternateurde méanismes,enempêhantlaformationde dimèresnon spéiques.La spéiitéde

l'appariementsousformed'embrassementdesboulespermetàlaRTdeseniretd'aboutiràlasynthèse

d'unADNbiaténaireviralvalide,bienintégrédansledéroulementduyleviral.

1.2 Motivations de la thèse

L'objetifdelathèseseplaelairementdansleadreexpérimentalénonédanslehapitrepréédent.

Ilestertainquel'ationdéstruturantedeNCp7etladiminutiondeladynamiquedelaboulePBSse

base avanttout sur des propriétés intrinsèquesdesdeux partiipants.En seplaçantvolontairementen

amontde l'interationNCp7-PBS, noussouhaitonsaborderlathématique del'étudede laexibilitéde

esdeuxstrutures,autraversdedeuxtehniquesd'analysedepointe.

Ces tehniquesontpourpointommununméanismesimilaired'ativation desmoléules,l'absorp-

(27)

Figure 1.6 Méanismes proposés par Godet & Al. [1℄ pour l'appariement des strutures

(-)/(+)PBS-Enl'absenedeNCp7(parourtduhaut),lesbasesazotéesrestentonnéesàl'intérieurde

labouleetnesontpasaessiblespourl'appariement.Cederniersefait probablementparl'intermédiaire

delatige,etnotammentviales bases(enrouge) exposées(parties protubérantes) àlabasedelatige.Par

sonativitéhaperonne,NCp7selieàlaboule,déstabilise lesbases, etontraint probablementlaboule

dansetteonformation,equiestàl'origine duparourtdetypeloop-loopkissing(enbas).

tiond'unphotonUV,maissediérenientparl'étudedesproessusderelaxationdesétatsexités.Elles

néessitentégalementl'utilisationdedeux uorophores.Idéalement,esdernierssontnatifs dusystème

quel'onveutperturber,onparlealorsdeuorophoresintrinsèques.Lorsqu'ilssontgreésousubstitués

danslamoléuled'intérêts,onparledeuorophoresextrinsèques.

Au seindelapremièreapprohe,nousutiliseronsunuorophoreextrinsèque,nommé2-aminopurine

(2Ap),entantquesondeloale,appliquéeenposition6,8et10delaboulede

(-)PBS.Lauoresene

de 2Apest fortementquenhéeparlesbases avoisinantes,et de e fait, lesinétiques de délins multi-

exponentielles qui en résultent doivent permettre de mieux identier les sous-états onformationnels

possibles de la boule. Appliquée à diérentes positions, les données olletées doivent permettre de

dérire globalement la exibilité de la boule. La nouveauté étant de pouvoir disposer d'un rapport

signalàbruit et d'unerésolution temporelletels que l'intégralité des omposantes de ladynamique de

uoresenepuissentêtrerésolues.

Au sein de la seonde approhe, nous utiliserons les apaités de détetion de la spetrométrie de

masse, ouplée à une méthode d'ativation par ollisions ave des atomes froids ou par absorption de

photonUVpourinterpréterlesdiérenesdefragmentationsentreNCp7libreourepliéeautourduZin.

L'étude de ette protéine en phase gazeuse ore une exellente opportunité de omprendre l'eet du

(28)

repliementsurlarépartitiondel'énergied'ativationauseind'unsquelettepeptidique, lorsqueeluiest

ontraintounon.

1.3 Approhe A : Dynamique struturelle de

(-)PBS-2Ap(6, 8

et 10)

1.3.1 Utilisation d'une sonde extrinsèque de uoresene : la 2Ap

La 2-aminopurine (2Ap) est un analogue uoresent de l'adénine (6-amino-purine). Elles dièrent

don parla position de leur amineprimaire respetive. 2Ap pourrait de e fait être qualiéede sonde

semi-extrinsèque.A l'instardesonéquivalentnaturel,ellepeutformerdeux liaisonshydrogènesave

lathymine,ets'empiledontrèsbiendansunduplexed'ADN,enperturbantpeulastrutureinitialede

edernier[60,61℄.La2Appeutêtreséletivementexitée à305nm,equiorrespondàuneabsorption

déaléeversleslongueursd'onderougesparrapportauxbasesazotéesnaturelles (260nm), etprésente

une émission entrée à370 nm. Son rendement quantique de uoresene est assez élevé (QY = 0.68

en solution) et varie en fontion son environnement prohe. Ainsi, l'inorporation de la 2Ap au sein

de duplexes d'ADN provoque une diminution de QY, selon un proessus qualié de quenhing de

uoresene.

1.3.2 Le quenhing de uoresene de la 2Ap

Les auses dee quenhing ont rapidement été attribuéesàun étatempilementde la2Ap aveses

bases voisines, e qui a permis son utilisation en tant que sonde pour étudier la dynamique de fusion

d'oligonuleotides[62℄. Alorsquela2Apseuleprésente ununiquetempsdeviedeuoresenede10ns

en solution, sondélin devient fortement hétérogène une fois inorporée dans unenvironnementoligo-

nuléotidique[63℄,hétérogénéitéattribuéeàdiversdegrésd'empilement.

Les possibilitésremarquables de la 2Apen tantque possible sonde struturelleloaleontdon en-

gendréesunnombreonséquentd'étudesayantpourbutdearatériserlesméanismesdequenhingde

uoreseneentre la2Ap et les bases avoisinantes. Étant donné l'impossibilité d'un transfert d'énergie

entre la 2Ap exitée et les autres bases, le quenhing de uoresene a été attribué à untransfert de

harge(CT).En sebasantsurlespotentielsd'oxydation desbases naturelles (G =1.29V <A=1.42

V<C=1.6V <T1.7Volt parrapportàl'életrodeàhydrogènenormal(NHE)) [64℄etdeelledela

2Ap(1.5VvsNHE),unméanismedetransfertdetroudela2Ap*verslesguaninesàpremièrementété

invoqué[65,66℄.Zewailetal.étudièrentdemanièreexhaustiveladépendaneduméanismedeCTsurla

positiondela2Apdansdiversdinuléotidesparspetrosopied'absorptionetdeuoresenetransitoire

femtoseonde(pompe-sondeetuponversion),poursuggérerunerelaxationpartransfertdetroulorsque

la2Apestenontatavedespurines(A,G),etpartransfertd'életronavedespyrimidines(C,T)[67℄.

(29)

État de l'artdu projet 1.3- ApproheA:Dynamiquestruturellede

(-)PBS-2Ap(6,8et10)

Cette assertiona peu après été en partie onrmée par des aluls théoriques TDDFT (Théoriede la

Fontionnelle de laDensité Dépendante du Temps) menés par Jean et Hall [68℄ sur des di-nuléotides

empilés sousforme B(onformation naturelle desdeux brinsd'ADN), deséquenes (5')-2Ap-X-(3')ou

(5')-X-2Ap-(3') . Lorsque X orrespond à une base pyrimidique, la transition vertialed'exitation se

fait prinipalement vers un état S

2

de répartition életronique similaire à 2Ap*. Un état sombre us- jaent S1 ave un fort aratère CT a également été mis en évidene. Le quenhing s'eetuerait de

manièredynamique,viaonversioninternerapidedeS

2

versS

1

.Enrevanhe,lorsqueX estunepurine,

lesdi-nuléotidesprésenteraientunedéloalisationéletroniquepartielle enS

0

,àl'originedetransitions d'exitationsàplusfaiblesforesd'osillateur,typiquementrenontréespourdesproessusdequenhing

statique.Enétendantleurétudeàuneonformationtypetri-nuléotides(5')-X-2Ap-X-(3'),esderniers

réarmentnalementqueesdeuxproessusontlieu simultanémentpourl'ensembledesséquenes.La

formeduCT(HTouET)dépendantdespotentielsredoxdesbasesavoisinantes[69℄.

3 ans plus tard,Wan et al. ontsuggéré l'existene d'un nouveauanal de quenhing, toujours par

transfertdehargemaisayantlieuavantrelaxationversl'étatvibrationnelleplusbasdel'étatexité.Ils

ont pourela omparélesduréesdevieultraourtes deomplexesovalentset non-ovalentsontenant

la 2Ap et divers ODN (A, G, Deazaguanine) ou du tryptophane, dans des expérienes d'absorption

transitoire ou de uoresene résolues en temps. En eet, la Up-onversion est uniquement sensible à

la relaxation de l'état exité, alors que l'absorption transitoire permet en plus de mettre en évidene

l'existene d'autres états sombres. Le fait que les inétiques déonvoluées de la fontion de réponse

instrumentale présentent à la fois une dépendane à

∆G

ainsi qu'uneintensité initiale plus faible que

la 2Ap libre est à l'originede leur onlusionsur le aratère non-équilibré dutransfert. Pournir,

notonsquelesnotionsdeCTetdequenhingstatique/dynamiqueserontabordéesplusendétailsausein

duChapitreIII.

1.3.3 Informations potentielles apportées par le quenhing de uoresene

La2Apadéjàétéutiliséepoursonderlaexibilitédelaboule

∆(−)

PBS,parmutationspontuelles

enposition6,8et10[1℄.L'étudestatiquedelauoresenearévéléeunerédutionduQYparrapport

àla2Ap libreen solutionaqueuse,signalantun quenhing dela2Ap parlesbases voisines.Ce dernier

est site-spéiqueet est plus prononé pour PBS-2Ap(10), e qui va de paire ave la proximité d'une

guanineenG11,iesupposélemeilleurquenher[21℄.L'orientationesttellequeleméanismedequenhing

s'eetue de manièretrès eae,e qui n'estpas leas enposition 6et 8,parrapport àG7. L'étude

delauoresenerésolueentemps, réaliséeparTCSPC, arévélée desinétiquesde délinhétérogènes,

signaturesdeutuationsdelaboulependantletemps deviedel'étatexité,et probablementdeCT

intervenantdansdesonformationsrestreintes.Entre80et90%del'informationn'apasétérésolue,ar

se déroulant sur une éhelle de temps inférieure à la résolution temporelle de l'appareil. Le problème

(30)

étant que e sont es populations non résolues qui ontribuent à l'information site-spéique dans la

boule. Autrement dit, on sait qu'il y a des variations loales, mais on ne sait pas ombien d'états

onformationnels évoluentsur ettedynamique ni leurs amplitudes respetives.La limite d'attribution

duphénomèned'empilementestd'ailleurstrèsoue,ommelanotiondedegrédeontraintedelaboule.

Seuleune résolutionomplètedestemps devieainsiquedesamplitudes assoiéespermettrad'avoirun

avispréisledegréde struturationdelaboule .Ilfaut égalementpourelaêtreapable dedélimiter

leseuil inétiqueaudelàduqueluntempsde vieseraattribué ommestatiqueet unautredynamique.

Ceseuilpeutêtreappréhendéenétudiantl'anisotropieloaledes2Apsauseindesboules.Godet&Al.

ontmesurédesinétiques dedélinanisotropiqueégalementhétérogènes,signesquela2Apexpérimente

diérents degrés de rotation (globale, segmentaire, loale). Notre résolution temporelle plus élevé et

notre rapport S/N devrait pouvoirnous indiquer s'il existe d'autresdynamiques orientationnellesplus

ourtesounon.Desprojetssimilaires,maissurd'autresmoléulesbiologiques,ontdéjàétémenésparles

groupesdeZewailet Xia [6, 70,71, 7, 72℄,attestantde l'utilitéet de lavaliditédetransposerleprojet

préédemmentdérit àl'éhelleultra-rapide.

1.4 Approhe B : CID - LID de NCp7 [35-50℄ sous forme libre ou

repliée

1.4.1 Quelle tehnique?

La spetrométrie de masse en tandem (MS/MS) est un outil permettant à la fois la réation, la

séletion,l'ativationet ladétetiond'ions moléulairesen phasegazeuse.Elle néessitel'utilisationde

deux analyseurs entre lesquels est disposé un piège ionique. Alors que le premier analyseur de masse

permet de ltrer l'ion parent désiré,son ativation énergétiques'eetue au sein du piège. Le résultat

dee proessus estensuite examinéparleseondanalyseur. Ledéveloppementdeette tehniques'est

eetué en parallèle à l'essor des méthodes d'ionisation dites doues omme la désorption-ionisation

laser assistéeparmatrie(MALDI)[73℄ oul'ionisation paréletrospray(ESI)[74℄,durantles années

80.

Collision Indued Dissoiation et/ou Laser Indued Dissoiation : Une fois pris au piège,

l'exitationdel'ionpréurseurpeutêtreeetuée pardiversméanismes,entre autreseneetuantdes

ollisionsaveungazneutre(CIDpourCollisionInduedDissoiation)oupardesméthodesoptiques(LID

pourLightInduedDissoiation).Ladernièreméthodeayantpouravantage,àonditionque lepeptide

dispose de strutures entrant en résonane ave la longueur d'onde du laser, d'exiter une transition

életroniqueaveune énergiequantiée,et surtoutd'induireune possiblefragmentationloalisée.

(31)

NH 2

COOH

G C

W K C G K E G H Q M K D C T

NH 2 G COOH

C W K C G

K E G H

Q M D K C

T Zn

35

40 45 50

35

40 45

50

H 2 N CH C R

OH O

R = H

H 2 C

H 2 C

H 2 C

H 2 C NH 2

H 2 C

H 2 C C OH

O

H 2 C

N NH

H 2

C H 2

C C NH 2 O

H 2

C H 2

C S CH 3

H 2 C C OH

O

Glycine Gly G

H 2

C NH

H 2

C SH Cystéine Cys

Tryptophane Trp

Lysine Lys

Acide Glutamique Glu E

Histidine His

Glutamine Gln

Méthionine Met

Acide Aspartique Asp

C

W

K

H

Q

M

D Abréviation

Xxx

Code Nom complet

Formule développée

(35-50)NCp7

(35-50)NCp7 + Zn

Figure1.7SéqueneduvariantsimpledoigtdeZin(35-50)NCp7:Représentationshéma-

tiquedelaséquenedupeptideNCp7,nueourepliéeautourduZin,grâeàlaprésenedumotifCCHC.

En bas :table résumant lanomenlatureadoptée pour les aides aminés entrant dans laomposition du

peptide.

(32)

1.4.2 Intérêt d'une fragmentation en phase gazeuse

Identier un peptide En biologie, la spetrométrie de masse est un outil sans pareil pour e qui

onernel'identiation d'un peptide inonnu. Deuxapprohesexistent: l'une qualiéede Bottom-Up,

onsisteenfragmenterleprotéinepardigestionenzymatiqueetidentierlamassedespeptidesobtenus;

alorsquel'approhetypeTop-Down utiliselesapaités pleinementdefragmentationden'importequel

spetromètredemassetandem.

Le shémadefragmentationest représentatifdelaomposition enaideaminédelamoléule,et de

efaitpeutêtreutiliséenomparaisonavedesspetresissusdebanquesdedonnéesoùgénérésin-silio

pardesalgorithmespréditifs. Ces derniers,malheureusement,onttendane àsebaseruniquementsur

la omposition m/z des spetreset négligentfortement les donnéesissues de l'intensité des pis, alors

qu'ilspeuventapporter,en supplémentde laompositionde lamoléule,desinformationsstruturelles

nonnégligeables[75℄.

Caratériser intrinsèquement un peptide : Lors d'un proessus de dissoiation, les onstantes

réationnelles traduisant la faisabilité d'une fragmentation dépendent, en plus de l'énergie interne du

système,àlafoisdel'énergieritiqued'ativationduomposémétastable,delatempératuredusystème,

ainsi que du nombre de mode normaux vibrationnels et rotationnels de la moléule [76℄. De e fait,

les expérienes en phase gazeuse permettent d'étudier des méanismes de redistribution d'énergie au

sein d'une moléule et de s'aranhir de l'eet du solvant. Ce sont autant de données expérimentales

appréiablesenmodélisationmoléulaire.

1.4.3 Pourquoi NCp7?

Si e n'est de par sa taille, qui en fait un hallenge expérimental en lui même, le variant simple

doigtdezin[35-50℄NCp7(Fig.1.7)nousest apparuommeunmodèleintéressant.Eneet,outreson

intérêtbiologique indéniable,ladiversitédeson ontenu enaide aminés,notammentbasiques,permet

amplement d'examinerleseets dedéplaement de hargesle longdu squelettepeptidique. Contenant

un seul tryptophane en position 37, [35-50℄ NCp7 peut être séletivement exitée à 266 nm par un

faiseaulaser, apportantuneénergiesupplémentaireausystème. Celapeutrévélerdenouveauxanaux

dedissoiationouontrebalanereuxissusdeCID.Enn,ontenantunseulmotifCCHC,ilestpossible

de prendre en ompte le repliement de la protéine autour du Zin sur la fragmentation du peptide.

Ainsi,parlebiaisdeemodèle,noussouhaitonsalimenterlaquestiondel'inuenedesinterationsnon

ovalentes struturantes surla relaxationdes peptides enphasegazeuse, et don, naturellement, surla

formationdesspetresdemasse.

(33)

Approhe A : Montage expérimental

Sommaire

2.1 Choix dumontage . . . 16

2.1.1 Motivationgénérale . . . 16

2.1.2 Conversiondefréquenes . . . 19

2.2 Aord dephase endiérenede fréquene. . . 20

2.2.1 Conditionsd'aorddephase . . . 20

2.2.2 Expressiondel'angled'aorddephaseentypeII . . . 23

2.3 Aeptane spetrale . . . 25

2.3.1 EaitédeonversionenDFG . . . 25

2.3.2 Eetdesdiérentsparamètresd'interationsurl'aeptanespetrale . . . 26

2.4 Fateursaetant larésolution temporelle . . . 27

2.4.1 Dispersiondevitessedegroupe(GVD) . . . 28

2.4.2 Désaorddevitessedegroupe(GVM) . . . 29

2.4.3 Désaorddufrontd'impulsion(PFM). . . 31

2.5 Élémentsdumontage . . . 32

2.5.1 SoureLaser . . . 32

2.5.2 Positionnementdel'éhantillon etolletiondelauoresene . . . 34

2.6 Caratérisation dumontageexpérimental. . . 37

2.6.1 Protooleexpérimental . . . 37

2.6.2 Performanes . . . 38

2.6.3 RésultatsetDisussion . . . 39

2.7 Conlusion . . . 44

(34)

La oneption, mise en plae et validation du montage utilisé au sein de l'approhe A (1.3) ayant

ompté pour une bonne partie de e travail de thèse, il nous est apparu justié de onsarer un

hapitre entierà sa desription. Nous présentons don un nouveauproédé de spetrosopie ultra-

rapidedeuoresenerésolue entemps,basésurlagénérationd'unediérene defréquenedetype

II (Type II DFG), permettant ainsi d'éhantillonner temporellement une uoresene moléulaire

down-onvertie (DC). Ce setup a fait l'objet d'une publiation [77℄. Il est le fruit d'une déjà

longue tradition de dispositifs expérimentaux, mais adapté au ontexte de l'étude de uorophores

biologiques. Nousdétaillerons lepointentral dumontage,àsavoirles onditions d'aorddephase

néessaires pour obtenir unetelle onversion, ainsique les diérents fateurs pouvant améliorer ou

détériorerlaformedusignal.Cedernierayantommeontrainted'êtreleplusrésolud'unpointdevu

temporeletlepluslargespetralement,toujoursdansleadredumatérielmisàdispositionauseindu

laboratoire.Puisquehaquedesignestpropreàl'équipequileonçoit,nousdétailleronssuintement

les diérentsélémentsquileomposentetleurmise enoeuvre.Enn, lesperformanes dumontage

seront exposéesdansleadred'uneétudetémoinsurle2,5-Diphenyloxazole(PPO).

2.1 Choix du montage

2.1.1 Motivation générale

Nous avons introduit, au sein du hapitre 1.3.1, la problématique reliée à l'utilisation de la 2-

Aminopurine (2Ap) en tant que sonde onformationnelle. La mise en plae de notre montage a été

motivéeparlebesoind'yrépondredelamanièrelaplusadaptéepossible.Andepouvoiraratériserle

plusnementpossibleladynamiquedequenhingdeuoresenedeomposésbiologiques,quiabsorbent

et émettent dans l'UV, l'appareil de mesure doit disposerd'une résolution temporelle sub-pioseonde

toutenprésentantunrapportsignalsurbruit(S/N)intéressant,d'unedétetionpolyhromatiquerésolue

entemps,et doits'adapterlepluspossibleauxoutilsdedétetiondéjàinstallésauseindulaboratoire.

Faeàe ahierdeshargesrelativementpréis,l'expérimentateursetrouveonfronté àunnombre

ertain de tehniques permettant derésoudre ette problématique[78℄. Toutes es tehniques reposent

surlemêmeprinipe,àsavoirperturberlemilieuparuneimpulsionultrabrève,dénissantuntemps0à

partirduquellauoreseneestformée,puisensuitedéterminerl'évolutiontemporelledelauoresene.

C'estsurettedernièreétapequelesdistintionsmajeuresapparaissent.Ilexistedesméthodesqualiées

deonventionnellespourlesquellesl'évolutiontemporelledelauoreseneestdéniepardesmoyens

partiellement optiqueset partiellementéletroniques,et d'autresméthodes qualiéesde tout optique

.Certesplusfailesàmettreenoeuvre,ledéfaut prinipaldestehniques onventionnelles estleur

résolutiontemporelle, aumieuxavoisinantquelques ps[79℄, unerésolution tropfaiblepouraratériser

pleinementlesphénomènesquinousintéressent.

Il est possible d'aner nos ritèresde hoix en prenanten ompte, au sein de haque atégorie,si

Figure

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