— LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - N°7 Novembre-Décembre 2007
Introduction
Bactérie opportuniste possédant de nombreux facteurs de virulence, Pseudomonas aeruginosa est un agent pathogène responsable d’infections nosocomiales redoutables tant par leur fréquence que leur gravité (pneumopathies, septicémies, infections urinaires, cutanées et suppurations).
Cette bactérie ubiquitaire dans l’environnement produit naturellement une céphalosporinase (AmpC), synthétisée à un niveau relativement faible mais qui participe à la résistance naturelle importante de cette espèce, et exprime naturellement plusieurs systèmes d’efflux dont le plus important est MexAB-OprM [1].
Emergence d’isolats cliniques de
Pseudomonas aeruginosa producteurs de bêta-lactamases
à spectre étendu en milieu hospitalier
Résumé: Les infections nosocomiales dues à des bacilles à Gram négatif producteurs de bêta-lactamases à spectre étendu (BLSE) sont à l’heure actuelle un sujet de préoccupation majeure en milieu hospitalier, en particulier en milieu de réanimation.
Les BLSE ne sont plus l’apanage des entérobactéries et leur diffusion est de plus en plus observée parmi de nombreuses espèces de bacilles non fermentant comme Pseudomonas spp et Acinetobacter spp en raison de l’utilisation abusive des bêta-lactamines. La multirésistance développée par les souches sécrétrices de BLSE, responsables d’épidémies nosocomiales conduit le clinicien à un choix très restreint d’antibiotiques encore efficaces dont les carbapénèmes.
En microbiologie clinique, la détection des souches productrices de bêta-lactamases à spectre étendu (BLSE) requiert la combinaison de techniques microbiologiques spécifiques, phénotypiques (test de synergie) et génotypiques (recherche de gènes de résistance hébergés par ces souches ..).
La surveillance des infections par des bacilles à Gram négatif producteurs de BLSE est devenue une nécessité en milieu de réanimation, pourvoyeur d’infections nosocomiales.
La maîtrise de la prescription des antibiotiques, l’application des règles élémentaires d’hygiène hospitalière (notamment l’hygiène des mains), le dépistage des patients porteurs de bactéries multirésistantes (BMR) ainsi que le recours aux précautions standard d’isolement technique et géographique sont autant de stratégies à mettre en oeuvre pour limiter la dissémination de ces souches.
Nous rapportons pour la première fois , cinq isolats cliniques de Pseudomonas aeruginosa producteurs de bêta-lactamases à spectre étendu (BLSE ), phénotype de résistance aux bêta- lactamines rarement observé en pratique de laboratoire au sein de cette espèce.
Mots clés : Pseudomonas aeruginosa-BLSE-infection nosocomiale-traitement-prévention.
I.LAHLOU AMINE1, Y.SEKHSOKH2 , H.LKASSMI1.
1- Laboratoire de Microbiologie, Département de Biologie Médicale, Hôpital Militaire Moulay Ismail, Meknès.
2-Laboratoire de Microbiologie, Département de Biologie Médicale, Hôpital Militaire d’Instruction Mohamed V, Rabat.
Adresse de correspondance : Laboratoire de Microbiologie , Hôpital Militaire Moulay Ismail , Meknès. - E-mail : idr_lahlou@yahoo.com
Article original
LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - N°7 Novembre-Décembre 2007 —
Elle développe par ailleurs une résistance acquise très fréquente et en constante évolution. Celle-ci est liée à sa capacité d’acquérir divers mécanismes de résistance, enzymatiques (pénicillinases, hyper- production de céphalosporinase chromosomique, bêta-lactamases à spectre étendu, carbapénémases de classe B) ou non enzymatiques (imperméabilité par mutation chromosomique de la porine OprD2, surexpression de systèmes d’efflux actif).
Plusieurs de ces mécanismes peuvent être associés et les phénotypes peuvent être parfois difficiles d’interprétation [2].
La multirésistance des souches a augmenté au cours de la dernière décennie : elle est la conséquence de l’utilisation abusive d’antibiotiques à large spectre.
Dans le présent article, les auteurs rapportent pour la première fois, cinq isolats cliniques de Pseudomonas aeruginosa producteurs de bêta- lactamases à spectre étendu (BLSE ), phénotype de résistance aux bêta-lactamines rarement observé en pratique de laboratoire au sein de cette espèce.
Matériels et méthodes Matériels
Sur une période de 06 mois (de Février à Juillet 2005), cinq isolats cliniques de Pseudomonas aeruginosa producteurs de BLSE ont été détectés au laboratoire de microbiologie de l’Hôpital Militaire d’Instruction Mohamed V de Rabat.
Ces isolats ont été obtenus à partir de divers produits pathologiques, recueillis chez cinq patients hospitalisés et concernaient deux prélèvements bronchiques protégés du service de réanimation médicale, deux aspirations bronchiques du service des brûlés et un prélèvement de pus du service de chirurgie traumatologique.
Méthodes
La mise en culture de ces produits pathologiques sur des milieux usuels (gélose au sang, gélose au sang cuit, gélose au bromocrésol pourpre) et sélectifs (gélose au cétrimide) incubés 24-48h à 37°c, en aérobiose permet d’isoler ces bactéries.
L’identification des souches de Pseudomonas aeruginosa est basée sur l’étude de leurs caractères morphologiques, culturaux et biochimiques.
Les milieux King A et King B sont ensemencés pour objectiver la production des pigments (pyocyanine
et pyoverdine).
Le sérotypage de ces souches est déterminé par technique d’agglutination sur lame au moyen d’antisérums spécifiques selon le protocole du fabricant. Il se définit comme une méthode de marquage des espèces bactériennes basée sur la détermination d’antigènes de surface, capsulaires, pariétaux ou flagellaires.
Pour le bacille pyocyanique, la sérotypie reste encore la méthode de choix du marquage infra-spécifique et peut être subdivisé en dix-sept groupes sérologiques sur la base de dix-sept groupes antigéniques O thermostables polysaccharidiques [3].
La sensibilité des souches aux antibiotiques est étudiée par la méthode conventionnelle de diffusion des disques en milieu gélosé et les critères de lecture et d’interprétation sont ceux du Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie [4].
La mise en évidence de la production de BLSE par ces souches est réalisée au moyen du test de synergie entre l’association ticarcilline +acide clavulanique et une céphalosporine de 3ème génération [5,6].
Résultats
L’examen direct après coloration de Gram des différents prélèvements a permis de montrer la présence de nombreux bacilles à Gram négatif et une importante réaction leucocytaire.
Les 02 prélèvements d’aspiration bronchique appartiennent à la classe 4 de Bartlett-Murray- Washington : 10-25 cellules épithéliales/
champ témoignant d’une contamination salivaire ( > 10 / champ ) mais avec un nombre de polynucléaires neutrophiles supérieur à 25/ champ . Ils ont donc été retenus pour l’examen bactériologique compte-tenu de la réaction inflammatoire [7].
La culture quantitative bactérienne pour les prélèvements pulmonaires est significative et supérieure au seuil autorisant l’identification et l’antibiogramme de la souche isolée : supérieure à 107 UFC /ml (UFC= unités formant colonies) pour les 02 aspirations bronchiques et à 103 UFC /ml pour les 02 prélèvements bronchiques protégés [7].
L’étude des caractères morphologiques et culturaux montre la présence de bacilles à mobilité polaire et à Gram négatif. Les colonies isolées sont de grande taille avec un aspect d’œufs sur le plat
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(fried eggs) au reflet métallique et au contour irrégulier (colonies la « large »).La recherche de l’oxydase est positive et l’odeur aromatique de seringat caractéristique.
L’étude des caractères biochimiques réalisée au moyen de galeries d’identification miniaturisées pour les non-fermentants (API20NE,Biomérieux) et par des techniques automatisées (automate VITEK-1, Biomérieux) , révèle l’appartenance des 05 isolats à l’espèce Pseudomonas aeruginosa.
Les souches isolées appartiennent au sérotype O11.
Le phénotype BLSE est suspecté devant les résultats de l’antibiogramme : sensibilité aux car boxypénicillines+acide clavulanique, sensibilité aux uréidopénicillines + tazobactam, sensibilité à l’imipénème et résistance à la ceftazidime et aztréonam (Figure 1).
Les isolats cliniques étaient par ailleurs, résistants à la gentamicine, amikacine, tobramycine et à la ciprofloxacine mais sensibles à la nétilmicine et à la fosfomycine.
La recherche d’une BLSE, réalisée grâce au test de synergie est positive dans 100% des cas : une image caractéristique en « bouchon de champagne », est visible (Figure 2 et 3).
Les résultats et l’aspect des antibiogrammes obtenus sont fortement évocateurs d’une BLSE de la classe A d’Ambler ou d’une oxacillinase- 18, sensibles toutes deux aux inhibiteurs (acide clavulanique, tazobactam) avec une forte hydrolyse des céphalosporines de 3ème et 4ème génération, aztréonam et sensibilité à l’imipénème.
Ce phénotype se distingue des BLSE de la classe D d’Ambler qui correspondent aux oxacillinases de spectre étendu, caractérisées à l’antibiogramme standard par un phénotype « pénicillinase peu sensible aux inhibiteurs », résistance à la ceftazidime , sensibilité à l’impénème, hydrolyse du céfépime /cefpirome souvent marquée.
Discussion
Décrites pour la première fois en 1983 en Allemagne, puis en France à Clermont-Ferrand en 1984 [8], la présence de BLSE est signalée dans le monde entier.
Elles sont présentes initialement chez Klebsiella pneumoniae et se retrouvent actuellement chez les
principales espèces d’entérobactéries isolées en clinique.
Le support plasmidique des BLSE et donc du caractère transférable de cette résistance, permet de prévoir , que d’autres espèces bactériennes (Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii) éloignées sur le plan taxonomique peuvent héberger une BLSE [9].
Pseudomonas aeruginosa peut produire des bêta- lactamases à spectre étendu : elles incluent soit des enzymes dérivées de pénicillinases (bêta-lactamases de classe A) soit des oxacillinases de spectre étendu (bêta-lactamases de classe D).
Ces BLSE possédent un spectre plus ou moins étendu aux céphalosporines de 3ème et 4ème génération voire aux carbapénèmes. Elles confèrent un haut degré de résistance aux céphalosporines de 3ème génération comme la ceftazidime largement employée. La première bêta-lactamase de classe A, PER- 1 (Pseudomonas Extended Resistance) fut identifiée à partir d’un isolat d’un patient turc hospitalisé à l’Hôpital Raymond Poincaré de Garches en 1991 [10].
Cette bêta-lactamase est désormais très répandue en Turquie, en Corée du Sud et en Italie [11]. Une bêta-lactamase apparentée (PER-2) a été décrite en Amérique du Sud [12].
Des dérivés de TEM et SHV (au même titre que chez les entérobactéries) ont été décrits : TEM- 4, TEM-21, SHV-5 et SHV-12. Ces variants ont été identifiés de manière sporadique chez P.aeruginosa [10].
Parmi les autres bêta-lactamases de classe A on connaît VEB-1 décrite essentiellement à partir d’isolats d’Asie du Sud Est (Vietnamese Extended spectrum β-lactamase) [13] ; GES- 1 identifiée à partir d’une souche de Guyane française (Guyana Extended spectrum β- lactamase) et ses dérivés (IBC-2, GES-9..) ont été identifiés également dans des souches d’Europe et d’Afrique.
Les bêta-lactamases à spectre élargi de classe A sont relativement rares.
De rares épidémies hospitalières de souches produisant la bêta-lactamase PER-1 ont été décrites dans plusieurs hôpitaux dans le Centre et l’Est de la France.
Les souches productrices de GES-1 ou VEB-1 restent très rares en France en 2005 alors que celles produisant VEB-1 sont particulièrement fréquentes en Asie.
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Toutes ces bêta-lactamases, classiquement appelées bêta-lactamases à spectre étendu hydrolysent fortement les uréidopénicillines, les céphalosporines de 3ème et 4ème génération, l’aztréonam et leur activité est inhibée in vitro par l’acide clavulanique. Le pourcentage d’identité génétique de ces enzymes varie de 20 à 70%, ce qui souligne la variété des bêta-lactamases de spectre étendu acquises par P.aeruginosa vraisemblablement après transfert à partir de réservoirs dans l’environnement.
Les gènes de bêta-lactamases de type VEB, GES sont situés au sein d’intégrons de classe 1 alors que le gène PER-1 est associé à un transposon composite.
Ces situations favorisent la mobilité et l’expression des gènes de bêta-lactamase à spectre étendu en association avec des gènes de résistance à d’autres familles d’antibiotiques, ce qui contribue à la multirésistance des souches productrices de ces enzymes. Une activité étendue aux carbapénèmes, mais modeste est observée d’une bêta-lactamase dérivée de GES-1 (GES-2). Elle a été identifiée à partir de souches sud-africaines. Elle a été reconnue sur la constatation d’une synergie entre l’imipénème et l’association ticarcilline-acide clavulanique. Elle est apparue dans le contexte d’une large utilisation de l’imipénème sans antibiogramme préalable.
Toutefois, l’activité de cette enzyme associée à un certain niveau d’imperméabilité peut être à l’origine de souches résistantes aux carbapénèmes et aux céphalosporines à large spectre [10].
Les bêta-lactamases de classe D ou oxacillinases de spectre étendu dérivent chez P.aeruginosa par substitutions ponctuelles des bêta-lactamases OXA- 10 (OXA-11, OXA-14, OXA-16 …) et OXA-2 (OXA-15, OXA-32).
Ces variants hydrolysent les céphalosporines de 3ème génération et /ou l’aztréonam à des degrés variables et leur activité n’est pas inhibée par l’acide clavulanique [14]. L’hydrolyse du céfépime /cefpirome est souvent marquée.
La seule oxacillinase de P.aeruginosa dont l’activité est bien inhibée par l’acide clavulanique et dont le phénotype de résistance est en tous points similaire à celui d’une bêta-lactamase à spectre étendu de classe A est l’OXA-18 [14].
Le support génétique de ces enzymes est plasmidique ou chromosomique et la plupart des
gènes font partie d’intégrons de classe 1. On ne connaît pas la prévalence de ces bêta-lactamases chez P.aeruginosa en France. Seules quelques souches (provenant de Turquie et de France) ont été décrites [15, 16].
La prévalence exacte des souches productrices de BLSE serait faible en France .En revanche, la situation est plus inquiétante dans certains pays, notamment en Turquie où la prévalence atteint 11%
et jusqu’à 50% en Thaïlande [17].
Au Maroc, la prévalence des bêta-lactamases à spectre étendu chez P.aeruginosa est méconnue en raison de la rareté de description de ce type de mécanisme de résistance mais également par le fait qu’une recherche systématique de BLSE n’est pas toujours conduite devant un antibiogramme évocateur d’un tel type de phénotype. D’où la nécessité d’une lecture interprétative attentive et correcte de l’antibiogramme et la réalisation de tests complémentaires de confirmation en cas de doute. Cependant, l’existence d’une BLSE (même lorsque le test de synergie est réalisé) peut être masquée par un effet inoculum et passer inaperçue, ce qui est à l’origine de faux négatifs (Figure 4).
L’utilisation d’un inoculum bactérien standardisé permet de démasquer et de révéler la présence d’une BLSE (Figure 2 et 3). Par ailleurs, l’association de mécanismes de résistance variés, mis en œuvre par cette bactérie complique la détection des souches BLSE sur un antibiogramme standard [17].
L’émergence au sein de notre formation de ces souches de P.aeruginosa hébergeant des BLSE peut être argumentée par les points suivants :
*Pression de sélection exercée par une antibiothérapie à large spectre (céphalosporines de 3ème génération, carbapénèmes, fluoroquinolones..), en particulier au sein des services « chauds » de réanimation pourvoyeurs d’infections nosocomiales.
*Association dans les prélèvements à des entérobactéries productrices de BLSE : en effet, les 02 souches isolées de prélèvements bronchiques protégés étaient associées à des Klebsiella pneumoniae productrices de BLSE.
*Contamination des dispositifs médicaux et
Figure 1 : Noter la sensibilité à l’association ticarcilline +acide clavulanique (TIM), pipéracilline +tazobactam (TZP), imipénème (IPM) et résistance aux céphalosporines de 3ème génération (ceftazidime : CAZ) et aux monobactames (aztreonam : ATM). Cet aspect doit motiver la recherche d’une production de BLSE par la souche.
Figure 2 : Recherche de BLSE positive
Noter l’image de synergie entre l’association ticarcilline + acide clavulanique (TIM) et les céphalosporines de 3ème génération (CAZ : ceftazidime, CTX : cefotaxime) , les monobactames (ATM : aztréonam) et le céfépime ( FEP).
Figure 3 : Recherche de BLSE positive
Les flèches indiquent les images de synergie entre l’association ticarcilline + acide clavulanique ( TIM) et les céphalosporines de 3ème génération (CAZ :ceftazidime) , et les monobactames (ATM : aztréonam).
Figure 4 : Recherche de BLSE négative en cas d’effet d’inoculum Noter l’absence de synergie entre l’association ticarcilline + acide
clavulanique (TIM) et les céphalosporines de 3ème génération (CAZ : ceftazidime, CTX : cefotaxime) , les monobactames
(ATM : aztréonam) et le céfépime (FEP).
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colonisation et/ou infection des patients par les bactéries aérobies strictes de l’environnement humide.
*Manquement aux règles strictes d’hygiène hospitalière.
Une confirmation de l’appartenance des 05 isolats cliniques de P.aeruginosa au même clone bactérien par électrophorèse en champ pulsé ainsi que l’identification par Polymérase Chain Réaction (PCR) du gène codant pour ces BLSE n’ont pu être réalisées. L’enquête environnementale n’a également pas été effectuée à la recherche de la source de contamination des patients.
Nous ne pouvons donc conclure formellement, qu’il s’agit de la même souche circulante dans ces différents services compte-tenu de l’absence d’arguments génotypiques de confirmation, mais seulement le suspecter en raison de l’identité des critères phénotypiques (identité des caractères biochimiques, de l’antibiotype et du sérotype).
Conclusion
Cette observation souligne la diffusion des BLSE à des espèces bactériennes habituellement peu concernées par ce mécanisme de résistance (Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii).
L’isolement de souches de Pseudomonas aeruginosa productrices de bêta-lactamases à spectre étendu au sein du laboratoire est décrit pour la première fois.
Le risque de dissémination épidémique de ces souches nosocomiales multirésistantes, implique la nécessité absolue de la surveillance continue des bactéries multirésistantes en milieu hospitalier, notamment dans les services de réanimation mais aussi la poursuite des efforts d’actions de prévention (rôle fondamental du comité de lutte contre l’infection nosocomiale) afin de limiter la diffusion de ce type de bactéries au sein de l’hôpital et en milieu communautaire.
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