Rapport final
No projet : IA217776
Développement d’un test pétale pour la détection de Sclérotinia sclerotiorum en production de haricots de transformation
Responsable scientifique : Hervé Van Der Heyden, Phytodata
Établissement : Fédération québécoise des producteurs de fruits et de légumes de transformation Date de remise : 10 avril 2019
Section 1 - Chercheurs impliqués et responsable autorisé de l’établissement (ces personnes doivent également faire parvenir un courriel pour attester qu’ils ont lu et approuvent le rapport.)
Hervé Van der Heyden, M.Sc.
Phytopathologiste
Compagnie de recherche Phytodata inc.,
291 rue de la Coopérative, Sherrington QC, J0L 2N0 514-617-4986
hvanderheyden@phytodata.ca Thérèse Wallon
Compagnie de recherche Phytodata inc,
291 rue de la Coopérative, Sherrington QC, J0L 2N0 450-454-3992
twallon@phytodata.ca
JudithLupien
Directrice générale, FQPFLT 555 Roland-Therrien bur 355 Longueuil
450-679-0540 8260 judithlupien@upa.qc.ca
Section 2 - Partenaires Myriam Gagnon
Fédération québécoise des producteurs de fruits et légumes de transformation 450-679-0540, poste 8131
mgagnon@upa.qc.ca Pierre Mauny Bonduelle Canada 514-829-2205
pierre.mauny@bonduelle.com
Section 3 – Fiche de transfert
Développement d’un test pétale pour la détection de Sclérotinia sclerotiorum en production de haricots de transformation
Hervé Van der Heyden et Myriam Gagnon
No de projet : IA217776 Durée : 04/2017 – 04/2019
FAITS SAILLANTS
Sclerotinia sclerotiorum est un champignon pathogène d'importance économique responsable de la pourriture blanche dans plusieurs productions maraîchères incluant le haricot. La table filière des légumes de transformation a ciblé, dans son plan stratégique, la recherche de solutions aux maladies dont la pourriture blanche. S. sclerotiorum survit dans les sols sous forme de sclérotes plusieurs années, parfois plus de 10 ans. Lorsque les conditions sont favorables, elles produisent des ascospores qui infecteront les inflorescences. La période de floraison est donc critique pour un contrôle adéquat de cette maladie. En moyenne, 2 à 3 applications de fongicides sont effectuées par période de semis sans tenir compte de la présence de l'agent infectieux. Malgré ces applications, des pertes de rendements attribuées à cette maladie sont rapportées et ces pertes, en plus d'occasionner des baisses de revenus aux producteurs, entraînent des problèmes d'approvisionnement pour la transformation. Il existe actuellement une trousse permettant de vérifier la présence de S. sclerotiorum sur les pétales des fleurs. Cette trousse pétale repose sur l'utilisation d'un milieu de culture et son délai de réponse peut dépasser 5 jours, ce qui réduit considérablement son utilité au champ. D'autre part, des marqueurs moléculaires destinés à la détection de S. sclerotiorum existent et pourraient représenter une alternative rapide et précise à la trousse pétales sur pétri. L'objectif principal de ce projet vise donc à adapter et valider un test de détection moléculaire permettant de caractériser et de quantifier l'inoculum de Sclerotinia sclerotiorum sur lespétales de haricots.
Plus précisément ce projet consiste à déterminer la relation entre l'ADN de S. sclerotiorum estimé par PCR et l'incidence finale de la pourriture blanche. Le milieu semi-sélectif utilisé dans le cadre de ce projet s’est avéré être spécifiques à S. sclerotiorum dans la majorité des cas. Ce milieu réagit en passant du mauve au jaune lorsqu’il y a production d’acide oxalique par S. sclerotiorum. Toutefois, un certain nombre d’échantillons n’ayant pas viré au jaune sur le milieu semi-sélectif se sont avéré être contaminés par S.
sclerotiorum et quelques échantillons ayant fait virer le milieu au jaune se sont avérés être contaminés par une autre espèce. Ainsi, il était nécessaire d’attendre la formation de sclérotes par S. sclerotiorum afin de confirmer l’identité du pathogène présent sur les pétales déposés à la surface des milieux de cultures. En condition de champ, la détection par PCR était plus sensible que la détection sur pétri. De façon générale, nous avons détecté l’agent pathogène 15 jours plus tôt à l’aide de la méthode moléculaire, par rapport à la méthode conventionnelle sur pétri.
OBJECTIF(S) ET MÉTHODOLOGIE
L'objectif principal de ce projet visait l’adaptation et la validation d’un test de détection moléculaire permettant de caractériser et de quantifier l'inoculum de Sclerotinia sclerotiorum sur lespétales de haricots.
Plus précisément ce projet consiste à déterminer la relation entre l'ADN de S. sclerotiorum estimé par PCR et l'incidence finale de la pourriture blanche. En 2017 et 2018, 10 champs ont été sélectionnés et échantillonnés à chaque semaine du 13 juillet au 15 août. À chaque échantillonnage, cinq parcelles ont été échantillonnées à l’intérieur desquelles 10 échantillons de pétales ont été prélevés pour former un échantillon composite. Un total de 295 échantillons de pétales ont été analysés. La présence de S.
sclerotiorum a été testé pour chacun des échantillons de pétales ont été testé de trois façons : sur des milieux (semi)-sélectifs, par qPCR et par LAMP-PCR. Les résultats obtenus avec les trois méthodes ont ensuite été comparés.
RÉSULTATS SIGNIFICATIFS POUR L’INDUSTRIE
L’approche proposée dans le cadre de ce projet visait à remplacer le test de détection sur pétris (test pétale) par un test moléculaire portable (LAMP-PCR). Pour valider l’approche, des pétales de haricots de haricot ont été prélevés hebdomadairement dans 10 champs par saison. Les pétales ont été mis en culture sur un milieu sélectif qui change de couleur lorsque Sclerotinia sclerotiorum pousse sur le milieu; ils ont ensuite été testés à l’aide du test portable (LAMP-PCR) et à l’aide du test de référence de laboratoire (qPCR) (Figure 1).
Figure 1 : Résumé schématique de la procédure évaluée.
Le milieu semi-sélectif utilisé dans le cadre de ce projet s’est avéré être spécifique à S. sclerotiorum dans la majorité des cas (Figure 2). Ce milieu réagit en passant du mauve au jaune lorsqu’il y a production d’acide oxalique par S. sclerotiorum. Toutefois, un certain nombre d’échantillons n’ayant pas viré au jaune sur le milieu semi-sélectif se sont avérés être contaminés par S. sclerotiorum et quelques échantillons ayant fait virer le milieu au jaune se sont avérés être contaminés par une autre espèce fongique. Ainsi, il était nécessaire d’attendre la formation de sclérotes par S. sclerotiorum afin de confirmer l’identité du pathogène présent sur les pétales déposés à la surface des milieux de cultures.
En condition de champ, la détection par LAMP-PCR était plus sensible que la détection sur pétri (Figure 3). De façon générale, le test LAMP-PCR détectait l’ADN de S. sclerotiorum 15 jours plus tôt que la méthode conventionnelle réalisée à l’aide du milieu sélectif (Figure 3).
Les saisons 2017 et 2018, n’ont pas été très favorables au développement de la maladie au champ. Quelques symptômes ont été rapportés en fin de saison lors des activités de dépistage en 2017, aucun symptôme n’a été rapporté en 2018 et aucune apothécie n’a été observée au sol pour 2017 ou 2018. Malgré cela, des souches de S.
Figure 2: Exemple de milieu d'échantillons de pétales utilisés sur milieu semi-sélectif. Les sections ayant virées au jaune indiquent la présence d’acide oxalique, sécrété par S.
sclerotiorum.
sclerotiorum ont été isolées des pétales prélevés au champ et de l’ADN de S. sclerotiorum a été détecté à partir des mêmes échantillons de pétales. La fréquence de détection était plus importante en 2017 qu’en 2018de même que la sévérité de la maladie au champ.
APPLICATIONS POSSIBLES POUR L’INDUSTRIE ET/OU SUIVI À DONNER
Ce projet visait tout d'abord à bonifier nos connaissances pratiques afin d'obtenir un meilleur contrôle de la pourriture blanche du haricot occasionné par Sclérotinia sclerotiorum. Concrètement, il s'agit de se doter d'une méthode précise permettant le positionnement des applications de fongicides en fonction de la présence et de l'importance de l'inoculum de S. sclerotiorum. Au terme du projet, nous avons développé une méthode de détection sensible et spécifique permettant d'identifier et de quantifier la présence et l'abondance de l'inoculum de S. sclerotiorum dans les pétales de haricots. Cette approche permettra de faire un pré-diagnostique au champ à l’aide d’un LAMP-PCR réalisé avec un thermocycleur portable et la possibilité de faire par qPCR un test de confirmation au laboratoire. Bien que la méthode soit efficace pour détecter l’ADN du pathogène dans les pétales de haricots, la faible pression de maladie observée en 2017- 2018 ne permet pas d’établir la relation entre le développement des symptômes au champ et la quantité d’ADN retrouvé sur les pétales. Plus d’essais seront nécessaires afin d’établir plus précisément cette corrélation.
POINT DE CONTACT POUR INFORMATION Hervé Van Der Heyden
Phytopathologie et épidémiologie quantitative Phytodata
291 rue de la Coopérative Sherrington
514-617-4986
hvanderheyden@phytodata.ca
REMERCIEMENTS AUX PARTENAIRES FINANCIERS
Ces travaux ont été réalisés grâce à une aide financière du Programme Innov’Action agroalimentaire, un programme issu de l’accord du cadre Cultivons l’avenir 2 conclu entre le ministère de l’Agriculture, des Pêcheries et de l’Alimentation et Agriculture et Agroalimentaire Canada.
Figure 3 : Comparaison des tests pétales sur pétris et en LAMP-PCR.
Section 4 - Activité de transfert et de diffusion scientifique (joindre en annexe la documentation en appui)
Activité de transfert Nom du document à l’appui
Aucune activité de transfert et de diffusion scientifique n’était prévue et n’a été effectuée pendant la période de réalisation du projet.
Section 5 - Activités de diffusion et de transfert aux utilisateurs (joindre en annexe la documentation en appui)
Activité de transfert Nom du document à l’appui
Publication des résultats finaux dans le Bulletin d’information ‘’le
Cultivé’’ automne 2019 Document à venir, sera mis en ligne sur le
site Internet de la Fédération https://www.legumes-
transformation.qc.ca/publications/bulletin/
Dépôt des documents finaux sur les sites WEB du PRISME et de la
FQPFLT, du PELI et du CRAAQ (à déposer lorsqu’approuvés) Document à venir, document sera mis en ligne sur le site Internet de la Fédération
Présentation par Hervé Van Der Heyden, à l’AGA de la FQPFLT,
décembre 2019 Document à venir, sera mis en ligne sur le
site Internet de la Fédération
Publication d’une fiche technique sur le projet sur le site Internet de la FQPFLT
Document disponible en ligne : https://www.legumes-
transformation.qc.ca/recherche-
developpement/developpement-dun-test- petale/
Présentation de l’avancée du projet dans le rapport annuel de l'AGA de la FQPFLT (décembre 2018) Disponible en ligne
Document disponible en ligne : https://www.legumes-
transformation.qc.ca/publications/rapports- annuels/
Présentation directe des résultats à Bonduelle (Octobre 2017) Présentation faite par Hervé Van Der Heyden, à la Maison de l’UPA
Section 6 – Grille de transfert des connaissances
1. Résultats
Présentez les faits saillants (maximum de 3) des principaux résultats de votre projet.
2. Utilisateurs
Pour les résultats identifiés, ciblez les utilisateurs qui bénéficieront des connaissances ou des produits provenant de votre recherche.
3. Message
Concrètement, quel est le message qui devrait être retenu pour chacune des catégories d’utilisateurs identifiées?
Présentez un message concret et vulgarisé.
Quels sont les gains possibles en
productivité, en rendement, en argent, etc.?
4. Cheminement des connaissances
a) Une fois le projet terminé, outre les publications scientifiques, quelles sont les activités de transfert les mieux adaptées aux utilisateurs ciblés? (conférences, publications écrites, journées thématiques, formation, etc.)
b) Selon vous, quelles pourraient être les étapes à privilégier en vue de maximiser l’adoption des résultats par les utilisateurs.
Outil PCR portable Producteurs de haricots
Transformateurs (Bonduelle) pour cibler traitement au moment opportun
Conseillers/agronomes/spécialistes des cultures
La détection par PCR est plus sensible que la détection sur pétri. De façon générale, l’agent pathogène a été décelé 15 jours plus tôt à l’aide de la méthode moléculaire, par rapport à la méthode conventionnelle sur pétri. Ce qui peut se traduire, si les conditions climatiques sont propices au développement de la maladie par des réductions d’application de pesticides.
Une présentation est prévue en décembre 2019, par Hervé Van Der Heyden, à l’AGA de la FQPFLT. Lors de cet événement, plusieurs représentants de Bonduelle sont présents.
La fiche de transfert sera aussi mise en ligne sur les sites Internet de la Fédération (FQPFLT), de Prisme et du CRAAQ.
Section 7 - Contribution et participation de l’industrie réalisées
La participation et contribution de l’industrie a impliqué la collaboration de diverses équipes comme prévu. Les installations et équipements de Phytodata ont été prêtés et utilisés sous la supervision d’Hervé Van der Heyden.
Robert Deschamps et Benjamin Abautret de Bonduelle Amériques ont participé à la recherche de sites et à la formation de l’étudiant au champ en 2017. Myriam Gagnon de la Fédération québécoise des fruits et légumes de transformation a sondé et contacté les producteurs intéressés à collaborer au projet. Ensuite, la direction de Bonduelle et Mme Myriam Gagnon ont sélectionné les champs à étudier à chaque début de saison. L’échantillonnage a été réalisé chez 10 producteurs en 2017 et 10 producteurs en 2018
2017
Ferme Christian Asselin inc. Asselin, Christian La Ferme Maison Rouge Vézzaro, Vittorio Ferme Louis Beauparlant Beauparlant, Louis Gérard Asselin et Fils Lte Asselin, Renaud
Les Fermes André Bérard inc. Bérard, Christian Les Fermes Richard Laporte Laporte, Richard
Agripem Peirs, Mitzi/ Labyt, Jean-Pierre Les Jardins Ducharme inc. Ducharme, David Ferme A.L. VIN inc. Vincent Ange Lys Ferme Denis Coulombe inc Coulombe Denis 2018
Ferme Christian Asselin inc. Asselin, Christian Ferme Louis Beauparlant Beauparlant, Louis Gérard Asselin et Fils Lte Asselin, Renaud
Les Fermes André Bérard inc. Bérard, Christian Ferme Bonneterre Sylvain Raynault
Les Fermes Richard Laporte Laporte, Richard Agripem Peirs, Mitzi/ Labyt, Jean-Pierre Les Jardins Ducharme inc. Ducharme, David 9274-5678 Québec inc Eric Gagnon Entreprise Qualiferme Danny Berthiaume
Section 8 - Rapport scientifique et/ou technique Introduction
Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, un ascomycète appartenant à la famille des sclerotiniaceaes, est l’un des champignons phytopathogènes les plus dévastateurs. Il est responsable de plusieurs maladies et il se décline sous plusieurs dénominations : pourriture blanche, moisissure blanche, affaissement sclérotique et pourriture à sclérotes. S. sclerotiorum infecte plus de 400 espèces de plantes incluant une large gamme de cultures d’importance économique ainsi que plusieurs mauvaises herbes (Boland et Hall, 1994). Il occasionne des pertes principalement aux dicotylédones telles que le tournesol, le soya, le canola, la carotte, la laitue et le haricot. De façon générale, les parties affectées par S. sclerotiorum sont translucides et la maladie se propage rapidement en circulant par les pétioles ou les tiges. Sur les tiges infectées apparaissent alors des lésions foncées d’apparence humide. Les tissus nécrosés produisent ensuite un épais mycélium blanc à l’intérieur duquel sont formés des sclérotes noirs de tailles pouvant varier de 1 à 35 cm (Bolton et al., 2006).
Ces sclérotes jouent un rôle prépondérant dans le cycle de vie du champignon puisqu’elles produisent l’inoculum et constitue la principale structure de survie à long terme (Willet et al., 1980). Elles peuvent survivre dans les sols sur une période de près de 10 ans (Ayers et al., 1979). Son énorme potentiel de reproduction combiné à sa capacité de survie à long terme, fait du sclérote la composante principale du cycle biologique. Ils peuvent germer en produisant des hyphes qui vont attaquer directement les tissus ou former des apothécies qui formeront à leur tour des ascospores destinées à l’infection des portions aériennes des plants et à la dissémination sur de plus longues distances. La plupart des maladies causées par ce pathogène sont occasionnées par les ascospores (Abawi et Grogan, 1979; Schwartz et Steadman, 1978; Steadman, 1979).
Dans la culture de haricot, c’est la présence d’ascospores combinée à la présence d’une plante sensible soumise à des conditions environnementales favorables qui permettent à la maladie de se développer.
Lorsque la température est comprise entre 4 et 16C, les sclérotes présents dans les premiers 5cm germeront et produiront les ascospores responsables de l’infection primaire (Wu et Subbarao, 2008). Le développement de S. sclerotiorum est favorisé par des températures fraîches inférieures à 29C et une humidité relative élevée (Workneh et Yang, 2000). Une forte biomasse de la culture favorise l’infection, la plante étant plus sensible du début floraison jusqu’au début de la formation des gousses. L’infection déclenchée par la germination des ascospores sur les feuilles ou à la base des tiges, touchera le plus souvent, en premier lieu, les fleurs de haricots, qui sont les tissus les plus sensibles à S. sclerotiorum (Olivier, Goossen et Swartz, 2008). De plus, il a été démontré que l’âge des fleurs a un impact sur la vitesse d’infection par S. sclerotiorum (Lefol et al., 1997). Des infections secondaires peuvent également avoir lieu lors d’un contact entre un plant affecté et un plant sain. Il n’existe actuellement aucun cultivar résistant à la pourriture à sclérotes du haricot. Son contrôle repose donc sur l’utilisation de mesures prophylactiques (bon drainage, réduction de la densité de semis, réduction des apports en azote, rotations longues, travail de sol), d’agents de lutte biologique (Coniothyrium minitans) et principalement sur l’utilisation de fongicides chimiques. En général, les produits doivent être appliqués avant la chute des premiers pétales, soit au stade boutons dès l’apparition des toutes premières fleurs. De nouvelles fleurs apparaissent régulièrement sur une période variant de 15 à 21 jours, après le début de la floraison. Ainsi, les traitements pour être efficaces, doivent être repris à intervalle de 7 jours, lorsque les conditions climatiques sont favorables.
Il existe actuellement des modèles de prédiction du risque de pourriture à sclérotes pour le canola et la laitue (Koch, 2007; Clarkson et al., 2014). Ces modèles sont basés sur l’évaluation de conditions environnementales (humidité, température, présence de la maladie les années précédentes, etc.). Pour le canola, Turkington et al. (1991) ont développé une méthode permettant d’isoler la présence de S.
sclerotiorum dans les pétales de canola. La méthode consiste à placer sur un milieu de culture semi-sélectif des pétales prélevés au hasard. Le milieu semi-sélectif est constitué d’un milieu complet auquel est ajouté un
colorant bleu (bleu de bromophénol) et il passe du bleu au jaune lorsque des colonies de S. sclerotiorum se développent. Ce changement de couleur est provoqué par la production d’acide oxalique lors de la croissance du champignon. Plusieurs auteurs rapportent que l’utilisation de cette méthode permet de prédire l’apparition de pourriture à sclérotes dans le canola (Turktington, 1988; 1991; Becka, 2016). Toutefois, cette méthode n’est que très peu utilisée comme outil d’aide à la décision des applications de fongicides en raison du long délai de réponse (croissance de 4 à 7 jours). De plus, d’autres champignons peuvent également produire de l’acide oxalique et induire un changement de couleur du milieu (principalement les champignons du genre Penicillium) (Perez et al., 2002). Récemment, des outils moléculaires spécifiques ont été développés pour permettre la détection de S. sclerotiorum à partir d’échantillons aériens et dans des tissus de plants affectés dans les cultures de canola et de carotte (Rogers et al., 2009; Parker et al., 2014; Almquist et al., 2015). Pour la carotte, Parker et al., (2014) ont comparé l’utilisation des tests moléculaires et des milieux semi-sélectifs pour réaliser le suivi de l’inoculum aérien de S. sclerotiorum. Les résultats obtenus étaient similaires avec les deux techniques, bien que le délai de réponse était de 3 jours et plus avec les milieux sélectifs et de seulement 5 heures avec les outils moléculaires. Pour le canola, les résultats obtenus par Almquist et al., (2015) suggèrent également une corrélation positive significative entre les résultats obtenus sur milieux sélectifs et ceux récoltés à l’aide des tests de détection moléculaire. L’utilisation de marqueurs moléculaires permet donc de contourner les problèmes liés à la spécificité et de réduire considérablement le temps de réponse.
L'objectif principal de ce projet vise donc à adapter et valider un test de détection moléculaire permettant de caractériser et de quantifier l'inoculum de Sclerotinia sclerotiorum sur les pétales de haricots. Plus précisément ce projet consiste à déterminer la relation entre l'ADN de S. sclerotiorum estimé par PCR et l'incidence finale de la pourriture blanche.
Matériel et Méthodes
Sélection des marqueurs moléculaires et validation. Les marqueurs moléculaires utilisés par Phytodata pour tester les concentrations aériennes de spores de S. sclerotiorum ont été adaptés pour une utilisation sur des extractions de pétales de haricots. À cette étape, les courbes standards ont été préparées et un contrôle de leur spécificité, visant à s’assurer que le marqueur ne procure pas un signal positif pour d’autres agents pathogènes du haricot, a été réalisé. Pour les marqueurs LAMP-PCR, les amorces publiées par Duan et al.
(2014) ont été utilisés. Dans chaque réaction de 25ul, contenait 1.2uM des amorces FIP et BIP, 0.2uM des amorces F3 et B3, 1.28M de bétaïne, 1mM des dNTPs, 4mM de MgCl2, 20mM de Tris-CHl, 10mM de KCl, 10mM de (NH4)2SO4, 2mM de MgSO4, 0.1% de Triton X-100, 8 unités de Bst, 1X de SYBR green et 2 ul de l’extraction d’ADN. Les réactions de PCR ont été réalisées dans un appareil Cfx-connect de Biorad ou un appareil portable de Diagenetix. La validation des essais et les courbes standards ont été faites avec de l’ADN génomique extrait de souches recueillies dans le cadre du projet ou disponible dans la collection du laboratoire.
Échantillonnage des pétales et évaluation des symptômes. En 2017 et 2018, 10 champs ont été sélectionnés et échantillonnés à chaque semaine du 13 juillet au 15 août. À chaque échantillonnage, cinq parcelles ont été échantillonnées à l’intérieur desquelles 10 échantillons de pétales ont été prélevés pour former un échantillon composite. Au total de 295 échantillons de pétales ont été analysés. Chacun des échantillons de pétales a été divisé en deux parties et regroupé de façon à obtenir cinq groupes par site pour chaque date. À chaque semaine, un dépistage des apothécies a été réalisé au sol en inspectant 5 sections linéaires de 1m à l’intérieur de chaque parcelle. En second lieu, un dépistage des plants a également été réalisé sur 5 sections linéaires de 1m de rang.
Détection de S. sclerotiorum à partir des pétales. La présence de S. sclerotiorum a été vérifiée pour chacun des échantillons de pétales et ceux-ci ont été testés de trois façons : sur des milieux (semi)-sélectifs, par qPCR et par LAMP-PCR. Tout d’abord, les échantillons de pétales ont été divisés en deux, la moitié destinée aux tests sur pétri et l’autre moitié destinée aux tests moléculaires. Les milieux semi-sélectifs ont été préparés
au fur et à mesure selon le protocole de Perez et al. (2001). Les pétales recueillis au champ ont été placés sur les boîtes de pétris de 90mm et incubés à température pièce pour une période de 10 jours. Une première observation des pétris a été réalisés après une période de 4 jours et une seconde observation a été réalisée après 10 jours d’incubation. Cette étape a été effectuée en temps réel, immédiatement après l’échantillonnage au champ. La seconde moitié des échantillons de pétales a été soumise à une extraction d’ADN, réalisée avec un kit d’extraction commercial (Fast-DNA Spin kit, Mp Biomedical). Les ADN ont été dosés à l’aide d’un spectrophotomètre (Nano drop lite, Thermo-Fisher) et mis au congélateur jusqu’à utilisation. L’analyse par PCR a été réalisée à l’aide d’un test TaqMan et un test LAMP PCR décrits antérieurement.
Résultats et discussion
Adaptation des marqueurs moléculaires et du milieu semi-sélectif. Le marqueur moléculaire adapté du test développé pour les capteurs de spores s’est avéré sensible et spécifique à S. sclerotiorum. Tel qu’attendu, le marqueur permet une amplification linéaire de S. sclerotiorum pour une quantité de 2.7 X10-06 à 2.7 X10-01 (figure 1 A) avec une efficacité au PCR de 103.98%, ce qui est conforme aux normes de développement de tels essais (Bustin et al. 2009). De la même façon, la courbe standard utilisée à l’aide du PCR-LAMP est également linéaire pour des concentrations d’ADN variant de 1.75X1000 à 1.76X10-04ng d’ADN génomique (figure 1B). Pour le LAMP-PCR, la réaction était positive à l’intérieur d’un délai de 21 minutes (figure 1B).
La réaction de LAMP-PCR était trop rapide pour pouvoir comparer avec le qPCR en temps réel, l’efficacité de la réaction LAMP-PCR étant de près de 200%. Aussi, pour permettre la comparaison entre l’efficacité des deux méthodes, différentes polymérases ont été évaluées.
Figure 1: A) Courbe standard en nombre de copie du gène ITS obtenus par PCR en temps réel et B) courbe standard en ADN génomique obtenu par LAMP-PCR.
Le milieu semi-sélectif utilisé dans le cadre de ce projet c’est avéré être spécifique à S. sclerotiorum dans la majorité des cas (Figure 2). Ce milieu réagit en passant du mauve au jaune lorsqu’il y a production d’acide oxalique par S. sclerotiorum. Toutefois, un certain nombre d’échantillons n’ayant pas viré au jaune sur le milieu semi-sélectif se sont avéré être contaminés par S. sclerotiorum et quelques échantillons ayant fait virer le milieu au jaune se sont avéré être contaminé par une autre espèce. Ainsi, il était nécessaire d’attendre la formation de sclérotes par S. sclerotiorum afin de confirmer l’identité du pathogène présent sur les pétales déposés à la surface des milieux de cultures.
Déterminer la relation entre l'ADN de S. sclerotiorum estimé grâce au test pétales sur pétris et par PCR. Les saisons 2017 et 2018, n’ont pas été très favorables au développement de la maladie au champ.
Quelques symptômes ont été rapportés en fin de saison lors des activités de dépistage en 2017, aucun symptôme n’a été rapporté en 2018 et aucune apothécie n’a été observée au sol pour 2017 ou 2018. Malgré cela, des souches de de S. sclerotiorum a été isolées des pétales prélevés au champ et de l’ADN de S.
sclerotiorum a été détecté à partir des mêmes échantillons de pétales. La fréquence de détection était plus importante en 2017 qu’en 2018 (Figure 3) et la sévérité de la maladie au champ était plus importante en 2017 qu’en 2018.
En condition de champ, la détection par LAMP-PCR était plus sensible que la détection sur pétri (Figure 4).
De façon générale, nous avons détecté l’agent pathogène 15 jours plus tôt à l’aide de la méthode moléculaire, par rapport à la méthode conventionnelle sur pétri (Figure 4).
Figure 2: Exemple de milieu d'échantillons de pétales utilisés sur milieu semi-sélectif. Les sections ayant virées au jaune indiquent la présence d’acide oxalique, sécrété par S. sclerotiorum.
Figure 3 : Concentration d’ADN dans les échantillons de pétales analysés pour les saisons 2017 et 2018.
Figure 4 : Comparaison des tests pétales sur pétris et en LAMP-PCR.
Pour 2017, les températures moyennes étaient légèrement en dessous de 20C au début du mois d’août (figure 3), ce qui peut avoir affecté la capacité de germination des spores et la progression de la maladie post infection. Il a, en effet, été démontré que la germination de S. sclerotiorum et la progression de la maladie est optimale entre 20 et 25C (Clarkson et al. 2014). De plus, de récents travaux ont clairement démontrés que des températures de sol situées entre 21.5 et 23.5C étaient optimales pour la formation des apothécies (Fall et al. 2018). Par ailleurs, il a également été établi que la formation des apothécies est optimale lorsque la canopée est fermée à plus de 60% (Fall et al. 2018). En 2017 par exemple, ce stade a été atteint vers le 7 août, précisément lorsque les températures moyennes étaient inférieures à 20C (figure 5).
Contrairement à 2017, la saison 2018 était plus chaude et les températures se situaient dans la gamme favorable à la production des apothécies et à l’infection des spores. Toutefois, la saison étant très sèche, il n’y a eu aucune précipitation entre le début juillet et le début août (Figure 5), la production d’apothécies a été très désavantagée. Cette météo défavorable explique en partie, une fréquence de détection inférieure et l’absence de symptômes au moment du dépistage. En 2018, la période de floraison a été plus courte qu’en 2017, et celle-ci a cessé (le 6 août) plus tôt qu’en 2017 (le 15 août). Conséquemment la période d’exposition des organes récepteurs aux spores de S. sclerotiorum était donc plus courte en 2018. La proportion des pétales contaminés décrit une courbe gaussienne avec un pic le 6 août en 2017 et un pic le 28 juillet en 2018, ce qui est cohérent avec la durée d’exposition des stades phénologiques sensibles aux spores de S. sclerotiorum.
Figure 5: Pluviométrie et températures moyennes pour la période de l’essai au champ en 2017 et 2018.
Figure 6: Proportion de pétales contaminés en fonction du temps pour 2017 et 2018.
Littérature citée
Almquist, C. and Wallenhammar, A.-C. (2015), Monitoring of plant and airborne inoculum ofSclerotinia sclerotiorum in spring oilseed rape using real-time PCR. Plant Pathology, 64: 109–118.
Boland, G.J. and Hall, R. (1994) Index of plant hosts of Sclerotinia sclerotiorum. Can. J. Plant Pathol. 16, 93–108.
Bolton, M.D., Thomma, B.P.H.J., Nelson B.D. (2006), Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary: biology and molecular traits of a cosmopolitan pathogen. Molecular Plant Pathology, 7: 1–16.
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