Etude de la performance des tannins condensés du thé vert dans la complexation de quelques perturbateurs endocriniens: application capteur.

Ministère de L’Enseignement Supérieur et de La Recherche Scientifique

Université Mohammed Seddik Benyahia – Jijel Faculté des Sciences et de la Technologie

Département de Génie des Procédés

Mémoire de Fin d’Études

Présenté par :

BELHOUL Meriem BOUHEBILA Faiza

En vue de l’obtention du diplôme :

Master en Science et Génie de l’Environnement

Option : Génie des Procédés de l’Environnement

Thème Thème

Encadrant : ZAAOUA Ali Professeur

Président : SFAKSI Zoubida Docteur Examinateur : ABBACI Amina Docteur

Année Universitaire 2019/2020

Etude de la performance des tannins condensés du thé vert dans la complexation de quelques perturbateurs endocriniens ;

Application capteur

Remerciements

Nos remerciements vont premièrement à Dieu, le tout puissant, qui nous a donné la force, la volonté et surtout le courage pour pouvoir

finir ce travail.

Pour notre encadrant Mr ZAZOUA Ali, Professeur au département de Génie des procédés à l’université de Jijel, pour tous

ses conseils scientifiques, ses encouragements tout au long du déroulement de ce travail.

Nos remerciements s’étendent aussi aux membres de jury pour avoir accepté d’examiner et juger ce mémoire.

Nous remercions également SEFARI Wassila et Halim Rabiaa, doctorantes en génie de l’environnement pour leurs disponibilités,

leurs aides, leurs conseils et encouragements.

Nous remercions tous les techniciens et les ingénieurs des laboratoires de la spécialité.

Finalement, pour tous ceux qui nous ont aidés de près ou de loin, Grand merci

Dédicace

Je tiens, en premier lieu, à remercier Dieu de m’avoir permis d’être là où j’en suis aujourd’hui et de m’avoir donné la patience et le courage

pour traverser tous les moments difficiles.

A ma chère mère Leila pour tous ses sacrifices, son amour et son soutien tout au long de mes études, merci maman,

A mon cher père Nadjib, merci papa pour ton encouragement et pour tout ce que tu as fait pour moi,

A Ma chère sœur Fatma Zohra, A mes frères Badis et Amine,

A toute ma famille,

A mon amie et camarade de travail, Faiza pour sa compréhension, son aide, et sa collaboration avec moi,

A tous mes amies et mes collègues pour tous les bons moments qu’on a vécus ensemble, ils resteront à jamais gravés dans ma mémoire,

A tous ceux que j’aime et ceux qui m’aiment, Je vous remercie tous.

Meriem BELHOUL

Dédicace

Je dédie ce travail :

A La mémoire de ma chère mama Zakia ( هتانج حيسف اهنكسا و هللا اهمحر ) que je convoite son éternel contentement.

A mon cher père Tahar pour son soutien incessant

A mes frères et soeurs et leurs maris et épouses

A mon cher mari Hicham et mes lumières Mohamed-Salah, Dania et Hiba (mes enfants et les prunelles de mes yeux)

A mes amies et confrères à l’université ou ailleurs

BOUHEBILA Faiza

Introduction Générale

Chapitre 1

Généralités sur les perturbateurs endocriniens et les capteurs électrochimiques

I. Perturbateurs endocriniens et environnement ……….……3

I.1 Le système endocrinien ……….……….………….…...3

I.2 Les perturbateurs endocriniens……….………..……….………4

I.3 Classification des perturbateurs endocriniens………...……....……….………....….4

I.3.1 Les substances naturelles……….………...………..……4

I.3.2 Les substances de synthèses……….……4

I.3.3 Les substances anthropiques……….………..………...…..5

I.3.4 Les principales sources des perturbateurs endocriniens…………..……….5

I.4 Mécanisme d’action………...……….6

I.4.1 Imitation d’action des hormones endogènes (effet agoniste)………...………6

I.4.2 Inhibition les interactions entre les hormones et leurs récepteurs (effet antagoniste)…...6

I.4.3 Action sur la synthèse, le transport, le métabolisme et l'excrétion des hormones…….…..7

I.4.4 Altération de développement des récepteurs hormonaux et leurs fonctions………...7

I.4.5 Altération des fonctions par des interactions avec les hormones………...…….8

I.5 Les effets des perturbateurs endocriniens……….……….8

I.5.1 L’âge d’exposition……….………….……8

I.5.2 Le temps écoulé entre l’exposition et ses effets………..………….…..8

I.5.3 La dynamique de réponse à la dose………...……..……...9

I.5.5 Maladies fréquentes causées par les PE………9

I.5.5.1 Cancers hormono-dépendants………..9

I.5.5.2 Troubles du système reproductif des hommes et des femmes……..………...9

I.6 Le Résorcinol (le PE à détecter) ………..……….…..10

I.6.1 Structure et propriétés physico-chimique……….……….……….…11

I.6.2 Sources et utilisation de résorcinol……….………11

I.6.3 Principaux effets du résorcinol……….………..11

I.6.4 Méthodes analytique pour la détection de résorcinol………..……….12

I.7 Les Capteurs (définition)……...………...13

I.7.1 Structure d’un capteur chimique………..………..14

I.7.2 Différents modes et types de capteurs……….………...14

I .7.2.1 Capteurs optiques………...14

I.7.2.2 Capteurs thermiques………..………..15

I.7.2.3 Capteurs mécaniques……….………..15

I.7.2.4 Capteurs électrochimiques……….……….……….………15

a. Capteurs potentiométriques ……….………16

b. Capteurs ampérométriques……….…..16

c. Capteurs conductimétriques……….17

d. Capteur impédimètrique………...17

I.7.3 Caractéristiques principales d’un capteur……….………..18

I.7.4 Méthodes électrochimiques de caractérisation….………..………18

I.7.4.1 Voltammétrie cyclique……….………...….19

I.7.4.1.1 Système réversible……….………....19

I.7.4.1.2 Système irréversible…….……….…19

I.7.4.2 Voltammétrie à ondes carrées………..………….………20

I.8 Les métabolites secondaires………21

I.8.1 Les Tanins……….……….21

I.8.2 Tanins condensés………...…………22

I.8.3 Propriétés physico-chimiques des tanins……...………..………..24

Chapitre 2 Extraction et caractérisation phytochimique II. Introduction………25

II.1 Macération et extraction………..……….……….25

II.2 Rendement d’extraction………27

II.3 Test phytochimique………...27

II.3.1 Réaction de caractérisation (Screening phytochimique)………..………28

a) Solution à analyser : préparation de l’infusé à 5% ………..……28

b) Teste phytochimiques ………..28

II.4 Dosage des tanins condensés………...………....……….29

II.5 Traitement de gélification………...………..30

II.5.1 Protocole de gélification………..………...………..30

II.6 Le pH de point isoélectrique (pH PZC)……….………...30

II.7 Caractérisation du tanin……….………...……31

II.7.1 Caractérisation par infrarouge FTIR………..………..31

II.7.1.1 Mode opératoire……….………..31

II.7.1.2 Acquisition des spectres d'absorption FTIR………31

II.8 Matériels pratiques utilisés………32

II.8.1 Capteur électrochimique………...……….32

II.8.1.1 Préparation des électrodes (Nettoyage)……….………..………32

II.8.1.2 Fonctionnalisation des électrodes……….……...………32

II.8.1.3 Caractérisation électrochimique de l’électrode tanin-agar/Au………33

II.8.1.4 Elaboration du capteur tanins-agar/Au………...……….35

II.8.1.5 Caractérisation électrochimique……….……….35

Chapitre 3 Résultats et discussions III. Introduction……….…….……….…………36

III.1 Caractérisation de molécules bioactives extraites de thé vert……...……….………..36

III.1.1 Rendement d’extraction………..……….…………36

III.2 Tests phytochimiques………..……….………37

III.3 Dosage des tanins condensés………..……….………….37

III.4 Le pH de point isoélectrique (pH PZC)………...……….……38

III.5 Caractérisation du tanin condensé………..……..……39

III.5.1 Caractérisation par infrarouge FTIR………39

III.5.2 Caractérisation par chromatographie en phase liquide à haute performance HPLC...40

III.5.3 Tentative d’identification………...……….……….41

III.5.4 Résultants d’application capteur………...………..……….……44

III.5.4.1 Efficacité de nettoyage des électrodes…………..……….…….…………...……44

III.5. 5 Sensibilité du capteur tanin-agar/Au………..………45

III.5. 5.2 La courbe de calibration de la voltamétrie cyclique……….……….46 III.5.5.3 Voltammétrie à ondes carrées SWV………...…………47 III.6. 5.3.1 Courbe de calibration de la voltamétrie à ondes carrées SWV…………48 III.6 Réaction électrochimique interface électrode -solution………….……….……..……49 III.7 Le mécanisme proposé……….………..…...………49 Conclusion et perspectives

Figure I.1 : Les glandes du système endocrinien chez l’être humain………3

Figure I.2 Effet agoniste des perturbateurs endocriniens……….…………6

Figure I.3Effet antagoniste des perturbateurs endocriniens………..…………..………..7

Figure I.4 Effet de blocage des perturbateurs endocriniens………….…………..…………..7

Figure I.5 Principe de fonctionnement d’un biocapteur……….………….13

Figure I.6 : Principe de mesure potentiométrique : accumulation de charges électriques à la surface de l’électrode indicatrice………..…………16

Figure I.7 : Schéma de principe des mesures impédimètrique………17

Figure I.8 : Représentation d’un voltammogramme cyclique……….19

Figure I.9 : Schéma de mesure pour la voltammétrie à ondes carrées……….……20

Figure. I.10. Structures des tanins hydrolysables………22

Figure. I.11. Structures du monomère flavanique……….……….22

Figure. I.12 La structure des tanins condensés……….……….23

Figure II.1 Protocole d’extraction des tanins condensés……….………26

Figure II.2 Résultats du dosage des tanins condensés………..……….29

Figure II.3 : Schéma du dispositif expérimental pour les mesures électrochimiques……….33

Figure II.4 Schéma de la cellule électrochimique à trois électrodes………..….34

Figure II.5 Dispositif de mesure électrochimique……….….34

Figure III.1 Point de charge nulle de bio adsorbant préparé……….38

Figure III.2 Analyse Infrarouge de l’échantillon………..……….39

Figure. III. 3 : Chromatogramme HPLC standard de l’extrais de thé vert………41

Figure. III. 4 : Chromatogramme HPLC de l’extrais de thé vert………..……….43

Figure III.6 Voltammogrammes cycliques pour différentes concentrations en résorcinol, dans 50 mM de PBS (pH 7)………..……….45 Figure III.7 Voltammogrammes cycliques pour différentes concentrations en résorcinol, dans 50 mM de PBS courant cathodique et anodique (pH 7)………...………46 Figure III.8 Les courbes de calibration de la voltammetrie cyclique ………...46 Figure III.9 Voltammogrammes à ondes carrées pour différentes concentrations en résorcinol, dans 50 mM de PBS (pH 7)………..….47 Figure III.10 Les courbes de calibration de la voltammetrie à ondes carrées ……….48 Figure III.11 Différentes étapes d’une réaction électrochimique………49 Figure III .12 Spectres IR-TF de la résorcine dans un milieu neutre (a), milieu acide (pH=1,2) (b), et milieu basique (pH=8,6) (c)………..50 Figure III .13 Oxydation de résorcinol………51 Figure III.14 Mécanisme réactionnel proposé……….51

Tableau I.1 : Sources principales des Perturbateurs endocrinien………..………5

Tableau I.2 : Propriétés physico-chimique du Résorcinol………..……….11

Tableau II.1 : tests phytochimique ………27

Tableau III.1 : Le rendement d’extraction………..36

Tableau III.2 : Métabolites secondaires mis en évidence au niveau de thé vert………….…37

Tableau III.3 : Temps de rétention des témoins utilisés en HPLC……….42

UV: Ultra violet IR: Infrarouge nm: Nanométre μl: microlitre g: Gramme

HCl: Acide chlorhydrique FeCl 3: Trichlorure de fer mV: millivolte

SWV: voltamétrie à onde carrée rpm: tour par minute

mM: milli molaire nM: Nano molaire

PBS: phosphate buffered saline

Introduction générale

A partir du début du 20ème siècle, la découverte de nouvelles technologies et les avancées scientifiques ont permis de grandes progressions. Ces progrès ont engendré un développement de l’activité humaine, industrielle, et urbaine, qui par conséquent, a induit à l’émergence de nombreuses substances chimiques. Depuis la moitié du 20èmesiècle, il y a eu une très forte augmentation de cancers, de pathologies immuno‐allergiques et des désordres métaboliques qui vont de la pathologie cardiovasculaire aux troubles de la reproduction.

Depuis quelques années, le sujet des perturbateurs endocriniens (PE) fait polémique et divise tant au niveau de la classe politique, que de la communauté scientifique ou de la population en générale.

Les (PE) sont des substances chimiques d'origine naturelle ou artificielle étrangères à l'organisme qui peuvent interférer avec le fonctionnement du système endocrinien. Nous nous sommes intéressés à un en particulier : le résorcinol.

Ce travail s'intéresse doncparticulièrement à un type de PE : les phénols et plus particulièrement le résorcinol. La présence de résorcinol dans l’environnement et le risque qu’il représente ont sensibilisé la communauté scientifique au réel besoin d’établir des stratégies permettant l’identification, la détection et la quantification de ces micropolluants dans l’environnement.

Le but est donc d'élaborer un biocapteur permettant la détection directe du résorcinol. Ce dispositif de détection repose sur la reconnaissance de l’analyte par un bio adsorbant qui miment la cible des PE dans l'organisme. Le concept de notre dispositif a pour but de lier le résorcinol aux tanins condensés du thé vert. En effet, Le tanin condensé a été déposé sur un transducteur en or afin de tester sa sensibilité envers ce perturbateur endocrinien.

Nous avons réalisé, par conséquent, toute une étude d’optimisationset de caractérisations.

Le manuscrit est composé de trois chapitres :

Le premier chapitre est consacré à un recueil bibliographique sur les perturbateurs endocriniens en ciblant plus précisément le résorcinol suivi par une définition des capteurs et biocapteurs et la composition des tanins.

Le deuxième chapitre concerne la présentation de quelques méthodes expérimentales utilisées dans notre travail à savoir : la méthode d’extraction, de gélification et l’analyse

Dans le troisième chapitre, tous les résultats sont présentés et discutés.

Enfin, le manuscrit est achevé par une conclusion et des perspectives.

Chapitre I

Généralités sur les

perturbateurs endocriniens et

les capteurs électrochimiques

3

I. Introduction

Dans notre vie quotidienne, nous sommes exposés par le biais de nombreux produits de consommation et d’équipement à une grande variété de substances chimiques. Même à faibles doses, certaines de ces substances peuvent agir sur le système hormonal de notre corps. Il s’agit des perturbateurs endocriniens qui agissent sur le système endocriniens des êtres vivants.

I.1 Le système endocrinien

Le système endocrinien est un réseau de communication et de contrôle complexe entre le système nerveux et les fonctions corporelles. Il implique des hormones, des glandes endocrines qui les produisent (hypothalamus, thyroïde, foie, pancréas, ovaires, testicules, glandes surrénales…etc. voir figure I.1) et des cellules spécialisées.

Figure I.1 : Les glandes du système endocrinien chez l’être humain

Les hormones libérées dans le sang par ces glandes, régulent de nombreux processus physiologiques dont la croissance, le développement, la reproduction, la grossesse, le métabolisme énergétique, la soif, la satiété, la pression artérielle, le rythme cardiaque, le sommeil, l’immunité, le métabolisme et l’adaptation avec les milieux extérieurs. Elles se lient aux cellules cibles via des récepteurs spécifiques situés à la surface et à l’intérieur des cellules pour produire des effets avant d’être métabolisées et éliminées. Les hormones sont des molécules actives à très faibles concentrations, entre le picomolaire et le nanomolaire.

Lorsque la cellule cible répond à la demande transmise par l’hormone via le récepteur, elle envoie à son tour un message à la cellule qui a sécrété déjà l’hormone.

4

Parfois, le processus ne prend que quelques secondes, par exemple s’il s’agit de réagir à un stress ; parfois, il s’étale sur de nombreuses années comme pour le processus de différenciation sexuelle. Cela signifie qu’une altération du système endocrinien peut perturbernotre équilibre et, dans certains cas affecter notre santé [1-4].

I.2Les perturbateurs endocriniens

Tout corps ou substance chimique (naturel ou artificiel) capable de nuire ou causer le moindre déséquilibre à l’un des éléments du système endocrinien est classé comme un perturbateur. Cette terminologie de perturbateur endocrinien été adoptée aussi par l’organisation mondiale de la santé (OMS) [5].

I.3Classification des perturbateurs endocriniens

A cause de la diversité et la nature multiple des perturbateurs endocriniens, il été toujours difficile aux chercheurs de mettre en œuvre une classification universelle. Mais majoritairement, on trouve en littérature trois groupes créés par rapport à l’origine et aux modes d’action des perturbateurs. Ces trois grandes familles sont les substances naturelles, synthétiques et anthropiques [6].

I.3.1 Les substances naturelles

Les substances naturelles sont produites par le corps lui-même soit chez les êtres humains ou les espèces animales telles que la progestérone, l’œstrogène, la testostérone, l’insuline...etc. On les trouve aussi dans les végétaux sous forme de phyto‐œstrogène. Ces dernières peuvent engendrer des déséquilibres hormonauxsurtout pour les nouveaux nés et de mois en mois chez l’adulte. D’ailleurs, une étude a montré que la consommation du soja peut engendrer des anomalies au niveau de l’appareil reproducteur [7-9].

I.3.2 Les substances de synthèses

Comme leur nom l’indique, les substances de synthèse sont fabriquées pour jouer le mêmerôleque les substances naturelles lors des traitements médicaux. Elles sont surtout utilisées en cas de déficit hormonal ou pour réguler le système endocrinien.

Parmi ces substances de synthèse, on peut citer :

 Les hormones utilisées dans les contraceptifs (progestérone et œstrogène) oraux

 Les hormones de traitement de la ménopause

5

 Les hormones pour pallier un déficit hormonal de certaines maladies tel que le diabète

I.3.3 Les substances anthropiques

Issues principalement de l’industrie cosmétique, connues pour leurs propriétés physico- chimiques. Les substances anthropiques contiennent des molécules liposolubles stockables facilement par l’organisme, ce qui peut présenter des effets indésirables pour le systèmeendocrinien. Parmi ces composants, on trouve les phtalates, les filtres solaires, les parabènes…etc. [10-11].

I.3.4 Les principales sources des perturbateurs endocriniens

Le tableau I.1, montre les différentes origines et les substances y contenant, d’après la littérature [12].

Tableau I.1 : Sources principales des Perturbateurs endocrinien

Sources Catégories Substances

Incinération et mise en décharge

Composés polychloré (résultant de la production industrielle ou sous-produits et substances interdites principalement)

Dioxines polychlorée, Biphényle polychloré Ruissellement

agricole et transport

atmosphérique

Pesticides organochlorés (retrouvés dans les insecticides et dont bon nombre sont maintenant abandonnés graduellement)

DDT, dieldrine, lindane

Ruissellement agricole

Pesticides actuellement utilisés Atrazine, trifluraline, perméthrine

Ports

Organoétains (retrouvés dans les agents antisalissures utilisés pour peindre la coque des navires)

Tributylétain Effluents

industriels et municipaux

Alkylphénols (surfactants – certains types de détersifs utilisés pour enlever l'huile – et leurs métabolites)

Nonylphénol Effluents

industriels

Phtalates (retrouvés dans les agents plastifiants)

Phtalate de dibutyle, phtalate de benzyle et de butyle

Effluents municipaux Ruissellement agricole

Hormones naturelles (produites naturellement par les animaux) ; stéroïdes synthétiques (retrouvés dans les contraceptifs)

Estradiol, estrone et testostérone ; éthényle estradiol

Effluents des fabriques de papier

Phytoestrogènes (retrouvés dans les plantes)

Isoflavones, ligans, coumestans

6 Produits de

consommation

Cosmétiques, produits d'hygiène personnelle et produits nettoyants, plastiques

Parabènes, phtalates, éthers glycoliques, parfums,

cyclosiloxanes, bisphénol A (BPA)

I.4 Mécanisme d’action

Nous avons vu, comment les perturbateurs endocriniens ont été classés par rapport à leurs origines et natures. Figurez-vous que des chercheurs préfèrent les regrouper par rapport à leur effet apporté ou proprement dit leur mécanisme d’action [13].

I.4.1 Imitation d’action des hormones endogènes (effet agoniste)

Le perturbateur endocrinien de structure similaire à celle de l’hormone peut interagir directement avec le récepteur cellulaire et l’activer, mimant l’action d’une hormone endogène et induisant des effets similaires, notamment par l’activation ou l’inhibition de transcription des gènes[14].

Figure I.2Effet agoniste des perturbateurs endocriniens

I.4.2 Inhibition les interactions entre les hormones et leurs récepteurs (effet antagoniste)

La substance PE se fixe sur le récepteur sans l’activer, en empêchant la liaison de l’hormone endogène avec son récepteur. Il bloque le fonctionnement de récepteur qui affecte les fonctions cellulaires normales liées à l’hormone, en empêchant la fixation du complexe hormone/récepteur sur l’ADN,et donc l’activation des gènes cibles [15].

7

Figure I.3Effet antagoniste des perturbateurs endocriniens

I.4.3 Action sur la synthèse, le transport, le métabolisme et l'excrétion des hormones

La substance PE peut modifier le métabolisme intracellulaire des glandes sécrétrices, en perturbant la biosynthèse des hormones elles-mêmes par modification des concentrations d'hormones endogènes. En particulier, certains PE sont capables d’affecter les enzymes de synthèse de la stéroïdogenèse, intervenant ainsi dans la synthèse des androgènes [14].

Figure I.4Effet de blocage des perturbateurs endocriniens

I.4.4 Altération de développement des récepteurs hormonaux et leurs

fonctions

8

La substance PE peut altérer les activités hormonales en activant ou supprimant le développement d’un récepteur cellulaire. Le bisphénol A est par exemple capable d’altérer la régulation protéique du récepteur nucléaire et/ou de ses cofacteurs par la voie de dégradation du protéasome.

I.4.5Altération des fonctions par des interactions avec les hormones

La substance PE peut interagir avec une hormone et modifier son message, et ainsi altérer les fonctions cellulaires. Certains PE sont des composés solubles dans les corps gras (lipophiles), c’est-à-dire qu’ils se fixent sur le tissu adipeux, et peuvent facilement s’accumuler dans les graisses de différentes espèces et ainsi contaminer une grande partie de la chaîne alimentaire. Ainsi, il est possible de doser les PE dans le sang, le tissu adipeux, le lait maternel, le liquide amniotique, le sang du cordon ou les urines.

Ainsi, les PEs n’ont pas d’effet toxique, mais ils induisent une modification de la régulation du système hormonal. Et c’est cette modification qui peut engendrer un effet nocif sur l’organisme. Voilà pourquoi, un PE, est défini par son mécanisme d’action et non pas par la nature des effets potentiels qu’il induit ou par ses propriétés physico-chimiques [16].

I.5 Les effets des perturbateurs endocriniens

Les effets des perturbateurs endocriniens dépendent de plusieurs paramètres tels que les quantités (les doses mise en jeu), les degrés et les durées d’exposition, la dynamique de leurs actions…etc.

I.5.1 L’âge d’exposition

On sait pertinemment que les individus diffèrent entre eux en sensibilité vis à vis les effets externes. Pareil, en ce qui concerne l’intervalle d’exposition aux polluants absorbés par l’organisme. Certains souffrent et seront affectés de façon critique sur tout pour les femmes en période de grossesse ou de puberté[17].

I.5.2Le temps écoulé entre l’exposition et ses effets

L’exposition aux perturbateurs endocriniens à des stades très sensibles du développement peut entraîner de profonds changements physiologiques et fonctionnels qui peuvent ne pas émerger sur le plan clinique avant un âge avancé. L'exposition elle-même peut cesser, mais l'impact sur le développement et les effets indésirables subséquents reste encore en progression [18-19].

9

I.5.3 La dynamique de réponse à la dose

Certain comportement semble contrarier la fameuse courbe dose-réponse connue en toxicologie qui présente une proportionnalité logique. De faibles doses peuvent avoir parfois un impact plus néfaste que des doses plus importantes. Cela s’explique par le fait que les hormones affectés ne sont pas si nombreux et le peu de substances polluantes suffisent à tous les infectées (notion de seuil) [19].

I.5.4 Les effets latents à long terme

Les effets des perturbateurs endocriniens peuvent être transmis a posteriori aux futures générations à travers les modifications épigénétiques sur les cellules germinales ou à travers une exposition environnementale le continue de la descendance [20].

I.5.5 Maladies fréquentes causées par les PE

Parmi les conséquences dramatiques, nous pouvons constater :

I.5.5.1 Cancers hormono-dépendants

Un cancer est hormono-dépendant lorsque les hormones jouent un rôle dans la prolifération des cellules cancéreuses[21]. Dans ce cas, on peut distinguer :

o -Le cancer du sein o -Le cancer de la prostate o -Le cancer germinal testiculaire.

L’augmentation d’incidence des cancers du sein et de la prostate chez les Asiatiques migrant aux États-Unis démontre l’influence prépondérante de l’environnement par rapport à la génétique [22].

I.5.5.2 Troubles du système reproductif des hommes et des femmes a- Chez les hommes

Les principaux effets et troubles pouvant toucher les hommes peuvent se résumer ainsi [21- 22].

 Baisse de la fertilité masculine (une baisse de la concentration, mobilité, morphologie de spermatozoïdes

 Cryptorchidie ou non descente testiculaire

 Hypospadias

10

 Distance anogénitale

b-Chez les femmes

On trouve chez les femmes les effets suivants :

 Le syndrome des ovaires polykystiques

 Diminution de la réserve ovarienne

 Fertilité féminine

 Endométriose

 Evolution de l’âge de la puberté

 Maladies neuro-dégénératives

 Allergies, diabète, obésité, ostéoporose, dérégulation de la thyroïde, du foie du pancréas

 Troubles neurologiques, maladie de Parkinson, Alzheimer, dépression Autisme, hyperactivité, troubles de l’apprentissage et déficit de l’attention chez l’enfant.[23-24]

I.6 Le Résorcinol (le PE à détecter)

Le résorcinol est le perturbateur endocrinien à détecter et étudier dans ce mémoire. La résorcine (ou résorcinol, ou benzène-1,3-diol en nomenclature IUPAC) est l'isomère méta du benzènediol. C'est un diphénol (C6H4(OH)2).

Le résorcinol se présente sous la forme de cristaux blancs hygroscopiques qui se colorent en rose sous l’influence de la lumière et de l’air ou en présence de certains catalyseurs comme le fer. Il possède une odeur caractéristique, quoique faible, et une saveur d'abord sucrée, ensuite amère. Il est très soluble dans l’eau (72 g/L à 20 °C) et soluble dans l’éthanol, l’acétone, le diméthylsulfoxyde et l’oxyde de diéthyle [25].

11 Tableau I.2 : Propriétés physico-chimique du Résorcinol

I.6.1

Structure et propriétés physico-chimique

I.6.2

Sources et utilisation de résorcinol Le résorcinol est utilisé pour,[26-28]:

 La fabrication de pneus, de produits dérivés du caoutchouc, de colles et de résines industrielles.

 Les feuilles de tabac et la fumée

 Il est aussi employé dans certains cosmétiques et soins d’hygiène (colorations pour cheveux, mascara à usage professionnel).

 Comme antioxydant pour des produits alimentaires comme les crevettes et comme antiseptique dans la composition de certains médicaments.

I.6.3

Principaux effets du résorcinol

Sur la base des données expérimentales et cliniques disponibles, les experts de l’Anses, les recommandations de la Commission européenne et selon les critères de l’OMS établi que : Formule et la structure de substance Détails

C

6

H

6

O

2

Etat Physique Solide

Masse molaire 110,11 g /mol Point de fusion 110 °C

Point d'ébullition 276 °C à la pression atmosphérique

Densité 1,28 à 20 °C Température 605 °C D’auto inflammation

Synonymes - 1,3-Benzènediol ;

- m-Dihydroxybenzène -résorcine - 1,3-Dihydroxybenzene

- 3-Hydroxyphenol-Resorcin

12

 Un effet du résorcinol sur la régulation de la concentration des hormones thyroïdiennes via l’inhibition d’une enzyme essentielle à leur biosynthèse ;

 L’hypothyroïdie sévère faisant suite à une exposition importante à cette substance par voie cutanée chez l’Homme (goitre, perte d’énergie, prise de poids, dépression dans certains cas) ;

D’autres effets sont aussi fréquents, tels que :

- La carcinogenèse du tube digestif supérieur induite par le tabac [30]

- Les anomalies hématologiques sévères dues à une exposition à vie [31]

I.6.4 Les

méthodes de détection de résorcinol

Le résorcinol est généralement détecté avec des méthodes classiques, parmi ces dernières

 L’inhibition de l'intensité de la chimioluminescence à l'aide d'un système d'injection de flux

 La méthode colorimétrique utilisant des nanoparticules d’argent

 La chromatographie liquide

 La chromatographie sur couche mince

 La résonance plasmonique de surface

Ces instruments classiques sont généralement complexes, coûteux, volumineux et souvent difficiles à mettre en œuvre et de demande globale de main-d'œuvre qualifiée. De plus, les phases de préparation des échantillons, d’incubation, et d’exploitation des résultats augmentent souvent très fortement la durée totale d’analyse.

Par conséquent, il existe actuellement une forte demande de méthodes alternatives pour répondre à ces critères

Parmi les dispositifs potentiels figurent les biocapteurs électrochimiques qui dépend de la nature de l’analyte, du milieu d’échantillonnage et des sensibilités et sélectivité requises.

Ainsi le développement de dispositifs portables électrochimiques nécessite de prendre en compte la simplicité et la robustesse des mesures, l’intensité du signal, la stabilité à long terme, la sélectivité et le changement du milieu d’analyse qui peut affecter la mesure.

De plus, l’analyse de certains composés toxiques nécessite leur détermination à l’état de traces (ou ultra trace). Afin de répondre à ces contraintes, il est possible de procéder à une étape de préconcentration du polluant sur la surface de l’électrode avant l’analyse. Cette étape peut s’effectuer électrochimiquement par électrodépôt ou chimiquement en modifiant la surface de l’électrode à l’aide de récepteurs spécifiques d’un polluant donné.

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La création de systèmes d’analyse portables nécessite également de prendre en compte le volume total du dispositif. L’objectif est de diminuer la taille du système d’analyse tout en conservant une détection sensible et sélective. Pour cela, la combinaison des avantages des réseaux d’électrodes (petite taille, faible volume d’échantillon, haute sensibilité et faible cout) avec des méthodes de préconcentration de polluants à la surface de l’électrode semble prometteuse. La simplification des techniques analytiques doit également faciliter la miniaturisation de l’instrumentation et en diminuer le coût.

I.7 Les Capteurs (définition)

Nous pouvons définir un capteur comme étant un outil qui répond à un stimulus physique ou chimique dans le but de produire un signal de détection mesurable. Alors que le développement de capteurs pour des stimuli physiques externes est relativement simple, cela devient plus compliqué quand les stimuli proviennent d’atomes ou de molécules.

Dans ce dernier cas, on parle alors de capteurs chimiques, biochimiques ou de biocapteurs.

Un biocapteur est défini comme un dispositif de mesure qui utilise une entité biologique (Enzyme, anticorps, antigène cellules, ADN, ARN, etc.) pour détecter et quantifier un analyte spécifique. L’analyte cible peut être une espèce chimique ou biologique. (Le biocapteur est obtenu par la combinaison d’un biorécepteur (couche sensible) qui assure la reconnaissance et la liaison de la molécule cible et d’un transducteur (mode de détection) qui transforme le phénomène chimique, biologique ou physique observé en signal électrique mesurable [32].

Figure I.5 Principe de fonctionnement d’un biocapteur

14

I.7.1 Structure d’un capteur chimique

Les capteurs chimiques sont composés de deux parties essentielles. La première partie concerne la réception, appelée aussi élément de reconnaissance moléculaire (couche sensible).

Il s’agit de la partie qui transforme l’information chimique en une forme de signal ou d’énergie mesurable. Cette réception peut être soit physique (ce sont typiquement les capteurs basés sur les mesures d’absorbance, de l’indice de réfraction, de la modification de masse,

…), soit chimique (systèmes où il y a une réaction chimique avec l’échantillon à analyser qui donne naissance à un signal

)

[33]. Aussi elle fait preuve de sélectivité, sensibilité et réversibilité. (La sélectivité consiste à retenir un seul composé par rapport aux autres composés présents dans le milieu.

La sensibilité se traduit par la capacité de la couche à modifier une de ses propriétés en présence de l’analyte.) Selon les molécules à détecter, plusieurs revêtements ont été développés Polymère, Oxydes semi-conducteurs, Minérale, Catalyseur et Biologique[34].

La deuxième partie est le transducteur il représente l’élément physique du capteur. Il sert à exploiter la modification chimique issue d’une interaction entre un analyte et la couche sensible du capteur pour la transformer en signal électrique. Suivant le type de la modification chimique, on choisira le type de transducteur approprié pour exploiter au mieux l’effet créé par la couche sensible en présence de l’analyte[35].

I.7.2 Différents modes et types de capteurs

Les capteurs sont multiples et leurs utilisations sont vraiment très variées. C’est pour cela que les industriels en générale les classes selon leurs principales fonctions[36].

I .7.2.1 Capteurs optiques

Le capteur optique est un dispositif qui transforme la réaction biochimique en information sous forme d’une grandeur optique. Ces informations, transportées par la lumière, sont la base des capteurs optiques qui forment le plus large groupe de transducteurs qui sont liés à la mesure de la lumière absorbée ou émise. Les principaux atouts de ces capteurs sont généralement leur caractère non destructif qui autorise des mesures in situ et en temps réel, une insensibilité aux interférences électromagnétiques et une sensibilité de détection élevée.

La majorité de ces capteurs utilise les techniques d’absorption et de fluorescence ou fait appel à des phénomènes d’interférence de la lumière[37].

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I.7.2.2 Capteurs thermiques

Les transducteurs thermiques aussi appelés capteurs enthalpimétriques ont été développés dans les années 1974. Ils sont destinés à déterminer la concentration d’un substrat par la variation d’enthalpie associée à des réactions exo ou endothermiques. Leur principe est basé sur l’immobilisation des récepteurs biologiques qui sont reliés à un microcalorimètre ou à une résistance thermique capable de mesurer les changements d’enthalpie ou de température dues aux réactions avec l’analyte [36].

I.7.2.3 Capteurs mécaniques

Au cours des dernières années, différents transducteurs mécaniques ont été largement répandus en tant que systèmes de détection de biocapteurs parmi lesquels nous trouvons les transducteurs basés sur l’effet piézoélectrique et les microsystèmes biologiques électromécaniques [36].

L’application d’une force et plus généralement d’une contrainte mécanique à certains matériaux dits piézoélectriques, le quartz par exemple, entraîne une déformation qui suscite l’apparition de charges électriques égales et de signes contraires sur les faces opposées[38].

I.7.2.4 Capteurs électrochimiques

Les senseurs électrochimiques transforment l’interaction électrochimique entre l’analyte et l’électrode en un signal porteur d’information. Leur principe de fonctionnement est basé sur le fait que certaines molécules électro-actives en solution peuvent échanger les électrons avec la surface de l’électrode selon le potentiel auquel cet échange a lieu. Les transducteurs électrochimiques restent les plus utilisés grâce à leurs principaux avantages liés à leur simplicité, leur coût de revient relativement faible et leur rapidité de réponse [36].

Les capteurs électrochimiques sont souvent utilisés dans le domaine médical, de l’environnement et de la sécurité comme par exemple pour la détection de polluants à l’état de trace ou la détection d’explosifs [39]. Dans cette catégorie nous distinguons : les capteurs potentiométriques, ampérométriques, impédimètrique, conductimétriques et voltammétriques.

-Les capteurs conductimétriques : basés sur la mesure de conductance d’une solution électrochimique

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- Les capteurs ampérométriques : basés sur une mesure de courant ; - Les capteurs potentiométriques : basés sur une mesure de potentiel ;

-Les capteurs impédimètriques : basés sur la mesure de l’impédance d’une cellule électrochimique par la technique de spectroscopie d’impédance[40].

a) Capteurs potentiométriques

La potentiométrie est une méthode électrochimique basée sur la mesure de la différence de potentiel entre une électrode de mesure constituée de matériaux conducteurs électroniques permettant des échanges d’électrons dans tout le contenu de la solution et une électrode de référence. La détermination des potentiels des électrodes permet de mesurer directement la concentration de l’analyte à doser [33].

Figure I.6 : Principe de mesure potentiométrique : accumulation de charges électriques à la surface de l’électrode indicatrice

b) Capteurs ampérométriques

Dans le cas des capteurs ampérométriques, c’est une relation entre l’intensité du courant (en ampères) et la concentration de l’analyte en solution qui est exploitée. Les informations inhérentes à l’analyte considéré sont obtenues par l’application d’un potentiel à l’électrode de travail qui provoque l’oxydation ou la réduction de l’analyte (à condition qu’il soit électroactif) avec apparition d’un courant qui est mesuré. Ce type de capteurs présente une

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bonne sélectivité intrinsèque étant donné que les processus redox des analytes électro-actifs se font à des potentiels caractéristiques bien définis et l’intensité du signal du pic de réduction ou d’oxydation de l’analyte considéré est proportionnelle à sa concentration [39].

c) Capteurs conductimétriques

Les transducteurs conductimétriques sont des alternatifs aux potentiométriques et ampérométriques, leur principe repose sur la mesure des propriétés conductimétriques d’un milieu entre deux électrodes parcourues par un courant alternatif. La conductivité d’un milieu est linéairement reliée à la nature des ions en solution (leur charge et leur mobilité) et de leurs concentrations[36].

d) Capteur impédimètrique

Le principe de ce type de transducteur repose sur la technique de la spectroscopie d’impédance basée sur l’application d’une contrainte sous forme d’une variation sinusoïdale en tension de quelques millivolts d’amplitude, entre l’électrode de référence et l’électrode de travail et la mesure du courant généré entre l’électrode de travail et l’électrode auxiliaire en fonction de la fréquence.

Figure I.7 : Schéma de principe des mesures impédimètrique

18

I.7.3 Caractéristiques principales d’un capteur

Les performances des capteurs sont caractérisées par différents paramètres [41] [42]. Les principaux sont les suivants :

- La sensibilité : lien entre les variations de signal du capteur et la concentration en espèce cible

- La stabilité : la reproductibilité dans les mêmes conditions de réponse - La limite de détection : concentration minimale détectable en espèce cible

- La sélectivité : la capacité de détection à détecter l'espèce cible parmi les autres espèces -Le temps de réponse : temps requis pour atteindre 90 % de la réponse en régime après mise en contact avec l’espèce cible à détecter

- La durée de vie : période pendant laquelle les caractéristiques du capteur permettent son utilisation avec un degré de précision suffisant

- La rapidité

:

C’est la qualité d’un capteur à suivre les variations de la grandeur mesurée -La précision : C’est l’aptitude du capteur à donner des indications proches de la valeur vraie de la grandeur mesurée.

-

Le bruit de fond : C'est une variation parasite, souvent aléatoire, du signal de sortie, dont la valeur moyenne est nulle et qui vient se superposer à la valeur à mesurer

I.7.4 Méthodes électrochimiques de caractérisation

La voltammétrie est une méthode d’électroanalyse basée sur la mesure du flux de courant résultant de réduction ou d’oxydation des espèces présentes en solution. Les différentes techniques voltammétriques découlent des innovations portant sur la façon dont le signal E=f(t) est imposé et le signal I = f(E) est mesuré qui ont été développées dans le but de maximiser le rapport If/Ic afin d’augmenter la sensibilité. If est le courant faradique associé aux processus d'oxydoréduction, Ic est le courant capacitif lié à l'existence de la double couche électrique. Soit I= If + Ic (contribution faradique et capacitive à l’interface électrode/solution) [42].

En effet, différentes techniques de voltammétrie peuvent être mises en oeuvre pour étudier la réponse d’un système électrochimique soumis à une polarisation. Les plus utilisées sont la voltammétrie cyclique, la voltammétrie différentielle pulsée et la voltammétrie à ondes carrées. Nous présentons seulement deux méthodes de caractérisation voltammétriques, la voltamétrie cyclique et la voltamétrie à onde carrée.

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Figure I.8 : Représentation d’un voltammogramme cyclique.

I.7.4.1 Voltammétrie cyclique

Lavoltamétrie cyclique est la technique d’analyse électrochimique, la plus utilisée grâce à sa simplicité de mise en oeuvre et la richesse des informations collectées pour l’étude deprocessus redox. Son principe repose sur le balayage d’un potentiel variable, à vitesse constante, de façon répétée en cycle fermé entre deux bornes appelées "potentiels d’inversion

». Le voltammogramme cyclique résultant forme un ou plusieurs pics en relation avec le nombre d’électrons échangés au cours de la réaction. Ce type de voltammétrie est utilisé pour l’analyse des propriétés redox des composés chimiques à l'interface de l'électrode en solution.

Il existe, donc, des critères permettant de différencier ces différents systèmes en voltampèremètre cyclique [35].

I.7.4.1.1 Système réversible

Si le transfert électronique est très rapide à la surface de l’électrode, le rapport des concentrations interfaciales en oxydant et en réducteur est donné par la loi de Nernst et est fonction du temps. Ce problème a été résolu numériquement par Randles et Sevcik [43] et [44]., puis par Nicholson et Shain[45] et permet d’exprimer les différentes caractéristiques de la courbe intensité-potentiel en fonction des différents paramètres du système.

I.7.4.1.2 Système irréversible

Lorsque la vitesse de transfert de charge devient plus faible comparée à la vitesse de transfert de matière, le système est dit irréversible. Le transfert électronique hétérogène est lent et donc

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l'équation de Nernst n'est plus applicable. La réaction inverse peut être alors totalement négligée [48].

I.7.4.1.3 Système quasi-réversible

L’étude de ce type de système a été réalisée par Matsuda et Ayabe[47], qui ont qualifié de quasi-irréversibles les réactions correspondant à un transfert de charge lent et pour lequel cependant la réaction inverse doit être prise en considération. Pour une telle réaction, l’intensité du courant n’est plus strictement linéaire vis-à-vis de la racine carrée de la vitesse de balayage. Dans la pratique, selon la vitesse de balayage du potentiel, un système donné peut apparaître réversible, quasi-réversible ou totalement irréversible.

I.7.4.2 Voltammétrie à ondes carrées

La voltammétrie à ondes carrées (VOC) est basée sur la combinaison d’une modulation d’onde carrée de période 1/f avec une rampe en escalier. Le signal d'excitation obtenu est une superposition en "escalier de potentiel d’une onde carrée symétrique d'amplitude ∆Es en phase avec la fréquence des "marches de l'escalier" (FigureI.9). Le courant est échantillonné pendant des intervalles de temps très courts à la fin de chaque impulsion là où le courant de charge est pratiquement constant. Le voltammogramme résultant correspond donc à la différence des courants anodiques et cathodiques échantillonnés (∆i = i1 - i2), éliminant le courant capacitif.La hauteur de pic est donc proportionnelle à la concentration de l'espèce électro-active[48].

Figure I.9 : Schéma de mesure pour la voltammétrie à ondes carrées [48].

Dans notre travail, nous allons étudier et effectuer des mesures sur le tanin condensé du thé vert et sa relation avec le résorcinol. Sur ce fait, nous préférons dans ce chapitre, vous montrer les aspects et la composition des tanins.

21

I.8 Les métabolites secondaires

Une des originalités majeures des végétaux réside dans leur capacité à produire des substances naturelles très diversifiées.

Les composés organiques des plantes sont divisés en deux catégories : la première, représente les composés qui existent dans toutes les cellules et jouent un rôle central dans lemétabolisme et la reproduction des cellules incluant les acides nucléiques, les acides aminés, les oses, et les lipides et connues sous le nom de métabolites primaires. La deuxième catégorie, sont les métabolites secondaires, qui n’exercent pas de fonction directe au niveau des activités fondamentales de la plante. D’après leur biosynthèse, les métabolites secondaires peuvent être divisés en quatre grandes catégories de métabolites secondaires chez les végétaux [49] [50]:

 Les composés phénoliques

 Les saponines

 Les alcaloïdes et composés azotes

 Les composés terpéniques.

I.8.1 Les Tanins

Ils sont d’origine végétale et non azotée, ce sont des composés polyphénoliques de structures variées ayant en commun la propriété de précipiter les alcaloïdes, la gélatine et les protéines [51].

Le thé est riche en tanin (8 à 15 % - 20 % pour le thé vert). Ce sont les composés qui contribuent à l’amertume, l’astringence et l’arrière-goût sucré de l’infusion du thé.

Les tanins sont classés en deux groupes selon leur structure chimique [52].

Tanins hydrolysables

Ce sont des polyesters d’oses et d’acides phénols. Les oses trouvés dans ces tanins sont surtout représentés par le glucose, ces tanins sont de deux types [51].

 Les tanins galliques qui sont les esters d’oses (glucose) et d’acides galliques.

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 Les tanins ellagiques qui sont des esters d’oses et d’acide ellagiques. Dans les deux cas, la fraction osidique est estérifiée par plusieurs molécules d’acide ellagique.

Acide galliques Acide ellagiques

Acide Tannique Acide Tannique Gallotannin Figure. I.10. Structures des tanins hydrolysables [51].

I.8.2 Tanins condensés

Ils sont également appelés tanins catéchiques ou proanthocyanidols. Ce sont des composés de nature flavanique existant à l’état naturel soit sous forme de monomères flavaniques soit sous forme plus ou moins condensées (de 2 à 10 unités flavaniques liés entre elles par des liaisons C-C, le plus souvent C4-C8 ou rarement C4-C6.).

Figure. I.11.Structures du monomère flavanique

23

Ils ne renferment pas de sucres dans leur molécule ; ils ne sont hydrolysés ni par les acides, ni par les tannasses mais en présence d’acide forts ou d’agents d’oxydation, Ce sont eux les composés majoritaires du thé vert et ils sont à l’origine de la plupart des activités du thé vert.

Ils sont surtout abondants dans les bourgeons et les jeunes pousses. Ils représentent 10 à 20%

en fonction du cultivar et de l’âge de la feuille [53].

Dans le thé vert, les constituants principaux sont des monomères de type catéchines (flavane- 3-ol : phényl-2-chromane substituée en 3 par une fonction alcool). Ce sont des composés incolores et hydrosolubles contribuant à l’amertume et au caractère astringent du thé vert. On trouve dans le thé vert des monomères catéchiques tels que la (+) catéchine et la (-) épicatéchine (EC) (0,2 à 2% de la matière sèche) (figures I.12).

Figure. I.12 La structure des tanins condensés [51].

Les tanins condensés (pyrotechnique ou proanthocyanidols) : Ils différent des tanins hydrolysables par :

 Une structure voisine à celle des flavonoïdes.

 Absence de partie osidique.

 Non hydrolysables, en milieu acide fort et à chaud ils se polymérisent en donnant des précipités insolubles rouges bruns appelés phlobaphènes.

24

I.8.3 Propriétés physico-chimiques des tanins

[56][57].

a- Solubilité

Les tanins sont difficilement solubles dans l’eau froide mais solubles dans l’eau chaude (solutions colloïdales), ils sont solubles dans l’alcool et l’acétone, insoluble dans les solvants orge apolaires (éther). Leur solubilité varie selon leur degré de polymérisation.

b- Précipitation

Les tanins sont précipités par de nombreux réactifs :

 Avec les métaux lourds : Fe, Pb, Zn, Cu

 Avec l’eau de chaux, la baryte, le tungstate de Na

 Avec les protéines (gélatine, albumine)

 Avec les sels d’alcaloïdes (contre poison)

 Avec le réactif de Stiasny ou formol chlorhydrique (uniquement les tanins catéchiques)

c- Polymérisation

Les tanins catéchiques et leurs intermédiaires réactionnelles ont tendance à se polymériser spécialement en solution acide concentrée ou par l’action d’agents oxydants.

d- Extraction :

 L’extraction des tanins (drogue fraiche) par un mélange d’eau et d’acétone.

 Distillation pour l’élimination de l’acétone.

 Purification de la solution extractive par le dichlorométhane (élimination des pigments et des lipides)

 Extraction des proanthocyanidols dimères et des tanins galliques par l’acétate d’éthyle

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Chapitre II

Extraction et caractérisation

phytochimique