IDENTIFICATION ET CLONAGE MOLÉCULAIRE DE

RADIOGÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE

IDENTIFICATION E T CLONAGE MOLÉCULAIRE D E G E N E S HUMAINS D E LA RÉPARATION PAR EXCISION

M a u r o MEZZINA

G r o u p e de Laboratoires de l'Ï.R.S.C.

U P R 42 CNRS, BP. n° 8, 94802 Villejuif

L e m a n t i e n d e l ' i n t é g r i t é d u m a t é r i e l g é n é t i q u e e s t u n e c o n d i t i o m e s s e n t i e l l e p o u r la v i e d e la c e l l u l e et ceci est a s s u r é p a r les p r o c e s s u s d e r é p a r a t i o n d e l ' A D N . Si u n e m u t a t i o n d a n s un g è n e d e r é p a r a t i o n p e r t u r b e le f o n c t i o n n e m e n t d e ce p r o c e s s u s , la c e l l u l e n ' e s t p l u s v i a b l e , ou a l o r s c e r t a i n s m é c a n i s m e s c e l l u l a i r e s s o n t i n d u i t s en e n g e n d r a n t d e s c h a n g e m e n t s d a n s le p r o g r a m m e g é n é t i q u e q u i p e u v e n t a b o u t i r à l a t r a n s f o r m a t i o n c e l l u l a i r e . L e s r a r e s m a l a d i e s g é n é t i q u e s h u m a i n e s d e la r é p a r a t i o n d e l ' A D N , c o m m e le

x e r o d e r m a p i g m e n t o s u m ( X P ) , l ' a n é m i e d e F a n c o n i ( A F ) , l ' a t a x i e t é l a n g e c t a s i e ( A T ) ou la s y n d r o m e d e B l o o m ( B S ) s o n t d o n c c a r a c t é r i s é e s p a r u n e i n s t a b i l i t é g é n é t i q u e et u n e f o r t e p r é d i s p o s i t i o n au c a n c e r . N é a m m o i n s , si l ' o n v e u t é t u d i e r l e s d i f f é r e n t s g è n e s i m p l i q u é s d a n s le p r o c e s s u s d e r é p a r a t i o n d e l ' A D N c h e z l ' h o m m e , c e s m a l a d i e s p r é s e n t e n t un s y s t è m e g é n é t i q u e m o d è l e ( 2 ) .

L a m a l a d i e X P e s t l a m i e u x c o n n u e s u r l e p l a n g é n é t i q u e et b i o c h i m i q u e . L e s m a l a d e s X P p r é s e n t e n t u n e s e n s i b i l i t é à l ' i r r a d i a t i o n u l t r a v i o l e t t e à 2 5 4 nm et à d ' a u t r e s a g e n t s c a n c é r i g è n e s et il a é t é d é m o n t r é q u e l e s c e l l u l e s d e c e s m a l a d e s p r é s e n t e n t u n d é f a u t d a n s la r é p a r a t i o n d e l é s i o n s s u r l ' A D N i n d u i t e s p a r un tel t r a i t e m e n t . D e p l u s , c e s c e l l u l e s ont un taux t r è s élevé d e m u t a b i l i t é et 100 % d e s m a l a d e s X P p r é s e n t e n t des c a n c e r s c u t a n é s d a n s les p a r t i e s du c o r p s e x p o s é e s au soleil ( 2 ) . C e t t e m a l a d i e est d o n c un m o d è l e b i o l o g i q u e p o u r é t u d i e r l e s l i a i s o n s e n t r e l a r é p a r a t i o n , la m u t a g é n è s e et la c a n c é r o g é n è s e c h e z l ' h o m m e .

D e u x a u t r e s m a l a d i e s g é n é t i q u e s h u m a i n e s p r é s e n t e n t u n p h é n o t y p e d e s e n s i b i l i t é a u x U V e t d e d é f a u t d e r é p a r a t i o n s i m i l a i r e , l a t r i c h o t h i o d y s t r o p h i e ( T T D ) et le s y n d r o m e d e C o c k a y n e ( C S ) . T o u t e f o i s , a u c u n d e c e s m a l a d e s n e d é v e l o p p e d e c a n c e r s c u t a n é s . L ' é t u d e d e s g è n e s d e la r é p a r a t i o n p a r e x c i s i o n p e u t d o n c n o u s a i d e r à m i e u x c o m p r e n d r e l e p a r a d o x e b i o l o g i q u e r e p r é s e n t é p a r c e s trois m a l a d i e s .

L ' a n a l y s e g é n é t i q u e d e ces t r o i s m a l a d i e s a m i s en é v i d e n c e 7 g r o u p e s d e c o m p l é m e n t a t i o n p o u r X P ( g r o u p e s A - G p l u s un h u i t i è m e g r o u p e de X P

" v a r i a n t " ) , et 3 g r o u p e s p o u r CS ( A - C ) . P o u r l e s m a l a d e s T T D p h o t o s e n s i b l e s , la m a j o r i t é a p p a r t i e n t au m ê m e g r o u p e d e c o m p l é m e n t a t i o n d e s c e l l u l e s X P - D , e t t r o i s a u t r e s m a l a d e s ( T T D 1 B R et T T D 4 V I et T T D 6 V I ) , r é c e m m e n t c a r a c t é r i s é s , a p p a r t i e n d r a i e n t à d e u x n o u v e a u x g r o u p e s d e c o m p l é m e n t a t i o n ( 3 , 4 ) . R é c e m m e n t , p l u s i e u r s i n d i v i d u s X P a p p a r t e n a n t a u x g r o u p e s d e c o m p l é m e n t a t i o n B , D et G m a n i f e s t a n t a u s s i la p a t h o l o g i e t y p i q u e du s y n d r o m e de C o c k a y n e o n t é t é décrit ( 2 ) . Il s e m b l e d o n c q u e la r é p a r a t i o n d e l ' A D N soit un p r o c e s s u s t r è s c o m p l e x e i m p l i q u a n t d e n o m b r e u x g è n e s . Il e s t p o s s i b l e q u e c e r t a i n e s m u t a t i o n s r e s p o n s a b l e s d u p h é n o t y p e d e r a d i o s e n s i b i l i t é a i n s i q u e d e d i f f é r e n t e s a n o m a l i e s d a n s le p r o c e s s u s d e la r é p a r a t i o n d e l ' A D N d a n s les c e l l u l e s X P , CS et T T D p u i s s e n t ê t r e l o c a l i s é e s d a n s d e s g è n e s c o m m u n s ( c o m m e dans le cas d e m a l a d e s X P - D et d e la m a j o r i t é d e s T T D p h o t o s e n s i b l e s ) ou p r o c h e s les u n s d e s a u t r e s . Ceci d o n n e r a i t lieu au m ê m e p h é n o t y p e c e l l u l a i r e ( d é f a u t d e r é p a r a t i o n d e l ' A D N ) m a i s à d e s m a n i f e s t a t i o n s p a t h o l o g i q u e s d i f f é r e n t e s c h e z les m a l a d e s .

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RADI0GÉNÉT1QUE MOLÉCULAIRE

D e p u i s le d é v e l o p p e m e n t d e s t e c h n i q u e s d e c l o n a g e d e s g è n e s , la c o m p r é h e n s i o n d e la r é p a r a t i o n d e l ' A D N a b e a u c o u p p r o g r e s s é . N o t a m m e n t , p l u s i e u r s g è n e s o n t é t é i d e n t i f i é s e t c l o n e s ; p o u r c e r t a i n s d ' e n t r e e u x , l ' h o m o l o g i e a v e c l e s g è n e s d e r é p a r a t i o n d a n s l e s o r g a n i s m e s i n f é r i e u r s n o u s d o n n e u n e i d é e d e l e u r f o n c t i o n . N o t a m m e n t , l e g è n e X P - A C ( X P - A c o r r e c t i n g ) c o m p l é m e n t a n t l e s c e l l u l e s X P - A ( 5 ) , E R C C 3 ( e x c i s i o n r e p a i r c r o s s c o m p l é m e n t a t i o n ) c o m p l é m e n t a n t X P - B / C S ( 6 ) , X P - C C c o m p l é m e n t a n t X P - C (7), E R C C 2 c o m p l é m e n t a n t X P - D et T T D / X P - D (8) et E R C C 6 c o m p l é m e n t a n t C S - B ( 9 ) . D ' a p r è s l e u r s s é q u e n c e s , E R C C 2 et E R C C 3 c o n t i e n n e n t d e s d o m a i n s f o n c t i o n n e l s d ' h é l i c a s e s , e t l e u r s p r o d u i t s a g i r a i e n t p r o b a b l e m e n t e n s y n e r g i e s u r l ' A D N e n d o m m a g é ( 6 ) .

G E N E S H U M A I N S D E L A R E P A R A T I O N P A R E X C I S I O N groupes de

c o m p l é m e n t a t i o n

X P - A X P - B XP-C XP-D XP-E X P - F XP-G CS-A CS-B T T D / X P - D TTD1BR T T D 6 V I

gene

XP-AC ERCC3 XP-CC ERCC2

nombre de l o c a l i s a t i o n A A présumé chromosomique

ERCC6 ERCC2

ERCC1 ERCC4 ERCC5 h h R 6 h h R 2 3

2 7 3 7 8 2 8 2 3 7 6 0

1 4 9 3

2 9 7

1 5 2

9 q 3 4 2 q 2 1

19ql3

15

l O q l l

19ql3

1 6 13 X q 2 4

h o m o l o g u e chez la l e v u r e R A D 1 4 R A D 2 5 R A D 4 R A D 3

R A D I O

R A D 6 R A D 2 3

L e s s t r a t é g i e s a d o p t é e s p o u r i d e n t i f i e r e t c l o n e r c e s g è n e s s o n t d i f f é r e n t e s . Ici s e r o n t d é c r i t e s et d i s c u t é e s les d e u x p r i n c i p a l e s .

L ' u n e c o n s i s t e à t r a n s f e c t e r c e r t a i n e s l i g n é e s d e c e l l u l e s d e r o n g e u r s ( C H O ) p r é s e n t a n t un p h é n o t y p e d e s e n s i b i l i t é a u x U V a v e c d e l ' A D N g é n o m i q u e h u m a i n s a u v a g e c o u p l é à un m a r q u e u r d e s é l e c t i o n c o m m e le g è n e neo , qui c o n f è r e u n e r é s i s t a n c e à l ' a n t i b i o t i q u e G 4 1 8 aux c e l l u l e s a y a n t intégré^ l ' A D N e x o g è n e . A p r è s u n e p r e m i è r e s é l e c t i o n e n G418, l e s c e l l u l e s s o n t s é l e c t i o n n é e s p o u r l e u r r é s i s t a n c e aux U V . L ' A D N d e c l o n e s d e c e l l u l e s d e r o n g e u r s r é s i s t a n t s aux U V e s t e n s u i t e f r a g m e n t é et r e t r a n s f e c t é d a n s les c e l l u l e s C H O . L ' A D N des c l o n e s r é s i s t a n t s a u x U V est e n s u i t e c l o n é d a n s u n e b a n q u e d e c o s m i d e s ou d e p h a g e s . L e s c o s m i d e s ou p h a g e s c o n t e n a n t de l ' A D N h u m a i n s e r o n t e n s u i t e s c r i b l é s p a r h y b r i d a t i o n p r é f é r e n t i e l l e ( l ' A D N h u m a i n n e s ' h y b r i d a n t p a s a v e c c e l u i d u r o n g e u r ) . C e t t e t e c h n i q u e p e r m e t d o n c d ' i d e n t i f i e r d i r e c t e m e n t l e g é n e d e r é p a r a t i o n . E n u t i l i s a n t c e t t e t e c h n i q u e , il a é t é p o s s i b l e d ' i s o l e r et d e c l o n e r les g è n e s E R C C ( 1 1 ) . U n e v a r i a t i o n d e c e t t e m é t h o d e c o n s i s t e à u t i l i s e r l e s c e l l u l e s h u m a i n e s c o m m e c e l l u l e s r e c e v e u s e s e t l ' A D N g é n o m i q u e d e r o n g e u r s d a n s l e s t r a n s f e c t i o n s .

RADIOPROTECTION - VOL 28 - N 1 (1993) 67

RADIOGÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE

On o b t i e n t a i n s i d e s s é q u e n c e s d ' A D N d e r o n g e u r c a p a b l e s d e c o r r i g e r la p h o t o s e n s i b i l i t é d e s c e l l u l e s h u m a i n e s . A v e c c e s s é q u e n c e s o n p e u t e n s u i t e c r i b l e r d e s b a n q u e s d ' A D N c o m p l é m e n t a i r e ( A D N c ) h u m a i n et i d e n t i f i e r le g è n e h o m o l o g u e c h e z l ' h o m m e . E n u t i l i s a n t c e t t e m é t h o d e il a é t é p o s s i b l e d'identifier 1' A D N c X P - A C (5).

U n e s t r a t é g i e a l t e r n a t i v e c o n s i s t e à u t i l i s e r d e s v e c t e u r s d ' e x p r e s s i o n E B V ( v e c t e u r s n a v e t t e s b a s é s s u r l e v i r u s E p s t e i n B a r r ) c o n t e n a n t u n e b a n q u e d ' A D N c h u m a i n . L ' a v a n t a g e d e l ' u t i l i s a t i o n d e c e t t e s t r a t é g i e r e s i d e d a n s le fait q u e c e s v e c t e u r s se r é p l i q u e n t e t e x p r i m e n t les s é q u e n c e s d ' A D N c l o n é e s , en r e s t a n t d e s u n i t é s é p i s o m a l e s . La b a n q u e d ' A D N c p e u t d o n c ê t r e i n t r o d u i t e d a n s les c e l l u l e s p a r t r a n s f e c t i o n o u é l e c t r o p o r a t i o n e t les c e l l u l e s e x p r i m a n t d e f a ç o n s t a b l e le v e c t e u r p e u v e n t ê t r e s é l e c t i o n n é e s en u t i l i s a n t d u m i l i e u c o n t e n a n t d e l ' h y g r o m y c i n e . C e t t e a p p r o c h e p e r m e t d ' o b t e n i r d e s e f f i c a c i t é s t r è s é l e v é e s d ' e x p r e s s i o n s t a b l e du v e c t e u r d a n s la c e l l u l e , c a r l ' é t a p e d ' i n t é g r a t i o n d a n s l ' A D N c e l l u l a i r e n ' e s t p l u s l i m i t a n t e . En effet, la l i m i t e d e la p r e m i è r e m é t h o d e e s t q u e l ' e x p r e s s i o n d e s é q u e n c e s g é n o m i q u e s e x o g è n e s n é c e s s i t e l ' i n t é g r a t i o n d a n s l ' A D N c e l l u l a i r e , c e q u i e s t un é v é n e m e n t d e t r è s f a i b l e f r é q u e n c e . Il e s t d o n c p o s s i b l e d ' o b t e n i r r a p i d e m e n t a v e c les v e c t e u r s E B V , au m o i n s 1 0 0 . 0 0 0 c l o n e s ( 1 0 0 . 0 0 0 est le n o m b r e e s t i m é d e s g è n e s e x i s t a n t c h e z l ' h o m m e ) d e c e l l u l e s p r é -

s é l e c t i o n n é e s à l ' h y g r o m y c i n e et d e s é l e c t i o n n e r les c e l l u l e s a y a n t a c q u i s la c o m p l é m e n t a t i o n p h é n o t y p i q u e e n i r r a d i a n t d i r e c t e m e n t l e s c l o n e s r é s i s t a n t s . U n a u t r e a v a n t a g e p r é s e n t é p a r c e t t e a p p r o c h e e s t la p o s s i b i l i t é d ' e x t r a i r e l ' A D N d u p l a s m i d e , à p a r t i r d e s c l o n e s p o t e n t i e l l e m e n t c o m p l é m e n t a n t s , p a r la m é t h o d e d e H i r t et d e le r é i n t r o d u i r e d a n s la b a c t é r i e E. coll. L ' A D N p l a s m i d i q u e a m p l i f i é d a n s l a b a c t é r i e p e u t ê t r e e n s u i t e v é r i f i é p o u r s a p r o p r i é t é d e c o m p l é m e n t a t i o n en le r e t r a n s f e c t a n t d a n s les c e l l u l e s .

L o r s q u e les s é q u e n c e s d ' A D N c o m p l é m e n t a n t ie p h é n o t y p e d e s e n s i b i l i t é aux U V s e r o n t i d e n t i f i é e s , la c a r a c t é r i s a t i o n d e s g è n e s en q u e s t i o n p o u r r a s ' e f f e c t u e r e n u t i l i s a n t l e s t e c h n i q u e s c o u r a n t e s d e la b i o l o g i e m o l é c u l a i r e d e s g è n e s c l o n e s .

L a d e r n i è r e s t r a t é g i e s ' e s t r é v é l é e c e l l e d o n n a n t l e p l u s d e r é s u l t a t s , n o t a m m e n t , les g è n e X P - C C et F A - C C , c e d e r n i e r c o m p l é m e n t a n t les c e l l u l e s d e l ' A n é m i e d e F a n c o n i g r o u p e C, ont pu ê t r e identifiés et c l o n e s ( 1 0 ) .

R E F E R E N C E S

1. H o e i j m a k e r s , J.H.J, and B o o t s m a , D . ( 1 9 9 2 ) D N A repair: t w o p i e c e s of the p u z z l e Nature Genetics 1, 3 1 3 - 3 1 4

2 . C l e a v e r , J . E . and K r a e m e r , K . H . ( 1 9 9 2 ) X e r o d e r m a P i g m e n t o s u m and C o c k a y n e S y n d r o m e vn_ Metabolic Basis of Inherited Disease in p r e s s 3 . Stefanini, M . , L a g o m a r s i n o , P . , G i l l a n i , S., N a r d o , T., Botta, E., Kleijcr,

W . , L e h m a n n , A. and S a r a s i n , A. ( 1 9 9 2 ) G e n e t i c h e t e r o g e n e i t y of the e x c i s i o n r e p a i r d e f e c t a s s o c i a t e d w i t h t r i c h o t h i o d y s t r o p h y . Cancer Research s u b m i t t e d

4 . Stefanini, M . , V e r m e u l e n , W . , Giliani, S., N a r d o , T . , M e z z i n a , M . ,

S a r a s i n , A . , H a r p e r , J.I., Arlett, C F . , H o e i j m a k e r s , J.H.J, and L e h m a n n , A . R . ( 1 9 9 2 ) A n e w n u c l e o t i d e e x c i s i o n r e p a i r g e n e a s s o c i a t e d w i t h t h e g e n e t i c d i s o r d e r t r i c h o t h i u o d y s t r o p h y . Nature Genetics, s u b m i t t e d . 5 . T a n a k a , K., Satokata, I., Ogita, Z „ Uchida, T. and O k a d a , Y .

( 1 9 8 9 ) M o l e c u l a r c l o n i n g of a m o u s e D N A r e p a i r g e n e t h a t

c o m p l e m e n t s t h e defect of g r o u p - A x e r o d e r m a p i g m e n t o s u m . Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 8 6 , 5 5 1 2 - 5 5 1 6 .

6. W e e d a , G. van H a m , R.C.A., V e r m e u l e n , W., B o o t s m a , D., van d e r H c b , A.J. and H o e i j m a k e r , J.H.J. ( 1 9 9 0 ) A p r e s u m e d D N A h e l i c a s e e n c o d e d

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RADIOGÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE

by ERCC-3 is i n v o l v e d in t h e h u m a n r e p a i r d i s o r d e r x e r o d e r m a p i g m e n t o s u m a n d C o c k a y n e ' s s y n d r o m e . Cell 62, 7 7 7 - 7 9 1

7 . L e g e r s k i , R. and P e t e r s o n , C. E x p r e s s i o n c l o n i n g of a h u m a n D N A r e p a i r g e n e i n v o l v e d in x e r o d e r m a p i g m e n t o s u m g r o u p C ( 1 9 9 2 ) Nature 3 5 9 7 0 - 7 3

8. Flejter, W . L . , M c d a n i e l , L . D . , J o h n s D . , F r i e d b e r g , C. and S c h u l t z , R . A . ( 1 9 9 2 ) C o r r e c t i o n of x e r o d e r m a p i g m e n t o s u m c o m p l e m e n t a t i o n g r o u p D m u t a n t cell p h e n o t y p e s by c h r o m o s o m e a n d g e n e t r a n s f e r :

i n v o l v e m e n t of t h e h u m a n E R C C 2 D N A r e p a i r g e n e , Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 89, 2 6 1 - 2 6 5 . I t i n , P.H., M . D .

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