с11адпо815 дгоир А
з1:гер1:ососса1
1пТес1 :10П8
И//УО СоНаЬогаИпд Сеп1ге
^ог Нетегепсе апб ЯезеагсЬ оп 31гер1ососа
М'тпеароИз, ММ. ОЗА
См\дЫ Р . и о И п з о п Ес1\л/агс1 1.Кар1ап
И/НО СоНаЬогаИпд Сеп1ге
^ог Пе^егепсе апб ВезеагсЬ оп 31гер1ососс1
Ргадие, СгесЬ ПериЬНс
^а^о8IаV З г а т е к Н и Ш В1соуа Л п Н а у П с е к
Не1епа Н а у П с к о у а Мка М о Н о у а
Раи1а Кпг
\Мог\6 НеаНИ О г д а п 1 2 а 1 | |
Оепеуа
1996
Лабораторная диагностика
инфекций, вызванных
стрептококком группы А
Сотрудничающий справочный и исследовательский
центр ВОЗ по изучению стрептококков
Миннеаполис, США Д у а й т Р . Д ж о н с о н
Э д в а р д Л . К а п л а н
Сотрудничающий справочный и исследовательский
центр ВОЗ по изучению стрептококков
Прага, Чешская Республика Я р о с л а в С р а м е к
Рут Б и к о в а И р ж и Г а в л и ч е к Г е л е н а Г а в л и к о в а И т к а М о т л о в а П а у л а К р и з
В ы п у щ е н о и з д а т е л ь с т в о м " М е д и ц и н а " по п о р у ч е н и ю М и н и с т е р с т в а з д р а в о о х р а н е н и я Р о с с и й с к о й Ф е д е р а ц и и , к о т о р о м у В О З
вверила п у б л и к а ц и ю д а н н о г о и з д а н и я на р у с с к о м я з ы к е
Всемирная организация здравоохранения Ж е н е в а
1998
Р.Джонсон ...(и соавт.]
1. Стрептококковые инфекции — диагностика. 2. 81гер1ососси8 руо^епек — выде
ление. 3. Диагностика лабораторная. 4. Бактериологические методы. 5. Руковод
ства I. Джонсон, Д.Р.
18ВЫ 92 4 154495 3 (Классификация ЫЬМ: \УС 210)
Всемирная организация здравоохранения охотно разрешает перепечатывать и пере
водить свои публикации частично или полностью. Заявление о разрешении на пере
печатку или перевод следует направлять в отдел публикаций Всемирной организации здравоохранения, Женева, Швейцария, который будет рац представить новейшую информацию о любых изменениях, внесенных в текст, планах выпуска новых пуб
ликаций, а также о б имеющихся в наличии переизданиях и переводах.
15ВЫ 5-225-03312-1 18ВЫ 92 4 154495 3
© Шг1с1 НеакЬ ОгйашгаНоп, 1996
© Всемрфная организация здравоохранения, 1998
На публикации Всемирной организации здравоохранения распространяются положе
ния протокола № 2 Всемирной конвенции об охране авторских прав.
Обозначения, используемые в настояшем издании, и приводимые в нем материалы ни в коем случае не выражают мнение Секретариата Всемирной организации здра
воохранения о юридическом статусе какой-либо страны, территории, города или района, их правительствах или их государственных фаницах.
Упоминание некоторых компаний или продукции отдельных изготовителей не озна
чает, что Всемирная организация здравоохранения отдает им предпочтение по срав
нению с другими, не упомянутыми в тексте. Как правило, патентованные наимено
вания выделяются начальными прописными буквами.
За точки зрения, представленные в данной публикации, несут ответственность только сами авторы.
© С.Ю.Чикина, перевод на русский язык, 1998
Содержание
П р е д и с л о в и е VII В с т у п л е н и е 1х 1. В в е д е н и е 1
1.1 П о с л е д с т в и я и н ф е к ц и й , вызванных с т р е п т о к о к к о м
г р у п п ы А 1 1.2 Структура и а н т и г е н н ы й с о с т а в с т р е п т о к о к к а г р у п п ы А 2
2. С б о р и т р а н с п о р т и р о в к а м а т е р и а л а 5
2.1 С б о р материала 5 2.2 Т р а н с п о р т и р о в к а материала в л а б о р а т о р и ю 6
3. К у л ь т у р а л ь н ы е и м о р ф о л о г и ч е с к и е с в о й с т в а с т р е п т о к о к к а
г р у п п ы А. Х р а н е н и е к у л ь т у р 12 3.1 Культуральные с р е д ы 12 3.2 М е т о д ы культивирования 16 3.3 Условия и н к у б а ц и и 18 3.4 Культуральные с в о й с т в а г е м о л и т и ч е с к о г о с т р е п т о к о к к а 18
3.5 А т и п и ч н ы е м о р ф о л о г и ч е с к и е ф о р м ы 21
3.6 Результаты п о с е в о в 2 2 3.7 Хранение культур 22 4. О п р е д е л е н и е с е р о л о г и ч е с к о й г р у п п ы п о м е т о д у Л а н с ф и л д 25
4.1 В в е д е н и е 25 4.2 О р и е н т и р о в о ч н о е о п р е д е л е н и е с е р о л о г и ч е с к о й г р у п п ы 26
4.3 М е т о д ы э к с т р а к ц и и г р у п п о в о г о а н т и г е н а 27 4 . 4 Сравнительная х а р а к т е р и с т и к а м е т о д о в э к с т р а к ц и и
г р у п п о в о г о а н т и г е н а 30 4.5 М е т о д ы и д е н т и ф и ц и к а ц и и г р у п п о в о г о а н т и г е н а 31
4.6 Э к с п р е с с - м е т о д ы о п р е д е л е н и я с е р о г р у п п ы 34
5. И д е н т и ф и к а ц и я с т р е п т о к о к к а г р у п п ы А 36 5.1 С е р о л о г и ч е с к и е м е т о д ы и д е н т и ф и к а ц и и с т р е п т о к о к к о в ы х
ш т а м м о в 36 5.2 Н е с е р о л о г и ч е с к и е м е т о д ы и д е н т и ф и к а ц и и с т р е п т о к о к к о в ы х
ш т а м м о в 37 6. В ы я в л е н и е Т-белка м е т о д о м а г г л ю т и н а ц и и 40
6.1 В в е д е н и е 40 6.2 П р и г о т о в л е н и е с у с п е н з и и с т р е п т о к о к к а д л я р е а к ц и и
а г г л ю т и н а ц и и 41 6.3 Постановка р е а к ц и и а г г л ю т и н а ц и и 4 2
6.4 Оценка результатов р е а к ц и и а г г л ю т и н а ц и и 43 7. С е р о т и п и р о в а н и е по р е а к ц и и п р е ц и п и т а ц и и с М - б е л к о м 45
7.1 П р и г о т о в л е н и е г о р я ч е г о с о л я н о к и с л о г о э к с т р а к т а
М-антигена по методу Л а н с ф и л д 45 7.2 О п р е д е л е н и е М-антигена в а г а р о в о м г е л е ( р е а к ц и я
д в о й н о й и м м у н о д и ф ф у з и и Оухтерлони) 46 7.3 Реакция п р е ц и п и т а ц и и в капиллярах 48
8. С е р о т и п и р о в а н и е с и с п о л ь з о в а н и е м р е а к ц и и с ы в о р о т о ч н о й
о п а л е с ц е н ц и и 49 8.1 В в е д е н и е 49 8.2 И с т о ч н и к и фактора о п а л е с ц е н ц и и и е г о с у б с т р а т 50
8.3 А г а р о в ы й м е т о д в выявлении ф а к т о р а о п а л е с ц е н ц и и 50 8.4 М е т о д с е р о т и п и р о в а н и я на а г а р е по и н г и б и р о в а н и ю
ф а к т о р а о п а л е с ц е н ц и и 52 8.5 П р о б и р о ч н ы й м е т о д для о п р е д е л е н и я ф а к т о р а
о п а л е с ц е н ц и и и с е р о т и п и р о в а н и я по е г о и н г и б и р о в а н и ю 54 8.6 М е т о д м и к р о п л а н ш е т к и для о п р е д е л е н и я фактора
о п а л е с ц е н ц и и и с е р о т и п и р о в а н и я по е г о и н г и б и р о в а н и ю 54 9. С е р о л о г и ч е с к и е р е а к ц и и для в ы я в л е н и я антител
к с т р е п т о к о к к у г р у п п ы А 58 9.1 И м м у н н ы й ответ на с т р е п т о к о к к о в ы е а н т и г е н ы 58
9.2 Получение и о б р а б о т к а с ы в о р о т к и пациента для
с е р о л о г и ч е с к и х и с с л е д о в а н и й 60 10. О п р е д е л е н и е а н т и с т р е п т о л и з и н а О 61
10.1 В в е д е н и е 61 10.2 С п е к т р о ф о т о м е т р и ч е с к и й м а к р о м е т о д 62
10.3 В и з у а л ь н ы й м а к р о м е т о д б е з и с п о л ь з о в а н и я
с п е к т р о ф о т о м е т р а 68 10.4 М е т о д м и к р о п л а н ш е т к и 69 11. О п р е д е л е н и е а н т и д е з о к с и р и б о н у к л е а з ы В 74
11.1 В в е д е н и е 74 11.2 М е т о д м и к р о п л а н ш е т к и 1 74
11.3 М е т о д м и к р о п л а н ш е т к и 2 78 12. О п р е д е л е н и е с т р е п т о к о к к о в о й а н т и г и а л у р о н и д а з ы - 83
12.1 В в е д е н и е 83 12.2 Т и т р о в а н и е г и а л у р о н и д а з ы 83
12.3 О п р е д е л е н и е а н т и г и а л у р о н и д а з ы в с ы в о р о т к е человека 85 13. Н е п р я м о й б а к т е р и ц и д н ы й т е с т для о п р е д е л е н и я у р о в н я
анти-М-антител 87 13.1 В в е д е н и е 87 13.2 М е т о д и к а 1 б а к т е р и ц и д н о г о т е с т а 92
13.3 М е т о д и к а 2 б а к т е р и ц и д н о г о т е с т а 96 13.4 М - т и п и р о в а н и е по результатам б а к т е р и ц и д н о г о т е с т а 101
13.5 О п р е д е л е н и е М-белка в н е п р я м о м б а к т е р и ц и д н о м т е с т е 101 14. П р о и з в о д с т в о а н т и с ы в о р о т о к для о п р е д е л е н и я с е р о г р у п п ы
и с е р о т и п а 102 14.1 Г р у п п о в ы е а н т и с ы в о р о т к и 102
14.2 Т - а г г л ю т и н и р у ю щ а я а н т и с ы в о р о т к а 104 14.3 М - т и п и р у ю щ и е а н т и с ы в о р о т к и 107 14.4 А н т и с ы в о р о т к и для т и п и р о в а н и я по фактору о п а л е с ц е н ц и и 110
С п и с о к л и т е р а т у р ы 112
Предисловие
в к о н ц е X X в. и н ф е к ц и и , вызванные 51гер1ососст руо^епез (группы А п о Л а н с ф и л д ) , и их г н о й н ы е и н е г н о й н ы е о с л о ж н е н и я п о - п р е ж н е м у остаются
важной м е д и ц и н с к о й и с о ц и а л ь н о й п р о б л е м о й во всех странах мира н е з а в и с и м о о т климата, экологической обстановки и уровня развития.
И н ф е к ц и и в е р х н и х д ы х а т е л ь н ы х п у т е й , в ы з в а н н ы е с т р е п т о к о к к о м г р у п пы А, — о д н а из н а и б о л е е распространенных бактериальных и н ф е к ц и й , о с о б е н н о у детей раннего возраста. Кроме того, во многих странах, находящихся в п р о ц е с с е индустриализации, н е г н о й н ы е о с л о ж н е н и я стрептококковой и н ф е к ц и и — о с т р ы й р е в м а т и з м и о с т р ы й п о с т с т р е п т о к о к к о в ы й г л о м е р у л о - н е ф р и т — обусловливают значительную д о л ю з а б о л е в а е м о с т и и с м е р т н о с т и . В таких высокоразвитых странах, где проживает ^/у населения з е м н о г о шара, трудности в диагностике и л е ч е н и и и н ф е к ц и й сочетаются с недостаточными в о з м о ж н о с т я м и восстановительной кардиохирургии при о с л о ж н е н н ы х рев
матических поражениях сердца. Увеличение случаев острого ревматизма и тяжелых с и с т е м н ы х п р о я в л е н и й с т р е п т о к о к к о в о й и н ф е к ц и и , таких как стрептококковый токсический шок, р о ж и с т о е воспаление, н е к р о т и з и р у ю - щ и й фасциит, которые о п и с а н ы в странах С е в е р н о й А м е р и к и , Скандинавии, Великобритании и других индустриальных государствах, представляет с о б о й с е р ь е з н у ю п р о б л е м у для врачей первичного звена, и н ф е к ц и о н и с т о в и орга
н о в здравоохранения.
К л и н и ч е с к и м , м и к р о б и о л о г и ч е с к и м , и м м у н о л о г и ч е с к и м , а также справоч
ным лабораториям принадлежит важная роль в о б е с п е ч е н и и т о ч н о й и н ф о р мации о б и н ф е к ц и я х , вызванных стрептококком группы А, п о э т о м у о н и являются неотъемлемой частью национальных программ по борьбе с ревма
т и з м о м и ревматическими п о р а ж е н и я м и сердца, острым постстрептококко
вым гломерулонефритом и тяжелыми и н ф е к ц и я м и , вызванными стрептокок
ком ф у п п ы А.
Д а н н а я книга представляет с о б о й к о м п л е к с н о е , у д о б н о е для пользователя, с н а б ж е н н о е м н о г о ч и с л е н н ы м и ссылками руководство п о в ы п о л н е н и ю п р о цедур, н е о б х о д и м ы х для лабораторной д и а г н о с т и к и и н ф е к ц и й , вызванных стрептококком группы А. С ю д а включены р е к о м е н д а ц и и н е только п о бак
териологическим, н о и п о серологическим методам, а также п о п р о в е д е н и ю тестов для вьювления стрептококковых антител. О с о б е н н о ц е н н ы о п и с а н и я таких важных технологий, как приготовление антисывороток для с е р о т и п и рования стрептококка, многие из которых н е распространяются к о м м е р ч е с ким путем. П р и в е д е н н ы е методики в течение многих лет применяются в двух справочных лабораториях, где работают авторы этой книги. Кроме того, в книгу включены вьщержки из о п у б л и к о в а н н о й ранее литературы с соответ
ствующими ссылками. И хотя в м и р о в о й практике используются и другие методики, в д а н н о м руководстве о п и с а н ы те, которые, согласно о п у б л и к о ванным д а н н ы м , признаны наиболее э ф ф е к т и в н ы м и .
Эталонные стрептококковые штаммы и сыворотки, которые не распростра
няются на коммерческой о с н о в е , м о ж н о приобрести л и б о в Банке сывороток ВОЗ в М и н н е а п о л и с е , С Ш А , л и б о в С о т р у д н и ч а ю щ е м справочном и и с с л е довательском центре В О З п о и з у ч е н и ю стрептококков в Праге, Чешская
Республика (Банк сывороток В О З в о з н и к в рамках коллаборативного проекта
сотрудничающих центров В О З в Праге, М и н н е а п о л и с е , Д е л и , Л и о н е и Риме и Национального стрептококкового центра в Санкт-Петербурге).
Всемирная организация здравоохранения в течение длительного времени активно пропагандирует стандартизованные методы лабораторной диагнос
тики стрептококковых и н ф е к ц и й . Первоначальные рекомендации ("Руковод
ство по микробиологической диагностике стрептококковой инфекции и ее ос
ложнений", н е о п у б л и к о в а н н ы й д о к у м е н т В О З / В А С / 8 0 / 1 ) , подготовленные д - р о м К.К.Раск1ат и н ы н е п о к о й н ы м д - р о м 1.К.оиа, были выпущены ВОЗ в
1980 г. и щ и р о к о использовались в лабораториях разных стран. Учитывая м н о г о ч и с л е н н ы е д о с т и ж е н и я в лабораторной технологии и в понимании природы стрептококковых и н ф е к ц и й , с о т р у д н и ч а ю щ и е центры ВОЗ в Праге и М и н н е а п о л и с е пересмотрели этот д о к у м е н т и включили в него описания дополнительных процедур, которые будут полезны клиническим, справоч
н ы м и исследовательским лабораториям. В О З благодарит авторов этой книги, поделивщихся с в о и м и опытом и з н а н и я м и с лабораториями и иссле
дователями всего мира.
Е.Тихомиров, секция В О З п о эпидемиологическому надзору за вновь в о з н и к а ю щ и м и и другими и н ф е к ц и о н н ы м и болезнями и борьбе с н и м и , Женева, Швейцария
Вступление
в диагностике и н ф е к ц и й , вызванных стрептококком группы А, и борьбе с н и м и роль лабораторий огромна, и это относится как к микробиологическим лабораториям, задача которых состоит в вьщелении стрептококка группы А из верхних дыхательных путей, так и к и м м у н о л о г и ч е с к и м л а б о р а т о р и я м , о п р е д е л я ю щ и м титр стрептококковых антител. Н е с м о т р я на п о я в л е н и е новых антибактериальных средств, о п ы т п р о щ е д щ е г о д е с я т и л е т и я п о к а зывает, что и н ф е к ц и и , вызванные с т р е п т о к о к к о м группы А, п о - п р е ж н е м у сохраняют с в о ю значимость и, вероятно, не утратят ее и в ближайшем будущем. Сегодня, в к о н ц е X X века, эта группа и н ф е к ц и й еще н е д о с т а т о ч н о изучена и остается в центре в н и м а н и я как к л и н и ч е с к и х , так и н а у ч н о - и с следовательских лабораторий. Сотрудничающие центры ВОЗ в Праге и М и н н е а п о л и с е о т м е ч а ю т растущее ч и с л о о б р а щ е н и й за р е к о м е н д а ц и я м и и заявок как на о б у ч е н и е п е р с о н а л а л а б о р а т о р и й , так и на получение лабо
раторных реактивов, многие из которых не распространяются коммерческим путем.
Д а н н о е руководство появилось под влиянием клинических и э п и д е м и о л о г и ческих проблем, связанных с о стрептококковой и н ф е к ц и е й , и множества соответствующих технических вопросов. Мы надеемся, что опыт, накоплен
ный в двух наших лабораториях, окажется ц е н н ы м и для других и будет способствовать усовершенствованию и стандартизации диагностической ра
боты. Методы, представленные здесь, ш и р о к о используются в клинической микробиологии и иммунологии и в исследовательских лабораториях, а все
с т о р о н н е е их о с в е щ е н и е позволит применять их в периферийных районах.
Большинство методик разработаны совместно двумя н а ш и м и лабораториями и признаны эффективными, н о в книге имеются также сведения, почерпну
тые из литературы. Два из описанных методов применялись лабораториями в М и н н е а п о л и с е и в Праге независимо друг от друга, н о это лишь отражает разные практические подходы к о д н о м у и т о м у ж е вопросу без утверждения преимуществ о д н о г о метода перед другим.
Д а н н о е р у к о в о д с т ю представляет с о б о й расширенный вариант документа ВОЗ (ЛУНО/ВАС/80/1), подготовленного в 1980 г. д - р о м ШсЬагд Раск1ат и ныне покойным д - р о м Л п КоНа. С тех пор м н о г о е изменилось как в кли
нической практике, так и в исследовательской работе, хотя некоторые клас
сические методы остались п р е ж н и м и . В книгу включено о п и с а н и е ряда методик, не вошедших в д о к у м е н т 1980 г., а также о б ш и р н ы й перечень литературы, что обеспечивает дополнительную и н ф о р м а ц и ю для заинтересо
ванных читателей. Мы приложили все усилия, чтобы представить материал в ф о р м е , д о с т у п н о й п о н и м а н и ю читателей л ю б о г о уровня.
Мы с благодарностью п р и з н а е м , что опирались на д о к у м е н т 1980 г., п о д г о товленный д - р о м Раск1ат и д - р о м КоПа; многие из их формулировок мы цитировали д о с л о в н о . Каждый из соавторов нашего руководства внес свой немалый вклад в его с о д е р ж а н и е , н о нам помогали и другие сотрудники.
Здесь нет возможности перечислить всех, п о и м е н н о , о д н а к о мы высоко ц е н и м их предложения и готовность предоставить с в о й материал.
Наша особая благодарность д - р у Евгению Тихомирову из секции ВОЗ п о эпидемиологическому надзору за вновь в о з н и к а ю щ и м и и другими и н ф е к ц и -
о н н ы м и б о л е з н я м и и борьбе с н и м и , который поддерживал нас и дал возможность закончить этот проект, а также г-же 8агаЬ ВаПапсе из Бюро публикаций ВОЗ за ее скрупулезную работу п о редактированию рукописи.
С п а с и б о вам о б о и м !
В^/щШ К./оНпзоп 1агоз1ау Згатек Ес1у^аг(1 Ь.Кар1ап КшИ В1соуа Сотрудничающий справочный и исследовательский Лп НагИсек центр ВОЗ по и з у ч е н и ю стрептококков, Некпа НауИскога М и н н е а п о л и с , С Ш А Л1ка МоИоуа
Раи1а Кп1 Сотрудничающий справочный и исследовательский центр ВОЗ п о изучению стрептококков, Прага, Чещская Республика
1. Введение
1.1 Последствия инфекций, вызванных стрептококком группы А
51гер1ососси$ руо^епез группы А п о Л а н с ф и л д (стрептококк группы А) является ш и р о к о распространенным и о п а с н ы м возбудителем б о л е з н е й человека во всем мире. Он вызывает р а з н о о б р а з н ы е и н ф е к ц и и , о б ы ч н о ( н о не и с к л ю чительно) в д е т с к о м , ю н о ш е с к о м и м о л о д о м возрасте, которые носят э н д е мический или э п и д е м и ч е с к и й характер. Главными входными воротами для стрептококка группы А и его о с н о в н о й локализацией в организме человека являются верхние дыхательные пути. Стрептококковый фаринготонзиллит н а и б о л е е часто в с т р е ч а е т с я с р е д и всех б а к т е р и а л ь н ы х и н ф е к ц и й глотки.
В с о ч е т а н и и с характерной с ы п ь ю о н и з в е с т е н как скарлатина. В б о л ь ш и н с т в е случаев с т р е п т о к о к к о в а я и н ф е к ц и я глотки — это с а м о о г р а н и ч и - в а ю ш а я с я и н ф е к ц и я , тем н е м е н е е о н а м о ж е т прогрессировать и вызывать а б с ц е с с ы в ткани м и н д а л и н , перитонзиллярных или ретрофарингеальных тканях, шейный лимфаденит, синусит, с р е д н и й отит, мастоидит и д а ж е менингит. В н и ж н и х отделах дыхательных путей стрептококк группы А может явиться п р и ч и н о й п н е в м о н и и . Значительный п р о ц е н т фарингеальных и н ф е к ц и й , подтвержденных значительным п о в ы ш е н и е м титра антистрептокок
ковых антител, характеризуется весьма у м е р е н н о й клинической с и м п т о м а тикой или даже б е с с и м п т о м н ы м т е ч е н и е м . Т е м не м е н е е о н и ассоциируются с риском п о з д н и х о с л о ж н е н и й [7] и в отличие от "хронических н о с и т е л е й "
могут быть активным источником распространения вирулентного стрепто
кокка.
Из первичных кожных и н ф е к ц и й , вызванных стрептококком группы А, чаше всего встречается импетиго (пиодермия), о с о б е н н о в условиях тропического климата. Другие проявления включают р о ж и с т о е воспаление, локальные нагноения в результате микротравм и ран, г н о й н ы е п о р а ж е н и я п о д к о ж н о й клетчатки (в том числе перианальной области). С к о ж н о й и н ф е к ц и е й с в я зывают некоторые редкие, н о тяжелые случаи н е к р о т и з и р у ю ш е г о фасциита и миозита, третья группа первичных стрептококковых и н ф е к ц и й — г и н е к о логические заболевания: вульвовагиниты и п о с л е р о д о в ы й с е п с и с , которые, хотя и нечасто, п о - п р е ж н е м у встречаются во м н о г и х странах.
И н ф е к ц и о н н ы е п о р а ж е н и я глотки, к о ж и и гениталий могут осложниться такими угрожающими ж и з н и с о с т о я н и я м и , как с е п т и к о п и е м и я , и н ф е к ц и о н - н о - т о к с и ч е с к и й шок, или развитием метастатических гнойных очагов: арт
рита, остеомиелита, перитонита и д а ж е острого эндокардита.
Стрептококк группы А уникален п о с в о е й с п о с о б н о с т и вызывать п о з д н и е н е г н о й н ы е о с л о ж н е н и я , например гломерулонефрит, который может раз
виться после и н ф и ц и р о в а н и я как глотки, так и к о ж и н е ф р о т р о п н ы м и штам
мами, и ревматизм, который о с л о ж н я е т только и н ф е к ц и и глотки. Во многих развивающихся странах б о л ь ш о й с о ц и а л ь н о й п р о б л е м о й являются ревмати
ческие поражения сердца [2]. В э к о н о м и ч е с к и развитых странах, хотя и редко, тоже возникают спорадические локализованные вспышки ревмокар
дита, что служит н а п о м и н а н и е м о с о х р а н я ю щ е й с я актуальности этой п р о блемы [3].
Стрептококк группы А является главной п р и ч и н о й острых бактериальных ф а р и н г и т о в [4]. На о с н о в а н и и о д н и х только клинических с и м п т о м о в уве
р е н н о д и ф ф е р е н ц и р о в а т ь стрептококковый и нестрептококковый фарингиты т р у д н о , если не н е в о з м о ж н о . Следовательно, н е о б х о д и м ы н а д е ж н ы е бакте
р и о л о г и ч е с к и е методы и д е н т и ф и к а ц и и возбудителя для т о ч н о й диагностики и н а д л е ж а щ е й терапии. Адекватная антибактериальная терапия значительно с н и ж а е т р и с к развития ревматизма и, вероятно, уменьшает частоту гнойных о с л о ж н е н и й . Р а н н е е начало лечения ускоряет выздоровление и предотвра
щает д а л ь н е й ш е е р а с п р о с т р а н е н и е и н ф е к ц и и .
Следует п о м н и т ь , что для т о ч н о й д и а г н о с т и к и острого ревматизма или о с т р о г о постстрептококкового гломерулонефрита н е о б х о д и м о доказательство п р е д ш е с т в у ю щ е г о и н ф и ц и р о в а н и я стрептококком группы А. Лучше всего это достигается п р и м е н е н и е м серологических методов, д е м о н с т р и р у ю щ и х рост антистрептококковых антител, хотя в начале б о л е з н и или при первичной д и а г н о с т и к е о п р е д е л е н и е антител м о ж е т быть м а л о и н ф о р м а т и в н ы м .
Структура и антигенный состав стрептококка группы А
Структура клетки стрептококка группы А включает несколько важных ком
п о н е н т о в . Самый наружный с л о й — капсула, с о с т о я щ а я из гиалуроновой кислоты. Стрептококки значительно различаются как п о капсуле, так и п о выработке гиалуронидазы, которая разрушает капсулу. В отсутствие капсулы наружным слоем является клеточная стенка. Поверхность ее покрыта волос- к о о б р а з н ы м и выпячиваниями, или ф и м б р а м и , с о с т о я щ и м и из М - , Т- и К - б е л к о в - а н т и г е н о в и л и п о т е й х о е в о й кислоты. Биологическая функция К,- и Т - б е л к о в неизвестна, хотя о н и часто используются как э п и д е м и о л о г и ч е с кие маркеры. Липотейхоевая кислота с п о с о б с т в у е т адгезии стрептококка группы А на слизистые о б о л о ч к и . М - б е л о к — главный вирулентный фактор стрептококка группы А, о б е с п е ч и в а ю щ и й защиту от фагоцитоза. В соответ
ствии с к л а с с и ф и к а ц и е й Л а н с ф и л д о ф и ц и а л ь н о зарегистрировано около 80 с е р о т и п о в стрептококка группы А п о М-белку. К р о м е того, о п и с а н о большое количество п р о м е ж у т о ч н ы х М - т и п о в и существует м н о ж е с т в о штаммов, и м е ю щ и х М - б е л о к , которые е щ е н е к л а с с и ф и ц и р о в а н ы . Антитела к М-белку связаны с т и п о с п е ц и ф и ч е с к и м иммунитетом. Модель стрептококкового М- белка [5\ показана на р и с . 1. К о н ц е в о й фрагмент С скрученной спирали М - б е л к а действует как м е м б р а н н ы й якорь. С л е д у ю щ и й за н и м фрагмент с б о л ь ш и м с о д е р ж а н и е м пролина и глицина "врезан" в клеточную стенку.
Д а л е е следуют четыре участка, или блока, с о с т о я щ и е из аминокислот (ус
л о в н о о б о з н а ч е н н ы е буквами А — О ) . Последовательность аминокислот в белках В—О различных М - б е л к о в , п о - в и д и м о м у , является строго постоян
н о й . О д н а к о блок А и короткая последовательность а м и н о к и с л о т в концевом фрагменте N чрезвычайно вариабельны и, п о - в и д и м о м у , индивидуальны для каждой молекулы М - б е л к а [6, 7\. С о п р е д е л е н н ы м и серотипами М-белка связан фактор о п а л е с ц е н ц и и ( О Р ) — т и п о с п е ц и ф и ч е с к и й фермент-антиген.
Он создает мутность в сыворотке некоторых видов млекопитающих и может использоваться для и д е н т и ф и к а ц и и отдельных М - т и п о в стрептококка груп
пы А. В настоящее время известно, что п о крайней мере 27 о ф и ц и а л ь н о зарегистрированных М - т и п о в вырабатывают фактор о п а л е с ц е н ц и и , н о на с а м о м д е л е , б е з с о м н е н и я , их гораздо больше.
С о б с т в е н н о клеточная стенка (клеточный каркас) с о с т о и т из петггидоглика- н о в (повторяющихся комплексов из Н - а ц е т и л г л ю к о з а м и н а и N-ацетилмура- м и н о в о й кислоты, с о е д и н е н н ы х перекрестно короткими пептидами) и п о л и -
1. ВВЕДЕНИЕ
Концевой фрагилвнт N
Рис 1. Предполагаемая модель стрептококкового М-белка/5/.
(В переложении г(еуеп8 и соавт. [5] из 81гвр(ососса1 М ргЫет. Утс&гЛ. А.Р13с11еШ, 1991, 8с{еп(№с Атепсап, 1пс. Все авторские права защищены.)
сахарида С (полимер К-ацетилглюкозамина и рамнозы). Разделение на с е рогруппы определяется антигенной структурой этого полисахарида С. А н т и гены цитоплазматическои мембраны, лежащей внутри за клеточной стенкой, и с о б с т в е н н о цитоплазмы не используются в настоящей рабочей классифи
кации стрептококка группы А.
Стрептококк группы А вьщеляет большое количество т о к с и н о в и ферментов.
Среди них — стрептококковые пиогенные экзотоксины-антигены (эритро- генные токсины А, В и С ) , с которыми связано, кроме прочего, появление скарлатинозной сыпи. Большое значение также имеет стрептолизин С — кислородоустойчивый неантигенный т о к с и н , который обусловливает г е м о лиз вокруг стрептококковых к о л о н и й , растущих в а э р о б н о й среде на поверх-
н о с т и чашек с кровяным агаром. Еще о д и н т о к с и н — стрептолизин О, о б ратимый к и с л о р о д о н е у с т о й ч и в ы й ц и т о л и з и н с кардиотоксическими свойст
вами. Так как этот гемолитический т о к с и н неактивен в присутствии кисло
рода, е г о свойства проявляются только вокруг к о л о н и й , растущих под п о верхностью кровяного агара. В о р г а н и з м е о н вызывает выработку антител (антистрептолизин О ) , что применяется в д и а г н о с т и к е для подтверждения и н ф е к ц и и . Также в качестве диагностических тестов определяют антитела к другим внеклеточным антигенам: д е з о к с и р и б о н у к л е а з е В ( Д Н К а з е В), гиа- л у р о н и д а з е , стрегггокиназе и н и к о т и н а м и д - а д е н и н - д и н у к л е о т и д а з е ( Н А Д а з е ) и а н т и т е л а к углеводам к л е т о ч н о й с т е н к и — а н т и п о л и с а х а р и д ы . Н а и б о л е е часто д л я п о д т в е р ж д е н и я д и а г н о з а стрептококковой и н ф е к ц и и используют а н т и с т р е п т о л и з и н О и а н т и - Д Н К а з у В. Реагенты для этих тестов, как и для о п р е д е л е н и я антигиалуронццазы, распространяются на коммерческой о с н о в е .
2. Сбор и транспортировка материала
2.1 Сбор материала
Для забора материала из глотки, носа, кожных п о в р е ж д е н и й , ран или других пораженных областей используют тампоны из ваты или синтетических в о локон. Если пораженный участок сухой, тампон следует предварительно смочить стерильной водой или ф и з и о л о г и ч е с к и м раствором.
Для взятия мазка из глотки надо быстро, н о тщательно, с легким нажимом протереть т а м п о н о м миндалины (или тонзиллярные ямки) и з а д н ю ю стенку глотки. Н е о б х о д и м о исключить м а с с и в н о е з а г р я з н е н и е т а м п о н а с л ю н о й , п о с к о л ь к у м и к р о о р г а н и з м ы р о т о в о й п о л о с т и , п р и с у т с т в у ю щ и е в с л ю н е , к о н к у р е н т н о п о д а в л я ю т р о с т с т р е п т о к о к к а группы А. З а б о р материала п р о в о д я т п о д к о н т р о л е м з р е н и я и с и с п о л ь з о в а н и е м щпателя, п р и ж и м а ю щего язык. При наличии экссудата о н также д о л ж е н быть взят для и с с л е д о вания.
Д л я взятия мазка из н о с а тампон вводят в каждую н о з д р ю и протирают им в н у т р е н н ю ю п о в е р х н о с т ь н о с о в ы х х о д о в . В случаях, когда и м е е т з н а ч е н и е п р и с у т с т в и е в в е р х н и х дыхательных путях д а ж е н е б о л ь ш и х количеств с т р е п т о к о к к а группы А, п р е д п о ч т и т е л ь н е е с о б и р а т ь материал о д н о в р е м е н н о как из н о с а , так и из глотки. П р и о с о б ы х э п и д е м и о л о г и ч е с к и х о б с т о ятельствах ( н а п р и м е р , в случае госпитальной и н ф е к ц и и ) источником стреп
тококка группы А могут быть прямая кишка, перианальная область, влага
л и щ е носителей \8, 9]; в таких ситуациях следует брать мазки из этих участков.
Из ран и кожных п о в р е ж д е н и й м о ж н о брать для анализа с е р о з н у ю жидкость.
Везикулезные высыпания на коже м о ж н о исследовать путем пункции вези
кул с с о б л ю д е н и е м асептики, после обработки к о ж и 70 % спиртом. При наличии импетигинозных корок на коже место поражения протирают с п и р т о м , корки удаляют стерильной иглой и с поверхности под н и м и берут мазок влажным т а м п о н о м . Согласно другому о п и с а н н о м у в литературе э ф ф е к т и в н о м у с п о с о б у , корки н е удаляют, а кожу вокруг них растягивают пальцами для получения выделившейся и з - п о д корки капли гноя. Эту каплю собирают к о н ч и к о м сухого тампона, который сам н е д о л ж е н касаться кожи. Обработки кожи перед э т о й процедурой н е требуется. Н о какой бы метод н и исполь
зовался, всегда лучше забирать материал из свежих очагов, чтобы получить чистую культуру стрептококка. И з старых очагов часто высевается как стреп
тококк, так и стафилококк.
При рожистом воспалении, когда поверхность кожи н е повреждена, м о ж н о применять аспирационный метод: в место наибольшего поражения через иглу внутрикожно вводят небольшое количество стерильного ф и з и о л о г и ч е с кого раствора (примерно 0,1 мл) и сразу ж е отсасывают жидкость обратно в ш п р и ц . Однако процент у с п е ш н о г о вьщеления стрептококка группы А при использовании этой методики д о в о л ь н о низкий. И з - з а малого объема полу
чаемой ж и д к о с т и с о д е р ж и м о е иглы лучше сразу помешать на кровяной агар или в о б о г а щ е н н у ю ж и д к у ю среду, например сывороточный или кровяной бульон. П р и буллезной ф о р м е рожистого воспаления с о д е р ж и м о е пузырей после обработки кожи аспирируют ш п р и ц е м .
А с п и р а ц и я ш п р и ц е м — стандартный метод получения материала при пери- т о н з и л л я р н о м а б с ц е с с е , г н о й н о м л и м ф а д е н и т е , синусите, среднем отите, остеомиелите и стрептококковых и н ф е к ц и я х других локализаций.
2.2 Транспортировка материала в лабораторию
Л ю б а я отсрочка в и с с л е д о в а н и и материала п о с л е его получения увеличивает вероятность ложноотрицательных результатов: лучше всего н е м е д л е н н о п о местить материал на чашку Петри с кровяным агаром. Если отсрочка пре
вышает несколько часов (ограничение времени зависит от материала, из которого изготовлены тампоны, от факторов окружающей среды и от пита
тельных с р е д ) , следует использовать транспортные среды, например среду Стюарта, п о л о с к и фильтровальной бумаги или силикогелевую транспортную систему.
2.2.1 Транспортные среды
П р и м е н е н и е транспортных с р е д р е к о м е н д у е т с я для материала, который нельзя н е м е д л е н н о посеять на чашку Петри, для предотвращения потери стрептококками ж и з н е с п о с о б н о с т и . Если п о с е в откладывается более чем на 48 ч, рекомендуется использовать или полосы фильтровальной бумаги, или силикагелевыи метод, о п и с а н н ы е в разделах 2.2.2 и 2.2.3 соответственно.
Системы для транспортировки культур в транспортной среде Стюарта м о ж н о приобрести на к о м м е р ч е с к о й основе; о н а у с п е ш н о применяется уже много лет. Также среду Стюарта м о ж н о приготовить в лаборатории, как о п и с а н о н и ж е [Щ.
Оборудование и материалы
— П р о б и р к и с завинчивающимися крышками.
— р Н - м е т р или индикаторная бумага.
— Автоклав.
Реактивы
— А н а э р о б н ы е солевые растворы:
дехлорированная ( д е и о н и з и р о в а н н а я ) дистиллированная вода 900 мл 1 % водный раствор хлорида кальция 20 мл 20 % водный раствор глицерофосфата натрия 100 мл гидроксид натрия, 1 моль/л (рН 7,2) 12—15 мл тиогликолевая кислота 2 мл
— Раствор агара:
дехлорированная ( д е и о н и з и р о в а н н а я ) дистиллированная вода 1000 мл агар 6 г
— Метиленовый с и н и й , 0,1 % в о д н ы й раствор 4 мл
Методика
1. Смешать к о м п о н е н т ы а н а э р о б н о г о солевого раствора, добавив гидроксид натрия д о р Н п р и м е р н о 7,2.
2. СВОР И ТРАНСПОРТИРОВКА МАТЕРИАЛОВ
2. Растопить агар и добавить его в а н а э р о б н ы й с о л е в о й раствор.
3. Измерить р Н и при н е о б х о д и м о с т и д о в е с т и д о 7,3—7,4.
4. Добавить 4 мл раствора метиленового с и н е г о и х о р о ш о перемешать.
5. Разлить жидкость п о пробиркам с з а в и н ч и в а ю щ и м и с я крышками ( п р о бирки д о л ж н ы быть почти полными) и автоклавировать при температуре
121 °С в течение 15 м и н . П о с л е автоклавирования и охлаждения среда д о л ж н а стать б е с ц в е т н о й .
6. Т а м п о н с н а б р а н н ы м на него материалом поместить в среду, рукоятку обломать или обрезать; пробирку герметично запечатать для отправки в лабораторию.
2.2.2 Применение полос фильтровальной бумаги
Высушивание и х р а н е н и е мазков на полосках фильтровальной бумаги м о ж е т продлить ж и з н е с п о с о б н о с т ь стрептококка группы А [11—13]. К р о м е того, это поддерживает с о о т н о ш е н и е стрептококков и другой флоры в мазке. Во время п о с л е д у ю щ е й инкубации п о л о с о к на поверхности чашек с кровяным агаром бумага п о л н о с т ь ю пропитывается питательной ж и д к о с т ь ю из агара. М и к р о организмы растут в слоях бульона м е ж д у б у м а ж н ы м и п о л о с к а м и и поверх
ностью агара. В таких условиях д а ж е слабые гемолитические штаммы с т р е п тококка обьгано продуцируют четкий гемолиз.
Приготовление полос фильтровальной бумаги
Оборудование и материалы
— Фильтровальная бумага (например, ватман № 1), разрезанная на полосы р а з м е р о м 2x6 с м .
— Глянцевая бумага (неадсорбирующая бумага, устойчивая к стерилизации паром), разрезанная на полосы р а з м е р о м 3x13 с м .
— Алюминиевая фольга т о л щ и н о й 0,015 м м , размером 10x20 с м , с л о ж е н н а я вдвое.
Методика
1. Пометить о д н у сторону п о л о с к и фильтровальной бумаги карандашом.
2. П о л о с к у глянцевой бумаги сложить почти вдвое, оставив верхний край н е м н о г о шире, чтобы ее м о ж н о было легко раскрыть, не загрязняя пальцами фильтровальную бумагу.
3. Вложить фильтровальную бумагу внутрь с л о ж е н н о й вдвое полоски глян
цевой бумаги так, чтобы карандашная метка оказалась против короткой части.
4. Завернуть глянцевую бумагу с н а х о д я щ е й с я в н е й фильтровальной бума
гой в а л ю м и н и е в у ю фольгу так, чтобы края фольги смыкались над чистой с т о р о н о й фильтровальной бумаги.
5. Завернутый в фольгу пакет автоклавировать в т е ч е н и е 30 м и н при т е м пературе 121 °С.
6. Затем дать пакету п о л н о с т ь ю высохнуть, п о с л е чего его м о ж н о и с п о л ь зовать.
7. Если простерилизованные пакеты хранятся с о в е р ш е н н о сухими, о н и в течение многих лет не нуждаются в п о в т о р н о й стерилизации.
Рис. 2. Перенос стрептококкового материала на фильтровальную бумагу для транспортировки.
Перенос материала на фильтровальную бумагу Оборудование и материалы
— Пакеты с фильтровальной бумагой, заранее подготовленные и простери
л и з о в а н н ы е .
— Шариковая ручка или фломастер для н а н е с е н и я меток.
— Т а м п о н из ваты или синтетических волокон для забора материала из глотки.
Методика
1. Надписать пакеты шариковой ручкой или карандашом на наружной с т о р о н е а л ю м и н и е в о й обертки.
2. Развернуть а л ю м и н и е в у ю обертку. Обратить в н и м а н и е на т о , чтобы чис
тая (без карандашных меток) сторона п о л о с о к фильтровальной бумаги была о б р а щ е н а вверх.
3. Т а м п о н о м произвести забор материала.
4. П о л у ч е н н ы й материал сразу ж е перенести на полоску фильтровальной бумаги, как показано на рис. 2. Д л я этого открыть полоску фильтроваль
н о й бумаги, п о д н я в верхний край глянцевой бумаги, и с легким нажимом прокатать тампон п о н е м а р к и р о в а н н о й с т о р о н е фильтровальной бумаги.
2. СВОР И ТРАНСПОРТИРОВКА МАТЕРИАЛОВ
захватывая в с ю д о с т у п н у ю поверхность. К оставшимся частям полоски несколько раз прикоснуться кончиком тампона.
5. Отпустить верхний край глянцевой бумаги, чтобы о н вернулся в и с х о д н о е п о л о ж е н и е , и оставить препарат д о полного высыхания на 1 0 — 1 5 мин (время высыхания зависит от о т н о с и т е л ь н о й влажности окружающей с р е д ы ) .
6. Завернуть препарат в а л ю м и н и е в у ю фольгу. Пакет хранить в сухом месте при к о м н а т н о й температуре д о отправки в лабораторию.
Примечания
• Пакет м о ж н о пересылать п о почте в о б ы ч н о м конверте, если это п о з в о ляют местные правила, касающиеся почтовых отправлений.
• Высушенный препарат м о ж е т храниться д о 7 д н е й б е з существенного у м е н ь ш е н и я числа стрептококков д а ж е при наличии е д и н и ч н ы х к о л о н и й , полученных от хронических носителей.
• Поскольку сырость с у щ е с т в е н н о с н и ж а е т ж и з н е с п о с о б н о с т ь стрептокок
ков группы А на полосках фильтровальной бумаги, д а н н а я методика может оказаться н е э ф ф е к т и в н о й во время с е з о н а д о ж д е й в тропических и с у б тропических странах. Эту проблему м о ж н о решить, используя для хране
н и я и пересылки о б р а з ц о в закрытые контейнеры с влагопоглотителями типа силикагеля.
Получение культуры с полосок фильтровальной бумаги Оборудование и материалы
— Пинцет.
— Бунзеновская или спиртовая горелка.
— Чашки с кровяным агаром (см. раздел 3.1.3).
— Термостат (37 °С).
Методика
1. В лаборатории раскрыть пакет.
2. Стерильным (прокаленным в пламени горелки) п и н ц е т о м вынуть поЛоску фильтровальной бумаги.
3. П о л о с к у фильтровальной бумаги положить лицевой стороной вниз (сторо
н о й с карандашной меткой кверху) на поверхность чашки с кровяным агаром. Бумага д о л ж н а плотно прилегать к краям чашки, чтобы п о д п о л о с к о й н е оставалось пузырьков воздуха.
4. Инкубировать чашку в аэробных условиях в т е ч е н и е 4 — 5 ч при 37 "С.
5. П о с л е этого снять полоску бумаги стерильным п и н ц е т о м (прокаленным в пламени горелки) и положить ее на несколько с е к у н д на с р е д н ю ю треть т о й ж е чашки. Затем переместить п о л о с к у на оставшуюся треть той ж е чашки, все время лицевой с т о р о н о й вниз.
6. Чашку оставить в термостате на ночь при 37 °С.
7. После этого исследовать посев на р-гемолитический стрептококк группы А.
Примечания
• На первом и втором участках контакта п о л о с к и фильтровальной бумаги с агаром вырастают типичные раздельные к о л о н и и бактерий. На п о с л е д н е м ,
