Objectifs : l’apparition des méthodes d’analyse chromatographiques de pointe telles que la CPG et la HPLC a amoindri le rôle joué par la Chromatographie sur Couche Mince au sein des Laboratoires d’analyses, neanmoins cette technique (CCM) a pris un intérêt accru compte tenu de son application très pratique notamment comme moyen de détection sur le terrain, en effet cette méthode s’avère d’un apport appréciable dans des situations imposant la rapidité d’analyse sans faire appel aux méthodes spécialisées.
Ce stage est destiné aux techniciens et aux utilisateurs des méthodes chromatographiques. Le programme proposé permettra aux participant:
- d’avoir des connaissances sur les méthodes chromatographiques notamment la technique sur couche mince,
- d’utiliser expérimentalement la CCM et de se rendre compte de l’apport pratique de cette technique
Public concerné Pré-requis
TS et plus Chimie organique Chimie analytique
Niveau Session (s) Durée Début Fin Volume horaire
I 1 3 jours Dim Mar 24H
Date de (s) session (s) Répartition du volume horaire 12 / 09 /2004 - 14 / 09 / 2004 04 H de Cours et 20H de TP
Contenu du programme Théorie :
1. Les différentes méthodes chromatographiques 2. La chromatographie sur couche mince (CCM) 2.1 Définitions et principe de la technique.
2.2 Mécanismes fondamentaux de séparation 2.3 Techniques et réactions de révélation 3. exercices d’application
Pratique :
1. choix des conditions d’analyse
- Adsorbants et plaques chromatographiques.
- Choix de l'éluant.
- Dépôt de l'échantillon.
- Développement de la plaque.
- Révélation
- Calcul des rapports frontaux
- Analyse qualitative et semi-quantitative 2. Applications expérimentales de la CCM.
- Description d'une analyse par CCM selon la technique utilisé - Résultats, interprétations et conclusion.
I.
Méthodes chromatographiques :
I.1 Généralités - Historique
Des 1903, quelques essais montrèrent qu’il était possible de mettre à profit les phénomènes d’adsorption pour séparer les constituants d’un mélange, mais ce n’est réellement qu’en 1906, à la suite des travaux du botaniste russe Tswett, que naquit la méthode à laquelle cet auteur donna le nom de chromatographie (étymologie : chroma = couleur).
En faisant des essais de filtration d’une solution de pigments végétaux (chlorophylles et xanthophylles) dans de l’éther de pétrole, dans une colonne remplie de carbonate de calcium finement pulvérisé, il constate que ceux-ci s’adsorbent au sommet de la colonne sous forme d’une étroite zone colorée. L’apport continu de solvant pur au sommet de cette colonne provoque la migration de haut en bas, à une vitesse propre, de chaque pigment, facilement observable par la superposition de zones ou anneaux diversement colorés, séparés les uns des autres d’où le nom de chromatogramme. Donné par Tswett à l’ensemble ainsi develeppé [1].
Les différents pigments peuvent alors être isolés, soit par fragmentation des différentes zones et lavage de chacune d’entre elle, avec un solvant approprié, soit en poursuivant l’addition du solvant et en recueillant à l’extrémité de la colonne les fractions correspondant à l’entraînement de chaque zone.
L’idée de repartir l’adsorbant, non plus dans une colonne mais sur une surface plane, date de 1938, elle est due à Izmailov et Shraiber [1]. Ces précurseurs utilisaient des plaques de verre revêtues d’une mince couche d’alumine. Onze ans plus tard, Mienhard et Hall introduisent l’amidon comme liant de l’adsorbant (alumine) reparti sur des plaques de verre.
Ce liant permet d’accroître la stabilité mécanique de la couche adsorbante.
En 1951, Kichner, Miller et Keller [2] développent une méthode semblable, connue sous le nom de « chromatostrip », tandis que Reitsuma en utilisant les plaques de verre introduit les chromatoplaques sur lesquelles on exécute simultanément plusieurs chromatogrammes. Mottier et Potterat fractionnent les colorants hydrosolubles avec de l’alumine en poudre, tassée à sec sur une plaque de verre. Puis Lederer en 1957 préconise l’emploi de l’acide silicique pour la séparation des caroténoïdes et des porphyrines, et Barbier l’applique au fractionnement des benzoquinones [ 2].
Ces expériences sont largement exploitées car elles font apparaître très nettement les différentes caractéristiques de toute chromatographie :
- Le phénomène mis en œuvre est bien défini. Il fait ici appel aux propriétés d’adsorption de la phase stationnaire dite parfois phase fixe et aux propriétés éluantes de la phase mobile.
- Le principe de la séparation peut être différent mais la répartition entre une phase stationnaire et une phase mobile reste le phénomène constant.
- Les étapes successives de l’opération chromatographique apparaissent distinctement :
.
Fixation initiale des substances sur la phase stationnaire;.
Déplacement sélectif de celles-ci par l’éluant entraînant leur séparation ;.
Identification des différentes fractions.Curieusement, la découverte de Tswett restera dans l’oubli pendant prés de vingt-cinq ans, jusqu’au moment ou les biochimistes Kuhn et Lederer montrèrent le parti que l’on pouvait tirer de cette expérience. Dés lors, de nombreuses modifications furent proposées afin d’améliorer la technique initiale.
En 1941 Martin et Synge (prix Nobel 1962) montrent que, dans certains cas, la phase stationnaire solide peut être avantageusement remplacée par une phase stationnaire liquide. La chromatographie de partage prend alors le pas sur la chromatographie d’adsorption. Dés cette époque également, ils prévoient qu’une phase mobile gazeuse peut se substituer à la phase liquide ; mais ce n’est qu’en 1952 que Martin et James appliquent cette hypothèse à la séparation des composés volatils ouvrant le champ à la chromatographie en phase gazeuse (gaz-liquide, gaz-solide).
l’apparition des méthodes d’analyse chromatographiques de pointe telles que la CPG et la HPLC a amoindri le rôle joué par la Chromatographie sur Couche Mince au sein des Laboratoires d’analyses, néanmoins cette technique (CCM) a pris un intérêt accru compte tenu de son application très pratique notamment comme moyen de détection sur le terrain, en effet cette méthode s’avère d’un apport appréciable dans des situations imposant la rapidité d’analyse sans faire appel aux méthodes spécialisées.
I.2 Chromatographie - aspects généraux
La chromatographie est une méthode physique de séparation basée sur les différences d'affinités des substances à analyser à l'égard de deux phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile. Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des
composants entraînés par la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successive sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque phase. Dans toute méthode chromatographique, les séparations sont fondées sur la différence de distribution des espèces entre deux phases non miscibles, l’une étant stationnaire, l’autre mobile :
Am As
La migration différentielle des diverses substances du mélange à analyser résulte de l'aptitude qu'a chacune de ces substances à se répartir différemment entre les deux phases (fixe et mobile) formant le dispositif séparateur. Pour un couple donné de phases fixe et mobile, chaque substance (i) est caractérisée par la valeur d'un coefficient (coefficient de répartition entre les deux phases) exprimant le rapport des concentrations en cette substance dans la phase fixe (Cs) et dans la phase mobile (Cm) :
Ki = Cs (i)/ Cm (i)
La mobilité chromatographique des substances, leur position le long du dispositif séparateur est fonction de la valeur de répartition entre les phases.
Le fluide (phase mobile) qui progresse dans la masse du support granulaire (phase fixe) provoque des perturbations successives de l'équilibre de répartition entre phases de chacune des substances (i), tandis que cet équilibre est en permanence rétabli par suite de l'affinité pour la phase fixe des substances chromatographiées [ 3 ].
En pratique, la chromatographie est faite soit dans un tube en verre, en métal ou en matière plastique appropriée contenant la matière granulaire constituant la phase fixe et le fluide mobile intergranulaire (phase mobile), soit dans une couche de matière granulaire portée par une plaque de verre ou de métal ou de matière plastique appropriée, soit dans une feuille de matière fibreuse (fibre de cellulose, de verre...). On parle alors respectivement de chromatographie sur colonne ou de surface (sur couche).
On définit un coefficient de partition K : K =
On peut classer les méthodes chromatographiques d'après la nature des phases utilisées ou celle des phénomènes mis en oeuvre dans la séparation.
I.2.1 Nature des phases
a) - Phase fixe ( stationnaire)
La phase fixe peut être solide ou liquide. Les solides, silice ou alumine traitées, permettent la séparation des composants des mélanges grâce à leurs propriétés adsorbantes. Ils
peuvent être employés comme remplissage d'une colonne (chromatographie par gravité et chromatographie à haute performance ou HPLC) ou étalés en couche mince sur une plaque de verre, d'aluminium ou en matière plastique (chromatographie sur couche mince ou CCM).
La phase fixe peut aussi être constituée par un liquide imprégnant un support solide ou encore par une chaîne carbonée fixée sur un support (phase greffée). Ainsi en chromatographie sur papier, la phase fixe est formée par l'eau que les molécules de cellulose du papier adsorbent, alors qu'en chromatographie en phase gazeuse, elle est constituée d'un liquide peu volatil et thermiquement stable imprégnant un granulé poreux.
b) - Phase mobile La phase mobile est:
- soit un gaz (ex: chromatographie en phase gazeuse): la phase mobile est appelée gaz vecteur ou gaz porteur.
- soit un liquide (ex : chromatographie sur papier, couche mince ou colonne): la phase mobile est appelée éluant.
1.2.2-Nature des phénomènes
On distingue quatre types de phénomènes que nous allons étudier successivement:
- Chromatographie d'adsorption - Chromatographie de partage - Chromatographie ionique - Chromatographie d'exclusion a) - Chromatographie d'adsorption
Elle est illustrée par la séparation chromatographique classique, sur colonne remplie ou sur couche mince, des composés moléculaires.
b) - Phénomènes d'adsorption et de partage
- l'adsorption est un phénomène d'interface à la différence de l'absorption
- lorsqu'à la surface du gel de silice on greffe une monocouche d'hydrocarbure, les molécules, qui présentent une partie lipophile et l'autre hydrophile, s'orientent à l'interface comme en témoigne l'exemple de l'orangé d'acridien en phase aqueuse.
- Polarité des phases:
Les séparations sont basées sur le principe de polarité c'est à dire l'existence de dipôles.
Phase mobile Adsorbants
Le pouvoir éluant d'un liquide dépend de sa propre polarité. Les liquides classés ci- dessous le sont par polarité croissante. On obtient ainsi une série éluotropique.
- éther de pétrole - cyclohexane - étrachlorométhane - trichloréthène - toluène - benzène
- dichlorométhane - éther diéthylique - trichlorométhane - éthanoate d'éthyle - pyridine
- propanone - propan-1-ol - éthanol - méthanol - eau
- acide éthanoïque
Les adsorbants figurant dans la liste ci-dessous sont classés selon l'ordre croissant de leurs forces d'interactions avec des composés polaires.
- Papier, cellulose
- Kieselguhr, terre de diatomées - Amidon
- Sucres - Talc
- Carbonate de sodium - Oxyde de magnésium - Gel de silice
- Alumine - Charbon activé
Le gel de silice et l'alumine sont les adsorbants les plus utilisés. En général, plus un adsorbant est actif, plus il retient fortement les composés polaires. Il est cependant possible de traiter un adsorbant pour modifier ses propriétés: Plus la teneur en eau d'un adsorbant est faible (ce qui a pour conséquence la présence d'un plus grand nombre de sites d'adsorption pour le soluté), plus il est polaire ou actif.
- interactions entre le composé à analyser et les deux phases
Lorsque les solutés sont neutres, l'ordre d'adsorption sur un adsorbant polaire comme le gel de silice ou l'alumine est le même que celui présenté pour les solvants. Les solutés apolaires (ex: alcanes) sont peu adsorbés alors que les solutés polaires (ex: méthanol) le sont fortement.
Par contre, on utilisera de préférence l'alumine pour séparer des solutés basiques comme les amines et le gel de silice pour les phénols et les acides car les solutés acides sont fortement adsorbés par l'alumine alors que les solutés basiques le sont par la silice.
c) - Chromatographie de partage
Elle est fondée sur la différence de solubilité des substances à séparer dans deux fluides parfaitement miscibles. Elle est mise en pratique en chromatographie sur papier. Un des fluides est un liquide retenu sur un support inerte et constitue la phase stationnaire.
L'autre, liquide ou gaz en déplacement, constitue la phase mobile. Le facteur principal qui intervient est le coefficient de partage entre chaque phase. On peut séparer des solutés dont les coefficients de partage entre les deux phases sont différents. Les plus solubles dans la phase mobile se déplacent plus facilement que ceux qui le sont moins.
Un autre facteur qui intervient est la polarité de la phase : En HPLC on peut utiliser des phases stationnaires peu ou non polaires, la phase mobile étant polaire (eau ou mélange eau - méthanol): on parlera alors de chromatographie de partage à polarité de phase inversée.
d) - Chromatographie ionique
La phase mobile est une solution tampon aqueuse et la phase stationnaire la plus courante est constituée de polystyrène sous forme de sphères de quelques micromètres de
diamètre, lesquelles ont été chimiquement transformées en surface pour faire apparaître des sites ioniques. Ces phases permettent l'échange de leurs contre-ions mobiles avec des ions, de même signe, présents dans la phase mobile. La séparation repose sur les coefficients de distribution ionique entre les deux phases.
e) - Chromatographie d'exclusion
La phase stationnaire est généralement un polymère poreux dont les pores ont des dimensions choisies en rapport avec la taille des espèces à séparer. On réalise une sorte de tamis à l'échelle moléculaire, dit à perméation sélective. Le coefficient de partition s'appelle dans ce cas le coefficient de diffusion. Cette technique est encore appelée filtration sur gel ou perméation de gel selon la nature de la phase mobile (aqueuse ou organique).
Le diamètre des pores est une caractéristique de chaque type de gel.
Un mélange de solutés de masses molaires variables traverse une épaisseur donnée de gel: les grosses molécules, celles dont le diamètre est supérieur à celui des pores, sont exclues et éluées les premières; les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses, leur migration est freinée en diffusant dans le gel.
La séparation est donc réalisée par le fait que les solutés sont élués dans l'ordre inverse des masses molaires.
Chromatographie
Sur Couche Mince
II - Chromatographie sur couche mince (CCM) II.1. Définition et appareillage:
La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur des phénomènes d'adsorption.
Les principaux éléments d'une séparation chromatographique sur couche mince sont:
Une phase liquide (en général un solvant organique ou mélange de solvants) se déplace par capillarité dans une mince couche uniforme de phase stationnaire (généralement du gel de silice, SiO2) étalée sur un support rigide ou semi-rigide qui est, en général, une plaque de verre ou d'aluminium ou une feuille de matière plastique.
Les substances à analyser sont séparées par partition entre les phases mobile et stationnaire. La CCM, relativement peu coûteuse et d'exécution facile, peut constituer un puissant moyen d'analyse qualitative lorsqu'elle est combinée à certaines formes de prétraitement des échantillons, comme l'extraction par solvant. Toutefois, certaines séparations peuvent être difficiles à réaliser de façon reproductible. L'interprétation des résultats peut aussi être très délicate, surtout lorsque plusieurs médicaments ou métabolites sont présents [4].
Ces différents éléments sont décrits comme suit :
- la cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé par un couvercle étanche.
- la phase stationnaire : une couche d'environ 0,25 mm de gel de silice ou d'un autre adsorbant est fixée sur une plaque de verre à l'aide d'un liant comme le sulfate de calcium hydraté l'amidon ou un polymère organique.
- l'échantillon : environ un microlitre (µl) de solution diluée (2 à 5 %) du mélange à analyser, déposé en un point repère situé au-dessus de la surface de l'éluant.
- l'éluant : un solvant pur ou un mélange : il migre lentement le long de la plaque en entraînant les composants de l'échantillon.
II.2. Principe de la technique.
Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l'échantillon est placée dans la cuve, l'éluant monte à travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarité. En outre, chaque composant de l'échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le front du solvant.
Cette vitesse dépend d'une part, des forces électrostatiques retenant le composant sur la plaque stationnaire et, d'autre part, de sa solubilité dans la phase mobile.
Les composés se déplacent donc alternativement de la phase stationnaire à la phase mobile, l'action de rétention de la phase stationnaire étant principalement contrôlée par des phénomènes d'adsorption. Généralement, en chromatographie sur couche mince, les substances de faible polarité migrent plus rapidement que les composants polaires.
Figure 1 : éléments principaux d’une C . C . M
II.2.1 Préparation des plaques
La phase stationnaire est généralement constituée d'une couche uniforme d’une épaisseur de 0,25 mm de gel de silice (taille moyenne des particules 20 µm). Les plaques mesurent généralement 20 × 20 cm, mais il en existe de plus petites. Certaines plaques du commerce contiennent un indicateur fluorescent qui peut être utile pour localiser les tâches avant la pulvérisation des révélateurs.
Il est possible d'améliorer la séparation de quelques substances basiques avec certains solvants en plongeant au préalable la plaque dans de le KOH méthanolique, puis en la séchant, mais, en général, on obtient le même effet en ajoutant du NH4OH concentré (d= 0,88) à la phase mobile. Il existe des plaques à hautes performances dont la phase stationnaire est constituée de particules de taille plus petite (5 - 10 µm) et qui sont plus efficaces que les plaques classiques. On trouve également des plaques à phases inversées, dans lesquelles un groupement hydrophobe (généralement en C2, C8 ou C18) est lié à la matrice de silice.
Les plaques à chromatographie peuvent être préparées au laboratoire à l'aide de gel de silice contenant un lien approprié et de plaques de verre mesurant 20 × 20 × 0,5 cm. Il est important de s'assurer que les plaques sont propres et exemptes de graisse. Le gel de silice est d'abord mélangé avec deux fois son poids d'eau pour former une suspension. Cette suspension est ensuite appliquée rapidement sur la plaque de verre à l'aide d'une étaleuse commerciale, de façon à former une couche de 0,25 mm d'épaisseur. Le cas échéant, de petites quantités d'additifs, par exemple des indicateurs fluorescents, peuvent être ajoutées au mélange. Les plaques sont séchées à l'air et doivent être conservées à l'abri de l'humidité. La qualité des plaques préparées au laboratoire doit être soigneusement contrôlée; pour obtenir une bonne séparation, il peut être utile de les activer (c'est-à-dire de les chauffer à 100°C pendant 30 mn avant utilisation). La méthode consistant à plonger les plaques de verre dans la suspension, puis à les sécher donne des résultats très variables et n'est pas recommandée. En général, la couche de silice des plaques préparées au laboratoire est nettement plus fragile que celles des plaques du commerce et les résultats sont beaucoup moins reproductibles. Et il est souvent préférable d'utiliser toujours la même marque de plaques. Toutefois, même dans ce cas, on peut constater des différences considérables d'un lot à l'autre en ce qui concerne le facteur de rétention et la sensibilité à certains révélateurs.
Par ordre d'importance décroissante, les adsorbants employés en CCM sont : le gel de silice, l'alumine, le kieselguhr et la cellulose.
A : sur plaque de verre b : sur plaque d’aluminium
Figure 2 : Cliché au microscope électronique d’une plaque recouverte d’une couche de gel de silice (agrandissement x 500)
Performances des plaques C.C.M (support et phases stationnaires) Le support le plus utilisé est la plaque de verre. Résistante aux traitements, d’usage simple. Elle présente une surface plane. Ses inconvénients sont sa fragilité et son poids relativement élevé (les plaques de verre ont une épaisseur de 1.3 mm). Elles nécessitent un emballage de bonne qualité et sont plus difficiles à recouvrir que les feuilles d’aluminium ou de polyester. Le coût de production est donc plus élevé.Les feuilles de polyester d’une épaisseur de 0.2 mm, sont très concurrentielles, car elles sont incassables, nécessitent peu d’emballage, résistent à tous les solvants et n’exigent qu’un faible volume de stockage. En outre, elles peuvent être découpées en ciseaux au format désiré. On peut même découper des composés après séparation, les éluer, etc. même les petits formats (4 x 8 cm) peuvent être produits et emballés de façon économique. Toutefois, durant la carbonisation sur feuille de silice, la température est limitée (jusqu’à 160°C).
Les feuilles d’aluminium ont été considérablement améliorées. En effet le support d’aluminium est plus épais (environ 0.15 mm), ce qui rend les feuilles plus stables et plus faciles à couper. Une feuille d’aluminium est plus résistante aux torsions qu’une plaque de verre.
Actuellement, vu les exigences de l’emploi des plaques C.C.M (dépôt de la phase stationnaire, liant, résistance chimique, travail à haute température….), la plupart des fournisseurs recommandent l’utilisation des plaques de verre ou des feuilles de polyester.
Depuis des années, beaucoup de séparations de chromatographie sur couche mince ont été standardisées et sont devenues des analyses de routine. Pour obtenir des résultats
reproductibles. Les plaques de CCM doivent répondre aux critères suivants : - revêtement homogène
- épaisseur de couche régulière - densité d’empilage élevée - bonne adhérence de la couche
- propriétés chromatographiques canstantes
les plaques de silice les plus utilisées sont de revêtement spécial pour des séparations particulières ayant les propriétés suivantes :
- Diamètre moyen de pore : 60Å - Surface spécifique : 500m2/g
- Volume moyen des pores : 0.75 ml/g - granulométrie de 5 à 17 µm
- plaque contenant un indicateur fluorescent à base de silicate de zinc activé au manganèse pour l’UV proche (254 nm) et un pigment fluorescent inorganique spécial pour l’UV lointain (366 nm)
- L’agent liant est un composé à haut degré de polymérisation stable pour la plus part des solvants et résistants aux réactifs de détection corrosifs.
- Meilleure efficacité de séparation
- Reproductibilité excellente du revêtement II.2.2Choix de l'éluant.
L'éluant est formé d'un solvant unique ou d'un mélange de solvants.
Un éluant qui entraîne tous les composants de l'échantillon est trop polaire; celui qui empêche leur migration ne l'est pas suffisamment.
Une méthode simple pour trouver l'éluant approprié consiste à préparer des solutions de l'échantillon dans différents solvants, en concentration d'environ 2 à 5% en volume. A l'aide d'une micropipette, on dépose une goutte de chaque solution sur une plaque, chacune séparée d'environ 1 cm. Le meilleur éluant est celui qui, lorsqu'il a terminé sa migration, a entraîné le soluté à une distance d'environ la moitié de celle qu'il a parcourue.
Une autre méthode consiste à déposer une solution des substances à analyser en plusieurs points, séparés d'environ 2 cm. Après séchage, on applique au centre de chaque point une micropipette remplie de solvant; Après diffusion, l'éluant qui convient sépare les solutés.
Choix de l'éluant dans le cas d'analyses :
- d'hydrocarbures : hexane, éther de pétrole ou benzène.
- de groupements fonctionnels courants : hexane ou éther de pétrole mélangés en proportions variables avec du benzène ou de l'éther diéthylique forment un éluant de polarité moyenne.
- de composés polaires : éthanoate d'éthyle, propanone ou méthanol.
II.2.3 Application et dépôt de l'échantillon
L'échantillon est mis en solution (2 à 5 %) dans un solvant volatil, qui n'est pas forcément le même que l'éluant : On emploie fréquemment le trichlorométhane (chloroforme), la propanone ou le dichlorométhane. La solution est déposée en un point de la plaque situé à environ 1 cm de la partie inférieure.
Certaines plaques du commerce sont fournies avec une couche d'adsorbant spécial pour simplifier l'application de l'échantillon. Toutefois, en règle générale, l'échantillon est appliqué directement sur la couche de gel de silice. L'origine doit être repérée en traçant légèrement au crayon une ligne à 1 cm au minimum du bas de la plaque, en veillant à ne pas endommager la surface du gel de silice. Une ligne est ensuite tracée à 10 cm de l'origine pour indiquer la position optimale du front du solvant; cette distance peut être modifiée au besoin.
Lorsqu'on utilise une plaque de 20 × 20 cm, il est conseillé de délimiter des couloirs verticaux de 2 cm de large, par exemple avec un crayon, afin de réduire l'effet perturbateur des bords de la plaque [5].
Les échantillons et les étalons seront appliqués avec soin sur la ligne de départ dans le couloir approprié, à l'aide d'une micro-pipette ou d'une seringue, de façon à former une tache de 5 mm de diamètre au maximum. Si les taches sont plus grandes, la résolution sera moins bonne lors du développement du chromatogramme.
Le volume appliqué doit être aussi faible que possible, en général 5 à 10 µl de solution contenant environ 10 µg de l’echantillon. Les échantillons à examiner seront appliqués les
premiers, suivis des étalons ou des mélanges d'étalons, de façon à réduire le risque de contamination croisée. On obtient facilement des micro-pipettes jetables à pointe très fine en étirant à la flamme d'un microbrûleur des tubes capillaires servant à la détermination du point de fusion. L'idéal est d'utiliser le même solvant pour l'application de l'échantillon et le développement du chromatogramme, mais cela n'est pas toujours possible; en général, le méthanol donne de bons résultats.
La plaque peut être chauffée, par exemple avec un sèche-cheveux, pour accélérer l'évaporation du solvant d'application, mais il faut la laisser refroidir avant de procéder au développement, et le chauffage risque d'entraîner la perte de substances volatiles
Figure 3 : Dépôt de l’échantillon en C.C.M
II.2.4 Développement du chromatogramme
Le développement consiste à faire migrer le solvant sur la plaque. Dans les analyses usuelles de laboratoire, le principal type de développement est la chromatographie ascendante:
Il existe de nombreux fournisseurs de cuves à développement pour la CCM.
Normalement, le bord supérieur de ces cuves est rodé de façon à assurer l'étanchéité du couvercle. L'étanchéité peut être encore améliorée en appliquant une petite quantité de lubrifiant siliconé. Le fond de certaines cuves présente une forme spéciale calculée pour réduire la quantité de solvant nécessaire. La plupart des méthodes citées dans la littérature recommandent l'utilisation de plaques et de cuves de dimensions standard, mais si l'on choisit des plaques plus petites il est avantageux d'utiliser aussi des cuves de dimensions réduites. La cuve doit être tapissée de papier filtre absorbant sur 3 côtés, et le solvant doit être ajouté au moins 30 mn avant le développement du chromatogramme. On obtient ainsi une atmosphère saturée en vapeur de solvant, ce qui améliore la reproductibilité. La phase mobile est parfois
constituée d'un seul solvant, mais la plupart du temps il s'agit d'un mélange; la phase mobile la plus utilisée en toxicologie analytique, par exemple, est probablement le mélange acétate d'éthyle/méthanol/hydroxyde d'ammonium concentré. Il est important de préparer les phases mobiles chaque jour, car leur composition peut changer par suite de l'évaporation de certains constituants ou de réactions chimiques. Des pertes d' NH4OH en particulier, peuvent être observées non seulement dans la phase mobile, mais aussi dans les flacons de réactifs laissés ouverts, ce qui est souvent à l'origine de difficultés.
Pour développer le chromatogramme, placer la plaque dans la cuve uniformément saturée, s'assurer que le bord inférieur de la couche de silice plonge dans le solvant, mais que celui-ci n'atteint pas les points d'application des échantillons et placer rapidement le couvercle sur la cuve. Le développement du chromatogramme doit être surveillé pour vérifier que le front du solvant avance de façon uniforme. En général, le front s'incurve à proximité des bords de la plaque; la courbure est plus prononcée si l'atmosphère de la cuve n'est pas suffisamment saturée en vapeurs de solvant. Cet effet peut être réduit en divisant la plaque en couloirs de 2 cm de large. La plaque est laissée dans la cuve jusqu'à ce que le solvant ait parcouru la distance prévue, généralement 10 cm à partir de l'origine. Elle est ensuite retirée de la cuve et placée dans une hotte aspirante jusqu'à ce qu'elle soit sèche. Le séchage peut être accéléré en dirigeant un courant d'air chaud sur la plaque (à l'aide d'un sèche-cheveux) jusqu'à ce que toutes les traces de solvant soient éliminées. Cela est particulièrement important avec les phases mobiles à base d'NH4OH car la présence d'NH4OH résiduel modifie les réactions observées avec certains révélateurs.
Figure 4 : Cuves de CCM durant le développement
II.2.5 Techniques de révélation.
L'identification des substances isolées se fait selon différentes méthodes (valable également pour la chromatographie sur papier):
- directement si les substances sont colorées
- à l'aide de révélateurs si elles sont incolores afin de les transformer en taches colorées; les produits sont souvent décelés par leurs réactions fonctionnelles classiques: les acides aminés par la ninhydrine qui donne avec la plupart une couleur bleu-violet, les acides organiques par des indicateurs colorés, les sucres par le réactif de Molisch qui utilise le pouvoir réducteur des sucres.
Quelques réactifs comme l'iode ou le permanganate donnent des colorations non spécifiques avec la plupart des composés organiques.
- toutes les substances ayant une absorption dans la région au-dessus de 230 nm sont étudiées sur des supports additionnnés de corps fluorescents par irradiation de lumière UV à ondes courtes (max< 254 nm). L'emploi de couches non additionnées de produits fluorescents permet aussi la mise en évidence de beaucoup de substances dans l'UV à ondes courtes (max <254 nm) ou à ondes lon,gues (max > 366 nm) par suite de la fluorescence propre des composés.
Dans tous les cas, il faut noter les positions des taches colorées juste à la fin de la chromatographie en les cerclant car certains produits disparaissent avec le temps.
. Réactions spécifiques de révélation
A l’aide de réactions chimiques, on peut modifier une substance incolore en une substance colorée ou active à la lumière UV; ceci est effectué par vaporisation d’un réactif spécifique sur la plaque ou par introduction de la plaque dans une cuve saturée du réactif.
Le tableau 1 illustre la les principaux solutions révélatrices en chromatographie sur couche mince [4]
Tableau 1 : Principaux réactifs minéraux employés en C.C.M.
Réactifs Composition Substances révélées
* H2SO4 conc.
*H2SO4 à 50%.
*H2SO4 à 2%
dans EtOH/H2O (1:1).
*H2SO4 dans
l’anhydride acétique (1:3).
* Vaporiser avec l’acide et chauffer à 100-110
0C.
* Vaporiser avec le réactif et chauffer à 200
0C. Observer à la lumière ordinaire et en UV.
*Vaporiser avec le réactif et chauffer à 1000C.
*Idem.
* Cholestérol, huiles essentielles, glucosides,
stéroïdes et sapogenines, vitamines,
drogues et produits pharmaceutiques.
*Esters méthyliques des acides gras et
composés époglycérides, esters du
cholestérol, acides tri terpéniques.
*Idem.
*Idem.
*H2SO4 – K2Cr2O7.
*H2SO4 – K2Cr2O7.
* H2SO4 + acide chromique.
*Sol. A :3g de K2Cr2O7 dans 20 ml d’eau + 10 ml de H2SO4 conc.
a) vaporiser la solution A, b) chauffer.
*Vaporiser une solution saturée de K2Cr2O7
dans H2SO4 conc et chauffer.
*Vaporiser une solution saturée d’acide chromique dans H2SO4 conc et chauffer.
*Lipides aliphatiques, phénoxydes d’alcoyle, sulfures, sulfones et sulfoxydes.
* H2SO4 - KMnO4. *Sol. A : 0,5 g de KMnO4 dans 15 ml de H2SO4 conc
a) vaporiser la solution A b) chauffer.
*Sulfures, sulfones et sulfoxydes.
* H2SO4 – HNO3. *Vaporiser une solution de H2SO4 – HNO3 (1 :1) et chauffer.
Vaporiser une solution à 5 % de HNO3 dans H2SO4 conc et chauffer.
*Terpènes oxygénés, amines aromatiques et
composés nitrés.
*HClO4. *Vaporiser une solution à 2 % ou à 25 % et chauffer à 1500C.
*Cholestérol.
*I2.
*I2 – Benzidine.
*Vaporiser une solution à 1% d’iode dans MeOH. Placer dans une enceinte fermée
contenant quelques cristaux d’iode.
*Vaporiser l’iode sur une couche traitée avec une solution à 0,5 % de benzidine dans
l’éthanol absolu.
*Esters méthyliques des acides gras.
*Les glycérides.
*SbCl3 dans CHCl3.
SbCl5 dans CCl4.
*Vaporiser une solution saturée de réactif dans CHCl3, puis chauffer 10 mn à 1000C. On peut également additionner le réactif de AcOH , ou de (Ac)2O et SOCl2.
*Vaporiser une solution à
20 % de réactif dans CCl4 puis chauffer à 120
0C.
* Aglycones, stéroïdes, esters du cholestérol, huiles, essentielles, pyréthrines, lipides, vitamines et carotènes, cétones aliphatiques à longue chaîne, acides biliaires, glycérides et triglycérides, acides
gras insaturés,
hétérocycles contenant des fonctions : OH, SH, NH2
* Idem
*Acide phosphomolybdique.
*Vaporiser une solution à 1,5 à 1,5%, 5%, ou 10%, de réactif dans EtOH puis chauffer 5 mn
à 1500C.
*Idem.
*KMnO4.
*KMnO4 + AcOH.
*Solution aqueuse à 0,25 %.
*Vaporiser un mélange à volumes égaux de
*Diterpénoides.
KMnO4 0,1 N et de AcOH 2N. *Produits oxydables.
*I2 – iodoplatinate de potassium.
*Vaporiser une solution de I2 0,5 % dans ChCL3, puis une solution à volumes égaux de
KI en solution aqueuse à 1,1 % et d’acide chloroplatinique à 0,135 %.
*Drogues contenant de l’azote, alcaloïdes,
vitamines, dérivés phénothiaziniques.
*SnCl2 –HCl. *Vaporiser une solution à 0,1 % de SnCl2 dans HCl conc.
*Composes nitrés aromatiques.
*AcOCo dans MeOH à 0,5 % et
LiOH dans MeOH.
*Vaporiser sur les deux solutions successivement.
*Barbituriques.
*Alcaloïdes.
*K3Fe(CN)6 –FeCl3. *Vaporiser une solution obtenue à partir de 1 volume de K3Fe(CN)6 à 5 %, 2 volumes de
FeCl3 aqueux à 10 % et 8 volumes d’eau.
*Tryptamines,
*Phénols, *Hydro- carbures chlorés.
II.2.6 Conservation des chromatogrammes
Les chromatogrammes sur couche mince sont généralement peu stables et leur conservation nécessite plusieurs techniques :
- photocopie de la plaque avec un appareil couleur
- dessin sur un papier transparent (ou cas ou le chromatogramme ne serait pas visible que sous la lumière UV, il serait nécessaire de dessiner au préalable le contour des taches
- prélèvement de la couche sur la feuille adhésive - photocopie
- procès verbal de résultats
II.2.6 Interprétation et exploitations des résultats II.2.6.1 Interprétation qualitative
Pour l’évaluation qualitative, le paramètre le plus utilisé est le facteur de rétention Rf ou encore sa valeur multipliée par 100, notée hRf. La valeur de Rf est définie par la relation:
Les valeurs de Rf sont donc comprises entre 0 et 1 et de préférence entre 0,1 et 0,8 (hRf entre 10 et 80). Pour obtenir des Rf reproductibles, il est nécessaire d’opérer dans des conditions
identiques: cuve saturée, composition identique de l’éluant, température constante, etc.
Echantillon A = référence migration en CCM et détermination du Rf
Echantillon B référence
Figure 5 : migration des échantillons sur la plaque de CCM
Afin de définir cette distance de migration, on utilise l’expression : valeur de Rf ( de l’anglais : retention factor).
Pour un couple éluant et support déterminé, Rf est une caractéristique de chaque soluté à la température de l'expérience. Sa valeur est toujours inférieure à un et on la calcule à deux chiffres après la virgule.
La valeur de Rf d’une substance est difficilement reproductible. Car elle dépend de nombreuses conditions :
- type de la phase stationnaire (fabricant, traitement préliminaire. Etc.
- granulométrie de la phase stationnaire - saturation de la cuve
- technique de travail température
Chemin parcouru par la substance depuis le start Chemin parcouru par la l’éluant depuis le start Rf =
. . . Ec A Ref Ec B
- quantité de l’échantillon portée (capacité de la phase stationnaire)
II.2.6.2Interprétation semi – quantitative
L’interprétation semi – quantitative est une méthode qui se limite en générale à la détermination grossière d’une impureté connue dans une substance. Une détermination directe du titre de la substance n’est possible que si on connaît toutes les impuretés présentes dans le mélange et seulement si leur pourcentage peut être mesuré.
Le titre de la substance peut alors être calculé en en soustrayant le pourcentage total des impuretés de 100%.
II.2.6 .3 Comparaison visuelle
Sur le chromatogramme, on porte une série de taches « spots » de différentes concentrations de l’impureté qu’on compare au mélange. Après l’élution, on compare la surface des différentes taches correspondantes. Ceci permet de donner une évaluation approximative de la concentration de l’impureté dans le mélange.
Les imputés dont teneur dépasse 10% dans la substance doivent être diluées de manière appropriée. Dans ces cas, l’évaluation est imprécise.
II.2.6.4 Interprétation quantitative
Après l’élution, la tache de la substance à doser est prélevée de la plaque après grattage de la couche, puis extraite de la phase à l’aide d’un solvant approprié
La teneur est déterminée par calorimétrie ou par spectroscopie
L’analyse quantitative est possible également avec un étalonnage approprié. Pour ce faire, soit on évalue la superficie de la tache, soit on effectue une mesure photométrique directement sur la plaque [5].
I.3 Techniques spéciales en chromatographie sur couche Mince II.3.1 Technique d’élutions répétés
Cette méthode est utilisée pour la séparation de substances dont les valeurs Rf sont très semblables.
En répétant plusieurs fois l’élution. On accentue les différences de migration. La plaque est sechée entre chaque élution
II.3.2 Technique d’élutions successives
On applique cette méthode à la séparation de mélanges de substances possédant des affinités très différentes envers la phase stationnaire ou la phase mobile, mais ou aucune séparation satisfaisante de toutes les substances n’est possible.
On sépare les substances par élution en utilisant généralement deux phases mobiles différentes. Pendant la première étape, on sépare une partie des constituants. Le reste se trouve dans une seule tache plus au moins éloignée du front. On continue alors l’élution avec un deuxième éluant qui sépare les constituants de cette tache.
Figure 6 : élutions successives en CCM II.3.3 Technique d’élution bidimentionnelle
L’élution à deux dimensions est une technique intéressante pour la séparation d’un mélange où les constituants sont nombreux. L’échantillon à analyser est à 3- 4 cm d’un coin de la plaque carrée. Puis on procède à la première élution. La plaque est ensuite sechée, puis, après l’avoir tournée de 90°, on effectue une deuxième élution avec le même éluant ou un éluant de composition différente. Le choix du deuxième éluant donne une séparation d’un autre genre et permet l’analyse de mélanges complexes
Chromatographie
monodimentionnèlle Chromatographie
bidimentionnelle
1er pas 12 cm
Eluant 1 Eluant 2
1er pas 6 cm
Figure 7 : Technique de la CCM bidimentionnelle comparée à la monodimentionnelle
II.4 Les Applications de la chromatographie sur couche mince
La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) est une méthode simple et rapide qui permet de suivre l'évolution d'une réaction et lorsque les conditions opératoires sont connues, elle permet un contrôle aisé et rapide de la pureté d'un composé organique. Si l'analyse, réalisée avec divers solvants et différents adsorbants, révèle la présence d'une seule substance, on peut alors considérer que cet échantillon est probablement pur.
De plus, étant donné que la chromatographie sur couche mince indique le nombre de composants d'un mélange, on peut l'employer pour suivre la progression d'une réaction.
La chromatographie sur couche mince est également la technique habituellement employée pour rechercher le meilleur solvant, avant d'entreprendre une séparation par chromatographie sur colonne.
Elle est également recommandée :
- pour la détection et l'identification d'un certain nombre de substances de composition de médicaments et des aliments
- comme technique de routine dans la toxicologie analytique.
- comme technique direct de la détection des substances toxiques (produits létaux)
Travail pratique à réaliser
1 – Exercice d’application
Un mélange de deux composés A et B conduit après migration à deux taches aux caractéristiques suivantes (distance de migration X et diamètre du spot W)
_ XA = 27 mm WA = 2 mm _ XB = 33 mm WB = 2,5 mm
La migration du front de solvant dans cette expérience est de 60 mm,
a)
Calculer Rf, N et H pour chacun des composés.b)
Calculer le facteur de résolution entre les deux composés A et B.c)
Etablir la relation entre le facteur de sélectivité et le Rf des deux composés. Calculer sa valeur numérique.
2- Travail expérimental demandé 2.1 Objectifs
- préparation des solutés et des mélanges à analyser (extraction et percolation) - Méthodes de choix de l’éluant
- Définition de la technique de révélation - Conduite d’une C.C. M
.
Détermination des rapports frontaux..
Identifier des substances séparées par C.C.M.
interprétation et discussion des résultats2.2 Matériel
Plaque à chromatographie (gel de silice sur support d'aluminium) et cuve à élution.
Ensemble des echantillons à analyser (références et mélange)
Eluants
Pipette capillaire.
Sèche cheveux.
Montage d’extraction par solvant
Cuve à révélation
2.3 Conduite du travail expérimental
a-Préparation de la cuve chromatographique.
- Introduire l'éluant ou le mélange de solvants.
- Ajuster le niveau à environ 0,5 cm du fond de la cuve.
- Fermer le récipient (la cuve doit être saturée de vapeur de solvant). Pour que la saturation et l'élution soient plus rapides, on peut placer une bande de papier filtre contre les parois de la cuve chromatographique.
-
b-Dépôt de l'échantillon sur la plaque
- Procéder au nettoyage de la plaque si nécessaire.
- Dissoudre l'échantillon dans un solvant approprié en solution de 2 à 5 % . - Déposer environ 0,5 µl de la solution en un point situé à 1 cm de l'extrémité
inférieure de la plaque; le diamètre de la tache doit être d'environ 2 mm pour la disposition de plusieurs produits.
- Sécher à l'aide d'un séchoir; éventuellement faire de nouvelles applications
c- Développement du chromatogramme
- Placer la plaque dans la cuve en position verticale.
- Refermer le récipient.
- Lorsque le front du solvant se trouve à environ 1 cm de l'extrémité supérieure de la plaque, la retirer et marquer cette position.(le trait peut être tracé à l'avance et servir de repère pour arrêter l'élution).
d-Révélation et calcul de Rf
- Sécher la plaque à l'aide d'un séchoir
- Révéler les taches sous une lampe UV ou à l'aide d'un révélateur - Cercler les taches et pointer leur centre.
- Calculer les Rf et identifier les substances séparées
