Partie IV
La biodiversité et sa dynamique
B : Réplication de l’information génétique et mitose
(suppose la parfaite connaissance de I_A_2_d et de I_A_3_d)
Le programme
Connaissances clés à construire
La transmission de l’information génétique au cours des divisions cellulaires est réalisée grâce à une duplication du matériel génétique, à faible taux d’erreur, suivie d’une une répartition équitable du matériel génétique entre les deux cellules filles.
IV-B.1 Duplication de l’information génétique : conservation et variation
L’ADN subit une réplication semi-conservative assurée par un ensemble de protéines au niveau de la fourche de réplication. Le processus assure fondamentalement la conservation de l’information. Des erreurs de réplication conduisent à des mésappariements qui peuvent être corrigés au cours ou à la fin de la réplication. Les erreurs non réparées modifient les séquences des génomes et constituent des mutations spontanées créant de nouveaux allèles. Un processus globalement « conservateur » est ainsi à l’origine de « variations ».
IV-B.2 Cycle cellulaire, mitose et répartition du matériel génétique
Chez les eucaryotes, la duplication du matériel génétique se produit au cours de la phase S du cycle cellulaire, lors de l’interphase. La mitose, pendant laquelle les chromosomes sont répartis de manière identique entre les deux cellules filles grâce au cytosquelette, boucle le cycle cellulaire.
La cytocinèse ne suit pas obligatoirement la division du noyau ce qui conduit alors à des syncytiums.
Commentaires, capacités exigibles
Par souci de simplification, la réplication du matériel génétique sera étudiée chez une Eubactérie.
- expliquer en quoi le mécanisme de la réplication permet la polymérisation d’un polynucléotide et conduit à la formation de deux nouvelles doubles hélices portant la même information que la molécule matrice ;
- expliquer le principe du fonctionnement général d’une ADN polymérase (réaction catalysée, sens de lecture et sens de synthèse, rôle des synthèses d’amorces) ;
- présenter un modèle simple de fonctionnement d’une fourche de réplication chez E. coli (ADN polymérase III, hélicase, primase, topoisomérase, protéines SSB) ;
- mentionner les mécanismes d’élimination et de remplacement des amorces ;
- montrer comment l’insertion d’une forme tautomère de base peut conduire à un mésappariement ;
- expliquer l’importance de l’activité autocorrectrice des ADN polymérases dans la limitation du nombre d’erreurs ;
- montrer un mécanisme de correction (tel que la correction par excision de base) capable d’éliminer des erreurs non repérées au cours de la réplication Lien : Mutations (§ IV-C)
- définir le cycle cellulaire et les caractéristiques essentielles de ses différentes phases ;
- montrer en quoi les mécanismes de la mitose, et en particulier le
fonctionnement du fuseau achromatique, permettent l’égale répartition des chromosomes, donc de l’information génétique ;
On considère uniquement la mitose de cellules pour lesquelles la division cellulaire suit la division nucléaire. On se limite aux mécanismes de base ; la cohésine, tout comme la séparase par exemple, ne sont pas exigibles. Le contrôle du cycle cellulaire n’est pas au programme. On mentionne les structures syncytiales sans développement (Oomycètes, voir IV-E).
B : Réplication de l’information génétique et mitose
I) Duplication de l’information génétique :
conservation et variation
Un ours mal léché
Au moyen âge, on pensait que l’ourson naissait informe et que sa mère le léchait afin de le façonner et de lui donner sa forme d’ours.
Morphogenèse externe
De la cellule œuf à l’adulte
L’information génétique contenue dans la cellule œuf (interagissant avec des facteurs cytoplasmiques) est suffisante pour diriger la construction de l’organisme, selon le plan d’organisation propre à l’espèce.
Des cellules différentes, un même génome
Aussi différentes soient- elles, les cent mille milliards (1014) de cellules de
l’organisme partagent le même génome !
Exceptions : les cellules anucléées (hématies), les gamètes (n
chromosomes), les lymphocytes (réarrangements chromosomiques), les mutations et transpositions…
Mais elles expriment des sous-ensembles de gènes différents, selon leur type cellulaire (voir IV-A-II, épigénétique).
Le génome de chaque cellule, potentiellement totipotent
Un noyau de cellule de glande mammaire (cellule différenciée) est totipotent… aux modifications épigénétiques près (épigénétique), qu’il faut effacer ! (l’ovocyte s’en charge)
Ian Wilmut et « sa » brebis Dolly, née en 1997
On prélève une cellule dans la mamelle
On ne garde que le noyau …
… qu’on introduit dans l’ovocyte énucléé
Puis l’on implante l’ovocyte dans une mère porteuse
On prélève un ovocyte non fécondé …
… que l’on énuclée Brebis A
Brebis B
Brebis C : « Dolly »
La preuve : le clonage par transfert nucléaire
L’information présente dans la cellule œuf reste présente dans toutes les cellules qui en dérivent.
Les clones bactériens
Les colonies bleues correspondent à des bactéries E. coli dotées de l’enzyme b-Gal, les blanches en sont dépourvues (insert dans le gène). Chaque bactérie d’une colonie blanche (à gauche), étalée sur une boite, reforme une colonie blanche (à droite) par divisions successives (fissions) et on vérifie qu’elle contient le même insert : on a un clone (ensemble de cellules au génome identique).
plasmide
plasmide
• Comment le génome de la cellule œuf (ou de la bactérie initiale) a-t-il été « répliqué » ?
• Ce processus peut-il être source de nouveauté ?
• Comment assurer la répartition égale des copies du génome entre les cellules filles ?
Le génome de la cellule œuf, ou de la bactérie originelle, est
donc répliqué. L’information qu’il contient est dupliquée.
B : Réplication de l’information génétique et mitose
I) Duplication de l’information génétique : conservation et variation
a) Réplication semi-conservative : mise en évidence chez une
eubactérie
Trois modèles pour la réplication
Modèle conservatif Modèle semi-conservatif Modèle dispersif
On « conserve » la molécule d’ADN originelle,
une nouvelle est crée
Les 2 brins se séparent, chacun sert de matrice à la synthèse d’un nouveau brin
Les brins des 2 ADN fils sont un mélange d’ADN
ancien et nouveau.
The most famous understatement
in biology !
“It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests
a possible copying mechanism for the genetic material.”
James Watson et Francis Crick,
Nature 171: 737-738 (1953)
L’expérience de Meselson et Stahl (1958)
Ils ont l’idée de distinguer l’ADN originel de l’ADN néoformé en utilisant un
isotope lourd de l’azote, 15N (non radioactif !) :
L’ADN « lourd », incorporant 15N, a une densité de 1,724 tandis que l’ADN
« léger » à 14N a une densité de 1,710.
Matthew Meselson et Franklin Stahl, au CalTech, étudient la réplication de l’ADN chez la bactérie Escherichia coli.
« La plus belle expérience en biologie »
(John Cairns, dans Le huitième jour de la création, 1979)NH N
NH
2O NH
N
NH
2O
15
N
14N
L’expérience de Meselson et Stahl (1958)
Pour séparer l’ADN selon sa densité, Meselson et Stahl vont utiliser la technique de la centrifugation en gradient de densité. Ils utilisent pour cela une solution concentrée de chlorure de césium (le césium est un métal lourd) qu’ils soumettent à une ultracentrifugation (24h à 300 000 g !) pour créer un gradient de densité. Si l’on ajoute de l’ADN bactérien en même temps, il va migrer et former une bande dans le tube (révélable par le bromure d’éthidium) selon sa densité.
Pour que toutes les bactéries soient au même point dans la réplication de leur ADN, il leur faut enfin mettre au point une méthode qui permet de synchroniser pendant quelques générations la division des bactéries.
[CsCl] = 2 M
Densité uniforme
= 1,5 g/mL
[CsCl] = 3 M
Densité = 2,5 g/mL [CsCl] = 0,5 M
Densité = 1,2 g/mL Centrifugation
Trois modèles pour la réplication
Modèle conservatif Modèle semi-conservatif Modèle dispersif
« L’ADN subit une réplication semi-conservative »
Gradient de densité
Générations
Bactéries E. coli cultivées en présence de thymidine tritiée : étalement de l’ADN et autoradiographie
Expérience de Cairns (1963)
John Cairns (1922-). Ce chercheur anglais a réalisé sa célèbre expérience à Cold Spring Harbor (NY), haut lieu de la biologie moléculaire.
Expérience de Cairns (1963)
A 5 mn : apparition d’un œil de réplication
A 12 mn : l’œil s’est élargi, les deux fourches sont
plus distantes
A 50 mn : le chromosome est entièrement marqué, un nouvel œil apparait ;
une branche avec le double de radioactivité
100 mm Brin « froid »
Brin radioactif, néosynthétisé
Autoradiographie Interprétation
Expérience de Cairns (1963)
Un œil de réplication peut correspondre à
une réplication uni ou bidirectionnelle
La réplication est bidirectionnelle
La linéarisation du chromosome circulaire viral permet de suivre la progression des fourches de
réplication, à la vitesse de 1500 nucléotides par seconde
(exercice : calculer le temps
théorique nécessaire à la réplication du génome d’E. coli).
Réponse : il y a deux fourches, donc on réplique 3000 nt/s, et 4,6. 106 nt en 1533 s, soit 25 mn 33 s…
Utilisation de nucléotides radiomarqués à des concentrations différentes au cours du temps, montrant la progression bidirectionnelle des fourches de réplication.
La réplication est bidirectionnelle
A t1 :
ajout de dNTP radioactifs à la concentration C1
A t2 :
ajout de dNTP radioactifs à la concentration C2>> C1
Duplication d’un chromosome lors de la phase S
http://www.lucieberger.org/svt/SVT%20en%201ere%20S/WEB_1eS/2_MorVeg/2_MorVeg.html
Et chez les eucaryotes ?
Nombreux yeux de réplication : plusieurs origines de réplication
B : Réplication de l’information génétique et mitose
I) Duplication de l’information génétique : conservation et variation
a) Réplication semi-conservative : mise en évidence chez une eubactérie
b) Mécanismes moléculaires de la réplication chez une
eubactérie
P O O N
NH O
O H3C
O-
5’
3’
P O O
O
NH2
N N
N N
O-
O 5’
3’
O- O
OH
3’
O-
P O O
OH O-
5’ N
N NH2
O O-
P O O
O-
O- P O O-
3’
P O O
O
N
NH O
O H3C
O-
P O O
OH O
O- 5’
3’
5’
P O O
O
NH2
N N
N N
O-
O 5’
3’
O- O
N N NH2
O
O- P O O
O-
O- P O O-
La réplication : création de liaisons
phosphodiester
OHP
OH P
P base
P base
P base base P
base P
base P
base P
base P
base P
base P
base P
base P
Ajout d’un dNTP à une extrémité 3’OH
5’
3’
P base
P base
5’
OH
Un polynucléotide est obtenu par la polymérisation de dNTP dans le sens 5’ → 3’
Cette réaction nécessite un brin matrice, non apparié, et donc l’ouverture de la double hélice.
Energie fournie par l’hydrolyse de la liaison phosphate-phosphate.
5’
3’
Une polymérisation catalysée : l’ADN polymérase III eubactérienne
C’est la principale enzyme responsable de la réplication chez les procaryotes. Il s’agit d’un très gros complexe formé de nombreuses sous-unités.
L’holoenzyme (entourée), responsable de la polymérisation proprement dite, est en double, les deux unités étant reliées par des sous-unités formant un pont. Des sous-unités en forme d’anneau (β2) permettent de « clamper » l’ADN. L’enzyme est également associée à une hélicase.
Une difficulté : la double hélice doit être ouverte
3’
La fonction enzymatique hélicase s’en charge (moyennant une dépense
d’énergie).
5’ 3’
5’
5’
3’
Mais ceci crée une autre difficulté : on crée des contraintes qui devront être relâchées.
3’
5’ 3’
5’
5’
3’
Une difficulté : le surenroulement doit être supprimé
3’
Une autre enzyme, la topoisomérase I, se charge de supprimer les surenroulements positifs (moyennant une dépense d’énergie)
5’ 3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
Topoisomérase I
Mécanisme d’action de la topoisomérase I
Coupure simple brin
Rotation de la double hélice
Ligation du brin coupé : surenroulement négatif
Une difficulté : l’ADN polymérase a besoin d’une extrémité 3’OH pour commencer
3’
5’ 3’
5’
5’
3’
Ceci est résolu par une enzyme, la primase, qui synthétise de courtes amorces d’ARN ! (4 à 12 nucléotides) à partir desquelles la pol III travaille.
Mais ceci crée une autre difficulté : il faudra ensuite se débarrasser de cet ARN !
« Mentionner les mécanismes d’élimination et de remplacement des amorces »
« Expliquer le principe du fonctionnement général d’une ADN polymérase (rôle des synthèses d’amorces) »
3’
5’ 3’
5’
5’
3’
Amorce
d’ARN
Une difficulté : l’amorce d’ARN doit être remplacée par de l’ADN
3’
5’ 3’
5’
5’
3’
Ceci est résolu par une autre polymérase, l’ADN pol I, qui en plus de son activité de synthèse 5’→3’, dispose d’une activité exonucléasique (de dégradation) 5’→3’.
« Mentionner les mécanismes d’élimination et de remplacement des amorces »
3’
5’ 3’
5’
Amorce
d’ARN
Une (grosse) difficulté : le fonctionnement de l’ADN polymérase est orienté
3’
Sens de lecture
du brin matrice : 3’ → 5’
Sens de synthèse du néobrin : 5’ → 3’
5’ 3’
5’
5’
3’
Ca marche pour un brin, où la synthèse peut progresser avec l’avancée de la fourche de réplication… Mais pour l’autre brin ? Synthèse à rebours de l’avancée de la fourche,
forcément discontinue. Mais alors, cela crée une autre difficulté : il faut relier les morceaux ! Avancée de
la fourche
« Expliquer le principe du fonctionnement général d’une ADN polymérase (sens de lecture et sens de synthèse) »
3’
5’
3’
5’ 3’
5’
5’
3’
5’
3’
Avancée de la fourche
3’
5’
3’
5’ 3’
5’
Les enzymes de la réplication
3’
5’
3’
5’ 3’
5’
Topoisomérase I Hélicase
Amorce ARN
5’
3’
Primase
Ouverture de la double hélice par l’hélicase, gestion du surenroulement par la topo. I Synthèse d’une
amorce ARN par la primase pour fournir une extrémité 3’OH à la Pol III
Pol III
Pol III
Ligase Elimination de l’amorce ARN :
activité 5’→3’ exonucléase de l’ADN Pol I + RNAse H
5’
3’ 3’
5’
3’
5’
5’
3’
3’
Fragment d’Okazaki
Remplissage : activité 5’ → 3’
polymérase de l’ADN Pol I
Liaison des deux fragments d’Okazaki contigus par suppression de la coupure simple brin : ligase
Amorce ARN
5’
3’ 5’
5’
Elongation par la Pol III à partir de l’amorce ARN, jusqu’à l’amorce ARN suivante
Pol I
5’
3’ 3’
5’
Remplacement de la Pol III par la Pol I
Pol I
3’
5’
5’
5’
Les fragments d’Okazaki : la synthèse discontinue du brin tardif
Œil de réplication ORI
ORI
ORI 5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
Expériences de pulse-chasse de Reiji Okazaki (1968) :
On récolte par un marquage court des petits fragments d’ADN simple brin de 1 kb environ : les fragments d’Okazaki
5’
3’
3’
5’
Brin tardif (discontinu) avec fragments d’Okazaki, 1000 à 2000 nucléotides chez les procaryotes)
Brin précoce (continu)
Progression des fourches de réplication
3’
3’
5’
5’
5’
3’
Coopération fonctionnelles des différentes enzymes bactériennes impliquées dans la réplication
Topoisomérase I Hélicase
Primase Pol III
Brin précoce (continu)
Ssb
5’
5’
3’
3’
5’
3’
Pol I Ligase
Brin tardif (discontinu)
ADN néosynth.
ARN (amorce)
3’ 5’
ADN matrice
Stabilisation de l’ADN simple brin par Ssb (Single strand binding protein)
Élongation (Pol III) Élongation/dégradation
ARN (Pol I)
Ligation Fragment d’Okazaki
Fourche
de réplication
« Présenter un modèle simple de fonctionnement d’une fourche de réplication chez E. coli (ADN polymérase III, hélicase, primase, topoisomérase, protéines SSB) »
Modèle de Kornberg : progression simultanée des deux Pol III grâce à une boucle de l’ADN matrice
Voir aussi les vidéos !
3’
5’
5’
3’
Brin précoce (continu)
5’
5’
3’
3’
Brin tardif (discontinu)
Amorce n
Fourche de réplication
5’ 3’
Amorce n-1
Amorce n-2 Stabilisation de
l’ADN simple brin
Dimère d’ADN pol III
Modèle de Kornberg :
progression simultanée des deux Pol III grâce à une boucle de
l’ADN matrice
3’
5’
5’
3’
5’
5’
3’
3’
Brin tardif (discontinu)
Amorce n+1
Fourche de réplication
5’ 3’
Amorce n
Amorce n-1 Stabilisation de
l’ADN simple brin
Dimère d’ADN pol III
ADN pol I
Procaryotes Eucaryotes Origine de réplication Unique Plusieurs
Œil de
réplication Unique Plusieurs
Enzyme de démarrage ARN primase α Pol
Fragment d’Okazaki 1000 à 2000 nucléotides
100 à 200 nucléotides Polymérase principale
d’élongation ADN pol III ADN - δ Pol
Comparaison procaryotes / eucaryotes
(réplication des eucaryotes pas exigible)
B : Réplication de l’information génétique et mitose
I) Duplication de l’information génétique : conservation et variation
a) Réplication semi-conservative : mise en évidence chez une eubactérie
b) Mécanismes moléculaires de la réplication chez une eubactérie
c) Les erreurs de réplication chez une eubactérie
La fidélité élevée de la réplication
Le gène lacZ code la b-galactosidase, dont on peut détecter l’activité. La séquence codante du gène lacZ fait 3069 bases chez E. coli.
On estime qu’une mutation touchant le gène lacZ va supprimer la fonction de la b-
galactosidase une fois sur trois (les deux autres sont des mutations silencieuses). Donc le taux réel de mutation (qu’on attribue ici entièrement aux erreurs de réplication) est sous-estimé d’un facteur 3 quand on ne regarde que le phénotype.
On observe un mutant LacZ- toutes les 106 générations, c’est donc qu’il y a eu 3 mutations. La polymérase a donc fait 3 erreurs en copiant 3069 x 106 bases, soit environ 3 milliards de
bases.
On en conclut que le taux de mutation chez E. coli est d’environ 10-9 (une erreur tous les milliards de bases recopiées) !
X 1 000 000 Sur 1 million
de générations, 1 mutant lac-, 3 mutations Une mutation de la
b-galactosidase sur 3
donne le phénotype lac-
…
3 kb
Rajouter une diapo sur les indels –
glissement de la polymérase
Cet équilibre est nommé tautomérie (les deux formes sont nommées tautomères).
Les formes céto- et amino- sont très majoritaires au pH physiologique.
« mettre en relation les caractéristiques d’une molécule et sa réactivité (équilibre céto-énolique) » Chapitre I-A-I N’apprenez pas à dessiner la thymine (ou une autre base à forme
céto), sachez simplement reconnaitre les formes cétone et énol.
Forme énol
N N
OH
N HN
O
O
Forme céto
Thymine
CH3 CH3
O
N HN H2N
Guanine N
N O
N
N N
OH
H2N N
Formes tautomères des bases azotées de l’ADN
Vous savez normalement dessiner la base adénine sous sa forme amine, apprenez à dessiner la forme imine.
Forme imine Forme amine
Cytosine N
N
NH2
O N
HN
NH
O
N N
NH2
N
N N
HN
NH
N
N
Formes tautomères des bases azotées de l’ADN
Adénine
N
O
O
N H Thymine
CH3
(Més)appariements liés aux formes tautomères : AC, GT
« montrer comment l’insertion d’une forme tautomère de base peut conduire à un mésappariement »
N
N
N N
N
H H
Adénine N
N
O N
H H
Cytosine : forme imino (rare)
N
N
N N
N H
Adénine
forme imino (rare) H
N
N
O N
H H
Cytosine
Thymine : forme énol (rare)
N
O
O N CH3
H
Guanine forme énol (rare) H
O
N
N N
N H
N H
O
N
N N
N Guanine
H
H N H
Mutation ponctuelle causée par tautomérie
A cette génération, elle ne l’est plus.
A cette génération,
l’erreur est discernable
« Des erreurs de réplication conduisent à des mésappariements. »
T C C A A
G G T
Cytosine revenue en forme amino : mésappariement
T C
T A
C A A
G T C
T C
C A A
G G T
T A
T C C A A
G A T
Arrivée de la polymérase
Forme imino de C: la paire A::Cse forme avec une probabilité de 10-5, la polymérase la valide.
T C C A A
G A T
T C
C A A
G A
T
Réplication : paire G::C normale
T C T A A
G A T
Substitution : transition C → T sur le brin de droite (pyrimidine→pyrimidine) T
C T
A
C A A
G A T
Ref. 1et 2 De façon aléatoire,
un A se place en face du C.
La paire A::Cest plus stable que la paire A::C (et les deux sont interconvertibles),
c’est donc la première qui est la principale responsable des transitions A→G. La paire A::Cest assez stable pour
durer le temps du travail d’édition de la polymérase (de l’ordre de la
milliseconde).
Correction : connaître le brin parent
C G
m
C A G
C G T
« Correction » du brin parent : mutation C
G C
A G
C G T
m
C G
T A
C A G
C T C
m
Veuillez noter :
que la base dans la forme tautomère rare soit dans le brin matrice ou dans le nucléotide ajouté,
cela aboutit au même résultat.
C G C A G
C A
T
m
C G
T A
C A G
C T C
m
C G C A G
C A
T
m
« Des erreurs de réplication conduisent à des mésappariements qui peuvent être corrigés au cours ou à la fin de la réplication. »
C G C A G
C G T
m
Correction du brin néosynthétisé
C G C A G
C A
T
m m
C G T A G
C A T
m m
C G C A G
C G T
m m
Correction du brin néosynthétisé Méthylation du
brin néosynthétisé
L’activité 3’→ 5’ exonucléasique de l’ADN polymérase III
« Expliquer l’importance de l’activité autocorrectrice des ADN polymérases dans la limitation du nombre d’erreurs »
5’
E P
Mode « polymérisation » Mode « correction »
3’
5’
3’ Brin matrice
Brin néosynthéthisé
5’
3’
5’
E P
P : site actif polymérase E : site actif exonucléase
3’
L’activité exonucléase 3’ → 5’
de la polymérase corrige une partie des mésappariements
S’il y a un mésappariement, la polymérase le détecte, car la double hélice est localement déformée. La polymérase « revient alors en arrière », dans le sens 3’→ 5’, pour enlever le nucléotide qu’elle vient d’ajouter.
Une fois sur 100, toutefois, le mésappariement n’est pas corrigé, et la polymérase continue.
Mais tout n’est pas perdu !
« Des erreurs de réplication conduisent à des mésappariements qui peuvent être corrigés au cours ou à la fin de la réplication. »
Le mécanisme de réparation des mésappariements
(mismatch repair)
La base erronée est sur le brin néosynthétisé ; mais comment reconnaître le bon brin (le brin parental) ?
Chez les bactéries, les séquences GATC sont méthylées sur le A, un peu après la réplication. Le brin fils, qui n’a pas eu le temps d’être méthylé, est reconnu et corrigé.
La correction passe par l’excision d’une dizaine de nucléotides, et la resynthèse.
(le nom des protéines impliquées n’est pas à connaître)
« montrer un mécanisme de correction (tel que la correction par excision de base) capable d’éliminer des erreurs non repérées au cours de la réplication »
Etape de réplication Erreur par nucléotide polymérisé/corrigé
Polymérisation 5’ → 3’ 10-5
Correction exonucléasique 3’ → 5’ 10-2 Correction des mésappariements après réplication 10-2
Total 10-9
Bilan : la fidélité de la réplication
En résumé
Un organisme pluricellulaire est formé de très nombreuses cellules qui dérivent toutes de la cellule œuf par des divisions cellulaires successives, et qui partagent toutes l’information génétique de la cellule œuf (à quelques exceptions près) (mais elles l’expriment différemment : différenciation cellulaire). C’est donc que l’ADN est répliqué (dupliqué) fidèlement, avant que les deux copies du génome soient réparties équitablement entre les deux cellules filles.
La réplication (étudiée dans ce chapitre chez les seuls procaryotes) est la polymérisation d’un nouveau brin d’ADN, à partir d’un brin matrice, par le positionnement d’un nucléotide de base complémentaire à celle du nucléotide du brin matrice, et la formation d’une liaison phosphodiester (à partir d’un nucléotide triphosphate). La réplication est donc semi-conservative (attention : dans la nouvelle molécule d’ADN double brin, la moitié de l’ADN initial est conservée, mais l’ensemble de l’information est conservée !).
La double hélice est désenroulée au niveau de l’origine de réplication, créant un œil de réplication, et la réplication progresse dans les deux directions opposées, sur les deux brins en même temps (fourche de
réplication). La réplication est assurée par des enzymes, les ARN polymérases, qui catalysent la synthèse de l’ADN dans le sens 5’->3’ (elles lisent donc l’ADN matrice de 3’ vers 5’) et qui ont besoin d’une extrémité 3’OH libre pour démarrer. Cette extrémité est fournie par une primase qui synthétise un court fragment d’ARN (amorce). D’autres enzymes/protéines sont présentes et coopèrent au niveau de la fourche de réplication. La double hélice est
ouverte par une hélicase, et les surenroulements générés par cette ouverture sont relâchés par une topoisomérase I.
Un problème particulier est créé par le fait que la polymérase principale (Pol III) ne peut avancer dans le même sens que la fourche de réplication que sur un brin (brin précoce). Sur l’autre brin (brin tardif), des segments d’ADN matrice simple brin sont transitoirement exposés (et stabilisés par la protéine SSB) car la réplication est
discontinue : à partir d’une amorce, et à la faveur d’une boucle du brin matrice qui lui permet de progresser dans le même sens que fourche, la Pol III synthétise un petit fragment d’ADN (fragment d’Okazaki). L’amorce ARN du fragment précédent est digérée et remplacée par de l’ADN par une autre polymérase, la Pol I (qui possède donc une activité exonucléase 5’->3’). Les fragments sont raboutés par la ligase.
En résumé (2)
Lors de la réplication, une base du brin matrice (ou du nucléotide ajouté sur le brin néosynthétisé) peut exister transitoirement sur la forme tautomère la plus rare (forme énol pour T et G, forme imine pour A et C). Ceci conduit alors la polymérase à ajouter un nucléotide différent de celui de l’appariement courant (erreur de
réplication), créant un mésappariement (par exemple, paire A=C). Après retour à la forme tautomère majoritaire, la paire de bases mésappariées est détectable, car elle déforme localement la double hélice d’ADN. A ce stade, l’erreur peut encore être corrigée ; en revanche, si le mésappariement n’est pas réparé avant, lors de la
réplication suivante, l’erreur sera fixée (en face du C sera ajoutée un G, donnant une paire CG tout à fait
conforme). On aura alors une mutation de type substitution (transition ou transversion), modifiant la séquence du génome de façon définitive (apparition d’un nouvel allèle si la mutation touche un gène). De telles mutations sont spontanées (non causées par un agent mutagène, la seule cause étant l’équilibre tautomérique).
Les mésappariements, qui surviennent en moyenne un fois tous les 100 000 nucléotides, peuvent être corrigés à différents stades, au cours ou à la fin de la réplication. La polymérase elle-même (Pol I ou Pol III) est capable de
« s’autocorriger » et de remplacer le nucléotide qu’elle vient d’ajouter si elle détecte un mésappariement (excision du nucléotide et recul de l’enzyme d’un nucléotide : activité exonucléase 3’->5’). Elle omet de le faire une fois sur 100.
Les mésappariements non corrigés lors de la réplication peuvent l’être après son passage. Différents systèmes de réparation (comme le mécanisme de réparation des mésappariements, MMR) sont en effet capables de
reconnaître le brin matrice, qui est méthylé sur des séquences spécifiques. Dans l’exemple du MMR, le brin néosynthétisé subit une coupure près du mésappariement, la double hélice est déroulée et le brin est
resynthétisé à partir de la coupure). Si trop de temps s’est écoulé à partir de la réplication, le brin néosynthétisé est à son tour méthylé, et il n’est plus possible de déterminer le brin porteur de la base à corriger.
Au final, on voit que la réplication est un processus globalement « conservateur » (sans quoi l’information génétique serait progressivement perdue), mais est aussi à l’origine de « variations » (source d’innovation génétique, à l’échelle des générations et des populations).
