Diagnostic du paludisme : apports des tests de détection antigénique sur bandelette

e paludisme est une des maladies infectieuses les plus meurtrières au monde. Rien qu’en Afrique, Plasmo- dium falciparum est responsable d’au moins un mil- lion de morts par an. Pour les personnes non immunes infec- tées par P. falciparum et non traitées, la létalité varie de 1-2 % à plus de 20 % (1). En 1998, dans le Nord-Est du Kenya, après deux années de sécheresse, les inondations dues à El Niño ont provoqué une épidémie dont le taux brut de mortalité a été estimé, pour la seule ville de Wajir (60 000 habitants), pendant une période de 2 mois, à 9,4 décès quotidiens pour 10 000 habi- tants, soit un total de plus de 3 500 morts (2).

Le diagnostic du paludisme repose sur la mise en évidence du parasite lors de l’examen microscopique d’un prélèvement san- guin (frottis, goutte épaisse). Depuis plus d’un siècle, date de la découverte de l’hématozoaire par Alphonse Laveran (pre- mier Français lauréat du prix Nobel de médecine en 1907), la technique n’a que peu évolué. Si les colorants modernes tels que les colorants de Field (RAL^®, Diff-Quick^®) agissent en quelques minutes, alors que le classique Giemsa nécessite plu- sieurs dizaines de minutes, le temps de lecture des lames reste inchangé. Il faut toujours compter au moins 20 minutes d’exa- men avant de rendre un frottis négatif. Bien que cette technique soit facile à mettre en œuvre, il faut souligner qu’elle nécessite un personnel expérimenté, un matériel fragile et un temps d’exa- men non négligeable. La recherche de nouveaux tests dia- gnostiques, plus simples à mettre en œuvre, est devenue un axe essentiel de la stratégie de la lutte contre le paludisme menée par l’OMS (3).

NOUVEAUX TESTS

De nouveaux tests biologiques, disponibles depuis peu, pour- raient répondre à ce besoin. Le principe de ces tests repose sur la détection sanguine d’antigènes spécifiques de Plasmodium.

Il s’agit d’une réaction immunochromatographique sur bande- lette de nitrocellulose. Le test fait intervenir deux anticorps, spé- cifiques de l’antigène parasitaire à détecter. Le premier anticorps est immobilisé sur la bandelette : c’est l’anticorps qui va fixer l’antigène parasitaire (anticorps récepteur). Le deuxième anti- corps est couplé à un colorant (anticorps révélateur). Soit il migre le long de la bandelette jusqu’au premier anticorps en même temps que l’échantillon sanguin (ICT Malaria Pf^®), soit l’échan- tillon sanguin migre vers l’anticorps récepteur, et dans un deuxième temps, c’est au tour du réactif contenant l’anticorps révélateur de migrer vers l’anticorps récepteur (ParaSight^®-F).

Si l’échantillon contient l’antigène parasitaire, le complexe anti- corps révélateur-antigène-anticorps récepteur définit une bande visible à l’œil nu. La réalisation du test nécessite un ou plusieurs réactifs, séparés ou associés (réactif de lyse, de migration, de révé- lation, de lavage). Dans tous les cas, le diagnostic est obtenu en moins de 15 minutes (10-15 minutes). Comparables pour leur réa- lisation et leur lecture aux tests de grossesse, ces tests diagnos- tiques peuvent être effectués par un personnel non spécialisé.

On peut classer ces tests en deux catégories : ceux qui détectent une glycoprotéine spécifique de P. falciparum (HRP-2 : Histi- din Rich Protein 2) et ceux qui détectent les isoenzymes de la lactate déshydrogénase (LDH). Cette deuxième catégorie de test détecte à la fois la LDH du genre Plasmodium (pLDH) et la LDH spécifique de P. falciparum (pfLDH).

Tous ces tests peuvent être réalisés à partir de sang capillaire ou veineux (tubes avec EDTA ou héparine).

Diagnostic du paludisme :

apports des tests de détection antigénique sur bandelette

!A. Paugam*

*Laboratoire de parasitologie-mycologie, hôpital Cochin, Paris.

RÉSUMÉ. Depuis quelques années, de nouveaux tests diagnostiques du paludisme sont disponibles. Ils reposent sur la détection de protéines spécifiques de P. falciparum (ParaSight^®-F ; ICT Malaria Pf^®), voire de P. falciparum et P. vivax (OptiMAL^®). Simples de réalisation, ces tests peuvent être pratiqués par un personnel non spécialisé. À partir de quelques microlitres de sang et en moins de 15 minutes, le résultat est apprécié à l’œil nu par l’apparition ou non d’une bande spécifique sur une bandelette de nitrocellulose. Si la sensibilité de ces tests est comparable à celle du frottis sanguin, elle reste inférieure à celle de la goutte épaisse. De plus, leur spécificité, actuellement réduite à une ou deux espèces de Plasmodium, et l’absence de quantification de la densité parasitaire font que ces tests ne peuvent remplacer l’examen micro- scopique qui reste la technique de référence pour le diagnostic du paludisme. Toutefois, en l’absence de laboratoire, de personnel expérimen- té ou en cas d’épidémie, ces tests sont un apport essentiel dans la lutte contre le paludisme.

Mots-clés : Paludisme - Plasmodium falciparum - ICT Malaria Pf^®- ParaSight^®-F -OptiMAL^®.

L

Détection d’HRP-2

En France, deux tests sont disponibles : le ParaSight®-F (Becton Dickinson, Meylan, France) et l’ICT Malaria Pf^® (Fumouze, Levallois-Perret, France) (figure 1).En termes d’uti- lisation, la principale différence entre ces tests concerne la tem- pérature de conservation des kits : 37 °C pour ParaSight^®-F et + 2 à + 8 °C pour ICT Malaria Pf^®. Après environ dix minutes de manipulation, la présence de l’HRP-2 se traduit par l’appa- rition d’un trait rose, visible à l’œil nu, soit sur une bandelette

“libre” (ParaSight^®-F), soit sur une bandelette enchâssée dans une carte-test (ICT Malaria Pf^®). L’apparition d’une bande témoin, garantissant la bonne exécution du test, est nécessaire à toute interprétation du test. Lorsque l’on compare les résul- tats obtenus avec le ParaSight^®-F et l’ICT Malaria Pf^®, ceux-ci apparaissent similaires (4).

Détection de LDH

Un seul test est commercialisé (non disponible en France) : l’OptiMAL^®(Flow Inc, États-Unis) (figure 2).Le résultat est obtenu en une dizaine de minutes. Selon la localisation de la bande de détection sur la bandelette, le test permet de distin- guer les LDH spécifiques de P. falciparum (pfLDH) de celles spécifiques du genre Plasmodium (pLDH) (figure 2).En fait, selon différentes études d’évaluation, la LDH dite du genre Plasmodium n’apparaît détectable que s’il s’agit des espèces falciparum et vivax. D’ailleurs, pour le fabricant, la détection se limite à P. falciparum et P. vivax. Lorsque le test détecte P. falciparum, deux bandes sont visibles (pLDH et pfLDH), et lorsque le test détecte P. vivax, une seule bande apparaît (pLDH). Comme pour les tests précédents, l’apparition d’une bande témoin, garantissant la bonne exécution du test, est néces- saire à toute interprétation.

Ces différents tests ont été évalués en prenant le diagnostic microscopique comme référence (frottis et goutte épaisse).

Faux négatifs

!Faible parasitémie. La sensibilité des tests varie en fonction de la parasitémie. Globalement, on peut considérer que leur sensibilité est comparable à celle obtenue avec un frottis san- guin. En dessous de 100 parasites/µl, il y a une nette diminu- tion de la détection (5, 6)(tableau I).Le seuil de détection de ces techniques ne permet pas de détecter les faibles parasité- mies (5-20 p/µl), dont le diagnostic n’est possible que par l’exa- men microscopique par la technique de la goutte épaisse.

ParaSight -F^®

Positif Négatif

Positif Négatif

C HRP-2 P. falciparum

P. falciparum

ICT Malaria Pf^®

c T

c T

C : contrôle de réaction T : test

Figure 1.Repré- sentation sché- matique des tests de détec- tion de l’anti- gène HRP-2 (Histidine-Rich Protein 2).

Positif Positif Négatif

C pfLDH pLDH

P. falciparum P. vivax

OptiMAL^®

Figure 1.Représentation schématique du test de détection des iso- enzymes de LDH (lactase déshydrogénase).

Tableau I.Sensibilité des tests en fonction de la parasitémie (5, 6).

Parasitémie Sensibilité des tests

(parasite/µl) OptiMAL^® P. falciparum

P. falciparum P. vivax ICT Malaria Pf^® ParaSight^®-F

100 54 % (12/22) 61 % (24/39) 71,4 % (15/22) 71,4 % (15/22)

> 100 92,8 % (13/14) 93,4 % (43/46) 96,4 % (55/57) 100 % (57/57)

!Forte parasitémie. Récemment, une publication a fait état d’un test ParaSight^®-F négatif chez un malade symptomatique pour lequel la microscopie avait retrouvé 30 % d’hématies para- sitées par P. falciparum (7). D’autres études ont également rap- porté des négativités pour des parasitémies élevées, que ce soit pour la détection d’HRP-2 ou de LDH. Ces parasitémies étaient nettement au-dessus du seuil de détection : 1 000 parasites/µl (8) : 1 400 p/µl (9), 8 480 p/µl (10), 20 000 p/µl (11). Il faut noter que la répétition du test à un jour d’intervalle (9), ou encore la dilution de l’échantillon (7) ont pu parfois permettre de lever la fausse négativité des tests. Toutefois, la raison de ces faux négatifs reste obscure. Parmi les différentes hypothèses avancées, la possibilité de souches déficitaires en HRP-2 a été confirmée par l’étude de neuf isolats de P. falciparum provenant du Mali et issues de malades pour lesquels le Para- Sight^®-F était négatif. Pour six de ces neuf souches, le gène HRP-2 n’a pas été détecté par PCR (12).

Faux positifs

!Circulation prolongée de l’antigénémie. Le suivi en paral- lèle, par microscopie et détection de l’antigène HRP-2, de malades infectés par P. falciparum et traités, a mis en évidence une détection prolongée d’HRP-2, après disparition de la para- sitémie. Cette détection a pu être observée plus de 15 jours après la négativité microscopique (13). La circulation prolongée d’HRP-2 ne permet pas d’utiliser ces tests pour surveiller l’évo- lution d’un traitement ou pour détecter les souches résistantes de P. falciparum. En revanche, la détection de LDH, bien cor- rélée avec la parasitémie, semble adaptée au dépistage de résis- tances aux antipaludéens (14).

!Facteur rhumatoïde. Le facteur rhumatoïde (FR) a été rapi- dement identifié comme pouvant être à l’origine de fausses positivités (15, 16). Bien que ces faux positifs aient été rap- portés pour tous les tests, leur fréquence varie selon la nature du test. Sur 79 prélèvements sanguins positifs pour le FR, issus d’autant d’individus (sans antécédents de paludisme, non ori- ginaires de zone d’endémie et n’ayant pas séjourné en zone d’endémie depuis au moins 5 ans), les pourcentages de fausses positivités observés avec les tests ParaSight^®-F, ICT Malaria Pf^® et OptiMAL^® sont respectivement de 19 %, 8 % et 4% (17).

Pour expliquer le plus faible pourcentage de fausses positivi- tés avec l’ICT Malaria Pf^®par rapport au ParaSight^®-F, qui détectent le même antigène, la nature du premier anticorps a

été évoquée : respectivement IgM et lgG (18). Ces différences de fréquence de fausses positivités selon la nature du test ont récemment été confirmées par une étude portant sur 133 échan- tillons sanguins positifs pour le facteur rhumatoïde et sans infec- tion palustre, 26 % étaient positifs pour le test ICT Malaria Pf^® et 3,5 % pour le test OptiMAL^®(19). Les principales caracté- ristiques de ces tests sont résumées par le tableau II.

UTILISATION DES TESTS EN ZONE D’ENDÉMIE

En zone d’endémie, le manque de structures médicalisées et le manque de personnel qualifié limitent le recours au diagnostic microscopique du paludisme et favorisent les traitements pré- somptifs devant tout syndrome fébrile. Ces traitements géné- ralisés, à l’aveugle, contribuent à sélectionner des souches de P. falciparum résistantes à des molécules, par ailleurs de plus en plus coûteuses, sans compter qu’ils retardent d’autant la recherche du bon diagnostic. C’est pour ces raisons que l’OMS préconise la mise au point de tests biologiques simples, moins contraignants que la microscopie (3). En zone de transmission, le manque de sensibilité des tests de détection antigéniques apparaît moins crucial que pour le diagnostic d’importation puisque, dans les populations ayant une prémunition vis-à-vis du paludisme, les seuils de parasitémie à l’origine de la symp- tomatologie sont plus élevés que dans une population non immune (20). En revanche, l’absence quasi totale de quantifi- cation du résultat est un inconvénient par rapport à la micro- scopie. Une interprétation semi-quantitative, selon l’aspect de la bande (plus ou moins nette), ne donne qu’une faible corré- lation avec la parasitémie. La persistance de l’antigène HRP-2 plusieurs semaines après disparition de la parasitémie ne per- met pas de détecter les résistances de P. falciparum au traite- ment. Mais, par ailleurs, cette circulation prolongée de l’anti- gène HRP-2, détectable en l’absence de parasitémie, semble être un atout pour le dépistage du paludisme chez la femme enceinte. L’infection par P. falciparum au cours de la grossesse, rarement responsable de paludisme congénital, accroît le risque de prématurité et de petit poids de naissance. Pour ces femmes, asymptomatiques pour la plupart, l’examen microscopique de sang périphérique ne permet de dépister que 80 % des cas. Pour une femme sur cinq, le diagnostic n’est porté qu’à l’accouche- ment par mise en évidence microscopique du parasite sur frot- tis placentaire. Dans une étude prospective réalisée au Came-

Tableau II. Principales caractéristiques des tests de détection d’antigène plasmo- dial par immunochromato- graphie sur bandelette.

Caractéristique ParaSight^®-F ICT Malaria Pf^® OptiMAL^®

Nature de l’antigène détecté Glycoprotéine : HRP-2 Enzymes : LDH

Espèce plasmodiale diagnostiquée P. falciparum P. falciparum et P. vivax

Volume de sang par test 50 µl 10 µl 10 µl

Fausse positivité avec le FR* +++ ++ +

Surveillance du traitement Non Oui

Commercialisation en France Oui Non

*FR : facteur rhumatoïde.

roun pour 181 femmes enceintes (21), l’infection par P. falci- parum a été recherchée dans le sang périphérique par examen microscopique (frottis, goutte épaisse) et par détection antigé- nique d’HRP-2 (ICT Malaria Pf^®). À l’accouchement, des frottis placentaires étaient systématiquement réalisés. On a diagnostiqué une infection à P. falciparum chez 64 femmes.

Cinquante-quatre ont pu être dépistées par la microscopie du sang périphérique, alors que pour dix, seuls les frottis de sang placentaires ont permis le diagnostic. L’ICT Malaria Pf^®a per- mis de dépister 59 des 64 cas. Dans cette indication, si la détec- tion antigénique n’apparaît que modérément plus sensible que la microscopie (89 % versus 84 %), l’association ICT Mala- ria Pf^®et microscopie permet d’obtenir une sensibilité de 93,8 %.

Le plus grand obstacle à l’utilisation de ces tests reste leur coût, variable selon les pays mais en moyenne compris entre 2 et 10 dollars le test, alors que l’OMS préconise un coût inférieur à 0,4 dollar pour inclure véritablement ces tests dans la straté- gie de lutte contre P. falciparum (18). D’ores et déjà, deux tests de détection d’HRP-2 sont commercialisés à moins de 1 dol- lar, comme le “Paracheck Pf”, de fabrication indienne (Nos- ten F. Shoklo Malaria Reseach Unit, Thailand, communication personnelle) et le PATH Falciparum Malaria^®test (22).

UTILISATION POUR LE DIAGNOSTIC DE PALUDISME D’IMPORTATION

D’après différentes études, la sensibilité et la spécificité des tests de détection antigéniques restent, là encore, inférieures à la microscopie (23, 24)(tableau III).En France, ces tests sont encore peu répandus, comme en témoignent les extraits sui- vants concernant le diagnostic biologique du paludisme, issus de la conférence de consensus de la Société de pathologie infec- tieuse de langue française (SPILF) de 1999 consacrée à la prise en charge et à la prévention du paludisme d’importation à P. fal- ciparum (25) : “Le jury propose la technique du frottis sanguin en première intention pour le diagnostic du paludisme [...]. La goutte épaisse, plus sensible, est l’examen de référence, mais sa lecture est plus délicate [...]. Les autres techniques (telles que la détection d’antigènes solubles spécifiques de P. falcipa- rum) ne sont pratiquement pas utilisées dans les laboratoires polyvalents du fait de leur coût et de leur non-remboursement par la Sécurité sociale. Par contre, dans les services spéciali- sés, elles peuvent être un apport au diagnostic immédiat de P. falciparum, soit une aide à un diagnostic rétrospectif”. Bien que cette dernière phrase n’ait pas été explicitée, il nous semble licite de proposer les indications suivantes d’utilisation des tests pour le diagnostic immédiat et rétrospectif pour un laboratoire

spécialisé comme cela a été énoncé par la conférence de consen- sus. Pour le diagnostic immédiat, le manque de sensibilité de ces tests en cas de faibles parasitémies limite d’autant leur seule utilisation en première intention ; aussi ne peuvent-ils être qu’un complément du diagnostic microscopique, par exemple, lorsque le diagnostic microscopique d’espèce est difficile (absence de gamétocytes et parasites asexués en trop faible nombre pour conclure sur l’aspect général du frottis ; morphologie parasi- taire altérée ou pouvant avoir été altérée par une chimiopro- phylaxie antipaludéenne). Pour le diagnostic rétrospectif, la persistance prolongée de l’antigène HRP-2 peut permettre un diagnostic à distance de l’accès lorsque la parasitémie n’est plus détectable par microscopie ; ce diagnostic rétrospectif anti- génique a l’avantage d’une réponse plus rapide que la classique sérologie.

UTILISATION PAR LE VOYAGEUR

Les séjours touristiques en zones d’endémies palustres sont de plus en plus fréquents. Les voyageurs peuvent désormais choi- sir des destinations très éloignées de toute structure médicale.

Dans ces situations, compte tenu des résistances de P. falcipa- rum aux principaux antipaludéens et de la gravité potentielle de l’infection, il est fréquent que le voyageur bénéficie, en plus des recommandations générales concernant la prophylaxie des piqûres de moustiques et du traitement prophylactique médi- camenteux, de la prescription d’un traitement curatif à utiliser en cas de fièvre. Dans ces situations, la question de l’intérêt de l’utilisation des tests de détection antigénique par le voyageur a rapidement été posée. Différentes études prospectives ont évalué l’utilisation des tests antigéniques comme moyen d’autodiagnostic pour le voyageur. Quel que soit le test utilisé, celui-ci nécessite un prélèvement sanguin. Les difficultés ren- contrées pour recueillir le sang et remplir le tube capillaire sont le principal obstacle à la réalisation du test. Cela peut expliquer jusqu’à 71 % (22/31) des échecs techniques rapportés par les voyageurs (26). L’utilisation du ParaSight^®-F, en consultation, par le médecin, a confirmé la difficulté de recueil des 50 µl de sang total. Sur 140 prélèvements, pour 42 (30 %), le médecin a dû s’y prendre à deux fois pour remplir le capillaire (27). Plus généralement, les défauts de manipulation des tests sont, en grande partie, à rapporter à la mauvaise compréhension des notices rédigées par les fabricants. Si l’on fournit un mode d’emploi adapté aux touristes (sans termes techniques et en tenant compte des remarques des utilisateurs) (28), si l’on asso- cie instructions écrites et orales en remettant le kit au voyageur (29), les proportions d’échec ne sont plus que de l’ordre de 9 % à 10 % respectivement, alors qu’elles peuvent atteindre 25 (29)

Tableau III.Paludisme d’impor- tation : performances comparées du ParaSight^®-F et de l’ICT Malaria Pf^® par rapport à la microscopie (23, 24).

Paramètre ParaSight^®-F ICT Malaria Pf^® ParaSight^®-F ICT Malaria Pf^®

Sensibilité 95 % (116/122) 95 % (116/122) 96 % (51/53) 96 % (51/53)

Spécificité 90 % (116/129) 89 % (115/129) 6 % (95/99) 98 % (99/101)

à 32 % (26) si la notice du fabricant est fournie sans explica- tion. L’utilisation de vidéo pourrait encore abaisser les erreurs.

Enfin, les difficultés d’interprétation des tests en cas de faible (< 0,1 % d’hématies parasitées) ou de forte parasitémie (> 2 %) limitent d’autant l’utilisation de ces tests par le voyageur (30).

CONCLUSION

Les tests de détection antigénique par immunochromatogra- phie sur bandelette ne peuvent prétendre remplacer le diagnostic microscopique. Ils sont moins sensibles que la goutte épaisse, ne sont pas ou peu quantitatifs et ne permettent le diagnostic que d’une (P. falciparum) ou deux (P. falciparum et P. vivax) espèces. Toutefois, leur sensibilité, proche de celle obtenue par frottis, permet un diagnostic rapide de P. falciparum, même par un personnel peu qualifié et dans un environnement démuni de toute structure sanitaire. La commercialisation de tests à moins d’un dollar peut permettre d’envisager l’utilisation de ces tests dans la stratégie de lutte contre le paludisme, en limitant notam- ment les traitements injustifiés, qui retardent d’autant les vrais diagnostics et qui participent, par la prescription d’antipalu- déens de plus en plus coûteux et inutiles, à la progression de la résistance des antipaludéens vis-à-vis de P. falciparum. "

R É F É R E N C E S B I B L I O G R A P H I Q U E S

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? ?

?

I.

F o r m a t i o n M é d i c a l e C o n t i n u e

M C

a. 0 à 1 % b.1 à 20 % c. 20 à 40 % d.40 à 60 % e. 60 à 80 %

a. permettent également le diagnostic des trois autres espèces de Plasmodium b.nécessitent une prise de sang par ponction veineuse

c. peuvent être réalisés en l’absence de toute structure sanitaire

d.peuvent être faussement négatifs en raison de l’existence d’une souche de P. falciparumdéficitaire en HRP-2

e. peuvent être positifs alors que la parasitémie a disparu à l’examen microscopique

a. permet le diagnostic des quatre espèces de Plasmodium b.permet seulement le diagnostic de P. falciparumet P. vivax

c. peut détecter les souches de P. falciparumrésistantes au traitement d.est négatif lorsque la parasitémie est indétectable par la microscopie

e. est moins sensible au facteur rhumatoïde (fausse positivité) que les tests de détection d’HRP-2

Voir réponses page 251

II.

(ParaSight^®-F, ICT Malaria Pf^®) :

III.

?

b.peut être responsable d’un petit poids à la naissance

c. n’est parfois diagnostiquée que sur le frottis de sang placentaire d.peut être responsable de prématurité

e. semble plus souvent diagnostiquée par la détection dans le sang périphérique de l’antigène HRP-2 que par la mise en évidence microscopique du parasite

IV.

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