A n n. Biol. anim. Bioch. Biophys.
PRÉSENCE DANS L E LAIT E T LA GLANDE MAMMAIRE DE COMPOSÉS GLUCIDIQUES LIÉS AU
GUANOSINE 5 ' DIPHOSPHATE
R. D E N A M U R , G. F A U C O N N E A U e t Geneviève J A R R I G E - G U N T Z
Station de Recherches de Physiologie animale, Centre National de Recherches Zootechniques, ]ouy-en-Josas.
C A B I B e t L E L O I R o n t isolé en 1954, à partir de la levure, u n dérivé glucidique du Guanosine 5 ' diphosphate, ( G D P 5'), le guanosine diphosphate mannose ( G D P M ) . L a présence de ce nucléotide fut ensuite signalée dans différents tissus, sécrétions et organismes : o v i d u c t e de poule ( S T R O M I N G E R , 1955), Pénicillium chrysogenum ( B A L J J O et al., 1956), laits de brebis, de chèvre, de truie, glandes m a m m a i r e s de brebis ( D E N A M U R e t al., 1958 a-b — 1959 a-b), Eremothecium ashbyii ( P O N T I S e t al., 1959).
L e guanosine diphosphate fucose ( G D P F ) est u n autre dérivé glucidique du guanosine 5' diphosphate, récemment identifié à partir des laits de brebis, de c h è v r e , de truie, de l a glande m a m m a i r e de brebis ( D E N A M U R e t al., 1958 a-b — 1959 a-b), ainsi que à'Aerobacter aerogènes ( G I N S B U R G 1958).
P a r m i les glucides liés a u G D P 5' le glucose et le mannose sont q u a n t i t a t i v e - m e n t les plus importants, c e p a n d a n t d'autres dérivés de la guanosine ont été signalés.
Ainsi, nous a v o n s décelé la présence de glucose e t de galactose dans les s o m m e t s de G D P M et de G D P F , résultant d ' u n fractionnement à froid sur D o w e x 1, de la fraction acidosoluble des laits de brebis ( D E N A M U R e t al., 1958). P O N T I S e t al.
(1959) o n t fait u n e o b s e r v a t i o n analogue à partir d'Eremothecium ashbyii, o ù l ' h y d r o l y s e du G D P M libéré en même t e m p s q u e le mannose u n e certaine q u a n t i t é de glucose et de fructuose (la somme glucose-fructose est égale à 6 p . 100 d u m a n - nose) . Ces derniers auteurs sont conduits à a d m e t t r e l'existence de G D P glucose e t de G D P fructose. P a r ailleurs P O N T I S (1957) a isolé à p a r t i r de l a l e v u r e u n composé dérivé du G M P 3 ' qu'il n ' a p u identifier, e t H E A T H le G D P 5 ' colitose à partir à'Escherichia Coli.
N o u s avons poursuivi l'étude des fractions glucidiques q u i paraissent liées a u G D P 5 ' dans les laits de brebis, de chèvre e t de truie, ainsi q u e dans les glandes m a m m a i r e s de brebis prélevées à des périodes différentes de l ' a c t i v i t é sécrétoire
(gestation, lactation).
L ' a n a l y s e des nucléotides acidosolubles des laits e t de la glande m a m m a i r e a é t é pratiquée selon l a m é t h o d e de H U R L B E R T e t al. (1954), mais à u n e t e m p é r a t u r e
Article publié par EDP Sciences et disponible sur le site http://rnd.edpsciences.org ou http://dx.doi.org/10.1051/rnd/19611074
C O M P O S É S G L U C I D I Q U E S L I É S A U G D P 5' 75 comprise entre 0 et 2 ° C *, ce qui nous a permis d'isoler dès le fractionnement primaire, le G D P M et le G D P F en d e u x sommets distincts, H et H ' (voir figure).
Afin de rechercher si ces sommets renferment des dérivés glucidiques du G D P 5', différents du G D P M et du G D P F , les nucléotides des sommets H et H ' sont débar- rassés de l'acide formique par e x t r a c t i o n s répétées à l'éther, puis adsorbés sur charbon (élimination des sucres phosphates) et élues par le mélange éthanol-ammoniaque- eau (50 V — 49 V — i V ) . Des éluats sont alors chromatographiés en éthanol-acétate d'ammoniaque M (75 V — 30 V — p H 7,5) selon la méthode de P A L A D I N I et D E L O I R
Flattions it 10 ce
Nucléotides acido-solubles du Util de truie ( 100 ml de lait)
Fractionnement obtenu sur colonne de Dowex 13,2 x40 cm à l'aide d'un gradient acide torinique (0—5 N). Formate d'ammonium (o—1,6 N).
(I9 52) . ou soumis à un deuxième fractionnement sur colonne de D o w e x 1, à l'aide d'un gradient formiate d'ammonium. A p r è s migration sur papier, les « spots » correspon- dant au G D P M e t au G D P F sont élues à l'eau. A p r è s chromatographie secondaire sur colonne, les s o m m e t s de G D P M et de G D P F sont séparés du formiate d'ammo- nium par adsorption sur charbon puis élution en milieu alcalin. D ' a n a l y s e des subs- tances ainsi isolées a permis l'identification de la fraction nucléotidique et la mise en évidence de plusieurs composés glucidiques liés à cette fraction.
a) L e G D P 5 ' représente le seule constituant nucléotidique ainsi que les analyses suivantes le d é m o n t r e n t :
* Tous les fractionnements chromatographiques (papier ou colonne) adsorptions sur charbon et éludons, ainsi que les éludons des papiers chromatographiques sont effectuées à 0-20 en raison de la labilité du GDP F.
— L e s spectres U . V . à p H i — 7 — 1 3 , sont caractéristiques de la guanosine ;
— L e G D P 5 ' et le G M P 5 ' sont seuls mis en évidence après h y d r o l y s e H C 1 0,1 N . L a séparation c h r o m a t o g r a p h i q u e de ces composés a été réalisée à la fois par m i g r a t i o n sur papier en éthanol-acétate d ' a m m o n i a q u e M (75 V — 30 V — p H 7,5) et p a r fractionnement sur colonne de D o w e x 1.
— L a guanine est la seule b a s e identifiéeaprès h y d r o l y s e p a r l'acide perchlori- que, 72 p . 100 à i o o ° C p e n d a n t 1 heure et chromatographie en isopropanol-acide chlorhydrique concentré-eau (678 V — 176 V — 146 V ) .
b) L e s composés glucidiques ont été isolés à l'aide de différentes méthodes : L e s « spots » ou les s o m m e t s secondaires correspondant a u G D P M et a u G D P F sont h y d r o l y s e s par HC1 (pH 2, 30 minutes, i o o ° C ) . L e s h y d r o l y s a t s débarrassés des nucléotides par échangeurs d'anions sont chromatographiés en plusieurs s o l v a n t s uti- lisés pour l'identification des sucres : butanol-acide acétique-eau (4 V — 1 V — 5 V ) , pyridine-acétate d ' é t h y l e - e a u (1 V —• 2 V — 2 V ) , phénol-ammoniaque 3 p . 100 e a u - c y a n u r e de potassium, butanol-pyridine-eau (3 V — 1 V — 3 V ) . L ' i o n o p h o r è s e en t a m p o n b o r a t e selon la m é t h o d e C O N S D E N et al. (1952) ainsi que la c h r o m a t o - ionophorèse (première dimension : phénol-ammoniaque ou p y r i d i n e - a c é t a t e d ' é t h y l e - eau ; d e u x i è m e dimension : ionophorèse en t a m p o n b o r a t e p H 9) ont é g a l e m e n t été utilisées.
L a similitude d u c o m p o r t e m e n t c h r o m a t o g r a p h i q u e et ionophorétique, ainsi q u e les tests de surcharge, associés à différentes révélations, nous ont permis d'iden- tifier outre le mannose et le fucose, déjà connus, le glucose, le galactose, l'arabinose et plusieurs oligosaccharides. L a présence et l'importance relative des divers glucides d o i v e n t être en visagées séparément dans la glande m a m m a i r e et le lait.
A . — • L E L A I T
i ° Les hexoses : le glucose e t le galactose o n t été observés dans les d e u x sommets de G D P M et de G D P F d u l a i t de truie, et dans le colostrum, le lait « o c y t o c i q u e » * et le l a i t de fin d e l a c t a t i o n chez la brebis. D a n s t o u s ces cas, le glucose est en q u a n t i t é plus i m p o r t a n t e que le galactose, il existe seul dans le l a i t de brebis sécrété d u 2 0e jour au 1 9 6e jour de lactation.
2° Les pentoses et autres sucres inconnus : l'arabinose a été isolé à partir d u G D P F dans le colostrum de brebis. U n autre sucre de R i (glucose) : 1,43 en p y r i d i n e — acé- t a t e d'éthyle-eau existe dans le G D P M des colostrum de brebis et dans le lait de c h è v r e . Enfin, u n sucre de R f (glucose) 2,7 (jaune citron après révélation par la benzidine, acide trichloracétique) a été t r o u v é dans le colostrum de brebis.
30 Les oligosaccharides nous a v o n s constaté la présence de trois oligosaccharides (a, b , c,) de R f (glucose : 0,15, 0,40, 0,65) en p y r i d i n e - a c é t a t e d ' é t h y l e - e a u .
L'oligosaccharide b qui est le plus i m p o r t a n t q u a n t i t a t i v e m e n t , présente les m ê m e s caractéristiques de migration que le lactose dans t o u s les s o l v a n t s utilisés et après ionophorèse.
* Le lait « ocytocique » est obtenu de la manière suivante : après la traite normale, on évacue le lait résiduel avec 2 0 U. I. d'ocytocine synthétique (Syntocinon). 3 0 minutes après, on pratique une deuxième vidange complète de la glande mammaire avec 2 0 U. I. d'ocytocine. Le lait sécrété pendant les 3 0 minutes est appelé lait « ocytocique » il est resté un temps limité dans les Acini mammaires, contrairement au lait normal qui peut subir certaines modifications pendant l'intervalle de 1 2 heures qui sépare habituellement deux traites consé- cutives.
C O M P O S É S G L U C I D I Q U E S L I É S A U G D P 5' 77 Il a p u être isolé en quantités assez importantes à partir des G D P F du lait de truie, du lait o c y t o c i q u e et du colostrum de brebis. Son h y d r o l y s e par l'acide sulfu- rique N , (1 heure, i o o ° C ) , conduit à du glucose et du galactose en quantités à peu près équivalentes, à l'oligosaccharide c et à d e u x sucres de R f (glucose) : 1,43 et 2,7 en pyridine-acétate d'éthyle-eau.
Des s o m m e t s de G D P F du colostrum e t du lait o c y t o c i q u e de brebis, du lait de chèvre et de truie renferment l'oligosaccharide a.
L'oligosaccharide c a été isolé à partir des sommets de G D P M et de G D P F du lait de truie.
L e s oligosaccharides a et c ont été obtenus en quantités trop faibles pour qu'il ait été possible d'étudier leur composition.
Enfin, nous a v o n s décelé la présence d'oligosaccharide dans le lait de brebis.
B . — L A G L A N D E M A M M A I R E
I ° Les hexoses : le glucose et le galactose existent à tous les stades gestatifs étudiés ( 7 5e jour — 9 0e jour —• 1 2 0e jour — 1 3 5e jour) dans les d e u x sommets pri- maires correspondant au G D P M et au G D P F , mais le rapport galactose/glucose est supérieur à 1. L e s d e u x hexoses ont été également isolés au cours de la lactation (4 heures, 1 0e jour, 1 5e jour, 5 4e jour) dans les d e u x sommets G D P M et G D P F , mais avec une importance relative plus grande pour le glucose. E n fin de lactation (150e jour, 1 8 0e jour) le galactose n'a pas été détecté, le glucose existe en faibles quantités.
2° Les pentoses : l'arabinose semble localisé dans le s o m m e t de G D P F du frac- tionnement primaire. S a présence est observée pendant la gestation ( 1 2 0e jour, 1 3 5e jour) et a u d é b u t de la lactation (3 heures, 24 heures, 1 5e jour). L e s quantités d'arabinose p e u v e n t être très importantes ; elles égalent celles du fucose et sont supérieures à celles du glucose et du galactose à la 2 4e heure de sécrétion.
U n a u t r e pentose de Rf (glucose) 1,44 en pyridine-acétate d'éthyle-eau, a été détecté dans le G D P F , en fin de gestation et au 1 5e jour de lactation.
30 Les oligosaccharides : au 1 5e jour de la lactation nous avons observé dans le sommet de G D P F l'existence d'un oligosaccharide migrant comme le lactose dans les 3 solvants utilisés (butanol-pyridine-eau ; pyridine-acétate d'éthyle-eau ; butanol acide acétique-eau). L e s quantités isolées étaient trop faibles pour permettre l'étude de sa constitution. N o u s n ' a v o n s p u déceler la présence d'oligosaccharide p e n d a n t la gestation.
D I S C U S S I O N
Différentes techniques ont été utilisées pour isoler et purifier le G D P M et le G D P F : d e u x fractionnements sur colonne à l'aide de gradients d'élution différents, deux adsorptions sur charbons ou un fractionnement sur colonne auquel s'ajoutent une adsorption sur charbon et une chromatographie sur papier ; aucune ne nous a permis de séparer le glucose, le galactose, l'arabinose et les différents oligosaccharides du mannose et du fucose liés au G D P 5 ' .
A la suite de ces résultats il semble logique d'admettre que ces glucides sont
liés au G D P 5' c o m m e le sont le mannose et le fucose ; ainsi, nos recherches abouti- raient à l'isolement des nucléotides suivants : G D P 5' glucose, G D P 5' arabinose, G D P 5' galactose, divers G D P 5' oligosaccharides. De t y p e de liaison existant entre G D P 5' et les glucides ne p e u t être précisé.
Il faut cependant signaler que le glucose et le galactose ont été isolés à partir des d e u x sommets de G D P M et de G D P F , m ê m e si ces derniers sont c o m p l è t e m e n t séparés au cours du fractionnement primaire. D a n s ce dernier cas, il est difficilement concevable que le G D P galactose et le G D P glucose soient élues de la colonne à 2 positions différentes. D ' a u t r e part, si les oligosaccharides existent s u r t o u t d a n s le G D P F , on en t r o u v e également dans le G D P M. Bien que l ' a n a l y s e de la consti- tution de ces oligosaccharides ne soit qu'ébauchée, l'oligosaccharide b étudié renferme s u r t o u t du glucose et du galactose. Il est alors probable q u ' u n e fraction du glucose e t du galactose existants dans les sommets de G D P M et de G D P F p r o v i e n t de la dégradation plus ou moins complète d'oligosaccharides liés a u G D P 5'.
Des études en cours ont pour b u t d'éclairer cette question essentielle, que l'on p e u t poser également p o u r l'arabinose et les autres sucres inconnus détectés.
Il est p r é m a t u r é de discuter le rôle m é t a b o l i q u e de ces divers composés glucidi- ques liés au G D P 5' puisqu'aucune réaction de t r a n s g l y c o s y l a t i o n n ' a été démontrée pour le G D P M et le G D P F . P a r analogie a v e c le rôle des U D P liés à divers glucides, on p e u t penser qu'ils interviendraient dans la biosynthèse des glycoprotéines ou des divers polysaccharides d u lait (produits finis de sécrétion ou intermédiaires dans la synthèse du lactose). A cet égard les laits de truie, de v a c h e , de ratte, de femme, contiennent de n o m b r e u x oligosaccharides tandis que le lait de brebis, à notre connaissance, n'a p a s été étudié.
Reçu en juin i960.
S U M M A R Y
T H E O C C U R E N C E I N M I L K A N D I N T H E M A M M A R Y G L A N D Q? G L U C I D C O M P O U N D S B O U N D T O G U A N O S I N E 5' D I P H O S P H A T E .
A n a l y s i s of t h e acid-soluble n u c l é o t i d e s of milk and of t h e m a m m a r y g l a n d carried o u t at a température around 0 ° C. h a s e n a b l e u s t o i s o l a t e D P G - m a n n o s e and D P G - f u c o s e in tvvo d i s t i n c t p e a k s H and H ' (see figure).
Différent t e c h n i q u e s h a v e b e e n used t o i s o l a t e and purify t h e D P G - m a n n o s e and D P G - fucose : t w o c o l u m n f r a c t i o n n a t i o n s u s i n g différent elution g r a d i e n t s , t w o carbon a d s o r p t i o n s or a c o l u m n fractionnation in c o n j o n c t i o n w i t h one carbon a d s o r p t i o n and paper c h r o m a t o g r a p h y . N o n e enabled u s t o separate g l u c o s e , g a l a c t o s e , arabinose a n d différent oligosaccharides from the 5' D P G - l i n k e d m a n n o s e and fucose. I t therefore s e c m s logical to a d m i t t h a t thèse carbohydrates.
are linked to 5' D P G as are m a n n o s e and fucose. T h e kind of link e x i s t i n g b e t w e e n 5' D P G and c a r b o h y d r a t e s c a n n o t be specified.
R É F É R E N C E S B I B L I O G R A P H I Q U E S
BALLIO A . , CASINOVI C , SERLUPI-CRESCENZI G., 1 9 5 6 . Occurence of free Nucléotides in Pénicillium Chry- sogenum. Biochim. Biophys. acla, 2 0 , 4 1 4 - 4 1 5 .
CABIB E . , LELOIR L . F . , 1 9 5 4 . Guanosine diphosphate Mannose. / . Biol. Chem., 2 0 6 , 7 7 9 - 7 9 0 . CONSDEN R . , STANIER W . M., 1 9 5 2 . Ionophoresis of sugars on paper and some applications to the analyses
of protein saccharides complex. Nature, 1 6 9 , 7 8 3 - 7 8 5 .
DENAMUR R . , FAUCONNEAU G., GUNTZ G., 1 9 5 8 . Isolement d'un nouveau nucléotide dans le lait de . Brebis : Le guanosine 5 ' diphosphate fucose. C. R. Acad. Sci., 2 4 6 , 2 8 2 0 - 2 8 2 3 .
C O M P O S É S G L U C I D I Q U E S L I É S A U G D P 5' 79 DENAMUR R . , FAUCONNEAU G., GUNTZ G., 1 9 5 8 . Les nucléotides liés aux glucides dans le lait. Congrès
Int. Biochimie (Vienne).
DENAMUR R . , FAUCONNEAU G., GUNTZ G., 1 9 5 9 . Les nucléotides acido-solubles des laits de Brebis, Vache, Chèvre et Truie. Rev. esp. FisioL, 1 5 , 3 0 1 - 3 1 0 .
DENAMUR R . , FAUCONNEAU G., GUNTZ G., 1 9 5 9 . Les nucléotides acido-solubles de la glande mammaire de Brebis. C. R. Acad. Sci., 2 4 8 , 2 5 3 1 - 2 5 3 3 .
GINSBURG V., KIRKMAN H. N . , 1 9 5 8 . Isolation of guanosine diphosphate fucose from Aerobacler Aeroge- nes. J. Amer. Chem. Soc, 8 0 , 3 4 8 1 .
HEATH E . C , i 9 6 0 . The isolation of guanosine diphosphate Colitose from Escherichia Coll. Biochem.
Biophys. Acla, 3 9 , 3 7 7 - 3 7 8 .
HURLBERT R . B., SCIIMITZ H . , BRUMM A. F . , POTTER V. R . , 1 9 5 4 . Nucleotide Metabolism. II Chromato- graphic séparation of Acido-solubles nucléotides. / . Biol. Chem., 2 0 9 , 2 3 - 3 7 .
PALADINI A. C , LELOIR L . F . , 1 9 5 2 . Studies on Uridine diphosphate glucose. Biochem. J. 5 1 , 4 2 6 - 4 3 0 . PONTIS II. G.., 1 9 5 7 . A new guanosine nucleotide from brewer's yeast. Biochem. Biophvs. Acla, 2 5 , 4 1 7 -
4 2 8 .
PONTIS G. H., JAMES A. L., BADDILEY J . , 1 9 5 9 . Guanosine diphosphate glucose and guanosine diphosphate fructose in Eremothecium Ashbyi. Biochem. Biophys. Acla, 3 3 , 5 8 8 - 5 8 9 .
STROMINGER J . L., 1 9 5 5 . Uridine diphosphate Acetylglucosanine phosphate and Uridinediphosphate Acc- tylgalactosanine sulfate. Biochem. Biophys. Acla., 11, 2 8 3 - 2 8 5 .
