ETUDE DE LA RESISTANCE DES TIQUES RHIPICEPHALUS MICROPLUS, A L’ALPHACYPERMETHRINE ET A LA DELTAMETHRINE

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UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI

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ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI

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DEPARTEMENT DE PRODUCTION ET SANTE ANIMALES

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Pour l’obtention

Du Grade de Licence Professionnelle en Production et Santé Animales

Thème :

Présenté et soutenu par :

AGOSSOU Gédéon Jesudona

10^ème Promotion Année académique 2017-2018

ETUDE DE LA RESISTANCE DES TIQUES RHIPICEPHALUS MICROPLUS, A L’ALPHACYPERMETHRINE ET A LA

DELTAMETHRINE

JURY

Président : Pr. KOUTINHOUIN Benoît Professeur Titulaire/ CAMES, Enseignant-

Chercheur à l’EPAC/UAC

Examinateur : Dr. BOKO Cyrille

Maître Assistant, Enseignant-Chercheur à l’EPAC/UAC

Superviseur : Dr. ADOLIGBE Camus Enseignant-Chercheur à l’EPAC/UAC

Maître de Stage:

YESSINOU R. Eric Doctorant à l’EPAC

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UAC/EPAC/PSA Gédéon J. AGOSSOU 2

Dédicaces

Je dédie le présent rapport

 A L’ETERNEL MON DIEU

Qui est le centre de l’accomplissement de toute chose ; Qui amène à l'existence ce qui n'existait pas ;

Qui est Maître des temps et des circonstances ;

Qui a le pouvoir de tout agrandir et de tout affermir ;

Qui est toujours là quand on a besoin de lui ; je ne saurais lui dire merci.

 A mon père Vincent AGOSSOU

Papa, l'avenir de tes enfants a toujours été au centre de tes préoccupations. Tu m’as donné l’éducation, l’amour, le courage et la force de toujours aller de l’avant. Sache que pour moi, il n’aura pas de meilleur père que toi. Ce travail est le résultat d'une affection paternelle permanente, soit remercié.

 A ma mère Christine KOUDEDO

Maman, merci d’avoir donné vie à l’être que je suis. Merci pour ton soutien, tes conseils et nombreuses prières. Tu me donnes l’espoir de réussir et d’évoluer pour un avenir meilleur.

 A vous mes frères, sœurs, cousins et cousines

Pour le soutien, le courage et l’amour que vous ne cessez jamais de manifester à mon endroit.

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Hommages

Au Professeur Souaïbou FAROUGOU, Professeur titulaire (CAMES), Enseignant-Chercheur à l’EPAC, Responsable de l’Unité de Recherche en Biotechnologie de la Production et Santé Animales (URBPSA) pour avoir accepté de nous recevoir comme stagiaire. Recevez ici l’expression de notre profonde gratitude. Votre simplicité indescriptible, votre indulgence et votre esprit scientifique constituent pour nous une référence. Votre rigueur, votre logique soutenue et la clarté de vos raisonnements sont des qualités de pédagogue, d’éducateur qui constituent pour nous de bons repères pour notre vie quotidienne ;

A notre Superviseur, le Docteur Camus ADOLIGBE, Enseignant-Chercheur à l’École Polytechnique d’Abomey-Calavi (EPAC), malgré vos diverses occupations, vous avez accepté de superviser ce travail. Votre simplicité, vos compétences et votre rigueur intellectuelle fait de vous un homme exceptionnel dévoué au travail bien fait. Recevez ici nos sincères remerciements et que Dieu vous élève davantage ;

A notre maître de stage, le Doctorant Eric Roland YESSINOU pour avoir décidé de conduire à bien ce travail. Je vous remercie ;

Au Président et aux Membres du Jury. Vous avez accepté de présider et de faire partie de notre jury malgré vos multiples occupations, nous vous adressons nos hommages les plus sincères et les plus respectueux.

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Remerciements

Ce document n’aurait pas été réalisé sans le concours de certaines personnes, que nous tenons à remercier à travers cette rubrique.

Mes remerciements s’adressent :

- A notre chef de département le Docteur Cyrille BOKO, Maitre-Assistant, Enseignant-Chercheur au Département de Production et Santé Animales de l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi pour tous les efforts que vous avez eu à fournir en notre nom ;

- Aux Enseignants de l’EPAC en général et à ceux du Département de Production et Santé Animales (DPSA) en particulier pour tous les efforts que vous fournissez chaque fois pour le bon déroulement de notre formation dans ce Département ;

- Aux Docteurs Nestor NOUDEKE, Anatole AGBOKOU, Joachim TONONGBE et Abdou MIGAN pour votre contribution, je vous remercie ; - Aux messieurs François DOSSA, Justin ADINSI, pour nous avoir donné

certains conseils pratiques du terrain ;

- Aux Oncles et aux Tantes, je vous remercie ;

- A tous mes camarades de la 10^ème production en particulier Martial AKPO, Moreille HOUNNOUGBO, Judicaël GAMEDJO, Bruno YAOVI, Blandine IDOHOU, Christian FAKAMBI et Stéphanie AKPO pour les moments passés ensemble.

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Table des matières Dédicaces ... 2

Hommages ... 3

Remerciements ... 4

Table des matières ... 5

Liste des sigles et abréviations ... 7

Liste des tableaux ... 9

Liste des figures ... 10

Résumé ... 11

Abstract ... 12

Introduction ... 13

Première partie: Généralités ... 15

1.1. Contexte de stage ... 16

1.2. Présentation de la structure d’accueil... 17

1.2.1. Description ... 17

1.2.2. Forces et opportunités ... 18

1.2.3. Faiblesses et menaces ... 19

Deuxième partie: Activités menées et difficultés rencontrées ... 20

2.1. Activités menées ... 21

2.1.1. Sur le terrain ... 21

2.1.2. Au laboratoire ... 22

2.2. Difficultés rencontrées ... 24

Problème identifié ... 24

Troisième partie: Etude de la résistance des tiques R. microplus à l’alphacyperméthrine et à la deltaméthrine ... 25

3.1. Synthèse bibliographique sur la tique R. microplus... 26

3.1.1. Généralités sur les tiques ... 26

3.1.1.1. Taxonomie ... 26

3.1.1.2. Morphologie générale des tiques ... 27

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3.1.1.3. Cycle évolutif ... 28

3.1.2. Les problèmes épidémiologiques causés par R. microplus ... 30

3.1.3. Distribution de R. microplus au Bénin ... 31

3.2. Matériel et méthodes ... 34

3.2.1. Collecte et traitement des tiques ... 34

3.2.2. Mise en ponte des femelles gorgées ... 34

3.2.3. Identification des tiques au microscope ... 34

3.2.4. Le Test d’Immersion des Adultes de R. microplus ... 35

3.2.5. Analyses moléculaires ... 36

3.2.5.1. Extraction d’ADN ... 36

3.2.5.2. Identification des espèces ... 37

3.3. Analyses statistiques ... 38

3.4. Résultats ... 39

3.4.1. Etat de sensibilité de R. microplus à l’alphacyperméthrine et à la deltaméthrine ... 39

3.4.2. PCR identification des espèces ... 43

3.5. Discussion ... 43

Conclusion et suggestions ... 46

Références bibliographiques ... 47

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Liste des sigles et abréviations ADN : Acide désoxyribonucléique AIT : Test d’Immersion des Adultes

CAMES : Conseil Africain et Malgache pour l’Enseignement Supérieur CO2 : dioxyde de Carbone

CTAB : Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide EDTA : Ethylène Diamine Tétraacétate

EPAC : Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi et al. : et collaborateurs

LARBA : Laboratoire de Recherche en Biologie Appliquée LC : Concentration Létale

LMD : Licence Master Doctorat Mgcl : Chlorure de Magnésium mg/ml : milligramme par millilitre mM : millimolaire

NTP : Nucléotide Triphosphate

Pafilav : Projet d’appui de la filière Lait et Viande PCR : Réaction de Polymérase en Chaine

REESAO : Réseau pour l’Excellence de l’Enseignement Supérieur en Afrique de l’Ouest

FR : Facteur de Résistance

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RI : Indice de Reproduction

R. microplus : Rhipicephalus microplus

SBEE : Société Béninoise d’Energie Electrique SE : Erreur Standard

trs/min : tours par minute µl : microlitre

URBPSA : Unité de Recherche en Biotechnologie de la Production et Santé Animales

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Liste des tableaux

Tableau 1 : Classification de la tique R. microplus (Perez-Eid et Gilot, 1998) . 27 Tableau 2 : Protozooses et rickettsioses transmises par R. microplus ... 31 Tableau 3 : Indice de Reproduction et le pourcentage d’inhibition de la ponte des tiques de Kpinnou et de l’Okpara par rapport à l’alphacyperméthrine et la Deltaméthrine. ... 41 Tableau 4 : Concentrations Létales et Facteurs de Résistances des populations de tiques de Kpinnou et de l’Okpara par rapport à l’alphacyperméthrine et la deltaméthrine ... 42

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Liste des figures Figure 1 : Vue extérieure de l’URBPSA ... 18

Figure 2 : Vue extérieure du laboratoire d’acarologie de l’URBPSA ... 18

Figure 3 : Tique dure de bovin ... 21

Figure 4 : Larves de R. microplus à l’affût (Barré et Uilenberg, 2010) ... 29

Figure 5 : Cycle de la tique R. microplus (Barré et Uilenberg, 2010) ... 30

Figure 6 : Distribution des espèces de R. microplus au Benin. Source: (De Clercq et al., 2012). ... 33

Figure 7 : Identification des tiques au microscope ... 35

Figure 8 : Broyage de la larve de tique……….. 37

Figure 9 : Ajout de CTAB sur la larve de tique ... 37

Figure 10 : Produit PCR -ITS2 de R. microplus sur gel d’Agarose ... 43

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Résumé

La tique du bétail particulièrement l’espèce R. microplus a développé une résistance contre les classes de pyréthrinoïde de synthèse utilisées pour son contrôle. Dans cette étude, le test d’immersion des tiques adultes a été réalisé in vitro pour vérifier la sensibilité aux pyréthrinoïdes de synthèse des tiques R.

microplus collectés sur les fermes de Kpinnou (Sud Bénin) et de l’Okpara (Nord Bénin. Le test d’immersion des adultes relève avec l’Alphacyperméthrine un indice de reproductivité de 0.02±0.00 et de 0.04±0.00 respectivement à Kpinnou et à l’Okpara. Avec la deltaméthrine, cet indice est de 0.24±0.00 à Kpinnou et de 0.10±0.03 à l’Opkara. L’identification moléculaire avec les amorces Y-ITS2 et E-ITS2 a permis de confirmer la présence de l’espèce R. microplus sur les deux fermes. La mise en place d’une nouvelle méthode de lutte contre la tique (R.

microplus), est indispensable pour limiter son ampleur et contrôler la résistance dans nos élevages bovins.

Mots clés:Kpinnou, Okpara. Résistance de R. microplus, identification moléculaire

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Abstract

The cattle tick, particularly R. microplus species, have developed resistance against the synthetic pyrethroid classes used to control them. In this study, the immersion test of adult ticks was conducted in vitro to check the susceptibility to synthetic pyrethroids of R. microplus ticks collected on Kpinnou (South Benin) and Okpara (North Benin) farms. The adult immersion test shows a reproductive index of 0.02 ± 0.00 and 0.04 ± 0.00 in Kpinnou and Okpara, respectively, with Alphacypermethrin. With deltamethrin, this index is 0.24 ± 0.00 at Kpinnou and 0.10 ± 0.03 at Opkara. Molecular identification with Y- ITS2 and E-ITS2 primers confirmed the presence of R. microplus on both farms.

The implementation of a new tick control method (R. microplus) is essential to better control its resistance on our cattle farms.

Key words : Kpinnou, Okpara. R. microplus resistance, molecular identification

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Introduction

Environ 80% des bovins à l’échelle mondiale sont infestés par des tiques (Laamari et al., 2012). Les Amblyommidae font partie des hématophages les plus nuisibles pour le bétail. Parmi elles, se trouve la tique Rhipicephalus microplus (R . microplus) qui représente un véritable problème pour le développement de l’élevage et entraîne de lourdes pertes dans les cheptels atteints (Rodriguez-Vivas et al., 2012). Cet ectoparasite qui a un cycle de reproduction très court s'est progressivement établi dans de nombreux pays en Afrique de l’Ouest après l’importation des bovins Girolando en provenance du Brésil (Madder et al., 2012). Le climat chaud et humide du Bénin situé dans la zone intertropicale a favorisé la perpétuation et la distribution de R. microplus (De Clercq et al., 2012). Dans nos élevages, la tique joue le rôle de vecteur de transmission des agents pathogènes responsables de la babésiose bovine (fièvre bovine), l’anaplasmose, la cowdriose et de la rickettsiose (Farougou et al., 2012). Dans le souci du contrôle des tiques, plusieurs formes de lutte sont menées à savoir : la lutte biologique, la lutte écologique, la lutte génétique et la lutte chimique (Yessinou et al., 2016). L'utilisation des acaricides contre les tiques est une méthode de lutte facile et est adoptée dans presque tous les élevages extensifs et intensifs de part le monde (Mendes et al., 2013).

Malheureusement, la pression de sélection des acaricides a conduit rapidement au développement de population résistante. Cette résistance est présente dans les pays où la tique notamment l’espèce R. microplus est présente (Andreotti et al., 2011 ; Lovis et al., 2013). Au Bénin, la tique R. microplus est également résistante aux pyréthrinoïdes de synthèse et représente un problème majeur dans la lutte antiparasitaire. Les éleveurs sont obligés parfois de faire recours à des méthodes non conventionnelles de lutte (Adehan et al., 2016). La résistance des tiques R. microplus aux pyréthrinoïdes est liée à plusieurs mécanismes biochimiques ou moléculaires (Stone, 2014). Les travaux réalisés au Bénin sur

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la résistance des tiques R. microplus aux acaricides ne sont que phénotypiques et ont été fait in vitro à travers le Larval Packet Test (Adehan et al., 2016). Ces études ne fournissent pas des informations exhaustives sur le mécanisme moléculaire de résistance de ces tiques aux acaricides.

Dans le but d’apporter notre contribution à la recherche dans ce domaine, nous avons choisi de faire notre stage de fin de formation pour l’obtention du grade de licence professionnelle à l’Unité de Recherche en Biotechnologie de la Production et Santé Animales. L’objectif général de cette étude est de Contribuer à l’amélioration de la productivité des bovins par un meilleur contrôle des tiques.

De façon spécifique, il s’agit :

 d’évaluer la résistance de R. microplus à l’alphacyperméthrine et à la deltaméthrine ;

 d’identifier par les outils moléculaires la tique R. microplus présente sur les fermes d’étude.

Le présent travail est subdivisé en trois parties :

 la première partie concerne les généralités ;

 la deuxième partie prend en compte les activités menées et les difficultés rencontrées ;

 la troisième partie porte sur l’etude de la résistance des tiques R. microplus, à l’alphacyperméthrine et à la deltaméthrine.

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Première partie : Généralités

PrP

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1.1. Contexte de stage

L’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi de l’Université d’Abomey-Calavi est créée par décret N°- 2002-551 du 16 décembre 2002, modifié par le décret N°- 2005-078 du 25 février 2005 portant création, attribution, organisation et fonctionnement de l’EPAC. C’est un établissement public d’enseignement supérieur, de formation technique et professionnelle, à caractère de grande école dotée d’une autonomie financière et d’un règlement pédagogique. Les domaines de compétence de l’EPAC couvrent dix (10) départements d’enseignement organisés en deux secteurs clés : le secteur industriel et le secteur biologique.

Le Secteur Industriel est composé de cinq départements : Génie Civil, Génie Electrique, Génie Informatique et Télécommunication, Génie Mécanique et Energétique et enfin Génie Biomédicale et Maintenance Hospitalière. Au niveau du Secteur Biologique, il y a cinq départements : Génie d’Imagerie Médicale et de Radiologie ; Génie de Biologie Humaine ; Génie de l’Environnement ; Production et Santé Animales et enfin Génie de Technologie Alimentaire.

Dans le cadre de la professionnalisation de l’enseignement supérieur, les formations en Licence et Master Professionnels ont été instaurées dans le secteur biologique de l’EPAC depuis l’année académique 2005-2006. Ces formations se renforcent aujourd’hui avec les réformes en cours sur le système LMD (Licence Master Doctorat) au sein du REESAO (Réseau pour l’Excellence de l’Enseignement Supérieur en Afrique de l’Ouest). Aujourd’hui, les curricula de formation ont été revus, l’année a été subdivisée en semestres, les cours ont été réorganisés en unités d’enseignement. Chaque unité d’enseignement se compose de plusieurs éléments constitutifs appelés ECU. La formation en Master Professionnel à l’EPAC dure deux ans après la Licence Professionnelle. Elle est répartie en quatre semestres dont trois sont destinés aux cours théoriques et aux travaux pratiques et le quatrième aux stages en entreprise et aux travaux de fin de formation. Au cours de la formation, un stage de six semaines est organisé

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pendant des vacances universitaires. Dans le cadre du LMD, ce stage est considéré comme une Unité d’Enseignement et est exécuté durant l’année académique.

Dans le cadre de notre stage de fin de formation pour l’obtention de la Licence Professionnelle au Département de Production et Santé Animales de l’EPAC, nous avons choisi l’Unité de Recherche en Biotechnologie de la Production et Santé Animales afin d’approfondir les connaissances théoriques et pratiques acquises au cours des trois années de formation.

1.2. Présentation de la structure d’accueil 1.2.1. Description

L’URBPSA est une unité de recherche créée et intégrée au LARBA le 03 avril 2009. Elle est dirigée par le Professeur Souaïbou FAROUGOU, Professeur Titulaire des Universités (CAMES). Ce dernier est assisté d’une équipe constituée de deux Maîtres de Conférence (CAMES), deux Maîtres Assistant (CAMES), et d’un Assistant. Cette unité accueille des mémorants et des doctorants pour leur stage de fin de formation. Le laboratoire réunit des spécialistes en pathologies animales, en parasitologie, en microbiologie, en zootechnie, en normes et contrôle de qualité, en génétique et en reproduction.

Le programme de recherche de l’URBPSA est centré autour des thématiques ci- dessous :

- Amélioration génétique des animaux domestiques ; - Tiques du bétail et pathologies transmises ;

- Qualité microbiologique des aliments ; - Conservation des aliments ;

- Pathologies infectieuses des animaux domestiques.

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Figure 1 : Vue extérieure de l’URBPSA

Figure 2 : Vue extérieure du laboratoire d’acarologie de l’URBPSA

1.2.2. Forces et opportunités

 Forces

L’unité de recherche est animée par un personnel dynamique et qualifié qui assure sa bonne marche. L’URBPSA, à travers son responsable, a acquis un minimum d’équipements et de consommables dont les principaux sont : trois étuves, deux spectrophotomètres, un bain marie, deux centrifugeuses, deux fours à microondes, un microscope photonique, deux microscopes stéréoscopiques, trois réfrigérateurs, un congélateur, une hotte à flux laminaire, un termocycleur, le matériel d’électrophorèse en gel d’agarose, la verrerie, deux ordinateurs de

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bureau HP, des milieux de culture et autres réactifs pour la mycologie et la bactériologie, des consommables pour la parasitologie et des ouvrages didactiques et de recherche (collections d’articles). En plus de ces matériels, l’Unité dispose aussi d’une connexion internet qui permet aux différents chercheurs de faire leurs travaux dans de très bonnes conditions. L’URBPSA a été doté en mars 2014 sur fond propre de son Responsable d’un bâtiment pour abriter son laboratoire. Les recherches dans cette Unité se font en collaboration avec d’autres laboratoires de centre d’intérêt commun.

 Opportunités

Grâce au dynamisme, à l’entrain de son responsable qui s’efforce et ne cesse de s’efforcer pour son agrandissement et son équipement en matériels de pointe, plusieurs projets de recherche sont en cours dans le centre.

1.2.3. Faiblesses et menaces

 Faiblesses

 le manque d’une unité d’application des résultats de recherche issus du laboratoire ;

 la non effectivité de la PCR du fait que certains équipements ne sont pas encore acquis.

 l’insuffisance de réactifs pour certains travaux

 Menaces

 l’absence d’une source alternative d’énergie pour pallier les ruptures à partir de la SBEE ;

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Deuxième partie : Activités menées

et difficultés rencontrés

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2.1. Activités menées

Au cours de ce stage, nous avons mené diverses activités : 2.1.1. Sur le terrain

 Collecte des tiques

Les tiques ont été prélevées sur les bovins (de la ferme d’élévage de Kpinnou et de l’Okpara) au niveau des zones de prédilection (tête, corps, péri-anal, pattes et queue) par simple extraction à l’aide d’une pince (Maurice et al., 1981), après contention de l’animal par les bouviers et l’équipe de collecte.

Une partie de ces tiques prélevées sur chaque animal a été immédiatement introduite dans un flacon contenant de l’alcool à 70° pour identification et une seconde partie dans un flacon vide percé pour le test d’immersion des adultes et la mise en ponte. A la fin du prélèvement, une étiquette portant des renseignements nécessaires est mise sur le flacon.

Figure 3: Tique dure de bovin

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2.1.2. Au laboratoire

 Préparation de milieu de culture solide

Un milieu de culture est un milieu favorable à la multiplication d’une bactérie.

Mode opératoire :

- préparer le matériel

- peser la quantité de poudre requise ;

- prélever la quantité nécessaire d’eau distillée pour la préparation du milieu ;

- verser une certaine quantité de l’eau distillée dans le bocal qui servira à la préparation du milieu,

- verser le milieu de culture dans l’eau distillée ;

si la poudre ne contient pas d’agar, y ajouter de l’agar afin de solidifier le milieu ;

- puis homogénéiser le mélange ;

- faire chauffer le milieu au bain-marie à 100° pendant 15 à 30 minutes ; - stériliser à l’autoclave le milieu (cycle liquide) à 21° pendant 15 minutes ; - lors des temps d’attente de la stérilisation, étiqueter les géloses (type de

gélose, date de préparation) ;

- une fois la stérilisation terminée, couler les géloses dans des boites de pétri dès qu’il est possible d’apposer la main sur le bocal sans se brûler.

 Identification de certaines bactéries

La bactérie est un micro-organisme ubiquiste, unicellulaire et sans noyau (procaryote) dont le génome est constitué d’ADN. Au cours de notre stage, nous avons eu à identifier certaines bactéries comme : Clostridium botulinum, Salmonella spp, Staphylococcus aureus, Listéria sp, Escherichia coli. Nous avons eu également à assister à la pose de la galerie api, au test d’indole et au test de mobilité.

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 Coloration Gram

La coloration Gram permet de mettre en évidence la paroi bactérienne sur un étalement ou frottis de germes séché et fixé sur une lame porte objet ; il est soumis au violet de gentiane (colorant de base) puis au lugol pour mordancer, c’est-à-dire faire pénétrer le violet de gentiane avant de subir l’action de l’éthanol à 96°. Les bactéries Gram- dont la paroi est perméable vont se laisser décolorer par l’alcool en perdant le violet de gentiane mais, elles seront recolorées par la fuschine dont elles gardent la couleur rouge-rose. La paroi des bactéries dite Gram+ est imperméable à l’alcool et forme avec le violet de gentiane un complexe indissociable par l’alcool, elle garde la couleur violette.

 Coloration et observation des frottis sanguins Pour y parvenir, il faut :

- préparer le colorant (15 gouttes de Giemsa dans 10 ml d’eau distillée) ; - immerger les lames dans la solution préparée pendant 25-30 min ; - rincer à l’eau claire ;

- laisser sécher à la température du laboratoire ;

- passer à l’observation (à l’objectif 100 dans l’huile à immersion).

 Extraction de sérum à partir de prélèvement sanguin Pour y parvenir, il faut :

- mettre les tubes contenant le sang dans la centrifugeuse ;

- mettre en marche la centrifugeuse à une vitesse de 1500 tours par minute pendant 15 min ;

- apprêter les tubes d’eppendorf sur lesquels sont mises les marques concernant chacun de ces prélèvements pour recueillir les sérums ;

- conserver les sérums dans un congélateur.

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2.2. Difficultés rencontrées

Nous avons connu plusieurs difficultés dans l’accomplissement de nos différentes activités. On peut citer entre autres :

 le déplacement des stagiaires pour la collecte des tiques sur les fermes ;

 l’impraticabilité des voies surtout en période de pluie ;

 le manque d’expérience en biologie moléculaire ;

 l’insuffisance de matériel retardant certaines activités.

Problème identifié

Au cours de notre stage, nous avions noté une abondance des tiques sur les animaux surtout l’espèce R. microplus et une inefficacité des acaricides utilisés pour son contrôle. En vue d’aider les éleveurs dans le choix des acaricides pour une meilleure gestion de résistance, nous avons réalisé le test d’immersion des Adultes et procédé à une identification de R. microplus par la réaction de polymérisation en chaîne (PCR).

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Etude de la résistance des tiques R.

microplus à l’alphacyperméthrine et à la

deltaméthrine

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3.1. Synthèse bibliographique sur la tique R. microplus 3.1.1. Généralités sur les tiques

3.1.1.1. Taxonomie

Les tiques sont des arthropodes hématophages. Ce sont des métazoaires à symétrie bilatérale, qui possèdent des appendices articulés. Leur exosquelette est dur et formé de chitine ; ce qui les positionne dans l’embranchement des Arthropodes (Siebold et Stannius, 1845). Les tiques possèdent une paire de chélicères, mais sont dépourvues d’antennes et de mandibules : ce qui les classe ainsi dans le sous-embranchement des Chélicérates. Elles ont un corps divisé en deux parties : un podosoma ou céphalothorax, qui porte quatre paires de pattes chez les adultes et les nymphes, et trois paires chez les larves et un opisthosoma ou abdomen ; ce qui fait d’eux des Arachnides (de Lamarck, 1801); la respiration est aérienne. Leurs corps sont globuleux, podosoma et opisthosoma non segmentés sont fusionnés : ce sont des Acariens. Les tiques (ordre des Ixodida) sont les plus grands des acariens, leur taille varie de 2 à 10 mm ou plus pour les femelles gorgées. Cet ordre, d’après différents auteurs, peut se diviser en 3 super-familles, réparties dans 2 sous-ordres. Le sous-ordre qui nous intéresse, est celui des Ixodina, ou tiques dures, comportant près de 670 espèces dans le monde, appartenant toutes à la Super-Famille des Ixodoidea (sauf : Nuttalliella qui appartient à la super-famille des Nuttalliedea). La tique R.

microplus fait partie des tiques dures. Sa classification simplifiée est présentée dans le tableau 1.

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Tableau 1 : Classification de la tique R. microplus (Perez-Eid et Gilot, 1998)

Embranchement Arthropodes

Classe Arachnides

Ordre Acariens

Famille Ixodidae

Genre Rhipicephalus (Boophilus)

Espèce R. microplus

Il est à noter que le genre Boophilus, qui nous intéresse ici, a récemment été intégré, par la plupart des auteurs, dans le genre Rhipicephalus, en raison des récentes avancées dans l’étude phylogénique et évolutive des tiques (Pérez et Boyard, 2007).

3.1.1.2. Morphologie générale des tiques

Les tiques dures sont des acariens de grande taille (entre 2 et 30 mm selon la stase et la réplétion) aux corps globuleux. Le mâle est de taille inférieure à la femelle. La partie antérieure du corps, le gnathosoma, comprend le capitulum, de forme rectangulaire ou hexagonale, qui constitue la zone de liaison au corps, et le rostre qui regroupe les pièces buccales. Les pièces buccales des tiques comprennent les pédipalpes qui ont une fonction sensitive, les chélicères, organes perforateurs, et un organe immobile médian et ventral, l’hypostome constitué de nombreuses dents incurvées qui permettent d’ancrer fermement la tique à la peau de son hôte (Bussieras et Chermette, 1991). Les Ixodidés portent un écusson dorsal chitineux très dur, le scutum. Le reste du corps est recouvert

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d'un tégument extensible qui se distend lors du repas sanguin. Le scutum recouvre l'intégralité de la surface dorsale chez le mâle, alors que seule la partie antérieure est recouverte chez la femelle lui permettant de décupler son volume lors du repas. Les larves, nymphes et femelles ont, sur la face dorsale, un tégument sclérifié (ou scutum) couvrant environ la moitié de l’idiosome, ce qui permet le gorgement. Alors que chez les mâles, il y a sclérification totale de la face dorsale, on parlera alors de conscutum. Ventralement, l’idiosome porte les pattes au nombre de quatre paires (nymphes, adultes), ou de trois paires (larves).

Chaque patte comporte six tarses se terminant par une paire de griffes, accompagnée d’une ventouse. Le tarse de la première paire de pattes des Ixodes porte sur sa face dorsale un organe sensoriel essentiel, l’organe de Haller, sensible à l’hygrométrie, aux phéromones, au CO2, aux métabolites exhalés par les bovins, à l’acide lactique, etc. Il permet notamment de localiser les hôtes.

3.1.1.3. Cycle évolutif

Chez les Ixodides, le cycle évolutif débute par l’œuf qui éclôt pour donner la larve qui, avant de donner l’adulte, se transforme d’abord en nymphe.

Les œufs

La ponte se fait au sol chez toutes les espèces après l’accouplement qui a lieu sur l’hôte ; habituellement, la femelle pond en des endroits abrités (sous une pierre, dans la litière végétale, dans les crevasses du sol). Le nombre d'œufs varie avec l’espèce, sa taille et l’importance du repas (de 1000 à 12 000 œufs).

Le temps d’incubation varie avec l’espèce, la température ambiante et l'humidité. Un défaut d’humidité ou une variation brusque de température peut tuer les œufs ; en hiver tempéré, les œufs sont au repos. En général, ce temps dure de 20 à 50 jours. Les œufs éclosent et donnent les larves.

(29)

La larve

Après éclosion, la larve est gonflée et molle. Elle durcit en quelques jours et se met activement à la recherche d’un hôte, pratiquant soit l’affût sur une herbe (figure 4), soit la recherche active par déplacement. Une fois l’hôte trouvé, son repas dure 3 à 12 jours suivant l’espèce et les conditions. Le repas terminé, elle effectue sa pupaison (métamorphose complète), qui durera 2 à 8 semaines suivant les conditions atmosphériques. Il en sort une nymphe.

Larves de R. microplus

Figure 4 : Larves de R. microplus à l’affût (Barré et Uilenberg, 2010)

La nymphe

A l’instar de la larve, la nymphe met quelques jours à durcir. Dès lors, ses activités sont semblables au stade précédent en ce qui concerne l’hôte et la durée du repas. La nymphe subit également une métamorphose sur le même hôte pour donner la tique adulte.

Les adultes

Chez l’adulte, la durée du repas sanguin est plus longue, mais elle dépend également de la température et de l’humidité. L’accouplement a lieu pendant le repas sur l’hôte. La femelle fécondée et gorgée se détache et pond (figure 5). Le

(30)

mâle reste longtemps sur l’hôte après le départ de la femelle et peut être transporté d’une région à l’autre lors des transhumances.

Figure 5 :Cycle de la tique R. microplus (Barré et Uilenberg, 2010) 3.1.2. Les problèmes épidémiologiques causés par R. microplus

Le parasitisme des bovins par R. microplus est la véritable cause de plusieurs dégâts que l’on peut classer en deux catégories :

- ceux dus à la présence de la tique sur la peau de l’hôte, telles que les lésions locales et la perte de sang, et ceux qui sont dûs aux toxines injectées par les parasites : il s’agit du rôle pathogène direct ;

- dégâts résultant de la transmission d’agents pathogènes : c’est le rôle pathogène indirect.

(31)

Rôle pathogène direct et indirect

Les tiques jouent le rôle de vecteurs des maladies parasitaires et infectieuses extrêmement variées. La tique R. microplus est non seulement dangereuse par son rôle pathogène direct (action mécanique irritative, spoliatrice et toxique), mais aussi et surtout par son rôle pathogène indirect comme vecteur des germes responsables de pathologies graves telles que : la babésiose, l’anaplasmose et la theileriose. En outre, les conséquences de l’activité de la tique, comme tout suceur de sang, infligent des dégâts importants comme l’irritation qui perturbe l’alimentation des animaux d’élevage, réduisant ainsi la productivité (Pegram et Chizyuka, 1990). La présence de ces tiques engendre aussi des plaies ouvertes laissant ainsi la possibilité d'infection ou d'infestation secondaire par des bactéries ou des champignons.

Tableau 2 : Protozooses et rickettsioses transmises par R. microplus Tique vectrice Cycle Hôtes Agent pathogène

(et hôte)

Espèce Rhipicephalus

(Boophilus) microplus

Monoxène monotrope

Bovins, autres grands mammifère s

Protozoaires : Babesidae (bovins) Theileriidae (équins) Rickettsiales : Anaplasmataceae (bovins)

Babesia bovis, B.

bigemina

(babésioses bovines tropicales)

Theileria equi (theilériose équine) Anaplasma marginale

3.1.3. Distribution de R. microplus au Bénin

L'introduction de R. microplus au Bénin a été attribuée en grande partie à l'importation des Girolando en provenance du Brésil par le gouvernement du Bénin à travers le Projet Pafilav dans le but d'améliorer les races de bovins indigènes (Madder et al., 2012). La première importation de bétail Girolando en

(32)

novembre 2004 suivi du résultat du prélèvement en octobre 2008 des tiques dans la zone de Kpinnou, indique la présence de R. microplus et les conditions locales sont idéales pour que cette tique s’installe (Adehan, 2009).

Une introduction de bovins Girolando en Côte d'Ivoire a aussi débouché sur l’installation et la propagation de R. microplus (Garance et al., 2007). La propagation de cette tique au Bénin est rapide et a atteint presque toutes les localités du Bénin (figure 6). La vitesse avec laquelle la propagation a eu lieu en Côte d'Ivoire est alarmante et le même scénario se déroule au Bénin, en raison du commerce ou la transhumance. Comme le souligne Madder et al., (2011) , R.

microplus est connue pour son caractère invasif et sa capacité de résister aux acaricides.

Au Bénin, la plainte des éleveurs par rapport à l’inefficacité des acaricides remonte aux années d’introduction de R. microplus dans le pays. Ces vecteurs ont défié toute la gamme d’acaricides dont regorgeait la Ferme de Kpinnou au point où les éleveurs ont été obligés de recourir à l’expérience de l’eau de Mer qui, malheureusement n’a eu aucun résultat concluant (Adehan, 2009). Une étude récente conduite par L’Institut de Médecine Tropicale d’Anvers en Belgique sur R. microplus au Bénin a révélé des phénotypes variables à l’identification microscopique et des croisements entre différentes espèces de R.

microplus à l’identification moléculaire (Sungirai, 2012).

(33)

Figure 6 : Distribution des espèces de R. microplus au Benin (De Clercq et al., 2012)

(34)

3.2. Matériel et méthodes

3.2.1. Collecte et traitement des tiques

Les tiques ont été prélevées manuellement sur les bovins de race Girolando, Azawak, Borgou et métis à l’aide d’une pince à bout pointu dans les zones de Kpinnou et de l’Okpara. Ces tiques ont été transportées au laboratoire dans des flacons, perforés de nombreuses ouvertures d’un millimètre de diamètre afin de permettre une bonne aération. Les tiques ont été ensuite identifiées morphologiquement à la loupe binoculaire à l’aide de la clé de détermination.

Une partie des tiques a été utilisée pour le test d’immersion des adultes et le reste pour la ponte. Quatorze jours après la ponte, 0,5 g d’œufs de tiques mis en élevage ont été transférés dans différents flacons et placés à l’étuve dans les conditions décrites par Ibelli et al., (2012) (27 à 28°C, 85 à 90% d’humidité relative) pour avoir les larves. Les larves de 14 à 21 jours ont été conservées et utilisées pour la caractérisation moléculaire.

3.2.2. Mise en ponte des femelles gorgées

Des tiques femelles de R. microplus gorgées ont été recueillies dans des tubes secs. Celles-ci ont été ramenées au laboratoire et conservées dans un milieu isolé. Les œufs obtenus ont été incubés dans l’étuve à une température de 27°C et à une humidité relative variant entre 86 et 90% pour l’obtention des larves de tiques.

3.2.3. Identification des tiques au microscope

L’identification des tiques conservées avec de l’alcool à 70°C dans des flacons plastiques à couvercles s’est déroulée en deux phases. La première phase a permis d’identifier les tiques jusqu’au niveau genre à l’aide d’un microscope stéréoscopique à grossissement 60X en utilisant la clé d’identification élaborée par (Walker, 2003). La seconde phase a été focalisée uniquement sur le genre Rhipicephalus dans le but de déterminer les différentes espèces. Pour ce faire, un microscope photonique (Olympus) a été utilisé au grossissement 100X.

(35)

Les critères de différenciation étaient basés sur la grosseur de la tique et de son rostre, l’aspect multicolore, et le nombre de festons.

Figure 7 : Identification des tiques au microscope

3.2.4. Le Test d’Immersion des Adultes de R. microplus

Le Test d’Immersion des Adultes (AIT) a été utilisé pour vérifier l’efficacité des acaricides sur les femelles gorgées de tique R. microplus (Drummond et al., 1980). Les acaricides achetés dans le commerce ont été utilisés pour réaliser ce test. Ils étaient respectivement concentrés à 50g/L pour l’alphacyperméthrine et la deltaméthrine. Les concentrations préparées pour réaliser le test d’immersion des adultes ont été respectivement de 0,03125 ; 0.0625 ; 0.125 ; 0.25 ; 0. 5 ; 1 ; 2 et 4 mg/ml. Le test a été répété trois fois pour chaque concentration (Rosado- Aguilar et al., 2010). Les tiques d’un poids environ de 0,2g ont été plongées par lot de 10 dans les solutions préparées pendant deux minutes. Ces tiques ont été ensuite placées dans des boites de Pétri de neuf (9) centimètres de diamètre à couvercle perforé d’environ un millimètre de diamètre, puis mis dans les conditions normales pour la ponte. Les observations des tiques ont été faites à l’aide d’un stéréo-microscope et le taux de mortalité a été enregistré après le traitement acaricide. Les tiques mortes sont reconnues par la noirceur des

(36)

cuticules, le manque de mouvement, l’absence du tube de Malpighi et de lésions hémorragiques de la peau. Après quinze (15) jours d’observations, le nombre de femelles en ponte a été noté, les œufs de chaque lot sont pesés à l’aide d’une balance analytique. Le volume initial de l’acaricide à prélever pour les concentrations préparées a été calculé suivant la formule :

Volume de l’acaricide prélevé (𝑚𝑙) = Concentration finale ×Volume finale Concentration initiale

3.2.5. Analyses moléculaires 3.2.5.1. Extraction d’ADN

Environ 30 larves de tiques de chaque échantillon ont été utilisées pour l’extraction d’ADN. La technique d’extraction a consisté à broyer finement les tissus des larves dans 100 microlitres (μl) de Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) à 2%, avec un piston de broyage et une pellette. Le broyat a été chauffé au bain-marie à 65°C pendant 5 minutes pour débarrasser les échantillons d’un maximum de protéine pouvant interférer dans les étapes ultérieures. 100 μl de chloroforme ont été ajoutés au broyat et mélangé par inversion. Le surnageant a été récupéré après centrifugation à 12 000 tours par minute (trs/min) pendant 8 minutes. Les acides nucléiques sont précipités par 100 μl d’isopropanol après 15 minutes de centrifugation à 12 000 trs/min. Le culot a été séché au speed vac pendant 4 à 5 minutes avant d’être repris dans 20 μl d’eau bidistillée et laissé suspendu sur la paillasse toute la nuit. La solution d’ADN a été conservée au congélateur à - 20°C.

(37)

Figure 8 : Broyage de la larve de tique Figure 9 : Ajout de CTAB sur la larve de tique

3.2.5.2. Identification des espèces

Les segments d’ADN cible sont amplifiés par la réaction de polymérisation en Chaine. Les paires d’amorces Y-ITS2 : CGAGACTTGGTGTGAATTGCA et E-ITS2 : TCCCATACACCACATTTCCCG ont été utilisées pour amplifier la séquence ITS2 de R. microplus (Brahma et al., 2014). Les amplifications ont été réalisées sous un volume de 25 μl (dont 23 μl de mélange de réaction « mix » et 2 μl d’ADN de tique extrait) à l’aide du thermocycleur Mastercycler® de marque nexus®. Le mélange de réaction PCR contient : 1x de tampon, 1 mM de Mgcl2, 0,2mM d’NTP, 0.2 uM de chaque amorce, 0.5 U de Taq polymérase et 2 μl d’ADN génomique. Les conditions de la réaction de PCR sont : un cycle de 94 °C pour 5min ; 30 cycles de 94°C pour 30s, 55°C pour 30S, 72°C pour 2 min et une extension finale à 72 °C pour 10 min. L’électrophorèse est réalisée sur gel d’agarose à 1.5% avec l’ADN amplifié et la lecture des résultats a été faite à l’aide d’un transluminator.

(38)

3.3. Analyses statistiques

Les données ont été enregistrées et analysées avec le logiciel R version 2.15.2 (2012). Pour l’état de résistance des tiques aux acaricides, les facteurs de variation considérés sont :

(a) Mortalité enregistrée jusqu'à 14 jours après le traitement (b) Masse d'œufs pondus par les tiques vivantes

(c) Indice de reproduction (RI) = masse d′oeufs femelle engorgée

(d) Pourcentage d'inhibition de la ponte (%O) =RI du contrôle−RI des traitements RI du contrôle

Pour chaque facteur de variation, le test de F a été utilisé pour déterminer sa significativité et les moyennes ont été comparées deux à deux par le test t de Student. Par ailleurs, pour l’évaluation de la résistance des tiques aux acaricides, le logiciel POLO PC a servi à calculer les concentrations létales 50% (LC50) et 95% (LC95). En utilisant les valeurs de LC50 des lignes de référence, le facteur de résistance (RF) a été élaboré par la formule donnée par (Castro-Janer et al., 2009).

(RF) = Valeur LC50 des tiques cibles Valeur LC50 des tiques sensibles

Pour le calcul de RF de l'alphacyperméthrine et de la deltaméthrine, les données sur la ligne de référence IVRI-I ont été utilisées. Sur la base de RF, les populations de R. microplus ont été classées comme :

- sensibles si RF < 1,4 ;

- résistantes de niveau I si RF = 1,5-5,0 ; - résistantes de niveau II si RF = 5,1- 25,0 ; - résistantes de niveau III si RF = 25,1-40 ;

- résistantes de niveau IV si RF > 41 (Sharma et al., 2012).

(39)

3.4. Résultats

3.4.1. Etat de sensibilité de R. microplus à l’alphacyperméthrine et à la deltaméthrine

Le tableau 3 renseigne sur l’Indice de Reproduction (RI) et le pourcentage d’inhibition de la ponte (%IO) des femelles gorgées de tique de Kpinnou et de l’Okpara. La tique R. microplus, testée avec l’Alphacyperméthrine a montré un Indice de Reproduction variant de 0.41±0.02 à 0.02±0.00 (p<0,001) et de 0.48±0.04 à 0.04±0.00 (p<0,05) respectivement dans la zone de Kpinnou et de l’Opkara. Le pourcentage d’inhibition de la ponte varie de 0.00±0.00 à 94.70±92.48 (p<0,001) dans la zone de Kpinnou contre 0.00±0.00 à 90.47±0.10 (p< 0.05) dans l’Okpara. Le test d’immersion des adultes réalisé avec l’Alphacyperméthrine a montré que les tiques sont capables de pondre des œufs à une concentration de 4mg/ml. Des résultats similaires ont été obtenus après le test d’immersion des adultes réalisé avec la deltaméthrine. L’indice de reproduction varie de 0.46±0.02 à 0.24±0.00 (P<0,05) dans la zone de Kpinnou et de 0.33±0.02 à 0.10±0.03 (p< 0.01) dans l’Okpara. Le pourcentage d’inhibition de la ponte à une concentration de 4mg/ml de deltamethrine est de 47.50±4.65 et de 68.32±11.99 respectivement dans la zone de Kpinnou et de l’Okpara.

Le tableau 4 présente les concentrations létales LC50 (95% IC), LC95 (95% IC) et les facteurs de résistances (RF) des populations de R. microplus de Kpinnou et de l’Okpara. Il ressort de ce tableau que, les concentrations létales de l’alphacyperméthrine ont été de [(LC50=3.42 (2.04-8.72) ; LC95=52.16 (16.39- 674.41)] dans la zone de Kpinnou et de [(LC50=1.8 (1.14-3.73); (LC90=38.58 (13.13-315.03)] dans l’Okpara. L’AIT réalisé avec la deltamethrine dans la zone de Kpinnou a révélé des concentrations létales de LC50=4.45 (2.50-14.68) et LC95=71.44 (19.37-1760.82) contre LC50=3.79 (2.28-10.10) et LC95=48.05 (15.39- 696.29) pour la zone de l’Okpara. Les pentes de concentration-mortalité

(40)

obtenues avec l’alphacyperméthrine et la deltaméthrine ont été plus faibles dans la zone de l’Okpara qu’à Kpinnou et sont respectivement de 1.47±0.28 et 1.49±0.31 à Okpara contre 1.39±0.27 et 1.36±0.30 à Kpinnou. Les facteurs de résistances (RF) obtenus par rapport à la souche sensible (Tick line IVRI-I) ont été largement supérieurs à 41 pour l’ensemble des acaricides utilisés. En effet, dans la zone de l’Okpara, ils sont de RF=86 et RF=379 respectivement pour l’alphacyperméthrine et la deltaméthrine. Par contre à Kpinnou, ils sont de RF

=114 pour l’alphacyperméthrine et RF=445 pour la deltaméthrine.

(41)

Tableau 3 : Indice de Reproduction et le pourcentage d’inhibition de la ponte des tiques de Kpinnou et de l’Okpara par rapport à l’alphacyperméthrine et la Deltaméthrine.

Clé: Les

fréquences suivie de la même lettre ne sont pas significativement différente *** : p<0,001 ; ** : p<0,01 ; * : p<0,05 ; ES=

Erreur Standard ;

D= Dose ; RI= Indice de Reproduction ; IO= Inhibition de la Ponte

KPINNOU OKPARA

Alphacyperméthrine Deltaméthrine Alphacyperméthrine Deltaméthrine

RI±ES IO±ES RI±ES IO±ES RI±ES IO±ES RI±ES IO±ES

D0 0.41±0.02a 0.00±0.00b 0.46±0.02a 0.00±0.00c 0.48±0.04a 0.00±0.00b 0.33±0.02a 0.00±0.00b D1 0.36±0.00a 12.06±9.35b 0.42±0.00ab 2.75±0.451c 0.36±0.09ab 26.24±11.84a

b

0.32±0.01a 3.13±2.04b D2 0.31±0.00a 22.27±13.75b 0.39±0.03ab

c

14.44±1.68bc 0.33±0.03ab 29.17±14.42a b

0.27±0.06ab 19.19±13.69ab D3 0.33±0.00a 17.02±10.40b 0.37±0.01ab

c

18.85±2.08bc 0.34±0.14ab 30.91±22.29a b

0.25±0.06ab 23.33±24.25ab D4 0.25±0.08a 36.27±12.94b 0.34±0.01bc

d

25.84±2.09ab 0.23±0.07ab 48.73±19.91a b

0.24±0.00ab 27.51±4.79ab D5 0.26±0.08a 37.38±20.08b 0.32±0.03cd 37.56±4.27ab 0.21±0.05ab 57.05±7.70ab 0.19±0.01ab 41.64±0.14ab D6 0.06±0.02

b

83.64±78.72a 0.31±0.02cd 31.24±12.07a b

0.14±0.06ab 68.06±16.30a b

0.21±0.01ab 35.64±9.76ab

D7 0.03±0.01 b

90.76±88.45a 0.29±0.01cd 33.23±3.43ab 0.14±0.00ab 70.38±4.16ab 0.14±0.02ab 55.86±9.44ab D8 0.02±0.00

b

94.70±92.48a 0.24±0.00d 47.50±4.65a 0.04±0.00b 90.47±0.10a 0.10±0.03b 68.32±11.99a

*** *** *** *** * * ** *

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Tableau 4 : Concentrations Létales et Facteurs de Résistances des populations de tiques de Kpinnou et de l’Okpara par rapport à l’alphacyperméthrine et la deltaméthrine

LC=Concentration Létale ; SE= Erreur Standard ; RF= Facteur de Résistance ; IC : Intervalle de Confiance.

Echantillon Pente ±SE LC50 (95% IC) LC95(95% IC) RF

Alphacyperméthrine

Tick line IVRI-I 3,30±0,1 0,031 (0,026-0,038) 0,076 (0,059-0,111) -

KPINNOU 1.39±0.27 3.42 (2.04-8.72) 52.16 (16.39- 674.41) 114

OKPARA 1.47±0.28 2.57 (1.37-10.38) 33.80 (8.96-1517.79) 86

Deltaméthrine

Tick line IVRI-I 4,60±0,2) 0,019 (0,016-0,023 0,037 (0,029-0,054) -

KPINNOU 1.36±0.30 4.45 (2.50-14.68) 71.44 (19.37-1760.82) 445

OKPARA 1.49±0.31 3.79 (2.28-10.10) 48.05 (15.39- 696.29) 379

(43)

3.4.2. PCR identification des espèces

Au total, 100 tiques ont été analysées. Les résultats de la PCR ont montré que les populations de tiques collectées dans les deux zones sont composées uniquement (100%) de l’espèce R. microplus (figure 10).

Figure 10 : Produit PCR -ITS2 de R. microplus sur gel d’Agarose

8 : contrôle négatif (-), les échantillons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13 : R.

microplus.

3.5. Discussion

La présente étude a permis d’évaluer la résistance de R. microplus à deux pyréthrinoïdes de synthèse dans la zone de Kpinnou et de l’Okpara. Le test d’immersion des adultes a révèlé des Indices de Reproduction de 0.02±0.00 et 0.04±0.00 pour l’alphacyperméthrine respectivement à Kpinnou et à l’Okpara, ceux de la deltaméthrine sont de 0.24±0.00 et 0.10±0.03 respectivement pour les fermes en question avec une concentration de 4mg/ml. La reproduction des tiques après l’application des acaricides démontre l’inefficacité des produits utilisés de nos jours pour le traitement de ces ectoparasites. Il ressort de cette étude que les populations de ces deux zones ont développé une grande résistance à la deltaméthrine et à l’alphacyperméthrine. La population de Kpinnou a été la population la plus résistante aux acaricides avec un RF=114 pour l’alphacyperméthrine et RF=86 pour la deltaméthrine. Selon la classification de Sharma et al., (2012), les résistances observées à Kpinnou et à l’Okpara sont de niveau IV. Les études précédentes réalisées au Bénin ont montré la résistance

1 2 3 4 5 6 M 8 9 10 11 12 13

1000pb

(44)

des tiques aux pyréthrinoïdes de synthèse (Yessinou et al., 2016). Les résultats de nos travaux sont similaires à ceux réalisés par (de Oliveira Souza Higa et al., 2015) qui ont montré au Brésil la résistance de R. microplus à l’alphacyperméthrine et à la deltaméthrine. Aussi, le test d’immersion des adultes réalisé sur la population de tique à l’Ecuador révèle une résistance de R.

microplus à l’alphacyperméthrine (Rodríguez-Hidalgo et al., 2017). Les pentes de concentration-mortalité de la deltaméthrine ont été de 1.36±0.30 à Kpinnou et de 1.49±0.31 à l’Okpara. Ces valeurs sont inférieures à celles de Ghosh et al., (2015) qui ont montré que la tique R. microplus est résistante à la deltaméthrine avec des pentes de concentration-mortalité deux fois supérieures. Le niveau de résistance élevée des tiques à Kpinnou par rapport à l’Okpara peut être expliqué par le fait que Kpinnou a été le foyer d’introduction et de diffusion de la tique du bétail R. microplus au Bénin (Madder et al., 2012) à partir des bovins Girolando importés du Brésil. En effet, plusieurs auteurs latino-américains avaient rapporté une grande résistance de cette tique aux pyréthrinoïdes de synthèse utilisés pour son contrôle au Brésil. Donc ces espèces étaient toutes résistantes dans le pays d’où ils étaient exportés de façon accidentelle vers le Bénin (Andreotti et al., 2011). La résistance de cette tique aux pyréthrinoïdes de synthèse n’est pas limitée seulement au Bénin, mais également aux autres pays de la sous-région ouest africaine où cette espèce est présente : Côte d’Ivoire (Madder et al., 2012), Burkina Faso et Mali (Adakal et al., 2013). Les résultats obtenus confirment les constats effectués dans les différentes fermes où les traitements acaricides sont effectués de façon très fréquente avec un surdosage des principales molécules utilisées (Yessinou et al., 2017). L’utilisation anarchique des produits chimiques pour le contrôle des ectoparasites augmente la pression acaricide sur les tiques en général et favorise une sélection des espèces monotropes monophasiques à cycle court ; catégorie dont fait partie R. microplus, qui sont beaucoup plus enclins à développer des mécanismes de résistance. En effet, plusieurs auteurs ont rapporté que lorsque les générations se succèdent rapidement pour une

(45)

espèce de parasite, la sélection de sous-populations résistantes est plus aisée, caractère particulièrement évident chez la tique du bétail R. microplus dont le cycle de développement est de vingt et un jours environ et s’effectue de façon permanente sur un seul hôte (Barré et Uilenberg, 2010 ; Guerrero et al., 2012), contrairement aux autres espèces de tiques autochtones comme Amblyomma variegatum dont le cycle peut durer jusqu’à 3 ans (Marshall, 2011).

(46)

Conclusion et suggestions

Le présent stage a permis de réaliser plusieurs tâches qui ont constitué pour nous une mission de stage globale et a été d’une importance capitale et reflète sa particularité à travers la pratique. Le Test d’Immersion des Adultes réalisé sur les femelles gorgées de R. microplus a permis de montrer que des populations de tique collectées dans ces deux zones d’étude sont résistantes à l’Alphacyperméthrine et la Deltaméthrine. Il serait donc judicieux de développer une nouvelle stratégie de contrôle et une utilisation rationnelle des acaricides afin de ralentir l’émergence de la résistance.

A l’issue de ces résultats, les suggestions suivantes sont formulées :

 sensibiliser les éleveurs sur la résistance des tiques aux acaricides ;

 promouvoir l’utilisation des extraits de plante à vertu acaricide ;

 faire la rotation sur les pâturages afin de limiter les infestations parasitaires, ceci pourrait diminuer le coût des traitements.

(47)

Références bibliographiques

Adakal H, Biguezoton A, Zoungrana S, Courtin F, De Clercq EM, Madder M.

Alarming spread of the Asian cattle tick Rhipicephalus microplus in West Africa—another three countries are affected: Burkina Faso, Mali and Togo. Exp Appl Acarol. nov 2013 ;61(3) : 383‑6.

Adehan S. Rhipicephalus (Boophilus) spp et Babesia spp chez le bétail du Département du Mono (République du BENIN). 2009.

Adehan SB, Biguezoton A, Adakal H, Assogba MN, Zoungrana S, Gbaguidi AM. Acaricide resistance of Rhipicephalus microplus ticks in Benin. Afr J Agric Res. 2016 ;11(14):1199–1208.

Andreotti R, Guerrero FD, Soares MA, Barros JC, Miller RJ, Léon AP de.

Acaricide resistance of Rhipicephalus (Boophilus) microplus in State of Mato Grosso do Sul, Brazil. Rev Bras Parasitol Veterinária.

2011;20(2):127–133.

Barré N, Uilenberg G. Spread of parasites transported with their hosts: case study of two species of cattle tick. Rev Sci Tech. 2010;29(1):149.

Brahma S, Ikbal SA, Dhamija A, Rath SP. Highly Enhanced Bisignate Circular Dichroism of Ferrocene-Bridged Zn (II) Bisporphyrin Tweezer with Extended Chiral Substrates due to Well-Matched Host–Guest System.

Inorg Chem. 2014;53(5):2381–2395.

Castro-Janer E, Rifran L, Piaggio J, Gil A, Miller RJ, Schumaker TTS. In vitro tests to establish LC 50 and discriminating concentrations for fipronil against Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae) and their standardization. Vet Parasitol. 2009;162(1):120–128.

De Clercq EM, Vanwambeke SO, Sungirai M, Adehan S, Lokossou R, Madder M. Geographic distribution of the invasive cattle tick Rhipicephalus microplus, a country-wide survey in Benin. Exp Appl Acarol.

2012;58(4):441–452.

Drummond JG, Curtis SE, Simon J, Norton HW. Effects of aerial ammonia on growth and health of young pigs. J Anim Sci. 1980;50(6):1085–1091.

Farougou S, Adakal H, Biguezoton AS, Boko C. Prévalence de l’infection d’Amblyomma variegatum par Ehrlichia ruminantium dans les élevages extensifs du Bénin. Rev Médecine Vét. 2012;163(5):261.

(48)

Garance M, Thys E, Geysen D, Baudoux C, Horak I. L’espèce Boophilus microplus en Afrique de l’Ouest. Exp Appl Acarol, 43, 233-234. 2007 [cité 1 déc 2017].

Ghosh S, Tiwari SS, Kumar B, Srivastava S, Sharma AK, Kumar S, et al.

Identification of potential plant extracts for anti-tick activity against acaricide resistant cattle ticks, Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae). Exp Appl Acarol. 2015;66(1):159–171.

Guerrero FD, Lovis L, Martins JR. Acaricide resistance mechanisms in Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Rev Bras Parasitol Veterinária.

2012;21(1):1–6.

Ibelli AMG, Ribeiro ARB, Giglioti R, Regitano LCA, Alencar MM, Chagas ACS. Resistance of cattle of various genetic groups to the tick Rhipicephalus microplus and the relationship with coat traits. Vet Parasitol. 2012;186(3):425–430.

Laamari A, Mrifag R, Boukbal M, Belghyti D. Dynamique des populations de tiques parasites des bovins de la région du Gharb au Maroc= Population dynamics of cattle ticks in Gharb Region in Morocco= Dinámica de las poblaciones de garrapatas parásitos de los bovinos de la región de Gharb en Marruecos. Rev Délevage Médecine Vét Pays Trop. 2012;65(3‑4).

de Lamarck J-B de M. Systeme des animaux sans vertèbres: ou tableau général des classes, des ordres et des genres de ces animaux...: précédé du discours d’ouverture du cours de zoologie... Deterville; 1801.

Lovis L, Mendes MC, Perret J-L, Martins JR, Bouvier J, Betschart B, et al. Use of the Larval Tarsal Test to determine acaricide resistance in Rhipicephalus (Boophilus) microplus Brazilian field populations. Vet Parasitol. 2013;191(3):323–331.

Madder M, Adehan S, De Deken R, Adehan R, Lokossou R. New foci of Rhipicephalus microplus in West Africa. Exp Appl Acarol.

2012;56(4):385–390.

Madder M, Thys E, Achi L, Touré A, De Deken R. Rhipicephalus (Boophilus) microplus: a most successful invasive tick species in West-Africa. Exp Appl Acarol. févr 2011;53(2):139‑45.

Marshall C. Campagne d’éradication de la babésiose bovine en nouvelle- calédonie (2008-2010). Thèse. Med. Vét, Faculté de Médecine de Créteil ,125 P. 2011 [cité 1 déc 2017].