© Jonathan Tremblay, 2022
Des cystatines à large spectre d'action pour la lutte aux insectes herbivores ravageurs
Thèse
Jonathan Tremblay
Doctorat en biologie végétale Philosophiæ doctor (Ph. D.)
Québec, Canada
Des cystatines à large spectre d'action pour la lutte aux insectes herbivores ravageurs
Thèse de doctorat
Jonathan Tremblay
Sous la direction de :
Dominique Michaud, directeur de recherche
Charles Goulet, codirecteur de recherche
ii
Résumé
Plusieurs études ont discuté du potentiel des cystatines en protection des plantes contre les insectes phytophages nuisibles. Ces protéines s’accumulent dans les tissus végétaux soumis à l’herbivorie, où elles exercent leurs fonctions protectrices en réprimant l’activité des protéases sécrétées dans le tube digestif de l’ennemi herbivore. Lorsque retrouvées en abondance dans la plante, les cystatines montrent un effet de protection mesurable, fonction de leur efficacité à interagir avec les protéases digestives de l’insecte. Dans le cas d’une forte inhibition, un déséquilibre fonctionnel est engendré, qui provoque un blocage de la digestion des protéines et une carence nutritionnelle menant à des troubles de développement.
Un long processus coévolutif entre la plante et ses ennemis herbivores a mené toutefois à des adaptations métaboliques chez l’insecte en réponse aux inhibiteurs de protéases, qui lui permettent souvent d’éviter l’effet négatif des inhibiteurs ingérés. Pour cette raison, un grand intérêt a été porté au fil des ans à l’amélioration des qualités fonctionnelles des inhibiteurs de protéases par différentes approches du génie des protéines. Plusieurs chercheurs se sont intéressé, en particulier, au cas du doryphore de la pomme de terre (Leptinotarsa decemlineata Say), un insecte ravageur d’importance majeure dans les cultures de pommes de terre à travers le monde.
Dans l’optique d’améliorer l’efficacité des cystatines contre les protéases digestives du doryphore, ce projet de thèse avait pour objectif d’explorer le potentiel d’une nouvelle approche du génie des protéines, le ‘design par substitution de boucles’ (de l’anglais Loop Replacement Design, ou LRD), pour en générer des variants à efficacité améliorée contre les protéases digestives de l’insecte cible. Un survol de la diversité fonctionnelle des cystatines végétales répertoriées dans la banque génomique GenBank a d’abord été réalisé pour identifier des cystatines candidates à capacités inhibitrices variées, à partir desquelles devaient ensuite être puisés les éléments fonctionnels pour le design des inhibiteurs hybrides. Les éléments fonctionnels sélectionnés ont été
‘greffés’ sur une cystatine modèle à potentiel inhibiteur modéré, la cystatine de tomate SlCYS8, pour la confection des cystatines hybrides à boucles substituées. Plus spécifiquement, des tests enzymatiques en laboratoire ont permis de confirmer le potentiel de l’approche LRD pour le design de cystatines améliorées. En bref, nos résultats ont démontré une amélioration significative du potentiel inhibiteur de la cystatine SlCYS8 modifiée de manière à inclure les sous-régions fonctionnelles de cystatines à plus fort potentiel inhibiteur, ils ont démontré, à l’inverse, un coût fonctionnel mesurable dans le cas des inhibiteurs hybrides intégrant les régions fonctionnelles de cystatines moins efficaces.
Ces résultats confirmaient l’intérêt de l’approche LRD pour le développement de cystatines améliorées contre les protéases digestives d’un insecte nuisible et mettaient en relief, sur le plan biochimique, un découplage fonctionnel des différents éléments structuraux de ces protéines. À la lumière de ces conclusions et en
complément au premier volet du projet, un deuxième volet a consisté à déterminer l’influence de la partie restante, ou « charpente » (de l’anglais : scaffold), des cystatines sur leur activité inhibitrice. Pour ce faire, les éléments fonctionnels de la cystatine SlCYS8 ont été greffés aux charpentes structurales d’autres cystatines.
L’activité inhibitrice des hybrides générés a été évaluée ensuite pour déterminer si cet élément structural, qui n’est pas un élément fonctionnel à proprement parler, influençait l’activité de l’inhibiteur. En bref, nos données ont montré une influence marquée de la charpente des cystatines sur leur potentiel inhibiteur et la pertinence de considérer cet élément structural comme un « élément fonctionnel secondaire » dans toute stratégie d’ingénierie moléculaire des cystatines à des fins de phytoprotection.
En somme, ce projet de thèse aura permis d’établir le potentiel d’une approche LRD pour la production de cystatines hybrides à forte activité inhibitrice contre les protéases digestives du doryphore de la pomme de terre.
Nos travaux auront permis aussi de mettre en évidence l’influence, sur le plan fonctionnel, de la charpente protéique des cystatines, un élément structural négligé jusqu’ici dans le design de variants améliorés de ces protéines. Des travaux complémentaires seront maintenant bienvenus pour déterminer le potentiel protecteur des nouveaux hybrides exprimés in planta. Des travaux seront utiles également pour mesurer leur potentiel comme partenaires de fusions traductionnelles, une approche complémentaire aux stratégies actuelles de mutagénèse pour le design d’inhibiteurs de protéases hybrides à spectre d’action étendu.
iv
Table des matières
Résumé ... ii
Table des matières ... iv
Liste des figures ... vii
Liste des tableaux ... viii
Remerciements ... ix
Avant-propos ... x
Introduction ... 1
L’exemple de la pomme de terre et de son ennemi ravageur le doryphore de la pomme de terre ... 1
Les cystatines végétales comme outil de lutte contre le doryphore de la pomme de terre : beau en théorie mais toujours à parfaire… ... 2
Chapitre 1 REVIEW | Recombinant cystatins in plants ... 5
1.1 Résumé ... 5
1.2 Abstract ... 5
1.3 Introduction ... 6
1.4 The basic structural elements of plant cystatins ... 6
1.5 Various Cys protease targets for cystatins in plant systems ... 8
1.5.1 Cystatins as ectopic regulators of endogenous Cys proteases ... 8
1.5.1.1 Cys protease regulation in reproductive organs ... 9
1.5.1.2 Cys protease regulation in non-reproductive organs ... 10
1.5.1.3 Additional applications in planta ... 11
1.5.2 Cystatins as ectopic inhibitors of pest Cys proteases ... 13
1.5.2.1 Complex protease-inhibitor interactions in plant/pest systems ... 13
1.5.2.2 The rational improvement of plant cystatins for pest control ... 16
1.6 Conclusions and perspectives ... 17
1.7 Acknowledgements ... 18
Chapitre 2 : Hypothèses et objectifs du projet ... 19
Chapitre 3 : Harnessing the functional diversity of plant cystatins to design inhibitor variants highly active against herbivorous arthropod digestive proteases ... 22
3.1 Résumé ... 22
3.2 Abstract ... 23
3.3 Introduction ... 24
3.4 Results ... 26
3.4.1 Variable contributions of the N-terminal trunk and two inhibitory loops to the protease binding
strength of plant cystatins ... 26
3.4.2 Functional variability among plant cystatin protein family members ... 29
3.4.3 A generic scheme for plant cystatin SE substitutions ... 32
3.4.4 SE substitutions for the molecular improvement of tomato SlCYS8 ... 34
3.5 Discussion ... 38
3.6 Materials and Methods ... 40
3.6.1 Cys protease–cystatin docking simulations ... 40
3.6.2 Representative plant cystatins ... 41
3.6.3 Recombinant cystatins ... 41
3.6.4 Test proteases ... 42
3.6.5 Ki(papain) value determinations ... 42
3.6.6 Arthropod protease assays ... 42
3.7 Author Contributions ... 43
3.8 Acknowledgements ... 43
Chapitre 4 : Hidden potential of the supporting scaffold as a structural module for plant cystatin enginneering ... 44
4.1 Résumé ... 44
4.2 Abstract ... 45
4.3 Introduction ... 46
4.4 Results and discussion ... 47
4.4.1 A generic scheme for cystatin scaffold substitution ... 47
4.4.2 The inhibitory potency of SlCYS8 functional elements is scaffold-dependent ... 50
4.4.3 The scaffold is a strong determinant of plant cystatins inhibitory potency ... 53
4.5 Conclusion ... 55
4.6 Experimental procedures ... 56
4.6.1 Recombinant cystatins ... 56
4.6.2 Test proteases ... 56
4.6.3 Ki (papain) value determinations ... 56
4.6.4 Insect protease assays ... 57
4.7 Author contributions ... 57
4.8 Acknowledgements ... 57
Chapitre 5 : Discussion et perspectives ... 58
vi
5.1 À propos de l’Hypothèse 1, sur la diversité fonctionnelle des cystatines naturelles et la modularité de
leurs éléments fonctionnels ... 59
5.2 À propos de l’Hypothèse 2, sur l’influence de la charpente des cystatines sur l’activité des éléments fonctionnels ... 60
5.3 En conclusion… ... 61
5.4 Perspectives et travaux complémentaires ... 61
5.4.1 Des bioessais in vivo en complément aux tests in vitro ... 62
5.4.2 Une prise en compte de l’impact des cystatines sur le métabolisme de la plante hôte ... 62
5.4.3 Un élargissement souhaitable du spectre d’action des cystatines végétales ... 63
5.4.4 Des fusions cystatine-macrocypine pour un élargissement du spectre d’action des inhibiteurs candidats ... 63
5.4.5 Potentiel inhibiteur des fusions SlCYS8–Mcp contre la papaïne ... 64
5.4.6 Inhibition des protéases digestives du doryphore de la pomme de terre par les fusions SlCYS8::Mcp ... 65
5.4.7 Inhibition des protéases de la pomme de terre par les fusions SlCYS8–Mcp ... 67
5.5 … En conclusion, suite et fin ... 68
Bibliographie ... 69
Annexe A – Figure supplémentaire ... 84
Supplemental Fig. 3.1: Maximum likelihood phylogenetic tree for 262 plant cystatin amino acid sequences available in the NCBI protein database. Red boxes highlight the 20 ‘representative cystatins’ selected for the functional assays. ... 84
Annexe B – Tableaux supplémentaires ... 85
Supplemental Table 3.1: Interaction binding energies inferred in silico for model Cys proteases. ... 85
Interaction binding energies inferred in silico for model Cys proteases papain, human cathepsin L and L. decemlineata IntD4 interacting with N-terminal trunk, Loop 1 and Loop 2 amino acids of tomato cystatins SlCYS8 and SlCYS9, rice cystatin OsCYS1, soyean cystatin GmCYS2 and corn cystatin ZmCYS1. ... 85
Supplemental Table 3.2 : Primary sequences of recipient cystatin SlCYS8, donor cystatins StCYS5, PpCYS and CsCYS, and SlCYS8 LRD hybrids bearing one, two or three structural elements of StCYS5, PpCYS or CsCYS. See Table 3 for SE hybrids nomenclature. The N-terminal trunk and inhibitory loops of StCYS5, PpCYS and CsCYS are shown in bold. ... 88
Supplementary Table 4.1 : Amino acid sequences of the tomato SlCYS8, potato StCYS5, Physcomitrella patens PpCYS and cucumber CsCYS scaffold hybrids designed in this study. Polypeptide segments of the supporting scaffold are shown in italics. ... 90
Liste des figures
Figure 1.1: Structural models for the plant cystatin oryzacystatin. ... 7 Figure 1.2: An LRD scheme to generate functional variability in plant cystatins: A first proof-of-concept. A. ... 17 Figure 3.1: Amino acid sequence alignments highlighting the residues ... 28 Figure 3.2: Docking models for cystatins SlCYS8, SlCYS9, OsCYS1, GmCSY2 and ZmCYS1 interacting with papain ... 28 Figure 3.3: Inhibition of L. decemlineata and T. urticae of Z-Phe–Arg-MCA-hydrolyzing (cathepsin L-like) enzymes by 20 representative members of the plant cystatin protein family ... 31 Figure 3.4: A generic scheme for plant cystatin SE substitutions. ... 32 Figure 3.5: Ki (papain) values for the SlCYS8 SE hybrids, relative to the Ki (papain) value for wild-type SlCYS8. ... 35 Figure 3.6: Inhibition of L. decemlineata Z-Phe–Arg-MCA-hydrolyzing (cathepsin L-like) and Z-Arg–Arg-MCA- hydrolyzing (cathepsin B-like) enzymes by the SlCYS8 SE hybrids. ... 36 Figure 3.7: Inhibition of T. urticae Z-Phe–Arg-MCA-hydrolyzing (cathepsin L-like) enzymes by the SlCYS8 SE hybrids. ... 37 Figure 3.8: Functional variability among populations of SlCYS8 variants produced by site-directed
mutagenesis at positively selected amino acid sites ... 38 Figure 4.1: A generic scheme for plant cystatin scaffold substitution: tomato cystatin SlCYS8 as a working model. ... 49 Figure 4.2 : Selected subset of cystatin scaffold hybrids produced in this study, as visualized in Coomassie blue-stained polyacrylamide gels following GST–glutathione affinity purification ... 49 Figure 4.3: Ki (papain) values for the SlCYS8 scaffold hybrids, relative to the Ki (papain) value determined for wild- type SlCYS8 ... 51 Figure 4.4 : Inhibition of L. decemlineata Z-Phe–Arg-MCA-hydrolyzing (cathepsin L-like) and Z-Arg–Arg-MCA- hydrolyzing (cathepsin B-like) digestive proteases by the SlCYS8 scaffold hybrids. ... 52 Figure 4.5 : Inhibition of L. decemlineata Z-Phe–Arg-MCA-hydrolyzing (cathepsin L-like) and Z-Arg–Arg-MCA- hydrolyzing (cathepsin B-like) enzymes by cystatin hybrids with the functional elements of PpCYS, StCYS5 and CsCYS grafted on alternative scaffolds. ... 54 Figure 4.6 : Functional variation among finite populations of SlCYS8 hybrids bearing alternative scaffolds (scaffold hybrids) and SlCYS8 hybrids bearing the functional elements of an alternative cystatin (Tremblay et al., 2021). ... 55 Figure 5.1 : Fusions traductionnelles intégrant une cystatine (SlCYS8 ou son variant LRD S-N1) (v. Chapitre 3) et une macrocypine fongique (Mcp 1 ou Mcp4). ... 64 Figure 5.2 : Inhibition des cathepsines L (en haut) et B (en bas) du doryphore de la pomme de terre par les macrocypines Mcp1 et Mcp4, la cystatine SlCYS8 et son l’hybride LRD S-N1 utilisés seuls ou en fusion. ... 66 Figure 5.3 : Inhibition des protéases foliaires de la pomme de terre par les macrocypines Mcp1 et Mcp4, la cystatine SlCYS8 et son l’hybride LRD S-N1 utilisés seuls ou en fusion. ... 67
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Liste des tableaux
Table 1.1: Cystatin-expressing transgenic plants tolerant to abiotic stress conditions–Selected examples ... 11 Table 1.2: Accessory cystatins for recombinant protein stabilization in Nicotiana spp. leaves ... 12 Table 1.3: Cystatin-expressing transgenic plants resistant to herbivorous arthropods, root parasitic nematodes or plant microbial pathogens–Selected examples a ... 14 Table 3.1: Binding energies inferred in silico for Cys proteases papain, human cathepsin L and L. decemlineata Intestain D4 interacting with different plant cystatins1 ... 27 Table 3.2: Plant cystatins selected for the functional studies and their calculated Ki values for model Cys protease papain ... 30 Table 3.3: SlCYS8 hybrids designed for the functional assays using the N-terminal trunk and/or inhibitory loops of potato cystatin domain StCYS5, P. patens cystatin PpCYS or cucumber cystatin CsCYS ... 33 Table 4.1: Plant cystatins selected for hybrid cystatin design 1 ... 48 Table 4.2: Hybrid cystatins designed in this study, and their production rate following heterologous expression in E. coli and affinity purification using the GST gene fusion system. ... 50 Tableau 5.1 : Constantes d’inhibitions (Ki) (nM) contre la papaïne pour les cystatines SlCYS8, son variant LRD S-N1 et les macrocypines Mcp1 et Mcp4 utilisées seules et en fusion. ... 65
Remerciements
Le doctorat est comparable à l’ascension d’un haut sommet andin : il requiert force de caractère, détermination, fougue, énergie et passion. C’est un parcours semé d’embuches, où les pentes deviennent parfois glissantes par mauvais temps. Au final, le seul sentiment qui nous envahit au regard du panorama surplombant le monde nous rappelle à quel point le voyage a valu tout cet effort. Et comme dans toute ascension de taille, un doctorat ne se complète jamais seul, mais plutôt entouré de gens aussi passionnés et peut-être même un peu plus fous que nous.
Pour m’avoir invité à bras ouverts dans son laboratoire, je tiens en particulier à remercier mon directeur de thèse, Dominique Michaud, qui m’a permis de me développer à mon plein potentiel, qui m’a encouragé à dépasser mes limites et qui m’a transmis une discipline de travail qui me suivra tout au long de ma carrière professionnelle.
Merci pour la confiance que vous m’avez accordée et surtout pour la liberté scientifique que vous m’avez offerte.
Merci également à mon codirecteur de recherche, Charles Goulet, avec qui j’ai pu étendre mes connaissances grâce à ces innombrables discussions « autour de la paillasse ». Merci pour votre disponibilité à toujours répondre à mes questions et pour m’avoir permis de développer l’esprit critique qui sommeillait en moi. Merci également pour tout le support et pour les encouragements à me dépasser toujours plus.
Je souligne aussi l’implication impeccable de celle qui assure année après année le bon roulement du laboratoire, Marie-Claire Goulet, pour m’avoir soutenu, conseillé et encouragé. Merci m’avoir toujours remis dans le droit chemin « quand je m’égarais », d’avoir toujours été de si grande écoute et d’avoir contribué à mon évolution comme jeune scientifique jusqu’à aujourd’hui.
Merci à mes collègues étudiants des laboratoires Michaud et Goulet pour votre amitié tout au long de mes études graduées : Vanessa Mercure-Godin, Louis-Félix Nadeau, Blandine Bulot, Anne-Marie Maltais- Chabiague, Philippe Jutras, Stéphanie Gervais, Antoine Leuthreau, Roberto Carlos Montoya, Maxime De Ronne, Stefano Bilotta, Maxime Delisle Couture et tous ceux que j’oublie.
Finalement et non les moindres, je tiens à remercier tout particulièrement ma femme, Karen Guay, pour le gigantesque support apporté chaque fois que j’ai songé à me rediriger vers un métier professionnel et pour m’avoir soutenu dans les moments les plus rudes. Merci également à mes parents pour m’avoir motivé à poursuivre mes études et pour tous les encouragements donnés au fil de ce long périple.
Un merci inconditionnel à tous.
– Jonathan
x
Avant-propos
Ce manuscrit est constitué d’articles scientifiques publiés ou à publier dans des revues scientifiques révisées par les pairs. De manière à répondre aux exigences de la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval, les chapitres rédigés en anglais sont précédés d’un résumé en français. Afin d’en simplifier la présentation, les références bibliographiques sont regroupées à la toute fin de l’ouvrage. Les contributions des coauteurs, pour chacun des chapitres, sont décrites ici :
Chapitre 1 - Introduction: Recombinant cystatins in plants
Jonathan Tremblay, Marie-Claire Goulet & Dominique Michaud.
Cet article de synthèse, rédigé sous la supervision de mon directeur de recherche, le Prof. Michaud, a été publié en 2019 dans la revue Biochimie. Marie-Claire Goulet m’a apporté un soutien important pendant la rédaction initiale du manuscrit, de manière à livrer un résultat de la situation sur les cystatines recombinantes qui soit étoffé et complet.
Chapitre 3 – Harnessing the functional diversity of plant cystatins to design inhibitor variants highly active against herbivorous arthropod digestive proteases
Jonathan Tremblay, Marie-Claire Goulet, Juan Vorster, Charles Goulet & Dominique Michaud.
Cet article original conçu et rédigé sous la supervision du Prof. Michaud et la co-supervision du Prof. Goulet a été publié en 2021 dans le périodique FEBS Journal. Les travaux ont été réalisés en collaboration avec le Prof.
Vorster, qui s’est attardé à la caractérisation in silico des interactions moléculaires en appui aux bases théoriques du concept proposé. Pour ma part, je me suis concentré sur le design expérimental des travaux et la démonstration empirique du concept, sous les judicieux conseils et le soutien technique de notre professionnelle de recherche Marie-Claire Goulet à toutes les étapes du projet.
Chapitre 4 – Hidden potential of the supporting scaffold as a structural module for plant cystatin engineering
Jonathan Tremblay, Marie-Claire Goulet, Charles Goulet & Dominique Michaud.
Cet article original, conçu et rédigé sous la supervision du Prof. Michaud et la co-supervision du Prof. Goulet, sera soumis sous peu au périodique Proteins–Structure, Function & Bioinformatics. Je me suis concentré pour ma part sur la conception du design expérimental et la démonstration empirique du concept proposé, encore une fois sous les judicieux conseils et le soutien technique de Marie-Claire Goulet.
Introduction
Les insectes phytophages et les plantes qu’ils consomment forment une part considérable de la biodiversité mondiale (Stotz et al., 1999). En co-évolution perpétuelle, ces deux entités biotiques majeures des écosystèmes actuels ont établi au fil du temps des interactions physiques et fonctionnelles complexes qui, après des millions d’années, évoluent toujours aujourd’hui. Les plantes, attaquées sans cesse par les insectes qui s’en nourrissent, ont mis en place une multitude de barrières physiques et chimiques destinées à décourager leurs ennemis naturels de les consommer (Schuman et al., 2016). De l’autre côté, les insectes ont acquis avec le temps des caractères qui leur permettent aujourd’hui d’échapper en partie aux défenses végétales (Zhu-Salzman et al., 2015b). Cette lutte acharnée entre les plantes et les insectes, avec comme toile de fond l’impact négatif considérable des insectes nuisibles en agriculture et tous les problèmes environnementaux liés à l’usage des pesticides pour la protection des cultures contre ces organismes, s’est avérée un sujet d’étude particulièrement animé ces dernières décennies. Beaucoup de chercheurs se sont attardé notamment à l’élucidation des défenses naturelles chez les végétaux et au développement de nouvelles approches de lutte contre les insectes qui soient moins dépendantes de l’usage des pesticides de synthèse.
L’exemple de la pomme de terre et de son ennemi ravageur le doryphore de la pomme de terre
Un cas bien documenté est celui de la pomme de terre (Solanum tuberosum) et de son principal ravageur le doryphore de la pomme de terre (Leptinotarsa decemlineata Say). La pomme de terre est une culture d’importance agronomique majeure dans le monde qui contribue près du tiers de la consommation totale de légumes en Amérique du Nord (MAPAQ, 2019). La production canadienne de pommes de terre, première culture légumière au pays, totalisait près de 150 000 hectares en 2019, pour des recettes totales de 1,29 milliard de dollars (Agriculture et Agroalimentaire Canada, 2019). Au Québec seulement, 5e province productrice de pommes de terre au Canada, plus de 590 000 tonnes de pommes de terre ont été produites en 2017, pour des recettes estimées à 173 millions de dollars (MAPAQ, 2019). L’importance de cette culture pour la santé financière de l’agriculture canadienne justifie la nécessité de la protéger, en particulier contre le doryphore de la pomme de terre, son principal insecte ravageur à la ferme. La distribution géographique de cet insecte phytophage en constante progression dans le monde, couplée à une augmentation inquiétante des populations résistantes aux insecticides homologués pour la pomme de terre, accentuent l’urgence de développer de nouveaux outils de lutte pour le contrôler (Alyokhin et al., 2008; Wang et al., 2017).
2
Une approche proposée par plusieurs pour augmenter la résistance des cultures aux insectes ravageurs est l’emploi de molécules antidigestives –notamment des inhibiteurs de protéases– qui, lorsque nouvellement exprimées dans la plante, ont pour effet de compromettre l’efficacité du métabolisme digestif de l’organisme cible. Comme les insectes phytophages dépendent des protéases digestives non seulement pour l’obtention des acides aminés nécessaires à la biosynthèse des protéines mais aussi sur le plan énergétique en raison de la quantité limitée de glucides riches en énergie dans le feuillage, une accumulation accrue d’inhibiteurs de protéases dans la plante peut induire à la fois une carence en acides aminés alimentaires et une baisse générale de la qualité nutritive de la diète ingérée. Dans plusieurs cas, ces effets causent une diminution du taux de croissance de l’insecte qui mène ultimement à un allongement de son cycle vital, voire à sa mort (Benchabane et al., 2010; Macedo et al., 2014; Schlüter et al., 2010). En particulier, les protéases à cystéines représentent une cible de choix dans le cas du doryphore, qui utilise des protéases digestives de cette classe pour digérer les protéines de son hôte végétal. En pratique, l’expression hétérologue d’inhibiteurs de protéases ciblant ces enzymes a été proposée comme stratégie pour rendre la pomme de terre résistante au doryphore, impliquant plus spécifiquement l’emploi de cystatines, des inhibiteurs de protéases ayant pour cibles différentes familles de protéases à cystéines (Benchabane et al., 2010; Šmid et al., 2013; Zhu-Salzman et al., 2015b).
Les cystatines végétales comme outil de lutte contre le doryphore de la pomme de terre : beau en théorie mais toujours à parfaire…
Le potentiel des cystatines végétales pour la protection des plantes cultivées contre leurs ennemis phytophages a été abordé par de nombreux auteurs dans la littérature scientifique depuis leur découverte dans les grains de riz par Soichi Arai et son équipe au milieu des années 1980 (Abe et al., 1987; Tremblayet al., 2019). Ces inhibiteurs de protéases se sont avérés efficaces contre une variété d’arthropodes nuisibles et d’agents phytopathogènes et plusieurs études se sont attardées au cas plus spécifique du doryphore de la pomme de terre. Bien que certaines études aient rapporté des effets concluants (Rasoolizadeh et al., 2016a; Rasoolizadeh et al., 2016b), le potentiel des cystatines recombinantes contre cet insecte demeure toujours à parfaire. Comme plusieurs insectes, le doryphore a développé au cours du temps des stratégies pour contourner l’effet négatif des inhibiteurs de protéases, qui impliquent notamment la sécrétion de protéases digestives peu sensibles aux cystatines (Brunelle et al., 2004; Cingel et al., 2016; Vorster et al., 2015).
Si l’emploi de cystatines recombinantes pour la lutte au doryphore apparaît toujours prometteur en théorie, des travaux demeurent nécessaires pour augmenter leurs capacités inhibitrices contre les « protéases insensibles » de l’insecte, de manière à rendre inopérante la stratégie d’adaptation de l’insecte basée sur la sécrétion de telles enzymes. Différentes approches d’ingénierie des protéines ont été proposées pour augmenter le potentiel
inhibiteur des cystatines contre les protéases digestives des insectes herbivores, y compris celles du doryphore.
En théorie, les variants développés confèrent aux plantes modifiées pour les exprimer une capacité anti- digestive et une résistance accrues contre les organismes cibles par rapport aux cystatines naturelles (Van Wyk et al., 2016). Par exemple, des versions hybrides de la cystatine de tomate SlCYS8 produites par mutagénèse dirigée à des sites hypervariables impliqués dans l’activité inhibitrice de la protéine ont montré un effet inhibiteur accru contre les protéases digestives du doryphore de la pomme de terre (Kiggundu et al, 2006; Goulet et al., 2008). Ces cystatines mutées se sont par la suite avérées efficaces contre le même insecte pour protéger des lignées de pommes de terre transgéniques les exprimant de manière constitutive (Rasoolizadeh et al., 2016a;
Rasoolizadeh et al., 2016b). En revanche, les effets observés, bien qu’améliorés, se sont avérés relativement limités dans le temps alors que l’insecte poursuivait son cycle vital et adaptait graduellement son métabolisme digestif à l’inhibiteur exprimé (Shatov et al., données non publiées). Au stade actuel, l’amélioration des inhibiteurs de protéases (et autres protéines de défense) demeure un défi pour le contrôle de plusieurs insectes cibles et le développement d’approches nouvelles pour l’optimisation de leurs propriétés biologiques demeure pertinent.
Des développements importants ont été réalisés depuis quelques années pour le design de nouvelles protéines d’intérêt biotechnologique, basés sur de nouveaux concepts comme le ‘design protéique par substitution de boucles’ (de l’anglais : Loop Replacement Design ou LRD) (Clark et al., 2009) et, plus récemment, sur l’emploi de charpentes protéiques (ou scaffolds) à caractéristiques structurales avantageuses, incluant celles des cystatines (Tiede et al., 2014; Marcos et al., 2017; Kyle, 2018). C'est dans ce contexte que s'est déroulé le présent projet, qui avait pour objet d’explorer le potentiel de ces nouvelles approches du génie des protéines et d’évaluer le potentiel de la charpente des cystatines végétales comme élément structural à part entière pour l’amélioration de ces protéines à des fins de phytoprotection.
Le premier chapitre de cette thèse, présenté sous la forme d’un article de synthèse publié dans le périodique scientifique Biochimie, brosse un portrait de la littérature récente sur les différentes applications des cystatines recombinantes dans les plantes et les approches de génie des protéines adoptées jusqu’ici pour améliorer leurs propriétés inhibitrices (Chapitre 1). Un court chapitre est ensuite présenté, où sont énoncées les hypothèses de travail du projet et les objectifs de recherche poursuivis pour les vérifier (Chapitre 2). Les deux chapitres suivants, présentés sous la forme de manuscrits scientifiques originaux, donnent le détail des résultats obtenus en cours de projet et des approches expérimentales mises en place pour les générer. Le premier article traite du développement d’une nouvelle approche de design protéique basée sur le concept de substitutions de boucles (Chapitre 3); le second traite de l’impact de la charpente (scaffold) des cystatines végétales sur leur
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efficacité inhibitrice (Chapitre 4). Enfin, un chapitre de discussion est présenté, où sont considérés les principaux résultats obtenus à la lumière des hypothèses de travail énoncées au départ (Chapitre 5). Sont présentés aussi dans ce dernier chapitre des résultats complémentaires à ceux présentés dans le corps de la thèse, qui confirment la compatibilité de l’approche de design protéique nouvellement proposée et celle, plus classique, des fusions traductionnelles pour la confection d’inhibiteurs hybrides à fonctions inhibitrices étendues.
Chapitre 1 REVIEW | Recombinant cystatins in plants
La revue de littérature dans les pages qui suivent a été publiée sous la forme d’un article synthèse sur invitation;1 les hypothèses et objectifs spécifiques du projet sont présentés au chapitre suivant (Chapitre 2).
1.1 Résumé
Des dizaines d’études ont démontré la pertinence des cystatines végétales recombinantes pour la régulation des protéases à cystéines dans différents systèmes biologiques. Le potentiel phytoprotecteur de ces protéines de défense en phytoprotection pour le contrôle d’arthropodes phytophages et d’agents phytopathogènes nuisibles a été largement documenté ces dernières 25 années. Leur efficacité comme régulateurs des protéases endogènes dans la plante hôte a également été considérée plus récemment, notamment pour implanter de nouveaux caractères d’intérêt agronomique, ou pour générer des environnements cellulaires à activités protéolytiques réduites pour la production de protéines recombinantes dans les plantes utilisées comme bioréacteurs. Après une brève mise à jour sur la structure moléculaire des cystatines végétales, nous résumons ici les plus récentes avancées biotechnologiques basées sur l’emploi de ces protéines. Une attention particulière est aussi portée à l’amélioration rationnelle de leurs caractéristiques structurales, dans l’optique d’améliorer leurs propriétés inhibitrices ou de moduler l’étendue de leurs effets contre différentes cibles biologiques.
1.2 Abstract
Dozens of studies have assessed the practical value of plant cystatins as ectopic inhibitors of Cys proteases in biological systems. The potential of these proteins in crop protection to control herbivorous pests and pathogens has been documented extensively over the past 25 years. Their usefulness to regulate endogenous Cys proteases in planta has also been considered recently, notably to implement novel traits of agronomic relevance in crops or to generate protease activity-depleted environments in plants or plant cells used as bioreactors for recombinant proteins. After a brief update on the basic structural characteristics of plant cystatins, we summarize recent advances on the use of these proteins in plant biotechnology. Attention is also paid to the molecular improvement of their structural properties for the improvement of their protease inhibitory effects or the fine- tuning of their biological target range.
1 Tremblay J, Goulet M-C & D Michaud (2019) REVIEW | Recombinant cystatins in plants. Biochimie 166, 184–193.
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1.3 Introduction
Protease inhibitors of the cystatin protein superfamily are ubiquitous in plants, where they play several roles including the inhibition of insect digestive cathepsins upon herbivory challenge and the regulation of Cys proteases during programmed cell death, leaf senescence or storage protein mobilization in reproductive organs (Arai et al., 2002; Benchabane et al., 2010). First identified in rice seeds by Soichi Arai, Keiko Abe and co- workers in the mid 1980's (Abe et al., 1987a; Abe et al., 1987b; Kondo et al., 1990), plant cystatins have been the object of intense work over the past three decades. Recent reviews have discussed the roles of these proteins as regulators of Cys protease-dependent cellular and physiological processes in planta (Díaz-Mendoza et al., 2014; Martínez et al., 2012; Szewińska et al., 2016). Other reviews have discussed their involvement in plant defense and their possible usefulness in plant protection (Lima et al., 2015; Martinez et al., 2016). After a brief update on the basic structural elements of plant cystatins, we here summarize recent advances towards the use of these proteins in plant biotechnology. We also pay attention to the molecular engineering of their structural and functional properties for the improvement of their protease inhibitory effects or the fine tuning of their activity range in biological contexts.
1.4 The basic structural elements of plant cystatins
Plant cystatins are competitive inhibitors of papain-like C1A Cys proteases harbouring the conserved structural motifs of cystatin protein superfamily members, i.e. a Gln-X-Val-X-Gly motif in the central region (where X is any amino acid), a Pro-Trp (or Leu-Trp) dipeptide motif in the C-terminal region, and a conserved Gly residue in the N-terminal region (Benchabane et al., 2010; Turk et al., 1991). Hypervariable, positively selected amino acids are found within (or close to) these conserved motifs, that strongly influence the inhibitory efficiency of the protein towards Cys proteases (Goulet et al., 2008; Kiggundu et al., 2006; Rasoolizadeh et al., 2016) (Fig. 1.1). As inferred from X-ray crystallography and NMR spectroscopy studies, the tertiary fold of plant cystatins consists of a five [or four]-stranded antiparallel ß-sheet wrapped around a central five-turn a-helix, similar to the tertiary fold of well characterized animal superfamily members like human stefin A or chicken egg white cystatin (Cavini et al., 2013; Chu et al., 2015; Irene et al., 2012; Júnior et al., 2017; Nagata et al., 2000; Valadares et al., 2013). A number of cystatins are expressed in plants as gene duplication-derived multidomain cystatins, the multicystatins (Diop et al., 2004; Green et al., 2013; Kouzuma et al., 2000; Waldron et al., 1993; Walsh et al., 1993; Wu et al., 2000); or as bifunctional two-domain inhibitors, the so-called type-II phytocystatins, that show inhibitory activity against both C1A Cys proteases and legumain-like C13 Cys proteases (Aceituno-Valenzuela et al., 2018;
Christoff et al., 2016; Christova et al.,2006; Girard et al., 2007; Martinez et al., 2007; Wang et al., 2008). Similar to human cystatin C (Janowski et al., 2001), some plant cystatins form domain-swapped dimers in solution,
thought to regulate the concentration of active cystatin monomers in planta (Cavini et al., 2013; Prabucka et al., 2017; Valadares et al., 2013). Plant cystatins act as pseudo-substrates to form reversible complexes with target proteases and block access to protein substrates (Benchabane et al., 2010). As described for animal cystatins (Bode et al., 1988; Machleidt et al., 1989; Stubbs et al., 1990), the inhibitory activity of plant cystatins depends on three structural elements that form a tripartite wedge to enter the enzyme active site (Arai et al., 1991;
Benchabane et al., 2010). The first structural element, a hairpin loop harbouring the conserved motif Gln-X-Val- X-Gly (residues Gln-53 to Gly-57 in model plant cystatin oryzacystatin I (OC-I, or OsCYS1) (Kiggundu et al., 2006); Protein DataBank entry 1EQK (Nagata et al., 2000)), physically interacts with specific amino acid residues in the active site cleft. The second structural element, a surface hairpin loop in the C-terminal region that bears the conserved Pro (Leu)–Trp motif (Pro-83 and Trp-84 in OC-I), also establishes physical interactions in the active site cleft. The third element, referred to as the N-terminal trunk, includes the Gly residue typical of cystatins (Gly-11 in OC-I) associated in most cases with a second Gly residue to form a conserved Gly–Gly dipeptide motif. As inferred from structural and functional studies on animal cystatins (Björk et al., 1995; Machleidt et al., 1989; Turk et al., 1991), the N- terminal trunk does not penetrate the active site but actively contributes to the
Figure 1.1: Structural models for the plant cystatin oryzacystatin. A. Side view of the protein showing its five-stranded ß- sheet core, its a-helix with the conserved LARFAVDEHN motif typical of plant cystatins (Benchabane et al., 2010), and its three functional elements (in red) forming an N-terminal trunk with the conserved Gly–Gly motif, a first hairpin loop with the conserved Gln–X–Val–X–Gly motif, and a second hairpin loop with the Pro–Trp motif penetrating the target protease active site along with the 1st hairpin loop. B. Side view of the protein highlighting hypervariable, positively selected amino acid sites (as inferred from Kiggundu et al., 2006) located within or close to the conserved inhibitory motifs identified in A (in red and pointed to by the arrows). Amino acids of the cystatin physically interacting with the model Cys protease papain are Gly-5 to Gly-11 on the N-terminal trunk, Gln-53 to Tyr-60 in the 1st loop, and Trp-80 to Gln-91 in the 2nd loop. The models were constructed with modelling software Discovery Studio 2.5 (Accelrys, San Diego CA), based on the structural coordinates of oryzacystatin I (Accession No. 1EQK in Protein Data Bank; http://www.wwpdb.org) (Nagata et al., 2000).
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binding process and specificity of the protein towards Cys proteases. Additional observations supporting a functional role for the N-terminal trunk of plant cystatins are the reported involvement of this region in the formation of inactive dimers (Prabucka et al., 2017) and protease inhibitory data with single variants of model tomato cystatin SlCYS8 showing the strong influence of hypervariable amino acids around the N-terminal Gly- Gly motif on the binding range, inhibitory potency and biological effects of the protein (Rasoolizadeh et al., 2016a; Rasoolizadeh et al., 2016b; Sainsbury et al., 2012).
1.5 Various Cys protease targets for cystatins in plant systems
Growing knowledge about the roles and modes of action of cystatins in plants has led over the years to promising developments towards the use of these proteins in plant genetic improvement. Numerous studies have assessed the potential of recombinant cystatins as anti-digestive proteins to engineer pest or pathogen resistance in major crops. Other studies have assessed their potential as ectopic modulators of endogenous proteases to introduce novel traits of agronomical value, or, more recently, as accessory proteins to regulate Cys protease targets of specific biotechnological relevance.
1.5.1 Cystatins as ectopic regulators of endogenous Cys proteases
The numerical importance and complex expression patterns of cystatin-encoding DNA sequences in plant genomes (Christoff et al., 2014; Girard et al., 2007b; Tan et al., 2014; Wang et al., 2015; Zhao et al., 2014), the wide distribution of cystatin superfamily members among plant taxa and their conserved structural motifs for protease inhibition suggest a prominent role for these proteins as regulators of Cys protease activities in plants (Arai et al., 2002; Benchabane et al., 2010; Martínez et al., 2012). Cys proteases are involved in such important physiological processes as storage protein breakdown in reproductive organs, amino acid recycling during leaf senescence, programmed cell death in developing tissues and protein turnover under stress conditions (Arai et al., 2002; Benchabane et al., 2010; Díaz-Mendoza et al., 2014; Diaz-Mendoza, Velasco-Arroyo, et al., 2016;
Grudkowska et al., 2004; Müntz, 2007; Müntz et al., 2002; Schaller, 2004; Szewińska et al., 2016; Van Der Hoorn, 2008; Vorster et al., 2019). Similar to cystatins, these enzymes are encoded by large sets of genes expressed under various developmental stages or environmental conditions (Beers et al., 2004; Díaz-Mendoza et al., 2014; Goulet et al., 2012; Martínez et al., 2012). Genome analyses assessing the evolutionary pathways of cystatin- and Cys protease-encoding genes in different plant taxa in fact revealed a long co-evolutionary route for cystatins and Cys proteases that generated over time an array of structural isoforms in both groups of proteins, presumably associated with the establishment of complex functional relationships in planta (Benchabane et al., 2010; Martínez et al., 2012; Martinez et al., 2008).
1.5.1.1 Cys protease regulation in reproductive organs
From a biochemical standpoint, the physiological effects of Cys proteases are determined in vivo by the stoichiometric balance between these enzymes and their cystatin interactors. An example of this is the NtCYS cystatin/NtCP14 protease bipartite module in tobacco seeds, shown to control programmed cell death and apoptotic events leading to embryo suspensor disintegration during germination (Choi, 2013; Zhao et al., 2013).
A third, often described example is the key impact of cystatin/Cys protease ratios in regulating the deposition, maintenance and breakdown of storage proteins in seeds and vegetative reproductive organs (Benchabane et al., 2010; Szewińska et al., 2016). A model was proposed earlier to describe the fate of these proteins in planta, based on changing cystatin/Cys protease ratios during the whole lifespan of reproductive organs (Benchabane et al., 2010). Cystatins are actively synthesized in developing storage tissues, where they readily outnumber Cys proteases to promote protein deposition and storage during dormancy (Arai et al., 2002; Benchabane et al., 2010; Szewińska et al., 2016). At germination, Cys protease-encoding genes are strongly induced, and cystatin- encoding genes strongly repressed, to decrease the overall cystatin/Cys protease ratio and facilitate storage protein mobilization for a quick release of amino acids essential to plantlet growth before emergence (Arai et al., 2002; Szewińska et al., 2016). The practical feasibility of modulating the germination rate of storage organs by ectopic regulation of cystatin/Cys protease ratios was suggested with transgenic lines of Arabidopsis overexpressing AtCYS6, a seed cystatin naturally expressed in growing seeds (Hwang et al., 2009). In line with the repressive effect of cystatins on seed germination, transgenic seeds constitutively expressing the cystatin germinated later than the seeds of a non-transgenic control line, in sharp contrast with the seeds of a T-DNA insertional mutant for AtCYS6 exhibiting high Cys protease activity and early germination compared to control seeds. A similar phenomenon was observed with BrCYS1, a cystatin naturally produced in growing seeds of Chinese cabbage, when expressed in transgenic Arabidopsis seeds under the control of a constitutive gene promoter (Hong et al., 2007). Similarly, the constitutive expression of cereal cystatins oryzacystatin I and corn cystatin II in potato prevented sprouting and nutrient loss in tubers stored in the cold for several months, via a downregulating effect on overall Cys protease activity in flesh tissue and a concomitant stabilizing effect on resident proteins including the highly abundant storage protein patatin (Munger et al., 2015). These findings, together with empirical data showing altered protein loads and germination rates in transgenic seeds engineered to under- or overexpress endogenous Cys proteases (Diaz-Mendoza et al., 2016), pointed overall to the relevance of these enzymes as targets for germination control in storage organs and to the biotechnological value of plant cystatins as ectopic regulators towards this goal.
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1.5.1.2. Cys protease regulation in non-reproductive organs
Numerous studies have also described the potential of plant cystatins as protective agents under adverse environmental conditions. Cystatin isoforms are upregulated in plants submitted to abiotic stress cues (e.g.
Ahmad et al., 2015; Chojnacka et al., 2015; Raimbault et al., 2013), in accordance with the presence of abiotic stress-responsive cis elements in the promoter sequence of several cystatin genes (Je et al., 2014; Zhang et al., 2008). Little is still known about the endogenous protease targets of cystatins and the mechanisms that underlie their protective effects under adverse conditions, but recent studies assessing the phenotype of plants engineered to express recombinant cystatins suggest a stress metabolism-inducing effect for these proteins.
For instance, corn cystatin II expression in transgenic potato induced the expression of stress-related proteins in leaves, including secretory peroxidases, serine/aspartic protease inhibitors and pathogenesis-related proteins, that are normally induced under abiotic or biotic stress conditions (Munger et al., 2012). Similarly, expression of barley cystatin HvCPI-2 in tomato induced the accumulation of wound-inducible proteinase inhibitor 2 in leaf tissue, glandular trichome development and measurable changes in the overall profile of leaf volatiles (Hamza et al., 2018). Other recent examples are the overexpression of antioxidative enzymes such as catalase, ascorbate peroxidase and glutathione S-transferase in Arabidopsis expressing apple cystatin MpCYS4 (Tan et al., 2017) and the downregulation of photosynthesis-related genes in barley leaves overexpressing barley cystatin HvCPI-6 (Santamaria et al., 2018) as often observed in leaves in reaction to stress cues (Bilgin et al., 2010; Zhong et al., 2019). The protective effects attributed to stress-inducible cystatins and the upregulating effect of recombinant cystatins on the expression of stress-related proteins in leaves likely explain the improved performance of plants transformed with cystatin-encoding DNA sequences under adverse conditions (Table 1.1). Increased tolerance to oxidative stress in transgenic Arabidopsis constitutively expressing apple cystatin MpCYS2 (Tan et al., 2015) or endogenous cystatin AtCYSa (Zhang et al., 2008) could for instance be explained by an elevated expression of antioxidative enzymes in leaf tissue as observed in transgenic Arabidopsis lines expressing apple cystatin MpCYS4 (Tan et al., 2017).
Similarly, overexpression of pathogenesis-related proteins, including fungal cell wall-degrading ß-glucanases and chitinases, in potato leaves expressing corn cystatin II could have contributed to the resistance of these plants to the necrotrophic fungus Botrytis cinerea (Munger et al., 2012). Further deciphering the pleiotropic effects of recombinant cystatins and their positive impact on host plant performance under adverse conditions could prove instrumental in coming years to harness the full potential of these proteins in crop protection.
Improved knowledge on Cys protease- and cystatin-mediated physiological processes could also open new avenues for recombinant cystatins, as for instance suggested by the positive impact of oryzacystatin I on
nodulation and tolerance to nitrogen deficiency in soybean lines engineered to express this inhibitor (Kunert et al., 2015; Quain et al., 2015).
Table 1.1: Cystatin-expressing transgenic plants tolerant to abiotic stress conditions–Selected examples
Plant Stress condition Recombinant cystatin References
Arabidopsis thaliana Alkali Soybean GsCPI-14 Sun et al., 2014
Chilling Arabidopsis AtCYSa and AtCYSb Zhang et al., 2008
Drought AtCYSa, AtCYSb Zhang et al., 2008
Apple MpCYS2 Tan et al., 2015
Apple MpCYS4 Tan et al., 2017
Oryzacystatin I (OC-I) Quain et al., 2014
Heat shock Oryzacystatin II (OC-II) Je et al., 2014
Oxidation AtCYSa, AtCYSb Zhang et al., 2008
MpCYS2 Tan et al., 2015
Salt / Osmotic stress AtCYSa, AtCYSb Zhang et al., 2008
Apple MpCYS5 Tan et al., 2016
Glycine max (soybean) Drought OC-I Quain et al., 2014
Malus prunifolia (apple) Drought MpCYS4 Tan et al., 2017
Senescence (stress-induced) MpCYS4 Tan et al., 2017
Nicotiana benthamiana Salt / Osmotic stress Taro CeCYS Chen et al., 2014
Nicotiana tabacum (tobacco) Chilling OC-I Prins et al., 2008
Van der Vyver et al., 2003
1.5.1.3 Additional applications in planta
Recombinant cystatins have been used in recent years as accessory proteins for alternative applications of practical or experimental relevance. A peanut cystatin was used in tobacco seeds to restore fertility in Cys protease-induced male sterile plants, as an eventual eukaryotic replacement to the widely used barnase-barstar bacterial gene system for hybrid seed production (Shukla et al., 2016). Inactive variants of tomato cystatin SlCYS8 were used to design protein fusions useful in comparing the stability of different linker peptides in heterologous cellular environments (Jutras et al., 2018). A poly-His-tagged version of the same cystatin was designed and used as a stabilizing, easy-to-purify fusion partner to proteins produced in heterologous expression systems (Sainsbury et al., 2016). Different plant cystatins were used as ‘molecular baits’ for resident Cys proteases in plant protein expression hosts, useful in protecting the structural integrity of recombinant proteins (Robert et al., 2016).
Plants are attractive hosts for the production of clinically-useful proteins (Lomonossoff et al., 2016; Sack et al., 2015), but a relatively low protein content and the abundance of poorly-specific proteases in most of their tissues have been a constraint to their wide-scale adoption by both the protein research community and the recombinant proteinré industry (Mandal et al., 2016; Pillay et al., 2014). Whereas several proteins accumulate at satisfactory
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levels in plant cell environments, several others undergo partial or complete hydrolysis that directly affects their structural integrity and final yield (Benchabane et al., 2008; Mandal et al., 2016; Pillay et al., 2014). A well- described example is the proteolytic processing of mammalian IgG antibodies in plant cell Golgi vesicles, that generates antibody fragments along with the expected full size antibodies of commercial value (De Muynck et al., 2010; Gomord et al., 2004). Another example is the partial trimming of two clinically-useful proteins, bovine aprotinin and human a1-antichymotrypsin, in leaf cells early after their transfer into the ER or later downstream along the secretory pathway (Badri et al., 2009; Benchabane et al., 2009). Different strategies have been proposed to minimize the unintended proteolysis of recombinant proteins in plant systems, involving for instance their targeting to alternative subcellular compartments with sorting peptides or the deletion of protease- susceptible sites by site-directed mutagenesis (Benchabane et al., 2008; Faye et al., 2005; Zischewski et al., 2016). Host cell engineering approaches have also been proposed, to implement protease activity-depleted environments much more compatible with maturing, often unstable recombinant proteins (Goulet et al., 2012).
One approach along this line consists of silencing the expression of host protease isoforms using DNA antisense or RNAi sequences (Duwadi et al., 2015; Kim et al., 2008; Mandal et al., 2014). Another approach consists of expressing an accessory, ‘companion’ protease inhibitor together with the protein of interest to inhibit functionally-related host resident proteases (Benchabane et al., 2008; Mandal et al., 2016; Robert et al., 2016), either in planta during protein expression (Goulet et al., 2012) or ex planta upon protein recovery from source tissue (Benchabane et al., 2009; Komarnytsky et al., 2006; Rivard et al., 2006). Cystatins have been used towards this end in recent years, notably allowing for the stabilization of mammalian IgG in leaves of the widely used expression host Nicotiana benthamiana (Table 1.2).
Table 1.2: Accessory cystatins for recombinant protein stabilization in Nicotiana spp. leaves
Expression host Accessory cystatin Recombinant protein References N. benthamiana 1 SlCYS9 (tomato) Blood-typing IgG antibody C5-1 Goulet et al., 2012
SlCYS8 (tomato) Blood-typing IgG antibody C5-1 Robert et al., 2016, 2013 Human a1-antichymotrypsin Sainsbury et al., 2013 Tumor-targeting IgG antibody H10 Jutras et al., 2016
Bovine aprotinin Robert et al., 2016
HIV-neutralizing antibody VRC01 Grosse-Holz et al., 2018 Human erythropoietin
Lysosomal a-galactosidase
N. tabacum 2 Oryzacystatin I (rice) Glutathione reductase from E. coli Pillay et al., 2012
1 Transient expression in non-transgenic host.
2 Transient expression in stably-transformed tobacco line (Pillay et al., 2012).
1.5.2 Cystatins as ectopic inhibitors of pest Cys proteases
Recombinant cystatins have been considered over the years not only to modulate Cys protease activities in planta, but also –and mostly- to target the digestive Cys proteases of herbivorous pests and pathogens ex planta (Benchabane et al., 2010; Lima et al., 2015; Martinez et al., 2016). Hilder et al., in 1987 (Hilder et al., 1987), and Johnson et al. two years later (Johnson et al., 1989), had already confirmed in the 1980's the potential of Ser protease inhibitor-encoding DNA sequences to introduce insect resistance in plant crops. Dozens of reports testing the approach with different inhibitors have then been produced since the publication of these two seminal papers, and the implementation of trypsin inhibitor-expressing crops in agricultural systems has been documented recently (Chen et al., 2011; Li et al., 2016). As of today, the potential of protease inhibitors in plant protection to control herbivorous arthropods, parasitic nematodes or microbial pathogens has been documented in numerous studies (Arai et al., 2000; Arai et al., 2002; Benchabane et al., 2010; Lima et al., 2015; Macedo et al., 2014; Martinez et al., 2016; Schlüter et al., 2010), often involving recombinant cystatin expression (Table 1.3). The ingested inhibitors inactivate susceptible proteases to compromise extracellular protein processing and amino acid uptake in the pest digestive tract or pathogen extracellular milieu (Benchabane et al., 2010).
Protease inhibitors cause dietary protein wastage and amino acid shortage in herbivorous arthropods, leading to detrimental growth delays and death of the herbivore in the most efficient cases (Broadway, 2000).
1.5.2.1 Complex protease-inhibitor interactions in plant/pest systems
Despite promising developments, the use of recombinant cystatins for pest control remains challenging in practice as the net protective effects of these proteins are insufficient in most instances. Arthropod herbivores have evolved different strategies to cope with dietary protease inhibitors, that typically involve the secretion of complex midgut protease complements with proteases from several functional classes, target protease overexpression to outnumber the ingested inhibitors and the secretion of protease isoforms barely susceptible to inhibition (Zhu-Salzman et al., 2015b). A well-documented example is the coleopteran herbivore Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata) (Maharijaya et al., 2015), that uses an array of rapidly evolving Cys protease isoforms to digest leaf proteins (Gruden et al., 2004; Gruden et al., 2003; Sainsbury et al., 2012; Vorster et al., 2015).
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Table 1.3: Cystatin-expressing transgenic plants resistant to herbivorous arthropods, root parasitic nematodes or plant microbial pathogens–Selected examples a
Plant Recombinant inhibitor Target proteases Herbivore /pathogen target Reference
RESISTANCE TO HERBIVOROUS ARTHROPODS
Arabidopsis thaliana Barley Icy6 Cys Myzus persicae Carrillo et al., 2011
Barley Icy6 (+ barley Itr1) Cys + Ser Tetranichus urticae Santamaria et al., 2012
Hordeum vulgare (barley) Barley Icy6 Cys T. urticae Santamaria et al., 2018
Medicago sativa (alfalfa) Oryzacystatin II (OC-II) Cys Phytodecta fornicata Ninković et al., 2007
Nicotiana benthamiana Taro CeCYS (+ chitinase, sporamin) Cys + Ser Spodoptera exigua Prins et al., 2008
Spodoptera litura
Nicotiana tabacum (tobacco) Taro Taro CeCYS (+ sporamin) Cys + Ser Helicoverpa armigera Senthilkumar et al., 2010
CpBV-CST1 (of viral origin) Cys Helicoverpa assulta Kim et al., 2016
Populus spp. (poplar) Oryzacystatin I (OC-I) Cys Chrysomela tremulae Leplé et al., 1995
OC-I (+ Bt toxin Cry3A) Cys Plagiodera versicolora Zhang et al., 2011
Saccharum officinarum (sugarcane) Sugarcane CaneCPI-1 Cys Sphenophorus levis Schneider et al., 2017
Solanum lycopersicum (tomato) Wheat multidomain TaMDC1 Cys Leptinotarsa decemlineata Christova et al., 2018 Solanum tuberosum (potato) Multidomain cystatin fusions Cys + Asp Frankliniella occidentalis Outchkourov et al., 2004
Various animal cystatins Cys + Asp Outchkourov et al., 2004
Barley HvCPI-1 (var. C68G) Cys L. decemlineata Álvarez-Alfageme et al., 2007
Tomato SlCYS8 Cys L. decemlineata Rasoolizadeh et al., 2016
OC-II Cys L. decemlineata Cingel et al., 2015
OCI + OC-II Cys L. decemlineata Cingel et al., 2014, 2017
Zea mays (corn) Barley HvCPI-6 Cys T. urticae Carrillo et al., 2011
RESISTANCE TO NEMATODES
Arabidopsis thaliana OC-I∆D86 (+ CpTI) Cys + Ser Heterodera schachtii Urwin et al., 1998
Lilium longiflorum (lily) OC-I∆D86 Cys Pratylenchus penetrans Vieira et al., 2015
Medicago sativa (alfalfa) OC-I Cys P. penetrans Samac et al., 2003
Musa spp. (banana) OC-I∆D86 Cys Radopholus similis Atkinson et al., 2004
Musa spp. AAB (plantain) CC-II Cys R. similis Roderick et al., 2012
Solanum lycopersicum (tomato) OC-I∆D86 Cys Globodera pallida Urwin et al., 1995
Taro CeCYS Cys Meloidogyne incognita Chan et al., 2010
Taro CeCYS (+ chitinase genes) Cys M. incognita Chan et al., 2015
Solanum melongena (eggplant) OC-I∆D86 Cys M. incognita Papolu et al., 2016
Solanum tuberosum (potato) OC-I Cys M. incognita, G. pallida Lilley et al., 2004
RESISTANCE TO PATHOGENS
Nicotiana benthamiana Taro CeCYS (+ chitinase, sporamin) Cys + Ser Alternaria alternata Chen et al., 2014 Pectobacterium caratovorum
Nicotiana tabacum (tobacco) OC-I Cys Potato virus Y Gutierrez-Campos et al., 1999
Taro CeCYS + sporamin Cys + Ser Pythium aphanidermatum Senthilkumar et al., 2010
Cocoa TcCYS4 Cys Moniliophthora perniciosa Santana et al., 2014
Solanum lycopersicum (tomato) Wheat multidomain TaMDC1 Cys A. alternata , Botrytis cinerea Christova et al., 2018 Pseudomonas syringae
Solanum tuberosum (potato) Corn cystatin II b Cys B. cinerea Munger et al., 2012
a Included in this table are studies involving bioassays with cystatin-expressing transgenic lines that showed complete or partial resistance to (a) herbivorous arthropod(s),root parasitic nematode(s) and/or microbial pathogen(s). b Indirect, pleiotropy-driven antifungal effect (Munger et al., 2012).
A range of effects on this insect have been described for transgenic potato lines expressing Cys protease inhibitors, from larval growth delays (Cingel et al., 2014, 2015; Dubin, 2005; Rasoolizadeh et al., 2016) and mortality (Lecardonnel et al., 1999) to enhanced growth and compensatory feeding concomitant with increased loads of secreted proteases in the midgut lumen (Cingel et al., 2015; Cloutier, 2000; Cloutier et al., 1999).
Proposed hypotheses for such diverging effects among studies involved recombinant inhibitor concentration in transgenic lines, differential inhibitor stability in leaf tissue, differential inhibitory efficiency against target Cys proteases, and experimental biases negatively or positively altering insect fitness (Rasoolizadeh et al., 2018).
From a biotechnological standpoint, these observations underline the need for a better understanding of complex cystatine::Cys protease interactions in plant/insect systems, essential to develop and select cystatin candidates well suited to Cys proteases secreted by the pest or the pathogen to control (Rasoolizadeh et al., 2016).
Biotic stress-inducible protease inhibitors in plants are the result of a long coevolutionary arms race driving the functional diversification of herbivore digestive proteases and plant protease inhibitors over evolutionary timescales (Christeller, 2005; Lopes et al., 2004; Zhu-Salzman et al., 2015b). This is for instance illustrated at the genome scale by the occurrence of multiple cystatin-encoding genes in higher plants (Girard et al., 2007b;
Martínez et al., 2005; Massonneau et al., 2005; Tan et al., 2014) and a correspondingly large number of digestive Cys protease genes in herbivorous Coleoptera (Consortium, 2008; Gruden et al., 2004; Sainsbury et al., 2012;
Schoville et al., 2018). Several evolutionary processes have shaped the organization of protease inhibitor families in plants, often involving gene duplication and positive selection of non-synonymous mutations at functionally relevant amino acid sites (Benchabane et al., 2010; Christeller, 2005). Defense-related protease inhibitors show sequence hypervariability at specific amino acid positions presumably indicative of positive selection and functional diversification towards arthropod herbivore digestive proteases (Ingvarsson, 2005;
Kiggundu et al., 2006; Kong et al., 2008; Li et al., 2011; Neiman et al., 2009; Talyzina et al., 2006). A well-known example is the eight-domain inhibitor potato multicystatin, produced in potato tubers to protect endogenous storage proteins during dormancy (Green et al., 2013; Weeda et al., 2009) and upregulated in leaves upon wounding or insect attack (Bouchard et al., 2003). The duplicated domains of this protein include hypervariable, rapidly evolving amino acid sites that give the whole protein a range of inhibitory specificities towards plant and insect Cys proteases (Goulet et al., 2008; Kiggundu et al., 2006; Rasoolizadeh et al., 2016) including the hypervariable, positively selected digestive Cys proteases of L. decemlineata (Vorster et al., 2015). Such advances in our understanding of basic cystatin::Cys protease interactions in a plant/pest system of agronomic relevance might be instrumental, in coming years, for the design and the selection of improved cystatin variants eventually useful in plant protection schemes (Rasoolizadeh et al., 2016).
