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Texte intégral

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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Broman, K. (1978). Existence de deux voies cataboliques de l'arginine chez Bacillus licheniformis et recherche du sens physiologique de cette duplication (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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(2)

3 CH

f H E O U E D E CHl^ME

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DES SCIENCES SERVICE DE MICROBIOLOGIE

EXISTENCE DE

DEUX VOIES CATABOLIQUES DE L'ARGININE CHEZ BACILLUS LICHEN IFORM IS

ET RECHERCHE DU SENS

PHYSIOLOGIQUE DE CETTE DUPLICATION

PRESENTE POUR L'OBTENTION DU GRADE LEGAL DE DOCTEUR EN SCIENCES.

ÎCATHLEEN BROHAN

(3)

SlBLiOTHÈQUE DE CHIMIE

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DES SCIENCES SERVICE DE MICROBIOLOGIE

EXISTENCE DE

DEUX VOIES CATABOLIQUES DE L'ARGININE CHEZ BACILLUS LICHENIFORMIS

ET RECHERCHE DU SENS

PHYSIOLOGIQUE DE CETTE DUPLICATION

-JW^^rar PRESENTE POUR L'OBTENTION DU GRADE LEGAL DE DOCTEUR EN SCIENCES

KATHLEEN BROMAN

(4)
(5)

Existence de deux voies cataboliques de l'arginine chez B. 1icheniformis et recherche du sens physio-

logique de cette duplication.

RESUME

Bacillus licheniformis peut utiliser les enzymes arginase, ornithine transaminase et pyrftiline deshydrogenase pour la dégradation de l'arginine. Cette voie conduit à

la formation d'urée, qui n'est pas utilisée, et de glutamate, qui peut servir d'unique source carbonée, azotée et énergétique.

Ce même organisme possède en outre une ornithine carbamoyl- transférase (OTC) inductible par l'arginine. Nous nous sommes donné pour but d'élucider le rôle de cette enzyme.

Nous avons montré que cette transférase inductible fait partie, avec les enzymes arginine désiminase et carbamate kinase, d'une deuxième voie catabolique de l'arginine.

Cette voie apparaît quand une culture contenant de l'arginine est mal oxygénée. Les taux des enzymes de la voie de

l'arginase sont plutôt bas dans ces conditions.

Cette importance de l'oxygénation a été confirmée par deux faits : le nitrate augmente les taux d'arginase et diminue la synthèse d'OTC inductible en a n a é r o b i o s e . Il agit donc comme l'oxygène. Or, le nitrate peut être utilisé comme accepteur terminal d'électrons dans la respiration anaérobique.

D'autre part, un mutant incapable de synthétiser de l'arginase et de l'ornithine transaminase a des taux s i g n i f i c a t i f s peut utiliser l'arginine comme source d'azote en anaérobiose mais pas en présence d'oxygène.

L'existence de ce mutant montre, de plus, que le besoin d'azote et la présence d'arginine ne suffisent pas à l'inducton de la voie de la désiminase.

Un deuxième mutant, issu du premier, possède une voie de

l'arginine désiminase inductible mais déréprimée en présence d'oxygène, et peut utimiser l'arginine comme source d'azote via cette voie dans ces conditions.

(6)

L'importance de la production énergétique delà voie de la désiminase a été examinée. Il semble que ce rôle ne devienne important que sur une source carbonée peu énergétique. Deux mutants apparemment touchés dans la formation d'ATP à partir d'arginine en témoignent.

En outre, différents composés azotés exercent des effets regulatoires sur les deux voies :

(a) la glutamine "réprime" l'arginase en présence de glucose et d'oxygène.

(b) le, glutamate et la glutamine "dérépriment" l'OTC catabolique en anaérobiose.

(c) l'ammonium n'a pas d'effet sur l'arginase mais réprime l'OTC catabolique.

(a) et (c) pourraient être des effets de répression catabolique azotée, (b) reste difficile à interpréter.

Au cours de ces travaux, nous avons également montré que B. 1icheniformis exige de la thiamine pour la croissance anaérobique sur les milieux définis utilisés. Cette exigence ne se manifeste pas en présence d'oxygène.

(7)

Je souhaite exprimer ma profonde gratitude à M. le Professeur J.-M. Wiame, qui m'a accueillie dans son service et qui m'a suivie et inspirée tout au long de ce travail.

Je tiens à dire également un grand merci à Victor Stalon, dont le travail a servi de point de départ à cette thèse et dont les conseils m'ont été d'un grand secours.

D'autres personnes, trop nombreuses pour les nommer toutes, ont apporté leur aide concrète et leur soutien moral à la réalisation de ce travail.

Je tiens à citer tout particulièrement :

- N. Lauwers, pour son aide dans la réalisation de certaines expériences.

- S. Vissers, qui a été mon "objectivité" et une source d'inspiration à plus d'une reprise.

- C. Legrain, A, Mercenier, M. Penninckx,

F. Ramos, J.-P. Simon, A. Urrestarazu et B. Wargnies, qui ont bien voulu partager avec moi leur bonne

humeur, leurs connaissances et leurs points de vue.

- P. Wilquet, pour son travail de dactylographie.

- Tous les membres du personnel universitaire et provincial du laboi-atoire, à qui j'ai souvent donné un surcroît de travail.

Un grand merci à ces personnes, ainsi qu'à toutes celles qui m'ont témoigné del'araitié au cours de ces années.

Ayant bénéficié,de bourses de spécialisation de l'IRSIA, je tiens à remercier cette institution de la confiance qu'elle m'a témoignée.

Enfin, que ma famille sache combien j'apprécie les sacrifices consentis pour me permettre de faire des études.

(8)

TABLE DES MATIERES

Pages INTRODUCTION

I. Utilisation de substances azotées chez les microorganismes. ^

A. Assimilation de l'azote inorganique 1 1. L'azote moléculaire 1

2. Réduction des nitrates 1

3. Assimilation de l'ammonium 2

B. Utilisation de substances organiques ^4 azotées.

II. L'arginine chez les microorganismes 5 Voie de synthèse (Figure I^) 6

Voies de dégradation (Figure I^) 8 Exemples de régulation :

„ , , , , 10

A. La régulation epiarginasique

B. Les deux ornithine carbamoyltransférases des Pseudomonas putida et aeruginosa 11 III. But du travail 12

IV. Le genre Bacillus 1^

A. Présentation l

B. Bacillus licheniformis 15

G. La sporulation et la répression catabolique chez Bacillus 15

V. Rôle coenzymatique de.la thiamine 16 VI. L'oxygène dans le monde microbien 17

(9)

pages MATERIEL ET METHODES

I. Milieux de culture II. Souches utilisées.

III. Conditions de culture IV. Récolte et extraction V. Dosages enzymatiques

VI. Dosage de métabolites de l'arginine dans le surnageant des cultures

19 1 9 21 21 22

25

RESULTATS 27

I. L'ornithine carbamoyltransferase inductible

est une enzyme catabolique. 27

II. Etude complémentaire de la régulation des deux voies.

A. Effet de la thiamine sur la croissance anaérobique.

B. Effet du nitrate sur les deux voies

C. Répression azotée de la voie de l'arginase D. Effets azotés sur l 'or'nithine carbamoyl-

transférase catabolique.

33 36 36 38 39

III. La présence des enzymes de l'une ou l'autre voie reflète bien le mode d'utilisation de 1'arginine.

IV. Recherche de mutants ne pouvant utiliser l'ornithine V. Le mutant dont la voie de la désirainase est réprimée

en présence d'oxygène.

VI. Quelle est l'importance de l'ATP fourni par la voie de l'arginine désiminase ?

39 43 48

49

CONCLUSIONS ET DISCUSSION 55

REFERENCES 62

(10)

1.

INTRODUCTION

I. UTILISATION DE SUBSTANCES AZOTEES CHEZ LES M I C R O O R G A N I S M E S L'azote est un élément essentiel pour les êtres vivants.

Il entre dans la composition des protéines, des acides nucléiques et de nombre d'autres substances qui participent à la vie

cellulaire. Différents types de substances peuvent être utilisées comme sources d'azote par les microorganismes, et d i f f é r e n t e s voies d'assimilation peuvent exister pour une même source azotée.

Certains composés fournissent à la fois del'azote et du carbone, ou servent de précurseurs dans certaines biosynthèses. Les rôles de ces composés et leurs conditions d'assimilation sont reflétés par la régulation qui s'exerce sur les voies m é t a b o l i q u e s

correspondantes. Nous résumerons ici quelques unes de ces voies, ainsi que certains principes généraux de leur régulation.

A. Assimilation de l'azote inorganique.

(Pour des revues, voir réf. 1 et 2).

1. L'azote moléculaire :

La fixation de l'azote moléculaire se rencontre chez les algues bleues, et chez certaines bactéries appartenant aux g e n r e s ' Azotobacter, Klebsiella, Desulfovibrio, D e s u l f o t o m a c u l u m ,

Thiobacillus, Mycobacterium, Bacillus, Clostridium, et parmi les bactéries photosynthétiques.

Cette fixation transforme l'azote moléculaire en a m m o n i u m . Les enzymes qui catalysent cette transformation sont des nitrogénases. La fixation de l'azote nécessite de l'ATP, des substrats carbonés pour accepter l'ammonium produit, un donneur d'électrons et un système de transport d'électrons.

Les nitrogénases sont inactivées par l'oxygène, et la fixation de l'azote nécessite 1'anaérobiose ou la mise en oeuvre de m é c a n i s m e s protecteurs de la nitrogenase. L ' a m m o n i u m et l'ADP sont souvent des inhibiteurs de la nitrogénase. L ' a m m o n i u m peut également fonctionner comme répresseur de sa synthèse.

La présence d'azote moléculaire n'est pas nécessaire pour induire la nitrogénase chez les microorganismes étudiés.

2. Réduction des nitrates :(Réf. 2 et 3)

Les nitrates peuvent être utilisés comme sources azotées par de nombreuses espèces de bactéries, par quelques l e v u r e s , chez certaines moisissures, chez les algues bleues et chez les algues eucaryotes. Nous ne parlerons ici que des voies u t i l i s é e s à cet effet par les bactéries. Chez ces dernières, le nitrate peut être réduit via deux voies bien distinctes. La première voie,

la véritable voie d'assimilation du nitrate, aboutit à la formation d'ammonium. Les intermédiaires connus sont le n i t r i t e , l'oxyde nitrique et 1 ' hydroxylamine (4). La deuxième voie ne produit que rarement de l'ammonium, mais permet l ' u t i l i s a t i o n du nitrate comme accepteur terminal d'électrons dans la respiration

anaérobie.

(11)

2 . En g é n é r a l , les organismes qui peuvent à la fois a s s i m i l e r et respirer le nitrate ont deux nitrate réductases qui sont r é g u l é e s I n d é p e n d a m m e n t . L'enzyme respiratoire est souvent réprimée et inhibée par l'oxygène, et induite par le nitrate, tandis que la nitrate ré du ct as e d'assimilation oeut être réprimée par une meilleure source d'azote, par exemple l'ammonium.

3 . A s s i m i l a t i o n de l'ammonium

Deux voies d'assimilation d e l ' a m m o n i u m se rencontrent fréquemment chez les m i c r o o r g a n i s m e s . Elles sont r e p r é s e n t é e s c i - d e s s o u s . a ) voie de la glutamate d é s h y d r o g é n a s e (réf. 5)

NH, + d - c é t o g l u t a r a t e + NADPH + H* — > glutamate + NADP"^ + H O

b ) voie de la glutamine s y n t h é t a s e - g l u t a m a t e synthase (réf. 6).

NH^ + g l u t a m a t e + ATP — > g l uta m ine + ADP + Po3^

g l u t a m i n e +o^-cétoglutarate + NADPH + H* — > 2 g l u t a m a t e + NADP"^

Chez les c h a m o i g n o n s , c'est la première voie qui est u t i l i s é e . Chez les bactéries, la deuxième voie se rencontre f r é q u e m m e n t , et les deux peuvent exister chez un même organisme. C'est le cas chez K l e b s i e l l a aerogenes. La régulation de ces deux voies chez cet or ga ni sm e mé.rite d'être décrite plus amplement (réf. 7).

Chez K. a e r o g e n e s , la déshydrogénase glutamique ne f o n c t i o n n e bien qu'en présence d'un excès d ' a m m o n i u m , son a f f i n i t é pour ce substrat étant très mauvaise. La g l u t a m i n e synthétase peut utiliser de l'ammonium à faible c o n c e n t r a t i o n . Cette dernière

enzyme possède, en outre, des propriétés r é g u l a t r i c e s r e m a r q u a b l e s : elle réprime sa propre synthèse. C'est une forme i n a c t i v e ,

adénylée de l'enzyme qui provoque cette répression. En p r é s e n c e d'un excès d'ammonium, c'est cette forme adénylée qui prévaut.

Dans ces conditions, il y a donc très peu de g l u t a m i n e synthétase (inactive de surcroît), et l ' a s s i m i l a t i o n de l'ammonium se fait via la g l u t a m a t e déshydrogénase. Quand l'ammonium est en quantité l i m i t a n t e , la glutamine synthétase se trouve, en m a j e u r e partie, sous sa forme active, non-adénylée, et est synthétisée en g r a n d e quantité. Dans ces conditions, la glutamine s y n t h é t a s e réprime la synthèse de la glutamate d é s h y d r o g é n a s e , devenue inutile.

La r é g u l a t i o n en cascade de la gl u tamine synthétase est représen- tée dans la figure 1.1, tirée delà référence 8.

Chez les b a c t é r i e s gram-, cette forme de régulation de la g l u t a m i n e synthétase semble assez générale (9, 10, 11).

Chez les o r g a n i s m e s ^ r a m + , c'est JiLQin.a certain. La. itlutamine synthétase ne subit probablement pas d'adénylation c h e t B a c i l l u s 1i c h e n i f o r m i s ( 1 2 ) . Toutefois, dans un organisme fort proche, le Bacillus subtilis, la glutamine synthétase régule sa propre synthèse ( 1 3 ) . Le mécanisme de cette régulation n'est pas encore connu.

(12)

3

ATP GS

Active

ATase

PPi

GS-AMP Inactive

UMP

UR

U.TP

UTase

PPi

P j^D-UMP'

GS

ADP

ATase

Pi

GS-AMP

Figure II : Régulation de l'activité de la glutamine synthétase chez K. aerogenes.

GS : glutamine synthétase ; ATase : enzyme d' adény lat ion : UTase : enzyme uridylation : UR : enzyme de d é s u r i d y l a t i o n : Pjj : protéine activatrice (P^^-A) et inhibitrice (P^^-D) de 1'adénylation. La transformation de P^^A et P^^D-UMP est activée par 1' c<-cétoglutarate et inhibée par la glutamine.

La réaction inverse est activée par la glutamine et inhibée par 1 ' o(-cétoglutarate .

(13)

B • ]it.i]^isa_tion_de_£ubs_tanGes^_or .

Nous nous limiterons ici, à quelques principes généraux de l'utilisation des acides aminés et de la régulation des voies

métaboliques correspondantes. Au chapitre suivant, nous décrirons plus en détail le métabolisme de l'arginine et son rôle chez les raicr©organismes.

Les acides aminés peuvent avoir plus d'un rôle dans une cellule.

Ils sont utilisés dans la synthèse des protéines, et peuvent également être dégradés pour fournir de l'azote. Souvent, ils servent aussi de sources de carbone, en fournissant des squelettes carbonés susceptibles d'entrer, notamment, dans le cycle de Krebs.

Certains acides aminés sont des précurseurs d'autres acides aminés, ou même d'autres types de composés. La régulation d'une voie d'utilisation d'un acide aminé dépendra du rôle joué par cette voie dans le métabolisme cellulaire.

Quelques modes de régulation fréquemment rencontrés dans la régulation des acides aminés sont :

(1) au niveau de l'activité :-inhibition d'une ou de plusieurs enzymes par certains produits de la chaîne métabolique à laquelle ces enzymes appartiennent, ou par un intermédiaire charnière entre deux voies. Quand plusieurs métabolites exercent une inhibition, leur effet peut être additif, cumulatif, coopératif ou concerté. Certains métabolites peuvent, parfois, antagoniser cette inhibition.

- activation par un précurseur.

(2) au niveau de la synthèse : - répression d'enzymes a n a b o l i q u e s car un produit de fin de chaîne.

- induction d'enzymes cataboliques par la substance qu'elles servent à dégrader. Parfois, c'est un intermédiaire de la chaîne qui assure l'induction.

- répression catabolique : le principe de la répression catabolique est le suivant : un organisme mis en présence d'une bonne source de carbone et d'azote, utilise cette source de préférence aux sources plus pauvres qui se trouveraient dans le milieu de c r o i s s a n c e . Les enzymes d'utilisation des sources médiocres n'apparaissent qu'après épuisement de la bonne source. Ceci donne lieu au

phénomène de diauxie, caractérisé par une croissance compor- tant deux phases exponentielles, séparées par une latence plus ou moins longue (réf.14). Un mécanisme de répression

catabolique carbonée et un mécanisme de répression catabolique azotée, ont été résolus au niveau m o l é c u l a i r e . Nous les

présenterons ici en quelques mots.

Répression catabolique carbonée chez E. coli (réf. 15)

Lorsque E. coli manque d'une bonne source de carbone/énergie pour croître, il apparaît de l'AMP cyclique, signal depauvreté énergé- tique. L'AMP cyclique se lie à une protéine réceptrice (protéine activatrice de gène catabolique, ou CAP) et l'ensemble CAP-AMP cyclique agit comme inducteur de la synthèse d'enzymes sujettes à la répression catabolique carbonée. L'inducteur CAP-AMP cyclique se lie au site promoteur pour faciliter la fixation de la RNA

polyraérase. En présence d'une bonne source de carbone/énergie, l'AMP cyclique n'est pas formé, et l'induction ne peut se faire.

(14)

5 . Répression catabolique azotée chez Klebsiella

aerogenes (réf. 7, 8).

L'histidine est à la fois une mauvaise source d'azote et une mauvaise source de carbone pour Klebsiella aerogenes.

Sur un milieu contenant du glucose, de l ' h i s t i d i n e , et un excès d'ammonium, les enzymes d'utilisation de l'histidine sont réprimées. En présence d'histidine, l'histidase peut être induite par manque de carbone/énergie ou par m a n q u e d'azote.

Si l'organisme a besoin de carbone/énergie, c'est le CAP-AMP cyclique qui induit la synthèse d'histldase. Si l'organisme manque d'azote, c'est la forme active, non a d é n y l é e , de la glutamine synthétase (voir chapitre précédent), qui stimule la synthèse des enzymes de dégradation de l ' h i s t i d i n e . D'autres enzymes cataboliques, qui ne fournissent que de l'azote à la cellule, n'obéissent qu'au contrôle de la g l u t a m i n e synthétase.

Ces deux formes de répression catabolique semblent assez générales chez les gram-. Chez les gram+, ce n'est pas bien établi. Chez les Bacillus, notamment, il n'y a pas de réaction d'adénylation de la glutamine synthétase. Cependant, cette

enzyme intervient dans la régulation de la sporulation ( 1 6 , 1 7 , 1 8 ) , et dans celle de l'histidase (18). Chez ces m ê m e s organismes,

si l'AMP cyclique est parfois détectée (19) les rapports concernant un rôle régulateur éventuel sont contradictoires (20, 21), et sa concentration est beaucoup plus faible que chez les bactéries gram-.

II. L'ARGININE CHEZ LES MICROORGANISMES.

La L-arginine est un acide aminé basique qui entre dans la structure des protéines synthétisées par les êtres vivants.

Voici sa formule : NH -CH-COOH I

^ ^ 2 ^ 3 N-H

I C = NH

I

On voit que cet acide aminé comporte plusieurs groupements

susceptibles de participer à des réactions chimiques. Pour cette raison, s'il nî-existe qu'une voie de synthèse ( Fig. I_ ) comportant peu de variantes chez les prototrophes de l'arginine, cet acide aminé peut être dégradé par des chemins multiples.

La figure I. 2 représente les voies de dégradation de l'arginine connues chez les microorganismes. Nous pourrions résumer ce schéma comme suit :

(15)

Figure 13 : Voie de biosynthèse de l'arginine.

(1) acétylglutamate synthétase ; (2) acétyIglutamate kinase ; (3) N-acétylsemialdéhyde

glutamique réductase ; (^) acétylornithine transaminase ; (5) acétylornithine désacétylase ; (6) ornithine c a r b a m o y l t r a n s f é r a s a ; (7) a r g i n i n o s u c c i n a t e synthétase ; (8) argininosuccinate lyase.

AcétylCoA

glutamate

•> CoA N, - a c é t y l g l u t a m a t e ATP — ^

ADP N, -acétylglutamyl-

phosphate NAOPH h

-*NADP

por N, -acétylsemialdéhyde

glutamique

Glutamate

Aapartate

Carbamylphosphat e.

^ a(-Cétoglutarate

a r g i n i n e

Fomarate

a r g i n i n o s u c c i n a t e

^

c i t r u l l i n e

•> PO 1-

ornithine

^ Acétate

N-acétylornithine

(16)

7.

Figure 12

Voies de dégradation de l'arginine chez les microorganismes.

Noms des enzymes : 1, arginase ; 2, ornithine transaminase ; 3, non enzymatique ; 4, pyrroline déshydrogénase ; 5, arginine désiminase ;

6, ornithine car.baraoyltransférase ; 7, carbamate kinase ; 8, arginine décarboxylase ; 9, arginine

oxygenase decarboxylante ; 10, guanidobutyraraidase ; 11, arginine oxydase ; 12, . d - c é t o a r g i n i n e

décarboxyl(ClS^ ; 13, guanidt)butyrate uréohydrolase, 14, agmatine uréohydrolase ; 15, agmatine désiminase ; 16, putrescine carbamyltransférase ; 17, carbamyl-

putrescine amidohydrolase. l8»guanidinobutyrate déshydro- génase ;

CP: carbanylphosphate SAQ: semialdéhyde glutamlque APC : acide À pyrroline-3-carboxylique

(17)

Figure lat NAD(P)+H

polyamines ou source de C et N

putrescine

glutamate

• ^ 7 ^ A D ( P ) H / (4)

succinate

APC

(3)

NH.

f\y\.y\:^: CO, i:^: urée SAG

ot-Cétoglutarate Glutamate

( 2 ) orni thine

guanidino but y rate \

guanidino- butyratniàe^

5». * r

ARGININE ARGININE

1 >

(8)

1

citrulline

\ (6)

ftDP

cpkiL

agraatine carbarayl-

putrescine ^ 16^

(14)

î

(17

00^

ATP NH..

(18)

9 1. Voie de l'arginase (réf.22) enzymes. (1), (2), (3), (4) :

Cette voie se rencontre chez les eucaryotes (champignons, p r o t o z o a i r e s ) et chez les procaryotes (bactéries des genres Bacillus, Agrobacterium, Proteus).

Cette voie conduit à la formation d'urée, qui peut souvent être dégradée plus loin et servir de source d'azote, et du g l u t a m a t e , acide aminé important dans le métabolisme azoté et pouvant

également servir de source de carbone. Un autre prolongement possible de cette voie est la synthèse de proline, via la semi- aldéhyde glutamique (23,32).

2. Voie de l'arginine désiminase (réf. 2^) :

Cette voie comporte les enzymes 5, 6 et 7. Elle peut

se prolonger de diverses manières. Elle sert de source d'ammonium.

Son rôle de production d'ATP semble très important chez certains organismes fermentatifs comme les Clostridium (25) et les

bactéries lactiques (26).

Lactobacillus leichmanii l'utilise pour former du CO^, et pour la synthèse de carbamoylphosphate nécessaire pour la synthèse des pyrimidines (27). Chez les Clostridium, l'ornithine formée peut être fermentée comme substrat unique (28), f o u r n i s s a n t , via la proline, de l'acide f - a m i n o v a l é r i q u e . D'autres p r o d u i t s de cette fermentation sont l'ammonium, l'alanine et l ' a c é t a t e .

Les Clostridium peuvent également oxyder l'ornithine par la proline ou la lysine. Les produits de l'ornithine sont alors l ' a l a n i n e , l'acétate, l'ammonium et le CO^ (29).

La voie de la désiminase est également présente chez des anaérobes facultatifs comme Aeromonas (30), et chez les Pseudo- monas, aérobes stricts. Là encore, le rôle de production d'ATP pourrait être important, puisque'on observe des niveaux plus élevés de ces enzymes dans des cellules mal o x y g é n é e s (31).

Chez les Pseudomonas encore, -la voie de l'arginine désiminase peut se prolonger par la décarboxylation de l'ornithine (37).

La putrescine obtenue peut servir à synthétiser des polyamines ou servir de source d'azote et de carbone. L ' o r n i t h i n e peut aussi

être transaminée pour former du glutamate ou de la proline.

3. Voie de l'arginine décarboxylase (enzyme 8) (réf. 33) La bactérie E. coli, notamment, utilise cette voie pour la synthèse de putrescine (3^ a et b). La deuxième enzyme de cette voie, dans ce cas, c'est l'agmatine uréohydrolase (n°l4 de la figure ). Streptococcus faecalis dégrade l'arginine via une

arginine désiminase mais l'agmatine peut également être dégrédée, via les enzymes 15, 16 et 17, pour donner de l'ATP, du dioxyde de carbone, de l'ammonium et de la putrescine (36). Certains repré- sentants des genres Pseudomonas et Aeromonas (37) possèdent une voie de dégradation impliquant les enzymes 8, 15 et 17.

La putrescine formée peut être utilisée comme unique source de carbone et d'azote (38 a et b).

(19)

1 0 . 4. Voie de l'arginine oxygénase décarboxylante (enzymes 9 et 10)

(référence 39)

La présence de cette voie a été détectée chez S t r e p t o m y c e s griseus. Elle fournit du dioxyde de carbone, de l'ammonium, de l'urée, et aboutit au succinate par l'intermédiaire du ^ - a m i n o - butyrate, suivie de l'oxydation de la semi-aldéhyde succinique formée.

5. Voie de l'arginine oxydase (enzymes 11^|î«i-12) (référence HO) Un Pseudomonas caractérisé comme P. putida la possède.

Elle ressemble à la précédente, mais commence par la d é s a m i n a t i o n oxydative de l'arginine, suivie de la d é c a r b o x y l a t i o n de

1'e(-cétoarginine obtenue. L'aldéhyde formé est oxydé en guanidinobutyrate qui subit le mSme sort que dans le cas précédent;

6. Ne figurant pas sur le schéma, une autre voie de d é g r a d a t i o n de l'arginine a été détectée récemment chez Klebsiella aerogenes (41). Cette nouvelle voie produit de l'ornithine, sans former d'urée ni de citrulline. Elle forme du glutamate et de l'ammonium. La première enzyme de la voie serait une arginine amidinotransférase,

Nous avons montré que la dégradation de l'arginine peut remplir des fonctions multiples : synthèse de polyamines, de pyrimidines, de proline, formation de g l u t a m a t e , d'ammonium, d'urée, d'ATP, d'aliments carbonés. On s'attend à ce que les effets régulatoires s'exerçant sur la dégradation de l'arginine chez un microorganisme reflètent le rôle joué par l'arginine dans celui-ci. Pour cette raison, l'étude du catabolisme de

l'arginine s'avère propice à la découverte de nouveaux m é c a n i s m e s de régulation. Nous en citerons ici deux exemples qui nous ont '1 menés, par les questions qu'ils ont s u s c i t é e s , à entreprendre le présent travail.

A. La régulation épiarginasique (réf. 42, 43i 44).

La levure Saccharomyces cerevisiae est capable de synthétiser et de dégrader l'arginine. Elle utilise, pour la dégradation, la

voie de 1'arginase-ornithine transaminase-pyrroline d é s h y d r o g é n a s e (45). Certains mécanismes de régulation agissent au niveau de la synthèse des enzymes impliquées dans ce m é t a b o l i s m e . L'arginine réprime les enzymes anaboliques et induit les enzymes c a t a b o l i q u e s . Il y a des éléments communs dans la régulation de l'anabolisme et du catabolisme (45). Le catabolisme est soumis à la répression catabolique azotée (46, 47) et une d é r é p r e s s i o n synergique est provoquée par le besoin d'azote et la présence d'arginine (48).

Outre ces régulation*de synthèse, l'enzyme anabolique, l ' o r n i t h i n e carbamoyltransférase, subit une régulation d'activité d'un type particulier : en présence d'arginine et d'un excès d ' o r n i t h i n e , cette enzyme est inhibée par l'arginase. Il existe, sur l ' o r n i t h i n e carbamoyltransferase deux sites pour l ' o r n i t h i n e , l'un pour la catalyse, l'autre pour la régulation (49, 50). Il y a de même, deux sites pour l'arginine sur l'arginase (51,52). La c i t r u l l i n e peut aussi servir comme effecteur du système (53). L ' i n t e r a c t i o n

(20)

11.

entre les deux protéines semble être facilitée par le fait que toutes deux ont une structure trimérique (54 ').

L'utilité de cette régulation, appelée régulation é p i a r g i n a s i q u e , serait d'empêcher un cycle de l'urée, coûteux en é n e r g i e , dans des conditions où il y a assez d'arginine, beaucoup d ' o r n i t h i n e , et que la dilution, par croissance, des enzymes a n a b o l i q u e s est encore insuffisante.

Il existe une certaine corrélation entre la tendance qu'a une levure à respirer ou à fermenter pour produire son é n e r g i e , et l'existence chez cette levure, de la régulation é p i a r g i n a s i q u e

(56 ). Des études comparatives de c o m p a r t i m e n t a t i o n de

l'arginase et de l'ornithine c a r b a m o y i t r a n s f é r a s e ont également été réalisées chez différentes levures (58). Les c o n c l u s i o n s de ces deux types d'études sont les suivantes :

Les levures obligatoirement respiratrices, ont leur a r g i n a s e dans le cytoplasme, et leur ornithine o a r b a m o y l t r a n s f é r a s e dans les m i t o c h o n d r i e s . Toute interaction entre ces protéines est donc exclue in vivo. Lorsque cette compartimentation est s u p p r i m é e par extraction, l'ornithine c a r b a m o y i t r a n s f é r a s e n'est pas inhibée par l'arginase.

Un grand nombre de levures fermentatrices présentent une i n h i b i t i o n é p i a r g i n a s i q u e en extraits. Celles-ci ont l'arginase et

l'ornithine c a r b a m o y l t r a n s f é r a s e dans le même c o m p a r t i m e n t , le cytoplasme. Les levures fermentatrices dont l'ornithine

c a r b a m o y l t r a n s f é r a s e n'est pas sensible à l ' i n h i b i t i o n par

l'arginase, ont ces deux enzymes dans des c o m p a r t i m e n t s séparés.

Il s'agit surtout de levures respiratrices p r é f é r e n t i e l l e s . Cette corrélation entre la compartimentation et la régulation é p i a r g i n a s i q u e semble logique, puisqu'une régulation de ce type n'a de sens que si les enzymes peuvent entrer en contact.

La question fondamentale que l'on voudrait résoudre par ce type d'étude est la suivante : quelles sont les poussées s é l e c t i v e s qui ont agi pour favoriser la localisation de l'ornithine trans- carbamylase dans le cytoplasme, et l'apparition corrélée de la régulation épiarginasique ? En quoi le mode et le lieu de la production d'énergie ont-ils influencé cette évolution ?

B. Les deux ornithine c a r b a m o y i t r a n s f é r a s e s de P s e u d o m o n a s putida.et aeruginosa (références 5 9, 3 1, 6 4 , 1 0 5 , 8 0 )

Pseudomonas putida svnthétise l'areinine par la voie h a b i t u e l l e , et possède pour la dégradation de ce composé une voie arginine désiminase. Il existe une étape commune entre la b i o s y n t h è s e et le catabolisme de l'arginine, c'est, dans le sens a n a b o l i q u e , la c a r b a m o y l a t i o n de l'ornithine, et dans le sens c a t a b o l i q u e , la phosphorolyse de la citrulline. Une enzyme qui catalyse l'une de ces réactions s'appelle ornithine c a r b a m o y l t r a n s f é r a s e .

Pseudomonas putida en possède deux. L'une de ces t r a n s f é r a s e s ne peut fonctionner, in vivo, que dans le sens p h y s i o l o g i q u e , à cause de ses propriétés a l l o s t é r i q u e s : il y a un effet de seuil pour l ' u t i l i s a t i o n du carbamoylphosphate. La deuxième t r a n s f é r a s e ne fonctionne que dans le sens anabolique. Ce sont ses propriétés cinétiques qui entraînent cette irréversibilité : la c i t r u l l i n e ne se fixe pas bien 8ur le site catalytique, mais forme plus facilement, par fixation en un autre site, un complexe a b o r t i f e n z y m e - c i t r u l l i n e .

(21)

1 2 o

L'enzyme catabolique ne nécessite pas la présence d'arginine

pour être induite, mais subit une certaine répression c a t a b o l i q u e carbonée. La répression de l'enzyme anabolique par l ' a r g i n i n e n'est que partielle. Il s'ensuit que les deux ornithine c a r b a - moyltransf érases sont toujours présentes simultanément.

A première vue, une seule enzyme réversible (la plupart des OTCases le sont) ferait bien l'affaire, et on peut se d e m a n d e r quel est le sens de ce dédoublement. La réponse semble être

que le dédoublement des transférases, avec leur i r r é v e r s i b i l i t é , permet une régulation plus fine au niveau de l'activité c a t a l y - tique. En effet,l'ATP et les polyamines, produits du c a t a b o l i s m e sont des inhibiteurs de l'enzyme dégradative. Il semble donc que ces deux transférases de Pseudomonas putida aient atteint un degré de spécialisation remarquable, qui leur permet une bonne intégration dans l'ensemble du métabolisme de l'arginine chez cette bactérie. La même situation se présente chez P. a e r u g i n o s a .

III. BUT DU TRAVAIL

Nous avons montré par des exemples, comment l'étude d ' u n e voie métabolique chez un microorganisme donné, permet, p a r f o i s , la découverte de nouveaux mécanismes régulatoires, et aide à situer cet organisme parmi ceux qui utilisent la même voie ou le même mode de régulation.

A long terme, on attend d'une telle étude, qu'elle c o n t r i b u e à élucider la nature des pressions sélectives qui agissent au cours de l'évolution et aboutissent à la sélection d'une voie ou d'un système de régulation. Il est donc important de c o m p r e n d r e le rôle physiologique des enzymes et des types de r é g u l a t i o n s que 1'on étudie.

Ainsi, on interprète le phénomène de régulation é p i a r g i n a - sique en termes d'économie énergétique, et on cherche à c o m p r e n d r e le lien qui existe entre ce mécanisme régulatoire et les m o y e n s utilisés par différentes levures pour la synthèse de l'ATP.

De même, on voit que l'irréversibilité, in vivo, des ornithine carbamoyltransférases de P. putida, permet une régulation au niveau de l'activité de ces enzymes, en rapport avec les besoins cellulaires.

Mais que penser d'un organisme qui dégrade l'arginine via la voie de l'ar^inase comme S. cerevisiae, mais possède deux ornithine carbamoyltransférases dont l'une est inductible par l'arginine ? C'est le cas de Bacillus licheniformis.

Une voie de l'arginase complète a été mise en évidence chez cet organisme par deux groupes de chercheurs (60, 6î).

Cette voie produit de grandes quantités de glutamate qui peut servir d'unique source de carbone et d'azote (63). De Hauwer et al. (60) ont isolé des mutants constitutifs pour une perméase de l'arginine, pour l'arginase, et pour l'orithine transaminase , et des mutants non inductibles pour l'ensemble des enzymes de la voie Ils ont proposé une organisation en deux opérons pour les gènes codant pour les enzymes de cette voie.

(22)

1 3 .

L'existence de deux ornithine carbamoyltransferases a été démontrée par Laishley et Bernlohr (62, 63)- L'une de ces enzymes est régulée comme une enzyme anabolique; elle est réprimée par l'arginine. La deuxième enzyme est induite par l'arginine et réprimée par le glucose. Elle semblait donc devoir jouer un rôle catabolique, comme chez les organismes qui possèdent une voie de l'arginine déslminase. Toutefois, plusieurs objec- tions s'opposaient à cette hypothèse : 1°) Laishley et Bernlohr ne parvenaient pas à mettre en évidence une arginine désiminase.

2°) Ils n'ont pas non plus réussi à faire fonctionner l'enzyme inductible dans le sens catabolique. 3°) L'importance de la voie de l'arginase étant connue, à quoi servirait une d e u x i è m e voie de formation d'ornithine à partir d'arginine ?

Legrain et Stalon (64) ont fait tomber la deuxième o b j e c t i o n i en faisant travailler les deux ornithine c a r b a m o y l t r a n s f e r a s e s de B. licheniformis dans les deux sens de la réaction. L'échec des investigateurs précédents était vraisemblablement dû au pH utilisé et au fait qu'ils ont employé trop peu d'enzyme dans leurs expéri- ences. D'autre part, des études taxonomiques (65, 66) ont montré que des cellules entières de B. licheniformis peuvent e x c r é t e r de l'ornithine, de la citrulline et de l'ammonium en p r é s e n c e d'arginine. Ces résultats étaient compatibles avec l ' e x i s t e n c e d'une voie de l'arginine désiminase, sans pour autant la prouver.

L'enzyme inductible présente une autre particularité : elle est trimérique, et de poids moléculaire faible, alors que la

plupart des ornithine carbamoyltransférases cataboliques comportent de plus nombreuses sous-unités (64). La régulation é p i a r g i n a s i q u e est absente chez les deux transférases de B. licheniformis (68), alors que B. subtilis, un organisme voisin, possède une ornithine carbamoyltransférase anabolique inhibable par son arginase (69).

Ce fait paraissait d'autant plus frappant que B. subtilis est un aérobe assez strict, alors que B. licheniformis est un bon

fermentateur. Le cas de Bacillus licheniformis posait donc une énigme, puisqu'il apparaissait à la fois comme un lien entre les situations présentes chez S. cerevisiae et P. putida, et comme une contradiction à la logique des deux systèmes.

L'ensemble de ces considérations a conduit à la recherche du rôle physiologique de l'ornithine c arba moy ltran sfé rase

inductible de Bacillus licheniformis. C'est là le but du travail.

Avant d'aborder l'étude proprement dite, nous allons pour- suivre cette introduction. Nous espérons que les chapitres

suivants apporteront quelques précisions qui permettront de mieux comprendre l'ensemble d e s problèmes qui se sont posés au cours de c e t r a v a i l .

(23)

IV . LE GENRE BACILLUS

A • t a t i o n (Réf. 70 et 71)

Le genre Bacillus regroupe des bactéries en forme de bâtonnets, aérobes ou anaérobes facultatifs, qui forment des endospores thermorésistantes. Ces bactéries se rencontrent fréquemment dans le sol, dans l'eau et dans les matières organiques en décompo- sition. Elles sont généralement gram+, et souvent mobiles par des flagelles péritriches. Les distinctions entre espèces sont basées sur des critères tels que : morphologie des cellules et des spores, capacités dégradatives, la croissance ou non en anaérobiose, les exigences nutritionnelles, la mobilité, la rétention de la coloration de gram, l'utilisation des nitrates, de l'azote m o l é c u l a i r e ...

Il existe des espèces pathogènes de mammifères, et des espèces

qui fabriquent, lors de la sporulation, des substances c r i s t a l l i n e s toxiques aux larves d'insectes. D'autres espèces semblent

dépourvues de caractère pathogène. Certains Bacillus sont

thermophiles. Plusieurs sont utilisés dans la recherche fondamentale pour leur peu d'exigences nutritionnelles et pour la possibilité d'utiliser l'outil génétique dans l'étude de leur physiologie

(transduction et transformation). Souvent, ils sont examinés en

tant que représentants du groupe des grara+, pour des c a r a c t é r i s t i q u e s propres aux organismes de ce groupe (structure de la paroi, par

exemple), ou comme base de comparaison quand il s'agit d'estimer l'étendue ou la généralité d'un phénomène connu chez un organisme gram-. Enfin, la sporulation et la germination sont intensément étudiées chez les Bacillus. Le processus de sporulation apparaît comme une forme de différenciation cellulaire. Ainsi, l'intérêt de l'étude de la sporulation dépasse le cadre de la physiologie

bactérienne : certains mécanismes mis en évidence dans ce système relativement simple pourraient se retrouver chez des organismes plus complexes .

L'utilisation du glucose chez les Bacillus étudiés (72, 73» 7^, 75), se fait principalement via la voie glycolytique d'Embden- Meyerhof-Parnas, avec une participation moindre de la voie des hexoses-monophosphate. La plupart desBacillus ont un cycle de Krebs complet en présence d'oxygène mais certains n'ontqu'un cycle partiel (78).

Les produits obtenus lors de la fermentation du glucose variant suivant les espèces de Bacillus et peuvent dépendre des c o n d i t i o n s de culture. Bacillus coagulans effectue une fermentation homo- lactique. B. cereus, B. Subtilis et B. licheniformis produisent surtout du glycerol et du 2-3 butanediol. B. polyrayxa forme du 2,3-butanediol, de l'éthanol et du dihydrogène ; B. m a c e r a n s produit de l'éthanol, de l'acétone, de l'acide acétique et de l'acide forraique.

(24)

B. Bacillus 1icheniformis 1 5 Bacillus licheniformis est un bacillus mobile, gram +. Il peut croître sur un milieu simple, ne contenant que des sels minéraux, du glucose et de l'ammonium. Il fut longtemps

considéré comme une variété de Bacillus subtilis, et doit son statut d'espèce à sa capacité de fermenter rapidement le

glucose (72, 79, 71). Bacillus 1icheniformis utilise les n i t r a t e s comme source d'azote et pour la respiration anaérobique. Comme les autres bacillus, il utilise, comme voie principale pour l'assimilation d'ammonium, la voie de la g l u t a m i n e - s y n t h é t a s e - glutamate synthase (81,82). n possède en outre une glutamate déshydrogénase dont le rôle est mal connu (82). L ' u t i l i s a t i o n du glucose a été bien étudiée chez cet organisme (72, 83)-

En présence d'oxygène, il y a production surtout de 2, 3 - b u t a n e d i o l , d'acetoïne et de CO^- En anaérobiose, les produits principaux

sont le 2 , 3 - b u t a n e d i o l , le glycerol et le CO^, et chez c e r t a i n e s souches, d'assez grandes quantités d'acide lactique. L ' a c é t a t e améliore le rendement en CO^ et en 2 , 3 - b u t a n e d i o l , tout en

diminuant fortement la quantité de glycérol formé. L'acétate n'est pas incorporé dans le butanediol, mais sert d ' a c c e p t e u r d'hydrogène, produisant de l'éthanol. La thiamine favorise la formation du 2,3-butanediol et du CO^ par rapport à la formation d'acide lactique (84).

La transduction et la transformation sont utilisées chez B . l i c h e n i - formis (85, 86).

C. La sporulation et la répression catabolique chez B a c i l l u s (réf. 77, 87, 88,.89).

Lorsque certaines substances nutritives (carbonées ou a z o t é e s ) s'épuisent dans le milieu où croît une population de B a c i l l u s , le phénomène de sporulation se déclenche. Les t r a n s f o r m a t i o n s m o r p h o l o g i q u e s qui mènent à la formation de l'endospore,

s'accompagnent d'événements biochimiques : synthèse de p r o t é a s e s , turnover rapide des protéines et du RNA, synthèse des c o n s t i t u a n t s de l'enveloppe de la spore, synthèse d'enzymes normalement

réprimées pendant la croissance végétative, apparition de s u b s t a n - ces a n t i b i o t i q u e s . Il est parfois difficule de déterminer si un événement observé a un rapport direct avec la sporulation, ou s'il s'agit d'un phénomène parallèle provoqué par l'épuisement du milieu. Ainsi, on s'est longtemps demandé si la sporulation et la dérépression catabolique obéissaient à un mécanisme commun.

Les signaux de la répression catabolique sont encore mal connus, chez Bacillus. L'AMP cyclique a été détectée chez certaines espèces (19), mais son rôle d'effecteur n'est pas établi (20).

De même, on n'a pas pu mettre en évidence une réaction d ' a d é n y l a - tion de la glutamine synthétase (12). A l'heure actuelle, il

semble que la sporulation s'apparente plus à la division c e l l u l a i r e (90) qu'à la répression catabolique. L ' e x i s t e n c e de mutants

réprimés pour la sporulation et de mutants capables de sporuler en milieu riche, mais présentant une répression catabolique n o r m a l e , incite à penser à l'indépendance des deux phénomènes. Ceci n'exclut pas cependant, que certains effecteurs communs puissent i n t e r v e n i r dans les deux mécanismes. En tous cas, la glutamine s y n t h é t a s e

semble être impliquée dans les deux processus : ,des riutants gin

ne sporulent pas (17,18) et produisent des nivea^ix^^c^^istidase (18).

Il a été suggéré qu'un intermédiaire de la chaîne b i o s y n t h é t i q u e des purines serait un effecteur dans la régulation de la

sporulation (91) et que la glutamine synthétase en serait le récepteur.

(25)

1 6 ,

D'autres substances ont été envisagées comme effecteurs de ces deux processus. Parmi celles-ci, il y a le GMP cyclique, qui est présent lors de la croissance végétative de Bacillus liche- niformis, mais qui disparaît à la fin de la croissance (92).

On pensait que cette substance pourrait avoir une s i g n i f i c a t i o n opposée à celle de l'AMP cyclique chez les gram-. Cette idée n'a pas encore eu de confirmation e x p é r i m e n t a l e .

On a également détecté des nucléotides hautement p h o s p h o r y 1 é e s , distincts des"magie spots" connus chez E. coli, et apparaissant au début de la sporulation. Ces substances pourraient bien

avoir un rôle dans la sporulation (93)-

V. ROLE COENZYMATIQUE DE LA THIAMINE (Réf. 95 et 97)

La thiamine, appelée aussi aneurine et vitamine El,est un coenzyme qui participe à plusieurs r é a c t i o n s impliquées dans le métabolisme carboné des êtres vivants. Certains organismes synthétisent ce coenzyme, d'autres l'exigent dans leur n u t r i t i o n La structure de la thiamine est la suivante :

NH^

CHr=-C CH

' \ /

I

C - CH.

C^ - CH^ - CH^ - OH

Groupe pyrimidine substitué

Groupe thiazole substitué

C'est l'ester pyrophosphorique de la t h i a m i n e qui agit in vivo, comme coenzyme.

Relativement peu est connu de la biosynthèse de la thiamine.

On sait que les entités pyrimidine et t h i a z o l e sont formées séparément, et la réaction d'union de ces deux entités a été étudiée (110), mais on ignore par quelles voies ces deux entités sont formées. Il semble que la biosynthèse de la pyamine

( 2 - m é t h y l - 4 - a m i n o - 5 - h y d r o x y m é t h y l - p y r i m i d i n e ) ne suit pas la voie connue pour la synthèse des pyrimidines et que la formation du groupe thiazole diffère de celle que l'on rencontre dans la synthèse des pénicillines et bacitrines. Les difficultés de ces études résultent notamment des faibles quantités de thiamine produites par les organismes capables de la synthétiser. C e l l e s - ci sont du même ordre que les besoins c e l l u l a i r e s .

Les réactions biochimiques auxquelles participe la

thiamine ont toutes un point commun : elles impliquent le clivage d'une liaison C - C adjacente à une fonction cétone, avec

transfert de l'une des portions du substrat sur le carbone en 2 de l'entité thiazole. Cette portion c o n s t i t u e alors un

"groupe activé" qui peut être cédé à un a c c e p t e u r pour former le produit.

(26)

1 7 .

Les réactions de clivage du pyruvate sont parmi celles qui nécessitent la thiamine comme coenzyme. Le "groupe a c t i v é "

est alors 1'hydroxyméthylthiamine pyrophosphate, ou " a c é t a l d é h y d e activé". Ce groupement peut être libéré sous forme d ' a c é t a l d é h y d e

(pyruvate décarboxylase de levure) ou cédé à un accepteur tel que 1'acétaldéhyde (formation d'acétoïne chez la levure), le pyruvate (formation d'acétoïne chez les bactéries), ou l'acide l i p o ï q u e (formation d'acétyIcoenzyme A). Les réactions p h o s p h o r o c l a s t i q u e s du pyruvate exigent également la présence de thiamine p y r o p h o s p h a t e Il se forme alors de 1'acétyIphosphate, de l'hydrogène et du

dioxyde de carbone, ou de 1 ' acéty1-phosphate et de l'acide formique D'autres réactions qui utilisent ce coenzyme sont celles c a t a l y s é e s par la transkétolase, la phosphokétolase, 1' «(-cétoglutarate

déshydrogénase et la glyoxylate carboligase.

VI. L'OXYGENE DANS LE METABOLISME MICROBIEN (Réf. 9^,95, 98).

L'oxygène est un élément qui intervient à plusieurs titres dans le métabolisme des microbes. L'oxygène m o l é c u l a i r e est un accepteur terminal d'électrons chez les organismes qui tirent leur énergie du processus respiratoire. Chez les e u c a r y o t e s photosynthétiques, c'est un produit de^^l^a photosynthèse.

L'oxygène est également indispensable pour la dégradation de certains composés (hydrocarbures, dérivés aromatiques, s t é r o l s , proline) et il intervient dans plusieurs voies b i o s y n t h é t i q u e s

(acides gras non saturés, acide nicotinique, p o r p h y r i n e s ,

quinones, caroténoïdes, stéroîdes), surtout chez les e u c a r y o t e s . L'oxygène joue également, directement ou non, un rôle r é g u l a t e u r dans un bon nombre de processus cellulaires. La croissance d'un anaérobe facultatif est généralement plus rapide, et à m e i l l e u r rendement, en présence d'oxygène, du fait que la r e s p i r a t i o n produit plus d'ATP que la fermentation. Le degré d ' a é r a t i o n du milieu de culture influence la nature des produits obtenus à partir d'un substrat carboné donné. La relation entre la tension d'oxygène dissous dans une culture, et la vitesse de respiration (nombre de mmoles d'O^ consommés par gramme de

cellules et par heure) n'est pas une relation simple. K l e b s i e l l a aerogenes, c u l t i v é en chémostat en présence d'un excès de

glucose ou d'une quantité limitante de ce substrat, se comporte de la façon suivante (99) : (a) à une tension d'oxygène d i s s o u s supérieure à 10 mm de mercure, la vitesse de respiration est indépendante de la tension d'oxygène ; (b) entre 0,5 et 10 mm Hg, il s'établit une phase "pertui^'hée", caractérisée par des oscillations de tension d'oxygène dissous qui reflètent des oscillations de vitesse de respiration ; (c) en dessous de 0,5 mm de Hg, il y a une nouvelle phase stationnaire, avec une vitesse de respiration plus élevée que dans la premiè re phase, et une diminution du rendement de croissance; (d) quî.nd la quantité d'oxygène dissous devient beaucoup plus petite, la vitesse de respiration finit par décroître.

Pendant la phase d'oscillation, une tension d'oxygène plus élevée correspond à une vitesse de respiration plus basse, et i n v e r s é m e n t .

(27)

1 8 .

Pendant la partie du cycle où la tension d'oxygène est élevée, un abaissement brutal de la tension d'oxygène en dessous d'une certaine valeur ( 2 à 4 mm Hg) provoque une augmentation de la vitesse de respiration. De même, lorsque la tension d'oxygène est basse, une augmentation brusque de la quantité d'oxygène fournie provoque un ralentissement de la respiration.

Ces expériences laissent supposer qu'il existe des m é c a n i s m e s de feedback agisssant rapidement pour réguler le processus de respiration. Si certaines autres bactéries ont un comportement

analogue à celui de K. aerogenes (Haemophilus parainfluenzae (100), E. coli ( 1 0 1 ) et Pseudomonas AMI ( 1 0 2 ) ) , la bactérie fixatrice

d'azote, Azotobacter, présente une régulation très différente ( 1 0 3 ) . La respiration chez cet organisme est d'autant plus

rapide qu'il y a plus d'oxygène. L'accroissement de la r e s p i r a t i o n s'accompagne d'une diminution de rendement. Dans ces c o n d i t i o n s , une bonne partie de l'oxygène respiré est réduitpar une chaîne de transport d'électrons parallèle, non couplée à la production d'ATP. Il s'agirait là d'un mécanisme protecteur de la f i x a t i o n d'azote très sensible à l'oxygène.

L'oxygène intervient encore comme régulateur de la synthèse d'enzymes. Il peut provoquer l'induction de la formation de mitochondries (levures), de la capacité respiratoire, de la synthèse de cytochromes et de déshydrogénases respiratoires

(levures, Staphylococcus, E. coli, Pasteurella pestis), des enzymes du cycle de Krebs (Bacillus, E. coli, P. pestis,

Aerobacter aerogenes), de la phosphorylation oxydative ( E . c o l i ) et de la biosynthèse des quinones. Il peut réprimer la s y n t h è s e des enzymes de la respiration anaérobie (nitrate réductase , thiosulfate r é d u c t a s e ) ou d'enzymes i m p l i q u é e s dans la

f ermentation.

Si relativement peu est connu des signaux qui participent à cette régulation au niveau moléculaire, il semble que c e r t a i n s effets de l'oxygène sur la synthèse des protéines seraient dus à l'action d'un répresseur (ou d'un i n d u c t e u r ) dont l'action dépendrait du potentiel rédox de la cellule. Le composé qui serait sensible à la présence de l'oxygène pourrait être un composant de la chaîne de transport d ' é l e c t r o n s vers l'oxygène.

Un mutant d'E. coli, dépourvu d'un élément de la chaîne compris entre le cytochrome b et l'oxygène, produit des taux élevés de nitrate réductase respiratoire en présence d'oxygène (104).

En plus des rôles qu'il joue, l'oxygène peut également être toxique, à faible dose, pour des anaérobes strictes, et à forte pression, pour des organismes respirateurs.

Deux métabolites responsables de cette toxicité ont été _ identifiées : l'eau oxygénée et le r a d i c a l - i o n superoxyde 0' La catalase protège contre la première, la superoxyde dismutase élimine le second.

D'autres mécanismes de toxicité d'oxygène sont encore mal connus.

(28)

1 9 .

MATERIEL ET METHODES

I. MILIEUX DE CULTURE

Tous les milieux de croissance contenaient le milieu m i n é r a l 15^ (réf. 105) dont la composition est la suivante :

Pour 1 litre d'eau distillée : 1,4 g KH^PO^ ; 14,3 g Na^HPO^.

12 H^O ; 0,6 g NaCl ; 1,7 g ^2^^H ' ^" ' 0 ' 2 5 . 1 O " ^ M ; MgSO^ : 2.10"^* M; FeCl^ : 2.10"^M.

A partir du chapitre II des résultats, toutes les cultures contenaient également 0,001 rag/ml de thiamine.

Les sources de carbone et d'azote variaient suivant les

expériences ; elles étaient utilisées aux c o n c e n t r a t i o n s suivantes (sauf lorsqu'une autre concentration est s i g n a l é e ) :

acides aminés : 20 mM ; glucose : 20 mM (cultures a é r o b i e s ) et 40 mM (cultures a n a é r o b i e s ) ; pyruvate de sodium : 100 mM ; sulfate d'ammonium : 10 mM ; nitrate de potassium : 40 mM.

Les milieux solides contenaient de l'agar à 2 %.

Le milieu de germination des spores contenait, outre le 154 et la thiamine, du glucose, du glutamate, de l'ornithine et de l'alanine, dans le cas de la sélection de mutants i n c a p a b l e s de croître sur l'ornithine comme source d'azote. Pour la sélection des mutants CK6 et CK40, le milieu de g e r m i n a t i o n contenait du glucose, de l'arginine, du sulfate d'ammonium et de l'alanine.

L'alanine est connu comme facteur nécessaire à la g e r m i n a t i o n des spores de Bacillus (réf.106).

II. SOUCHES UTILISEES

Souche sauvage : Bacillus licheniformis ATCC (American Type Culture Collection) n" 14580.

Sé 1^££t^i^on_des_mutant^£ : (inspirée des réf. 60 et 17)

Mutants BL-196, BL-187, BL-237, BL-337 : 5.10^ à 10^° spores ont été irradiées à la lumière ultra-violette jusqu'à une survie d'environ 5 pour mille. Les spores irradiées ont été lavées à l'eau, resuspendues dans 50 ml de milieu de g e r m i n a t i o n , et a g i t é e s à l'air à 37''C pendant trois heures. Après ce temps,

(29)

2 0 o

les cellules germées ont été lavées deux fois dans du milieu n°15^, et resuspendues dans 25 ml de milieu sélectif contenant du glucose et de 1 ' ornithine comme sources de carbone et d'azote.

Après une heure d'agitation aérée à 37°C, de la pénicilline a été ajoutée dans le milieu à raison de 10.000 U /ml. L ' a g i t a t i o n a continué pendant trois heures. Les cellules restantes ont été lavées trois fois dans du milieu 154, resuspendues dans 10 ml de ce même milieu et étalées, à raison de 0,1 ml/boîte sur des

boîtes de Pétri contenant du glucose et du glutamate comme sources de carbone et d'azote. Cette sélection a donné quatre mutants incapables de croître sur glucose + ornithine, en présence d'oxygène, sur les 500 colonies testées. Une méthode similaire a été utilisée par De Hauwer et al. pour la sélection de m u t a n t s du catabolisme de l'arginine chez Bacillus (réf. 60).

Le mutant BL-196-2 a été obtenu spontanément à partir du mutant BL-196. Il a été sélectionné pour sa capacité de croître sur glucose + arginine en présence d'oxygène.

Les mutants CK-6 et CK-HO ont été obtenus par irradiaton de spores et par sélection à la pénicilline, comme décrit plus haut, à quelques différences près. Le milieu de germination était

différent (voir Milieux de culture), et la germination a été

réalisée sous atmosphère d'azote (voir Cultures en anaérobiose ) . L'agitaion dans le milieu de germination a duré 8 heures.

Le milieu de sélection contenait du pyruvate de sodium comme source de carbone, et de l'arginine et du sulfate d'ammonium comme sources d'azote. La sélection à la pénicilline s'est faite en anaérobiose, et a duré 16 heures. Les cellules ayant résisté à l'action de la pénicilline ont été étalées sur

glucose + ammonium, et les colonies auant poussé sur ce milieu en présence d'oxygène ont été testées pour leur capacité de croître, en anaérobiose, sur glucose + arginine et sur pyruvate + arginine. Les mutants CK-5 et CK-40 croissent normalement sur le premier milieu, mais non sur le second.

Ils croissent normalement sur pyruvate + NH^ en présence d'oxygène.

Tous ces mutants seront décrits plus amplement dans le chapitre des résultats.

(30)

III. CONDITIONS DE CULTURE

2 1 .

Les cultures aérobies "bien oxygénées" ont été réalisées dans des fioles cylindro-coniques de 1 1 contenant 500 ml (Chapitre I des résultats) ou 100 ml (Chapitres suivants ) de milieu de

culture. Elles ont été agitées vigoureusement à l'air.

Les cultures "mal oxygénées" du Chapitre I ont été faites dans des fioles de 1 1 remplies jusqu'au g o u l o t , et agitées également.

Les cultures liquides anaérobies ont été réalisées dans des

fioles spéciales pourvues d'une cellule pour la lecture de densité optique, et de deux robinets rodés, permettant le passage d'un courant d'azote pur à l'intérieur de la fiole, ainsi que la fermeture hermétique de celle-ci. Le courant d'azote servait à chasser l'air contenu dans la fiole,et à le remplacer.

Les conditions ont été ajustées empiriquement de manière à ce que les dernières traoes d'oxygène, détectables au bleu de

méthylène, disparaissent dans des cultures-témoins avant toute croissance visible. Le milieu de fioles-témoins ouvertes après ce temps redevenait bleu. Nous pensons que 1 ' anaérobiose

obtenue de cette manière devait être assez bonne, puisque

certains milieux, qui supportent une bonne croissance en présence d'oxygène, ne donnent plus aucune croissance dans ces conditions.

Les cultures anaérobies sur boîte ont été réalisées dans une

boîte fermée contenant un générateur d'hydrogène et de CO^, ainsi qu'un catalyseur de la formation d'eau à partir de dihydrogène et de dioxygène (Gas-Pak, B.B.L.)

Toutes les cultures ont été réalisées à 37''C.

IV. RECOLTE ET EXTRACTION

Les cultures ont été récoltées par centrifugation, en phase

g

exponentielle de croissance, vers DO = .500 (5.10 c e l l u l e s / m l ) pour les cultures aérobies, et vers DO = .170 pour les c u l t u r e s anaérobies. Les culots ont été lavés dans une solution de

chlorure de sodium à 0,9 %•

Pour l'extraction, les cellules ont été resuspendues,dans la plupart des cas, dans du tampon phosphate M/20 à pH 7,5.

(31)

2 2 «

Pour le dosage de l'arginine désiminase, le tampon utilisé était le tampon Na'^-citrate (50 mM), à pH 5,4, et pour le dosage de la carbaraate kinase, le tampon d'extraction était le t r i s - H C l 50 mM à pH 7,2. Les extraits ont été préparés par traitement

aux ultrasons dans un appareil Mullard pendant cinq minutes.

V. DOSAGES ENZYMATIQUES

Tous les dosages ont été réalisés à 37°C.

Do3a£e_de_l^_^ar£i_na3e (Archibald, réf. 107) : Ce dosage a été fait par détermination colorimétrique de la quantité d'urée formée dans 2 ml de mélange réactionnel contenant de l ' a r g i n i n e 50 mM, du tampon glycine-NaOH 50 mM à pH 9 et du chlorure de manganèse, à une concentration finale de 5 mM. La réaction a été déclanchée par l'arginine et arrêtée par 2 ml d'acide chlorhydrique 1 N. Le milieu a été acidifié par 1,5 ml d'un

mélange d'acide sulfurique c o n c e n t r é e t d'acide o r t h o p h o s p h o r i q u e concentré dans les proportions 1 : 3 (en volume), et 0,25 ml de phèny1-propanedione rrionoxime à 3 % dans l'éthanol ont été a j o u t é s . La coloration est arrivée à saturation an bout de 90 minutes au bain-marie bouillant.

Dosage de l'ornithine carbamoyltransférase (Archibald, réf. 107) : L'ornithine carbamoyltransférase a été dosée par d é t e r m i n a t i o n colorimétrique de la quantité de citrulline formée dans 2 ml de mélange réactionnel contenant du tampon EDTA-NaOH 6.10 M à

pH 8,5, de l'ornithine 5 mM et du c a r b a m o y l p h o s p h a t e de lithium à la concentration de 10 mM. La réaction a été déclenchée par

le carbamoylphosphate et arrêtée et préparée pour la c o l o r i m é t r i e comme dans le dosage précédent. L ' i n c u b a t i o n au bain-marie

bouillant avec le réactif colorimétrique (diacétylmonoxime ) a duré 30 minu-f-es .

Quand nous avons dosé l'ornithine c a r b a m o y l t r a n s f é r a s e , nous n'avons pas séparé sur colonne l'enzyme catabolique de l'enzyme anabolique. Toutefois, les travaux de Laishely et Bernlohr (62) ont montré qu'en présence d'arginine il n'y a pratiquement pas d'ornithine carbamoyltransférase anabolique, et qu'en absence d'arginine, l'enzyme catabolique n'est pas induite.

(32)

2 3 .

Figure M1 : Inhibition par excès d'ornithine • des deux ornithine carbamoyltransférases de B. licheniformis ATCC 14580.

enzyme catabolique(^ enzyme anabolique +- La concentration en ornithine mise à part,

les conditions sont celles du dosage (voir texte).

I' I' \' I* 1^ 1^ r

[ORMITHINE] 10 M

(33)

Dans le cas où nous doutions de l'identité de l'enzyme dosée , un test rapide permettait de les distinguer. Les deux enzymes de notre souche diffèrent par leur schéma d'inhibition par

excès d'ornithine. Ces schémas sont montrés dans le graphique Ml

Ë£ 2 Ë: £ £ _ Ë £ _ l A â £ £ i l l i l l ^ _ ^ i . â i î ! î i l l â . ^ ® (Archibald, réf. 107): L'arginine désiminase a été dosée par détermination colorimétrique de la

quantité de citrulline formée dans 2 ml de mélange réactionnel contenant du tampon citrate 50 mM à pH 5,4, de l'arginine 50 mM,

-2

du chlorure de manganèse 2.10 M et 0,1 mg d'uréase. La réaction a été démarrée par l'extrait, arrêtée par 2 ml de TCA à 6 ^ et centrifugée pour précipiter l'excès de protéines. Un ml de cette solution a été dilué dans 3 ml d'eau et la colorimétrie a été faite comme plus haut.

Dosage de la çarbamate kinase (Legrain et Stalon, réf. 118 ) : La çarbamate kinase a été dosée par détermination de la quantité de dioxyde de carbone radioactif formé à partir de carbamoyl-

1 4

phosphate de lithium radioactif ( C) dans 2 ml de mélange réactionnel contenant du trampon Tris-HCl à pH 7,2, 50 mM, de l'ADP 10 mM, du chlorure de magnésium 40 mM et du carbamoyl-

12 14

phosphate ( C ) + ( C) à une concentration de 5 mM.

Une suggestion de C. Legrain a permis de doser cette enzyme dans son sens physiologique : deux minutes avant l'arrêt total de la réaction par 2 ml d'acide sulfurique 6 N, le carbamoyl- phosphate n'ayant pas réagi est détruit par l'addition de 20 moles d'ornithine et de 400 unités d'ornithine carbamoyl- transférase de E. coli dans 0,5 ml de tampon Tris-HCl 60 mM à

Après addition de l'acide, les récipients contenant le mélange ont été agités à 30°C pendant 30 minutes pour permettre le

dégagement du dioxyde de carbone, qui a été capté sur des filtre imbibés d'hyaraine. La radioactivité a été mesurée dans 5 ml de toluène-diphényloxazole 0,5 % au moyen d'un scintillateur Beckman 100 C.

pH 8,5.

Figure

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Références

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