1
Figures
Figure I.1. Les trois classes de récepteurs membranaires. (a) Récepteurs couplés aux protéines G. (b) Récepteurs canaux. (c) Les récepteurs sans activité enzymatique intrinsèque (exemple : récepteur lié à une protéine à activité tyrosine kinase comme l’érythropoietine et les interférons). (d) Les récepteurs avec une activité enzymatique intrinsèque suite à la liaison avec le ligand. Ils peuvent être par exemple des monomères avec une activité guanylate cyclase générant du cGMP ou des récepteurs à activité tyrosine kinase. (Molecular Cell Biology)
A. Récepteurs couplés aux protéines G
B. Récepteurs canaux C. Les récepteurs sans activité enzymatique intrinsèque
D. Les récepteurs enzymes
Récepteur Protéine G inactive
Protéine effectrice inactive
Protéine G active
Protéine effectrice active (générant des seconds messagers)
Site de liaison du
Ligand
Protéine-tyrosine
kinase (inactive) Substrat
Substrat phosphorylé
Activité guanylate cyclase (atrial naturetic factor)
Activité tyrosine kinase (NGF, PDGF) Ligand
Ligand
Ligand Ligand
Récepteur
Figure I.2. Quelques seconds messagers intracellulaires. (Molecular Cell Biology)
G Effet Protéine effectrice associée 2nd messager
G
sAdenylyl cyclase cAMP
Canal Ca
2+Ca
2+Canal Na
+Changement de potentiel membranaire G
iAdenylyl cyclase cAMP
Canal K
+Changement de potentiel membranaire
Canal Ca
2+Ca
2+G
qPhospholipase C IP
3, DAG G
oPhospholipase C IP
3, DAG
Canal Ca
2+Ca
2+G
tcGMP phosphodiestérase cGMP G
bγPhospholipase C IP
3, DAG
Adenylyl cyclase cAMP
= stimulation; ↓ = inhibition. IP
3= inositol-1,4,5-trisphosphate; DAG = 1,2-diacylglycerol.
(Molecular Cell Biology)
Table I.1. Quelques exemples de sous-unités de petites protéines G chez les mammifères.
1,2-Diacylglycerol (DAG)
3’,5’-Cyclic AMP (cAMP)
3’,5’-Cyclic GMP (cGMP)
Inositol
1,4,5-triphosphate (IP3)
Figure I.3.
Activation de l’adénylyl cyclase par stimulation d’un récepteur couplé aux protéines G.
(Molecular Cell Biology)
Récepteur (ex : TSHR)
L’activation du récepteur engendre son changement conformationnel
Liaison du récepteur à la protéine Gsα
Le changement
conformationnel de la protéine Gsα permet la liaison du GTP et la dissociation des sous- unités Gβγ
La protéine Gsα lie l’adénylyl cyclase qui produit de l’AMPc et l’hormone (ou ligand) se dissocie
Le recouvrement de l’état inactif initial suite à l’hydrolyse du GTP en GDP
Figure I.4. La cascade de l’AMP cyclique. (Molecular Cell Biology)
GPCR : récepteur couplé aux protéines G ; PKA : protéine kinase A ; R : sous-unité régulatrice ; C : sous-unité catalytique, CREB : CRE binding protein ; CRE : cAMP responsive element ; CBP : CREB binding protein.
Figure I.5. Libération de Ca
2+dans le cytosol par la voie de l’inositol. (Molecular Cell
Biology) DAG : 1,2-diacylglycérol ; IP
3: inositol-1,4,5-trisphospate; PIP
2: phosphoinositol-
4,5-bisphosphate; PKC: protein kinase C; PLC: phospholipase C
Figure I.6. Activation de Ras suite à la stimulation d’un récepteur à activité tyrosine kinase.
(Molecular Cell Biology)
Ras inactif Récepteur (monomère)
Dimérisation des récepteurs activés par leur ligand et
autophosphorylation des résidus tyrosines
Liaison des effecteurs GRB2 et Sos dans le but derecruter Ras Récepteur (dimère)
Sos permet l’échange de GDP par du GTP chez Ras provoquant sa dissociation
Ras actif
Figure I.7. Cascade impliquant des récepteurs à activité tyrosine kinase (Molecular Cell Biology) RTK : récepteur à activité Tyrosine Kinase ; SRE : Serum Response Element ; SRF : Serum Response Factor ; TCF : Ternary Complex Factor ; TRE : TPA Response Element
SOS/
Grb2/
Shc
GTP GDP
Raf
TRE
Jun Fos DUSPs
MAPKK
PI3K
MAP kinase Ras
active
RTK
Figure I.8A. La voie PI3-Kinase. mTOR : mammalian target of rapamycin ; RTK : récepteur à activité Tyrosine Kinase ; PDK : phosphoinositide-dependent kinase ; PIP
2: phosphoinositol-4,5-bisphosphate;
PIP
3: phosphoinositol-3,4,5-trisphosphate ; PTEN : phosphatase and tensin homolog ; p70s6K : 70-kDa ribosomal protein S6 kinase ; p110 et p85 : sous-unités de la PI3K.
DAG + Inositol 1-phosphate DAG + Inositol 1,4-bisphosphate
PI PIP PIP2 DAG + IP3
PI 3-phosphate PI 3,4-bisphosphate PI 3,4,5-trisphosphate
Figure I.8B. Formation des phosphoinositides (en rouge et jaune) et des inositol phosphates (en bleu), respectivement par plusieurs kinases, notamment la PI3K) et la PLC. (Molecular Cell Biology)
PLC
PI3K
PI3K 3-phosphatase
3-phosphatase 3-phosphatase PIP2
PIP3
p85 p110 PIP3
PIP2
PTEN
PH AKT
PDK2 PDK1
S473 T308
Bad
Substrats du noyau
mTor
Survie cellulaire, prolifération, invasion
p70s6K Ras
Kinase
PLC PLC
PI3K
Figure I.9. Schéma des différentes molécules d’adhésion. (Molecular Cell Biology)
Protéine de jonction intracellulaire Protéines
d’adhérence et récepteurs
cellulaires Protéines du
cytosquelette Adhésion cellule-cellule
Adhésion cellule- matrice
Glycosaminoglycans Protéines de l’âme Protéines de l’âme Protéines liantes du protéoglycan superficiel du protéoglycan de
la matrice
Fibre de collagène
(D)
Figure I.10. Structure et fonction des cadhérines. (A+B) La molécule (homodimère avec une partie extracellulaire composée de 5 répétitions cadhérine et un site de liaison au calcium entre chacune d’elles). (C) L’influence du calcium extracellulaire qui rigidifie la structure de la cadhérine, lui permettant de se lier à d’autres cadhérines. (D) Liaison de la cadhérine au cytosquelette d’actine par les
téi té i t b té i L téi 120 t é l l f ti d dhé i
(D)
protéines a-caténine et b-caténine. La protéine p120 peut réguler la fonction des cadhérines.
(Molecular Cell Biology)
Figure I.11. La thyroïde.
Figure I.12. Le follicule thyroïdien.
Figure I.13. Synthèse et sécrétion des hormones thyroïdiennes. rTSH: récepteur de la TSH; AC:
adénylate cyclase; NIS: symporteur sodium-iodure; THOXs: thyroïde oxydase (DUOX); TPO:
thyroperoxidase; TG: thyroglobuline; MIT/DIT: mono/diiodotyronine; T3: triiodotyronine; T4:
thyroxine; AA: acides aminés.
Figure I.14. Rétrocontrôle négatif des hormones thyroïdiennes.
évênements précoces évênements tardifs
PTC
PAPILLAIRE CARCINOME
RAS, TRK, … BRAF*
RET/PTC
MICROPAPILLAIRE CARCINOME
Ras*
Pax8/
PPAR γ THYROCYTE
FOLLICULAIRE
ADENOME CARCINOME
FOLLICULAIRE PEU CARCINOME
p53*
ß-catenin*
FA FTC
ANAPLASIQUE CARCINOME
ATC
BRAF*
Ras*
RET/PTC Pax8/PPAR γ TSHR*
DIFFERENTIE
- doublements limités (20-25x) a 8/ γ
TSHR*
G
sα
*
ADENOME AUTONOME
AA
- doublements limités (20-25x) - perte de la fixation d’iodure
- Activation de la télomérase
- doublements illimités
- activation du cycle cellulaire
cAMP
HYPERFONCTIONNEL
- augmentation de l’apoptose
Figure I.15. Modèle de la tumorigénèse épithéliale thyroïdienne.
* = mutation
/ = translocation
Figure I.16.
A. Morphologie nucléaire caractéristique des PTC (grossissement d’origine 400X)
B. PTC à variante classique (grossissement d’origine 100X)
C. PTC à variante folliculaire (FVPTC) (grossissement d’origine 100X)
D. Variante de PTC à cellules hautes (grossissement A.
d’origine 200X)
E. PTC à variante cribiforme (grossissement d’origine 100X)
(source: Nabeel Al-Brahim et al, 2006) B.
C.
D.
E.
A. C.
RET sauvage RET/PTC
oncoprotéine partenaire de fusion
partenaire de fusion
B.
Figure I.17.
A. Le domaine tyrosine kinase de la protéine Ret (en vert), activé par autophosphorylation lors de la dimérisation qui suit la liaison du ligand, peut fusionner avec la partie N-terminale d’une autre protéine pouvant dimériser (en gris), formant ainsi l’oncoprotéine RET/PTC. Celle-ci ne se trouve plus à la membrane.
B. Différentes cascades de signalisation activées par la protéine RET sauvage.
C. Les oncoprotéines formées par les différentes protéines de fusion dans les carcinomes papillaires (liste non exhaustive).
(source: Murakumo, 2006)
Figure I.18. La méthode des MicroArray.
DNA clones
PCR amplification purification Robotic
Hybridize target to microarray Test Reference
Reverse trans- cription
Label with fluor dyes
Excitation
Laser 1 Laser 2
Emission
Computer analysis
101
102 102
Adénomes Autonomes Hyperfonctionnels PTC
A.
10-1 100 101
10-2 10-1 100
10-1 100 101
10-1 100 101
La corrélation de toutes les lames ensemble = 53% La corrélation de toutes les lames ensemble = 66%
102
B.
100 101
Spot 2
10-1 100 101 102
10-1
Spot 1
Figure III.1.
A. Corrélations PerkinElmer – VIB
Elle varie d’une lame à l’autre et entre les PTC et les adénomes autonomes hyperfonctionnels.
Ell i i f ti d b d è é
Elle varie aussi en fonction du nombre de gènes conservés.
La comparaison est faite sur 50% des gènes les plus exprimés en PerkinElmer et en VIB.
(PerkinElmer est en x, VIB en y.)
B. Corrélations entre les spots dupliqués sur lames PerkinElmer
Elle varie entre 54% et 96%, avec une moyenne de 80% et une médiane de 84%.
A.
modula tion of genes dow nre gula ted on microa rra y
1 1.2 1.4
nge
modula tion of ge nes upregula te d on microa rray
4 5
e
(>50x régulé)
0 0.2 0.4 0.6 0.8
akt2 flrt2 Rap1Ga ATF3 tob1 dusp1 egr1 egr2 ctgf tr3 srf
genes
fold chan
0 1 2 3
dus p5 nell2 tnc s lc34a2 ts c22
genes
fold change
B.
thbs2
8 10 12 14
ange
normal RT PCR
nell2
10 15 20
ange norm al
RT-PCR
0 2 4 6
6 9 14 20 21 22 23 25 s418 s423 s425
tissue identication
fold ch RT-PCR
microarray
0 5 10
6 9 14 20 21 22 23 25 s418 s423 s425
tissue identication
fold cha
m icroarray
dusp5 ctgf
0 2 4 6 8 10 12 14
6 9 14 20 21 22 23 25 s418 s423 s425
tissue identication
fold change
normal RT-PCR microarray
0 0.5 1 1.5 2 2.5
6 9 14 20 21 22 23 25 s418 s423 s425
tissue identification
fold change norm al
RT-PCR m icroarray
Figure III.2.
A.Moyennes standardisées des ratios d’expression dans 11 PTC différents étudiés par RT-PCR en temps réel pour 3 gènes surexprimés et 7 gènes sousexprimés dans les données microarray. (La déviation standard des logarithmes des ratios a été calculée pour chaque gène, puis additionnée ou soustraite à la moyenne logarithmique.)
B. Comparaison des moyennes des données d’expression génique issus des microarray (étude D sur lames ‘Agilent’
avec les échantillons individuels) et de la RT-PCR en temps réel. Quatre gènes sont représentés, dont 3 surexprimés dans les PTC (THBS2, NELL2 et DUSP5) et 1 sousexprimé (CTGF). Les échantillons 14, 23 et 25 montrent( ) p ( ) généralement une diminution de l’expression génique au lieu d’une augmentation (également dans les autres gènes étudiés et non représentés) aussi bien par microarray que par RT-PCR. Selon le ‘MDS’ et les données cliniques, il s’agirait d’échantillons plus ou moins semblables (des variants folliculaires, sous-type trabéculaire pour les échantillons 14 et 23, et inversement l’échantillon 25 est un variant trabéculaire, sous-type folliculaire; tous BRaf négatifs et regroupés dans le MDS (figure 2 de l’article ‘Br. J. Cancer’).
FasN: FTC (à gauche: le normal adjacent)
FasN: PTC (A: tissu normal de l’échantillon B; B et C: PTC; D: PTC avec métastases)
A B
C D
Figure III.3. Immunodétection de la protéine FasN dans des coupes histologiques de FTC et de PTC.
(collaboration avec J. Swinnen, KUL et B. Franc, A. Paré, Paris)
A.
B.
Figure III.4. Représentation par Doppler du flux sanguin dans une thyroïde normale (A) et dans un adénome autonome (B). Dans ce dernier on observe une augmentation de la vascularisation.
(Images fournies par Pr. L. Leenhardt)
PTC: 1.6x up 2.3x down 2.4x up 2.8x down 2.2x up 4.8x up AA: 4.4x down 4.0x up 1x 2.9x up 4.3x down 2.3x down
Figure III.5. Signature de 6 gènes obtenue par classification supervisée des résultats
microarray (PE) permettant de distinguer les adénomes autonomes des carcinomes
papillaires. En rouge sont représentés les 12 PTCs post-Tchernobyl (chPTC), en vert, les
8 PTCs sporadiques (sPTC) et en noir, les 13 adénomes autonomes (AA). La moyenne
des rapports d’expression de chaque gène pour chaque type de tumeur est donnée sous le
graphique : ‘up’ indiquant une augmentation d’expression et ‘down’, une diminution
d’expression par rapport au normal adjacent.
Anxa1 CKB microarray qRT-PCR IHC microarray qRT-PCR IHC
Normal
NA NA Little or no staining NA NA Strong staining (mostly apical and nuclear)PTC
↑17/20 (85%) ↑11/20 (55%) ↑22/23 (95%) ↓14/20 (70%) ↓17/21 (81%) ↓19/25 (76%)AA
↓13/13 (100%) ↓10/12 (83%) no staining ↑10/12 (83%) ↑9/12 (75%) ↑5/8 (62%)Table III.7. Comparaison de l’expression d’ANXA1 et de CKB dans les carcinomes papillaires (PTC) et les adénomes autonomes (AA) analysées par microarray, RT-PCR en temps réel et immunohistochimie (IHC). Les expressions mesurées par microarray et RT-PCR sont des ratios d’expression (tumeur/normal). NA = not available.
Figure III.6. Données RT-PCR en temps réel pour ANXA1 et CKB dans les différents sous- types de tumeurs comparées à leur tissu normal adjacent. Les ratios standardisés (± SEM) de 20 PTCs (10 sporadiques (sPTC), 10 post-Tchernobyl (chPTC)), 12 adénomes autonomes (AA), 4 carcinomes folliculaires (FTC) et 3 adénomes folliculaires (FA) sont représentés.
0 0.5 1 1.5 2
anxa ckb anxa ckb anxa ckb anxa ckb
fold change
PTC FTC AA FA
1 1 1 1
NPTC PTC
FTC NFTC
NATC ATC
NFA FA
NAA AA
Figure III.7. Immunoréactivité de l’annexine A1 dans différentes tumeurs thyroïdiennes
comparée à leur tissu normal adjacent : carcinome papillaire (PTC), carcinome folliculaire
(FTC), carcinome anaplastique (ATC), adénome folliculaire (FA), adénome autonome (AA)
et normal adjacent (N).
NPTC PTC
NAA AA
HN
NFTC FTC
NFTC FTC
NATC ATC
Figure III.8. Immunoréactivité de la CKB dans différentes tumeurs thyroïdiennes comparée à leur
tissu normal adjacent : carcinome papillaire (PTC), carcinome folliculaire (FTC), carcinome
anaplastique (ATC), adénome autonome (AA) et normal adjacent (N).
RTK (ex. RET)
milieu extracellulaire A.
Ras PI3K Akt BR f
cytoplasme
PIP2 PIP3
PDK1
P
Rac, Rho A, X?
p110
BRaf
MAPK
milieu extracellulaire
FTC
?
milieu extracellulaire
cytoplasme RET/PTC
PIP2
Shc Grb2 Sos
PI3K
? B.
Ras BRaf MAPK
Sos
?
Figure IV.1. Hypothèse expliquant l’activation de la voie PI3K par une mutation activatrice de
R (A) i l’ téi t l i RET/PTC (B) i di t ti
PTC
Ras (A) mais pas par l’oncoprotéine cytoplasmique RET/PTC (B). indique une mutation
constitutive de la protéine concernée.
PTC
cascade des MAPK ↑ (via BRAF mutation etc)
ATC
Thyroid cell
(via BRAF mutation, etc) PI3K ↑↑↑
PI3K/Akt↑↑↑
Figure IV 2 Modèle simplifié du rôle des voies PI3K/Akt et MAPK dans la tumorigénèse
Adenoma FTC
PI3K/Akt ↑↑↑PI3K/Akt ↑↑
PI3K/Akt ↑↑↑
(via gene copy gain or mutations)
Figure IV.2. Modèle simplifié du rôle des voies PI3K/Akt et MAPK dans la tumorigénèse
thyroïdienne menant respectivement au développement des FTC et PTC. Les flèches ↑
indiquent le rôle croissant de la voie PI3K/Akt dans la tumorigénèse.
MICROMAX
TM(PerkinElmer)
• 2400 cDNA humains ainsi que quelques contrôles de plantes
• cDNA double brin obtenu par PCR, taille moyenne 2.2 kb
• Plus de 50 banques différentes
• Plus de 10 tissus différents
• 80% des gènes se retrouvent dans le cerveau
• Plus de 40% sont des clones complets
• Ces 2400 cDNA proviennent de gènes codant pour des cytokines et facteurs de croissance, protéines associées à l’ADN ou l’ARN, protéines de transport, hormones et peptides actifs, hydrolases, inhibiteurs, isomérases, ligases, lyases, oxidoréductases, récepteurs, protéines impliqués dans les modifications post-traductionnelles et dans la sécrétion des protéines, chaperons, protéines de structure, transférases,… Les gènes contrôles sont des ‘housekeeping genes’ (gènes de maintenance) et des gènes de plantes. Ces derniers servent à la normalisation de l’intensité du signal obtenu avec les différents fluorophores.
VIB microarray facility
• Approximativement 17000 cDNA humains provenant de produits PCR d’EST, dont la taille est comprise entre 500 et 2000bp (http://www.microarrays.be/service.htm):
origine des clones
# gènes # contrôles # spot/clone # gènes connus sur l’array
VIB Human 5k I Incyte 4596 12 2 3585
VIB Human 5k II RZPD 4224 384 2 3237
VIB Human 5k III RZPD 4224 384 2 2053
VIB Human 5k IV Incyte, RZPD
4224 384 2 2605
Moyenne des 4 arrays (5k)
Incyte, RZPD
17268 3 x 384 (1164)
2 11480 VIB Human 21k I Incyte ,
RZPD
21005 384 1 9920
Figure V.1. Information sur les gènes se retrouvant sur les lames ‘PerkinElmer’ et ‘VIB’
Cy3-Tyramide
HRP Cy3 Tyramide
2 3 = HRP
inactivation
Fluor
Fluor
HRP
Biotin 1
Bi ti
Cy5-Tyramide
St t
Fluor Biotin Biotin Strepta HRP 5
4
microarray
Figure V 2 La méthode d’amplification TSA (Tyramide Signal Amplification Perkin Elmer) Figure V.2. La méthode d amplification TSA (Tyramide Signal Amplification, Perkin Elmer).
Cette méthode d’amplification du signal consiste à incorporer des haptènes (fluorescéine ou biotine) lors de la synthèse des ADNc à partir du ARN total. Après hybridation des sondes, l’array est incubé, dans une première étape, en présence d’un anticorps couplé à la peroxydase de raifort, reconnaissant spécifiquement la fluorescéine incorporée aux ADNc (1), puis est mis en présence de tyramide couplée à la cyanine-3. La peroxidase catalyse la déposition de tyramide couplée à la cyanine-3 (2) et est ensuite inactivée (3). L’array est incubé, dans une seconde étape, en présence de streptavidine également couplée à la peroxydase de raifort (4), puis en présence de tyramide de streptavidine également couplée à la peroxydase de raifort (4), puis en présence de tyramide couplée à la cyanine-5 (5). Ceci entraine une déposition de tyramide couplée à la cyanine-5.
(HRP: horseradish peroxidase; Fluor: fluorescéine; Strepta: streptavidine; Cy-3: cyanine-3; Cy-5:
cyanine-5)
RT
ADN polymérase, Rnase H
AAA…AA
Oligo-dT Promoteur T7
5’ 3’
3’ 5’
ARNm
AAA…AA
Oligo-dT Promoteur T7
5’ 3’
3’ 5’
ARNm 1er brin d’ADNc
ADN polymérase, Rnase H
Oligo-dT Promoteur T7
5’ 3’
3’ 5’
AAA…AA Promoteur T7 1er brin d’ADNc
5’ 3’
’
AAA…AA Promoteur T7
’ 2ème brin d’ADNc
Transcription in vitro en présence de RNA polymérase T7
ARN antisens 3’ UUU…UU 5’
Oligo-dT Promoteur T7 5’
3’
1er brin d’ADNc
Figure V.3. Amplification d’ARN messager par transcription in vitro (pour plus
d’information, voir : Van Gelder, 1990).
Figure V.4. La technologie ‘Taqman’ : L’amplification PCR avec une
sonde ‘Taqman’ possédant un fluorophore rapporteur en 5’ et un
quencheur en 3’. Ce dernier peut absorber la fluorescence du rapporteur
quand il est à proximité de celui-ci. La destruction de la sonde par
l’activité exonucléase de la polymérase permet la visualisation du
rapporteur. Le signal émit par celui-ci est donc ‘parallèle’ au nombre de
transcrits amplifiés.
∆R
R
n+∆R
nR
n-Fluorescence
Seuil de détection
Nombre de cycles Ligne de base
Figure V.5. Représentation graphique de la RT-PCR en temps réel où l’intensité de la fluorescence R
nest exprimée en fonction du nombre de cycles. L’intensité de la fluorescence à chaque cycle est proportionnelle à la concentration d’amplicons, le cycle seuil (Ct) représente le nombre de cycles requis où le signal d’émission de fluorescence est statistiquement et significativement plus élevé
Nombre de cycles
que la ligne de base (généralement 10x au dessus du bruit de fond). Le seuil de détection (défini
manuellement ou par le programme PCR) correspond au nombre de cycles où le programme
commence à détecter la fluorescence (Ct utilisé ultérieurement dans les calculs).
Figure V.6. Le principe des Tissus-MicroArray (TMA): des coupes tissulaires provenant d’un millier d’individus sont déposés sur les lames. Un bloc de tissus, fixé à la formaline, puis dans la paraffine, peut générer jusqu’à 300 coupes consécutives. Toutes les lames ont les mêmes tissus à la même position et peuvent être utilisées dans plusieurs analyses au niveau ARN ou protéique et comparées entres elles. (Source : Kallioniemi et al., 2001)
Figure V.7. Comparaison entre une lame microarray, capable d’analyser simultanément des milliers de gènes appartenant à un échantillon, et les ‘tissus-microarray’, capables d’analyser une cible (ARN ou protéine) simultanément dans des milliers d’échantillons différents.
(Source : Kallioniemi et al., 2001)
Surexpression de l’EGF
FGF
HGF
Surexpression
de l’EGFR Surexpression de MET FGFR
switch
β-caténine Sousexpression
de la E-cadhérine
(CDH1) Wnt-signaling
Cellule stromale
Surexpression de VEGF et FGF
β-caténine Cycline D1MYC FGFR VEGFR
Matrice extracellulaire Cellule épithéliale cancéreuse
Surexpression de la Fibronectine (FN)
Figure V.8. Modifications des interactions intercellulaires et avec la matrice extracellulaire dans
les carcinomes thyroïdiens altérant notamment la transcription génique, la signalisation par des
facteurs de croissance autocrines et paracrines ou encore l’adhésion cellulaire (Adapté de Kondo et p ( p
al., 2006; Nature Reviews Cancer 6, 292-306).
1
Tables
Figure I.2. Quelques seconds messagers intracellulaires. (Molecular Cell Biology)
G Effet Protéine effectrice associée 2nd messager
G
sAdenylyl cyclase cAMP
Canal Ca
2+Ca
2+Canal Na
+Changement de potentiel membranaire G
iAdenylyl cyclase cAMP
Canal K
+Changement de potentiel membranaire
Canal Ca
2+Ca
2+G
qPhospholipase C IP
3, DAG G
oPhospholipase C IP
3, DAG
Canal Ca
2+Ca
2+G
tcGMP phosphodiestérase cGMP G
bγPhospholipase C IP
3, DAG
Adenylyl cyclase cAMP
= stimulation; ↓ = inhibition. IP
3= inositol-1,4,5-trisphosphate; DAG = 1,2-diacylglycerol.
(Molecular Cell Biology)
Table I.1. Quelques exemples de sous-unités de petites protéines G chez les mammifères.
1,2-Diacylglycerol (DAG)
3’,5’-Cyclic AMP (cAMP)
3’,5’-Cyclic GMP (cGMP)
Inositol
1,4,5-triphosphate (IP3)
Tumeurs bénignes Tumeurs malignes
Bien limitée Mal limitée
Encapsulée Non encapsulée (en général)
Histologiquement semblable au tissu d’origine
Plus ou moins semblable au tissu d’origine (dédifférenciation, différenciation aberrante) Cellules régulières Cellules irrégulières (cellules cancéreuses)
Croissance lente Croissance rapide
Refoulement sans destruction des tissus voisins
Envahissement des tissus voisins
Pas de métastases Métastase(s)
Pas de récidive locale après exérèse complète Récidive possible après exérèse supposée totale
Table I.2. Critères de distinction entre tumeurs bénignes et tumeurs malignes.
type de tumeur prévalence ratio ♀/♂ âge (années) métastases
lymphatiques métastases
distantes Survie dans les 5 ans Carcinomes
papillaires 85-90% 2:1-4:1 20-50 <50% 5-7% >90%
Carcinomes
folliculaires <10% 2:1-3:1 40-60 <5% 20% >90%
Carcinomes peu différenciés
Rare-7% 0.4:1-2.1:1 50-60 30-80% 30-80% 50%
Carcinomes
dédifférenciés 2% 1.5:1 60-80 40% 20-50% 1-17%
Table I.3. Caractéristiques clinico-pathologiques des carcinomes thyroïdiens (références :
Hundahl, 1998; DeLellis, 2004; LiVolsi, 1994 ; Carcangiu, 1984; Rodriguez, 1998 ;
Kebebew, 2005 ; adapté de Kondo et al., 2006; Nature Reviews Cancer 6, 292-306).
altérations
génétiques Carcinomes papillaires post- Tchernobyl (chPTC)
Carcinomes papillaires sporadiques (sPTC)
Carcinomes folliculaires (FTC)
Carcinomes peu
différenciés
Carcinomes indifférenciés (ATC)
références
Réarrangement RET/PTC
50-90% 13-43% 0% 0-13% 0% Williams, 2002; Tallini, 1998, 2001; Lam, 1998; Sugg, 1999;
Musholt, 2000; Nakazawa, 2005;
Santoro, 1992, 2002; Quiros, 2005
Mutation Braf 0-12% 29-69% 0% 0-13% 10-35% Xing, 2005; Davies, 2002;
Namba, 2003; Nikiforova, 2003;
Soares, 2004
Réarrangement AKAP9/Braf
11% 1% inconnu inconnu inconnu Xing, 2005; Ciampi, 2005
Réarrangement
NTRK1 3% 5-13% inconnu inconnu inconnu Musholt, 2000; Wajjwalku, 1992; Bongarzone, 1996; Rabes, 2000
Mutation ras 0% 0-21% 40-53% 18-27% 20-60% Lemoine, 1989; Namba, 1990;
Manenti, 1994; Ezzat, 1996;
Esapa, 1999; Basolo, 2000;
Nikiforova, 2003; Suchy, 1998
Réarrangement
Pax8/PPARγ inconnu 0% 25-63% 0% 0% Nikiforova, 2003; Kroll, 2000;
Nikiforova, 2002; Marques, 2002; Cheung, 2003; Dwight, 2003
Mutation
CTNNB1 inconnu 0% 0% 0-25% 66% Garcia-Rostan, 2001; Miyake,
2001
Mutation p53 inconnu 0-5% 0-9% 17-38% 67-88% Ito, 1992; Fagin, 1993; Donghi, 1993; Dobashi, 1994; Ho, 1996;
Takeuchi, 1999
Table I.4. Altérations génétiques dans les carcinomes thyroïdiens (Source : Kondo et al., 2006; Nature Reviews Cancer 6, 292-306).
(CTNNB1 : β-caténine ; NTRK1 : ‘neurotrophic tyrosine kinase receptor, type1’ ; PPARG :
‘peroxisome-proliferator-activated-receptor-γ’)
Gènes surexprimés dans les PTC Gènes sousexprimés dans les PTC facteurs de croissance et récepteurs
ADORA1 (adenosine A1 receptor) MET (hepatocyte-growth-factor receptor) PDGFR (platelet-derived growth factor receptor) PDGFA (platelet-derived growth factor receptor-α) TGFA (transforming growth factor-α)
transduction de signal
CITED1 (Cbp/p300-interacting transactivator)
EPS8 (epidermal-growth-factor receptor pathway substrate 8) RXRG (retinoid-X receptor-α)
WNT7A (wingless-type MMTV integration site family, member 7A) IGFBP6 (insulin-like growth factor binding protein 6)
DUSP6 (dual specificity phosphatase 6) ETV5 (ets variant gene 5)
régulation du cycle cellulaire
CCND1, CCND2 (cyclin D1/2)
CDC2 (cell division cycle 2) (CDC7 dans les PTC agressifs)
adhésion cellulaire et matrice extracellulaire
CDH3 (P-cadherin)
DPP4 (dipeptidylpeptidase 4, CD26) FN1 (fibronectin 1)
LGALS3 (galectin 3) LAMMB3 (laminin β3)
MMP11 (matrix metalloproteinase 11), PLAU (plasminogen activator, urokinase) P4HA2 (prolyl 4-hydroxylase α-subunit) SERPINA1 (α1 antitrypsin)
TIMP1 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1) GJB3 (gap junction protein, beta 3)
CLDN1, CLDN10, CLDN16 (claudin1/10/16) FAP (fibroblast activation protein)
ECM1 (extracellular matrix protein 1), CHI3L1 (chitinase 3-like 1), collagens
EVA1 (epithelial V-like antigen 1) CD44
NRCAM (neuronal cell adhesion molecule) NRP2 (neuropilin 2)
FLRT3 (fibronectin leucine rich transmembrane protein 3) COMP (cartilage oligomeric matrix protein)
ST14 (Suppression of Tumorigenicity 14) SPUVE (protease, serine, 23)
cytosquelette
KRT19 (cytokeratin 19) SCEL (sciellin)
MYH10 (myosin, heavy chain 10, non-muscle) SLIT1 (slit homolog 1 (Drosophila)
autres
KCNJ2 (potassium inwardly-rectifying channel, subfamily J, member2) GK2 (glycerol kinase 2),
S100A4, S100A11, S100A14, S100A6 (S100 calcium binding protein A) RIL (ou PDLIM4) (PDZ and LIM domain 4)
SFTPB (surfactant, pulmonary-associated protein B), TMPRSS4 (transmembrane protease, serine 4)
LRP4 (Low density lipoprotein Receptor-related Proptein 4) MRC2 (mannose receptor, C type 2)
IGSF1 (immunoglobulin superfamily, member 1) PAM (peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase) ENDOD1 (endonuclease domain containing 1)
SLC34A2 (solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2) AGR2 (anterior gradient homolog 2)
ADPRTL1 (poly (ADP-ribose) polymerase family, member 4) N33 (tumor suppressor candidate 3)
QPCT (glutaminyl-peptide cyclotransferase) CTSC (cathepsin C)
NPC2 (Niemann-Pick disease, type C2) CST6 (cystatin E/M)
DPYSL3 (dihydropyrimidinaserelated protein-3) ...
gènes suppresseurs de tumeur
BCL2 (B-cell lymphoma protein 2) GAS1 (growth-arrest-specific 1)
métabolisme thyroïdien
DIO1, DIO2 (type-1/2 iodothyronine deiodinase) TPO (thyroperoxidase)
autre
HBA (haemoglobin-α)
CRABP1 (cellular retinoic acid binding protein 1) TFF3 (trefoil factor 3)
SERP1 (stress-associated endoplasmic reticulum protein 1) RNASE2 (ribonuclease, RNase A family, 2)
STATA5 (signal transducer and activator of transcription 5A) DDIT3 (ou GADD153) (DNA-damage-inducible transcript 3) ITPR1 (inositol 1,4,5-triphosphate receptor, type 1)
MKRN2 (makorin, ring finger protein, 2) MTMR4 (myotubularin related protein 4) HSBP1 (heat shock factor binding protein 1) WWOX (WW domain containing oxidoreductase) MINA53 (MYC induced nuclear antigen) SOSTDC1 (sclerostin domain containing 1) GATM (glycine amidinotransferase) PHF10 (PHD finger protein 10) MLF1 (myeloid leukemia factor 1) DUSP1 (dual specificity phosphatase 1) APOD (apolipoprotein D)
FABP4 (fatty acid binding protein 4) MT1G (metallothionein 1G)
…
Table I.5.
Gènes différentiellement exprimés dans les carcinomes papillaires de manière consistante dans différentes études microarray (Huang, 2001; Wasenius, 2003; Yano, 2004; Hawthorn, 2004;
Aldred, 2004 ; Jarzab, 2005 ; Weber, 2005 ; Puskas, 2005 ; Hamada, 2005;
Hucz, 2006 ; Fluge, 2006 ; Chen, 2006)
Etude A Etude B Etude C Etude D (L. Delys)
Type de lame Microarray PerkinElmer
Microarray VIB
Tissu-MicroArray (TMA) B. Franc
Microarray Agilent Nombres de
cDNA sur lame
2400 cDNA 17000 cDNA 49 tumeurs + normal
adjacent sur 4 lames
16000 cDNA
Nombre de gènes sur lame
2136 gènes 13000 gènes protéines AnxaA1 +
CKB
12000 gènes
Méthode d’amplification
de l’ADN hybridé
amplification TSA amplification avec la T7 RNA polymérase
immunohistochimie amplification avec la T7 RNA polymérase
Echantillons hybridés par
lame
8 sPTC ‘sporadiques’
12 chPTC ‘Tchernobyl’
13 AA
1 mélange de 13 sPTC 1 mélange de 14 chPTC 1 mélange de 5 AA
28 sPTC
6 AA, 8 adénomes atypiques, 3 NOS 6 FTC, 4 ATC, 1 FA
14 sPTC ‘sporadiques’
12 chPTC ‘Tchernobyl’
Résultats escomptés
- Profil d’expression (clustering hiérarchique)
• signature
• définir (sous)types de tumeurs - Marqueurs diagnostiques
- Mécanismes et cascades moléculaires - Physiopathologie
- Validation données microarray - Marqueurs diagnostics - Visualisation de la localisation dans les différentes tumeurs
Table III.1. Comparaison des différentes études (microarray et tissu-microarray) réalisées durant ce travail (études A, B et C), ainsi que par le doctorant Laurent Delys dans notre laboratoire (étude D).
(AA : adénome autonome, PTC: carcinome papillaire, FTC : carcinome folliculaire, ATC : carcinome anaplasique, FA : adénome folliculaire, NOS : carcinome ‘no other specification’)
Table III.2. Représentation du nombre d’échantillons hybridés sur les lames microarray et étudiés par RT-PCR en temps réel pour les différentes pathologies étudiées. Le nombre de gènes différentiellement régulés dans les études A et B (up = surexprimé ; down = sous- exprimé), ainsi que le nombre de gènes dont la modulation a été confirmée par RT-PCR en temps réel sont également représentés.
Adénomes
autonomes
PTC
sporadiques
PTC Tchernobyl Microarray
PerkinElmer
# gènes up
# gènes down
13 patients 11 gènes 23 gènes
8 patients 8 gènes 16 gènes
12 patients 8 gènes 16 gènes Microarray
VIB
# gènes up
# gènes down
5 patients 348 gènes 364 gènes
14 patients 278 gènes 247 gènes
13 patients 278 gènes 247 gènes RT-PCR en
temps réel
# gènes up
# gènes down
13 patients 10 gènes 22 gènes
8 patients 9 gènes 13 gènes
3 patients
9 gènes
13 gènes
Table III.4. Données microarray (VIB et Agilent), obtenues sur les PTC sporadiques (Spo) et post-Tchernobyl (CH), dont nous avons les confirmations par RT-PCR en temps réel (Taqman). La colonne ‘VIB’ représente les données obtenues par microarray sur les lames VIB (mélanges de PTCs sporadiques et post-Tchernobyl ; ‘av’ : moyenne des deux). La colonne ‘Agilent’ reprend les moyennes des données microarray obtenues à l’aide des lames commerciales Agilent sur les différents échantillons. Les rapports d’expression (tissu tumoral/tissu normal) sont exprimés en facteur d’inhibition (down) ou de stimulation (up). La colonne ‘Taqman down’ indique le nombre d’échantillons où l’expression du gène est diminuée par RT-PCR en temps réel (Taqman), ‘Taqman up’ indique le nombre de patients où l’expression du gène est augmentée et ‘Taqman no regulation’ indique le nombre de patients où l’expression du gène n’est pas régulée. Les données entre parenthèses représentent les numéros des échantillons où le gène est modulé, afin de constater que ce sont généralement les mêmes échantillons qui sont concernés par des régulations différentes. Deux gènes (rap1gap et tsc22) ont été analysés par microarray sur les lames Perkin Elmer et non sur les lames VIB.
Gènes VIB (PE)
Spo CH av
Agilent
Spo CH av
Taqman down Spo CH av
Taqman up Spo CH av
Taqman no regulation Spo CH av
Adénomes Autonomes
dusp1 ctgf tob1 egr1 egr2 flrt2 tr3 srf akt2 bcl-2
rap1gap (PE) CKB
ATF3
Down 2.1x 2.0x 2.1x Down 1.7x 3.1x 2.4x Down 2.0x 1.5x 1.7x Down 2.1x 1.5x 1.8x Down 2.7x 3.7x 3.2x Down 15.0x - - Down 1.2x 2.5x 1.9x Down 1.6x 2.9x 2.2x Down 2.8x - - Down 2.1x 2.4x 2.2x Down - - 2.2x Down 2.8x - - Down 1.5x 1.7x 1.6x
2.9x 1.9x 2.4x 1.7x 2.4x 2.1x 2.0x 1.4x 1.7x 1.9x 1.7x 1.8x 2.9x 1.8x 2.4x 2.0x 3.1x 2.6x 1.9x 1.2x 1.5x 1.4x 1.6x 1.5x 2.1x 2.8x 2.5x - - - 3.7x 2.7x 3.1x - - - 1.5x 1.5x 1.5x
8/8 3/3 11/11 7/8 3/3 10/11 6/8 3/3 9/11 8/8 2/3 10/11 7/8 1/3 8/11 6/8 3/3 9/11 6/8 2/3 8/11 5/8 2/3 7/11 5/8 3/3 8/11 7/8 3/3 10/11 5/5 5/6 10/11 8/10 9/11 17/21 5/10 8/12 13/22
0/11 0/11 0/11 0/11 0/11 0/11 1/8 1/11 0/11 1/8 1/11 0/11 0/11 1/11 1/21 4/10 3/12 7/22
0/11 1/8 1/11 2/8 2/11 1/3 1/11 1/8 2/3 3/11 2/8 2/11 1/8 1/3 2/11 3/8 1/3 4/11 2/8 2/11 1/3 1/11 1/8 1/11 2/10 1/11 3/21 1/10 1/12 2/22
Down Down
Down Down
Down Down
Up Down dusp5
nell2 slc34a2 tsc22 (PE) tnc
ANXA1
Up 3.1x 3.1x 3.1x Up 6.0x 9.8x 7.9x Up 25x - - Up - - 2.2x Up 2.3x 3.9x 3.1x Up 2.0x 1.9x 1.9x
2.5x 2.1x 2.3x 3.0x 6.0x 4.3x 2.0x 1.4x 1.7x 2.0x 3.0x 2.5x 1.7x 2.0x 2.0x 2.6x 3.5x 3.0x
2/8
(14/23)2/11 2/8
(14/23)2/11 0/11 0/11 4/8
(14/21/23/25)4/11 3/10 3/11 6/21
5/8 3/3 8/11 5/8 3/3 8/11 5/8 3/3 8/11 4/8 3/3 7/11 4/8 3/3 7/11 4/10 6/11 10/21
1/8 1/11 1/8 1/11 3/8
(14/21/23)3/11 4/8
(6/14/20/21)4/11 0/11 3/10 2/11 5/11
Down Down
Down
patient VIB PE Agilent qRT-PCR IHC patient VIB PE qRT-PCR
sPTC (mélange) (individuel) (individuel) (individuel) (individuel) AA (mélange) (individuel) (individuel)
p1 x x v2 x
p2 x x v6 x
p3 x x v5 x x
p4 x x x v4 x x x
p5 x x x v1 x x x
p5 x x x v1 x x x
p6 x x x x a8 x
p7 x x a5 x
p8 x x a4 x
p9 x x x a2 x
p10 x a21 x
p11 x x x x a1 x
p12 x a18 x
p13 x a15 x x
p14 x x x x a12 x
p18 x x a11 x
p19 x x s1 x
p20 x x x v3 x
p21 x x x s2 x x
p22 x x x j1 x
p23 x x x d1 x
p24 x j3 x
25 16
p25 x x x a16 x
p26 x x s6 x
T5 x s7 x
T11 x b3 x
T18 x b7 x
chPTC b8 x
s418 x x x
s425 x x x
s420 x x
s420 x x
s423 x x x x
s422 x x x
s405 x x x
ch70 x x
ch414 x x x
ch163 x x
ch155 x x
ch12 x x
ch123 x x
ch109 x x
ch104 x x
s404 x
s409 x
s415 x
v519 x
v608 x
Table III.5. Représentation des échantillons employés dans les différentes études (microarray VIB, PE (PerinElmer) et Agilent; RT-PCR en temps réel; et immunohistochimie (IHC)). Ces études ont été effectuées sur des échantillons individuels ou sur des mélanges de différents échantillons.
(sPTC: PTC sporadiques; chPTC: PTC post-Tchernobyl; AA: adénomes autonomes)
A.
B.
Table III.6.
A. Représentation des différentes catégories biologiques (Gene Ontology, niveau 3, http://babelomics.bioinfo.cipf.es/index.html) où les PTC (en rouge) et/ou leur tissu normal adjacent (en vert) ont des gènes exprimés. Le pourcentage de gènes modulés dans chaque catégorie est donné, ainsi que la p-value.
B. Représentation similaire donnant la localisation protéique des gènes exprimés dans les tissus
tumoraux (rouge) et normaux (vert). ( g ) ( )
Anxa1 CKB microarray qRT-PCR IHC microarray qRT-PCR IHC
Normal
NA NA Little or no staining NA NA Strong staining (mostly apical and nuclear)PTC
↑17/20 (85%) ↑11/20 (55%) ↑22/23 (95%) ↓14/20 (70%) ↓17/21 (81%) ↓19/25 (76%)AA
↓13/13 (100%) ↓10/12 (83%) no staining ↑10/12 (83%) ↑9/12 (75%) ↑5/8 (62%)Table III.7. Comparaison de l’expression d’ANXA1 et de CKB dans les carcinomes papillaires (PTC) et les adénomes autonomes (AA) analysées par microarray, RT-PCR en temps réel et immunohistochimie (IHC). Les expressions mesurées par microarray et RT-PCR sont des ratios d’expression (tumeur/normal). NA = not available.
Figure III.6. Données RT-PCR en temps réel pour ANXA1 et CKB dans les différents sous- types de tumeurs comparées à leur tissu normal adjacent. Les ratios standardisés (± SEM) de 20 PTCs (10 sporadiques (sPTC), 10 post-Tchernobyl (chPTC)), 12 adénomes autonomes (AA), 4 carcinomes folliculaires (FTC) et 3 adénomes folliculaires (FA) sont représentés.
0 0.5 1 1.5 2
anxa ckb anxa ckb anxa ckb anxa ckb
fold change
PTC FTC AA FA
1 1 1 1
TMA pathology with number of patients (n)
0 + ++ +++ 0 + ++ +++ 0 <25%
25%-
75% >75% 0 <25%
25%- 75% >75%
Anxa1
cytosol nucleus
staining intensity number of stained cells
cytosol nucleus
Anxa1
M38 PTC (n=20) 3 2 10 5 0 0 13 7 3 3 8 6 0 7 5 8
NPTC (n=19) 19 0 0 0 4 6 9 0 19 0 0 0 4 15 0 0
M25 PTC (n=8) 2 0 6 0 2 0 6 0 2 2 4 0 2 0 3 3
NPTC (n=4) 4 0 0 0 3 0 1 0 4 0 0 0 3 1(<10%) 0 0
M26 AA (n=8) 8 0 0 0 4 0 4 0 8 0 0 0 4 4 0 0
N AA (n=8) 8 0 0 0 5 0 3 0 8 0 0 0 5 3(<10%) 0 0
M38 FTC (n=1) 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0
NFTC (n=1) 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0
M33 FTC (n=5) 5 0 0 0 1 4 0 0 5 0 0 0 1 4 0 0
NFTC (n=3) 2 1 0 0 2 1 0 0 2 1(<10%) 0 0 2 1(<10%) 0 0
M38 ATC (n=4) 4 0 0 0 4 0 0 0 4 0 0 0 4 0 0 0
NATC (n=1) 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0
M38 FA (n=1) 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0
N FA (n=1) 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0
NOS (n=3) 1 0 2 0 0 0 3 0 1 0 2 0 0 1 2 0
N NOS (n=3) 3 0 0 0 3 0 0 0 3 0 0 0 3 0 0 0
CKB
M38 PTC (n=18) 5 11 0 2 16 0 2 0 5 5 4 4 16 2 0 0
NPTC (n=19) 0 6 6 5 8 1 7 1 0 5 8 4 8 8 1 0
M25 PTC (n=11) 0 1 8 2 0 1 9 1 0 0 2 9 0 3 8 0
NPTC (n=9) 0 0 7 2 0 0 5 4 0 0 5 4 0 1 7 1
M26 AA (n=8) 0 0 8 0 5 0 3 0 0 0 1 7 5 2 1 0
N AA (n=9) 0 0 9 0 1 0 8 0 0 0 6 3 1 2 4 2
M38 FTC (n=2) 0 0 2 0 2 0 0 0 0 1 0 1 2 0 0 0
NFTC ( 0) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
NFTC (n=0) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
M33 FTC (n=6) 0 1 5 0 3 1 2 0 0 0 1 5 3 3 0 0
NFTC (n=5) 0 0 4 1 0 0 1 4 0 0 3 2 0 2 3 0
M38 ATC (n=4) 2 1 1 0 4 0 0 0 2 0 0 2 4 0 0 0
NATC (n=1) 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0
M38 FA (n=1) 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0
N FA (n=0) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
NOS (n=3) 0 0 2 1 2 0 1 0 0 0 0 3 2 0 1 0
N NOS (n=3) 0 0 0 3 0 0 0 3 0 1 0 2 0 2 1 0