LES FACTEURS INFLUENCANT UNE MIGRATION ELECTROPHORETIQUE

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LES FACTEURS INFLUENCANT UNE MIGRATION ELECTROPHORETIQUE

RÉPUBLIQUE DU BÉNIN

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MINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

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UNIV ER SI TÉ D’ ABO MEY-C AL AV I

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ECOLE POLYTECHN IQUE D’ABOMEY-CALAVI

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DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE

Option Option Option

Option : Ana: Ana: Ana: Analyses Biolyses Biolyses Biolyses Bio----MédicalesMédicalesMédicales Médicales

POUR L’OBTENTION DU

DIPLOME DE LICENCE PROFESSIONNELLE

Année Académique 2007 Année Académique 2007 Année Académique 2007

Année Académique 2007----2008200820082008

1^ème Promotion

Sous la supervision de : Pr Frédéric LOKO

Pharmacien Biologiste

Maître de Conférences EPAC/UAC Directeur CIRSAR

Sous la Direction de : Dr. Idrissou ABDOULAYE

Pr. Agrégé de Biochimie et de Toxicologie Chef du service de Biochimie Directeur Général du CNHU-HKM

&

Paul KPOSSOU

Ingénieur Biologiste Laboratoire de Biochimie CNHU-HKM de Cotonou

Présenté et Soutenu par :

DOTOU BESSAN A. Edwige

&

ZOHOUN Z. Loïca Jeanne d’Arc

Composition du Jury :

Président : Pr ZOHOUN Isidore, Enseignant à la FSS / UAC

Membres : - Pr ABOUDOULAYE Idrissou, Enseignant à la FSS / UAC

- Pr LOKO Frédéric,

Enseignant à l’EPAC / UAC

Date de soutenance : 17 Septembre 2008

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REPUBLIQUE DU BENIN ---

UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI ---

ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI

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DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE

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Option : ANALYSES BIOMEDICALES

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DIRECTEUR : Professeur Agrégé Marc T. T.

KPODEKON

DIRECTEUR –ADJOINT, CHEF DU SERVICE DES ETUDES

ET DE LA PEDAGOGIE : Docteur Daton MEDENOU

CHEF DU DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE

HUMAINE : Docteur Hospice C. SECLONDE

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LISTE DES ENSEIGNANTS DU DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE (GBH)

OPTION : ANALYSES BIOMEDICALES (ABM)

Années Académiques : 2005-2008

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LISTE DES ENSEIGNANTS DU DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE (GHI)

(Années Académiques 2005-2008)

I-ENSEIGNANTS PERMANENTS

N° NOM PRENOMS MATIERES ENSEIGNEES

1 ADISSODA Cyrille Anglais

2 ADOMOU Alain Physiques

3 AGOSSOU Pamphile Anglais

4 AHOYO Théodora Angèle Microbiologie Générale

5 ANAGONOU Silvère Education physique et sportive

6 ATCHADE Pascal Parasitologie

7 AVLESSI Félicien Chimie Générale

8 BANKOLE Honoré Bactériologie

9 HOUNSOSSOU Hubert Biométrie

10 DANHA Akogbédji Anglais

10 DOSSOU Cyriaque Techniques d’Expression et Méthodes de Communication

11 LOKO S. Frédéric Biochimie Générale et Clinique

12 LOZES Evelyne Immunologie Générale

13 SECLONDE Hospice Immuno-Hématologie et Transfusion Sanguine

14 SEGBO Julien Biologie Moléculaire et Génétique

15 SOGLO Henri Chimie Organique

16 SOUMANOU M. Mohamed Biochimie Générale

17 TOPANOU Adolphe Hématologie et Hémostase

18 YANDJOU Gabriel Techniques d’Expression et Méthodes de Communication

19 YOVO S.P.Kokou Physiologie Générale, Pharmacologie et Toxicologie

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II-Enseignants Vacataires

N° NOM PRENOMS MATIERES ENSEIGNEES

1 ABLEY Sylvestre Déontologie médicale

2 AKOTGBETO Martin Entomologie médicale

3 AMOUSSOU-GUENOU Marcellin Bio physique

4 BINAZON César Soins infirmiers

5 DARBOUX Raphaël Histologie

6 DOSSEVI Lordson Techniques Instrumentales et Biologie Cellulaire

7 FOURN Léonard Santé Publique

8 GANGBO Flore Immuno Cytochimie

9 HOUNNON Hyppolite Mathématiques

10 YESSOUFOU Saliou Travaux Pratiques Microbiologie Générale

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DEDICACE DEDICACE DEDICACE DEDICACE

Je dédie ce rapport Je dédie ce rapport Je dédie ce rapport Je dédie ce rapport

•

A A A A

Dieu l’Eternel en qui, j’ai mis toute ma confiance et qui m’a donné la sagesse nécessaire pour surmonter les difficultés.

•

A A A A

mon père DOTOU K. Emile pour le soutien moral et affectif ; apporté durant toute ma formation.

Reconnaissance filiale

•

A A A A

ma mère FANOU D. Séraphine. Pour toutes les peines que tu as endurées et les sacrifices que tu as consentis pour mon avenir. Reçois ce travail en signe de ma profonde reconnaissance.

Reconnaissance filiale

•

A A A A

mon époux BESSAN Alban Bienvenu. Pour ton soutien moral, financier et affectif sans cesse renouvelé. Reçois en signe de reconnaissance ce travail.

Que dieu te bénisse

•

A A A A

mes enfants ERWIN et WARREN. Dans l’espoir que vous ferez mieux que moi, trouvez ici le fruit de tant d’année d’espérance. Que Dieu vous bénisse.

Amour maternel

•

A A A A

mes belle mères HINNAKOU Agathe et HOUSSOU Valérie.

Profonde gratitude

•

A A A A

mes frères et sœurs, cousins, cousines, nièces, neveux et leurs familles. Trouvez à travers ce travail mes sincères reconnaissances pour votre soutien moral et affectif.

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•

A A A A

ma belle famille. Recevez ce travail, en témoignage des lourds sacrifices consentis pour moi.

•

A A A A

Madame QUENUM Juliette éposue CHEKETE. Ce travail est le fruit de vos multiples conseils.

• Sincères remerciements

Sincères remerciements

•

A A A A

Madame Vicentia S. GLELE, recevez ce travail en témoignage de vos soutiens et multiples conseils.

•

A A A A

tous mes camarades de promotion particulièrement ATREVI Mariane TCHIBOZO Edwige et ZOHOUN Loïca.

Heureuse carrière

DOTOU A. Edwige DOTOU A. Edwige DOTOU A. Edwige DOTOU A. Edwige

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DEDICACE DEDICACE DEDICACE DEDICACE

Je dédie ce mémoire Je dédie ce mémoireJe dédie ce mémoire Je dédie ce mémoire :

•

A A A A

Dieu l’Eternel qui, j’ai mis toute ma confiance et qui ma donné la sagesse pour surmonter les difficultés.

•

A A A A

mon père ZOHOUN G. Cyriaque ; vous avez toujours su investir physiquement, moralement, spirituellement, maternellement et financièrement pour la réussite de vos enfants. Vous n’avez jamais ménagé aucun effort pour apprendre à vos enfants, le sens du travail bienfait, la dignité, l’honnêteté…….

Trouvez dans ce travail, le témoignage de ma profonde gratitude et de mon filial attachement. Puisse l’Eternel Tout Puissant, Vous comblé de sa grâce afin que vous puissiez jouir longtemps du fruit de vos labeurs.

•

A A A A

ma mère QUENUM Ida, témoignage d’amour et de gratitude pour toutes ces années de sacrifices et de dévouement. Trouve dans ce travail la concrétisation de tes souhaits et de tes inlassables efforts.

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•

A A A A

mes belles mères (AGONKAN Nicole et KASSIFA Gilberte) mes frères, mes sœurs, mes cousins et mes cousines recevez à travers ce travail toute ma gratitude pour votre constance assistance.

•

A A A A

tous mes oncles : ZOHOUN Sylvain, ZOHOUN Isidore et ZOHOUN Augustin, ZOHOUN Théophile pour le soutien moral et affectif, recevez le témoignage de ma profonde reconnaissance.

•

A A A A

tous mes amis, en particulier GUEDENON Clément, ALAVO (Bénédicte et Pulchérie), ATREVI Mariane, DOTOU Edwige, DOSSOU Charnelle, TCHIBOZO Edwige et à toute ma promotion.

ZOHOUN Z. Loïca ZOHOUN Z. Loïca ZOHOUN Z. Loïca ZOHOUN Z. Loïca

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REMERCIEMENTS REMERCIEMENTS REMERCIEMENTS REMERCIEMENTS

C’est le lieu de remercier ceux qui ont contribué à rendre possible la confection de ce rapport de stage par leur concours et leur amélioration.

•

A A A A

notre maître, le Professeur Frédéric S.LOKO à qui nous rendons un hommage particulier. Monsieur le Professeur, malgré vos multiples occupations, vous nous avez accueillis dans votre service et avez dirigé dans la sérénité et avec beaucoup d’humilité nos travaux de stage.

C’est encore une preuve de l’homme humble que vous êtes et de votre affection pour vos étudiants !

« Ceux qui se confient en l’Eternel renouvellent leur force. Ils prennent le vol comme l’aigle, ils courent et ne se laissent point, ils marchent et ne se fatigue point ». Essaie 40 :31

•

A A A A

u Professeur Abdoulaye IDRISSOU. Pour tous vos bienfaits, à notre stage, nous vous prions de trouver ici le témoignage de notre gratitude.

•

A A A A

Monsieur Sven HUYSSEN, Représentant Résident de la Coopération Technique Belge (CTB), pour tous vos bienfaits, recevez ici le témoignage de ma profonde gratitude.

•

A A A A

Madame ATAYI, Actuellement en fonction à l’Ambassade de la Belgique Près le Bénin, pour tous vos bienfaits,

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•

A A A A

Madame Vicentia S. GLELE, Chargé de bourses à la CTB Bénin, pour tous vos soutiens fraternels, moraux, intellectuels.

• A Madame ATINDEHOU, chargé de bourse au Ministère du Développement, pour tous vos soutiens fraternels, moraux, intellectuels.

•

A A A A

tous le personnel de la CTB.

•

A A A A

Monsieur Paul KPOSSOU. Vous avez été sensible à nos moindres difficultés et n’avez ménagé aucun effort pour favoriser l’évolution de nos travaux de stage.

•

A A A A

Mr AFFIN Ezéchiel, surveillant du Laboratoire de la biochimie. Pour votre aide et votre sympathie.

•

A A A A

u surveillant adjoint Mr Marouf AGNIDE et à Mme Liliane JOACHIM. Pour vos encadrements techniques et soutiens de tout genre.

•

A

madame Laetitia BOKO.

•

A A A A

tout le personnel du CNHU-HKM. Pour l’esprit de fraternité qui a régné tout au long de notre stage.

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•

A A A A

u Docteur Hospice SECLONDE. Pour vos encadrements techniques et soutiens de tout genre.

Ma profonde gratitude

•

A A A A

tout le personnel non enseignant du département de Génie de Biologie Humaine

•

A A A A

tous le personnel enseignant département de Génie de Biologie Humaine. Vous aviez contribué très efficacement à notre formation universitaire.

Hommages mérités

•

A A A A

tous nos collègues de la première promotion. Souvenir des moments difficiles mais riches en expériences.

Heureuse carrière à nous tous

•

A A A A

tous ceux qui de près ou de loin ont contribué à la réalisation de ce travail.

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Au Président de notre jury,

C’est un grand honneur que vous nous faites en acceptant de présider notre jury de mémoire.

Nous tiendrons grand compte de vos remarques pour améliorer ce travail.

Hommage respectueux.

Aux membres de notre jury,

Nous sommes très sensibles à l’honneur que vous nous faites en acceptant de siéger dans notre jury de soutenance.

Nous vous prions de recevoir notre

respectueuse gratitude.

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RESUME RESUME RESUME RESUME

Notre rapport pratique de stage qui a porté sur « les facteurs influençant une migration électrophorétique »,nous a permis de constater que la moindre modification de certains de ces facteurs de migration conduit à des erreurs au niveau des différentes fractions isolées sur l’électrophorégramme des proteines sériques.

Ces erreurs varient d’une fraction à une autre. L’erreur relative relevée lors de l’augmentation du volume de tampon est de 10.73 % pour l’albumine et de 48,41 % pour les gammaglobulines.

Quand la solution de coloration est recontituée avec de l’eau de robinet, l’image de migration est déteinte et non interpretable.

Au cours d’une analyse d’électrophorèse aucune condition de migration, ne doit être négligée à cause de l’importance de cet examen en biologie clinique.

ABSTRACT ABSTRACT ABSTRACT ABSTRACT

Our plotting convenient of practicum that carried one « The factors influencing has migration electrophoretic », permitted custom to notes that the least modification of some of thesis migration factors drives to mistakes to the defer fraction level isolated one the electrophoregramme of the proteins seriques.

These mistakes vary from a fraction to another. The relative mistake raised at the time of the increase of the tampon volume is of 10.73% for the albumin and 48,41% for the gammaglobulines.

When the solution of coloration is recontituted with the tape water, the picture of migration is faded and uninterpretable.

During an analysis of electrophoresis no condition of migration, must not be disregarded because of the importance of this exam in biology clinic.

Discipline: Biochimie

Mots clés: électrophorèse, protéine, serum, gel d’agarose

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INTRODUCTION INTRODUCTION INTRODUCTION INTRODUCTION

PREMIERE PARTIE

PREMIERE PARTIE PREMIERE PARTIE : GENERALITES PREMIERE PARTIE : GENERALITES : GENERALITES : GENERALITES

DEUXIEME PARTIE

DEUXIEME PARTIE DEUXIEME PARTIE : CADRE ET METHODE D’ETUDE DEUXIEME PARTIE : CADRE ET METHODE D’ETUDE : CADRE ET METHODE D’ETUDE : CADRE ET METHODE D’ETUDE

TROISIEME PARTIE

TROISIEME PARTIE TROISIEME PARTIE : RESULTATS TROISIEME PARTIE : RESULTATS : RESULTATS : RESULTATS

QUATRIEME PARTIE

QUATRIEME PARTIE QUATRIEME PARTIE : DISCUSSION QUATRIEME PARTIE : DISCUSSION : DISCUSSION : DISCUSSION

CONCLUSION ET RECOMMAND CONCLUSION ET RECOMMAND CONCLUSION ET RECOMMAND

CONCLUSION ET RECOMMANDATION ATION ATION ATION P L A N

P L A N

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INTRODUCTI INTRODUCTI INTRODUCTI

INTRODUCTION ON ON ON

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RAPPORT DE STAGE – LICENCE PROFESSIONNELLE – 2008 1

FACTEURS INFLUENCANT UNE MIGRATION ELECTROPHORETIQUE DOTOU EDWIGE & ZOHOUN LOICA

L’état sanitaire de la population dépend de la qualité des prestations des praticiens, mais ceux-ci doivent avoir confiance et s’appuyer sur les capacités diagnostiques des laboratoires de Biologie qui sont un élément essentiel du système de santé.

Malgré, l’amélioration des outils biologiques disponibles dans le domaine des explorations diagnostiques aboutissant parfois à une meilleure standardisation et à un niveau plus élevé de performance,la réalisation en routine de l’électrophorèse pose parfois quelques problèmes d’interprétation .

Dans le cadre de notre stage de fin de formation au Centre National Hospitalier et Universitaire Hubert K. Maga (CNHU-HKM), nous avons dans nos observations pratiques constaté au niveau des migrations électrophorétiques ce qui suit : la longueur des migrations n’est pas toujours la même, les images parfois décolorées ou déformées, ce qui nécessite quelques fois des reprises.

Pour apporter notre contribution à la résolution des difficultés inhérentes à la réalisation de l’électrophorèse nous avons choisi comme thème d’application de stage : « Les facteurs influençant une migration électrophorétique ».

Notre objectif général est de déterminer les difficultés qui peuvent conduire à la reprise d’une migration électrophorétique.

INTRODUCTION

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Nos objectifs spécifiques sont :

1-Explorer les différents facteurs qui interviennent dans la migration lors de l’électrophorèse des protéines ;

2- Faire ressortir les erreurs d’interprétation liées au non respect de ces conditions.

Pour atteindre ces objectifs, le présent travail sera structuré en quatre parties :

La première sera consacrée aux généralités sur les électrophorèses. Dans la deuxième partie, nous indiquerons le cadre et la méthode de travail. La troisième partie présentera les résultats qui seront analysés et interprétés dans la quatrième partie. Puis suivront notre conclusion et nos recommandations.

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GENERALITES GENERALITES GENERALITES GENERALITES

cÜxÅ|¢Üx ctÜà|x

cÜxÅ|¢Üx ctÜà|x ^:

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1 1 1----1 Définition 1 1 Définition 1 Définition 1 Définition

L’électrophorèse est une méthode physique de séparation de molécules ionisées sous l’influence d’un champ électrique. La séparation est fonction de leurs charges dans un tampon de pH donné.

Le fractionnement obtenu va permettre d’orienter ou de confirmer un diagnostic biologique, d’où la nécessité de choisir une méthode électrophorétique sensible et résolutive permettant de déceler les moindres variations par rapport à un profil plysiologique [1 ; 2 ; 3].

1 11

1----2222 DifféreDifférentes types d’électrophorèse DifféreDifférentes types d’électrophorèse ntes types d’électrophorèse ntes types d’électrophorèse

∼ Electrophorèse libre

Elle est dite également en veine liquide ou électrophorèse de frontière. Les particules ne se séparent pas complètement mais ils forment des frontières mises en évidence par des méthodes optiques telle que l’absorption ultra violette pour les protéines.

∼ Electrophorèse analytique

Elle a pour but la séparation du plus grand nombre possible de constituants d’un mélange. Les supports souvent utilisés sont les gels d’amidon de polyacrylamide, d’acrylamide et d’agarose.

Ces gels possèdent des propriétés filtrantes qui permettent de

1 1

1 1----GENERALITES GENERALITES GENERALITES GENERALITES

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séparer les particules non seulement en fonction de leurs charges électriques mais aussi de leur taille.

∼ Electrophorèse préparative

Elle a pour but d’obtenir des quantités plus ou moins importantes d’un ou de plusieurs constituants d’un mélange.

Aussi, le rendement de l’opération doit il être pris en considération depuis de la finesse de la séparation.

∼ Electrophorèse de zone

La migration est réalisée dans une phase liquide mais celle- ci s’imprègne dans un milieu solide poreux ou un milieu gélifié. Ici les supports, les plus utilisés sont le papier, l’acétate de cellulose et les gels de gélose ou d’agarose. L’électrophorèse de zone est le procédé le plus pratiqué et le moins coûteux. C’est ce procédé qui est utilisé au laboratoire de biochimie où nous sommes en stage. Il est réalisé sur un support d’agarose (hydragel) [2 ; 4 ; 5 ; 6].

1 11

1----3333 Electrophorèse en biologie cliniqueElectrophorèse en biologie cliniqueElectrophorèse en biologie cliniqueElectrophorèse en biologie clinique

En biologie clinique lorsqu’on parle d’électrophorèse, il s’agit souvent de l’électrophorèse de l’hémoglobine, des protéines sériques et de l’immunoélectrophorèse.

L’électrophorèse de l’hémoglobine qui porte sur les chaînes de la globine permet de séparer les hémoglobines normales des hémoglobines anormales. Elle permet donc de poser le diagnostic des hémoglobinopathies.

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Les hémoglobines anormales définissent l’affection appelée hémoglobinopathie qui est le résultat d’une anomalie soit de structure ou de synthèse portant sur l’une des chaînes de la globine. Lorsqu’il s’agit d’une anomalie de structure on parle d’une hémoglobinopathie qualitative due à une substitution d’un acide aminé par un autre. C’est le cas par exemple des hémoglobinopathies S, C,D ect….

On parle d’une hémoglobinopathie quantitative lorsque l’anomalie est de synthèse comme c’est le cas dans les thalassémies [1 ; 7 ; 8 ; 9].

L’électrophorèse des protéines sériques constitue un moyen d’exploration permettant l’orientation du diagnostic clinique dans les cas suivants : les maladies inflammatoires, les douleurs osseuses, la surveillance des myélomes, les maladies infectieuses, le suivi des greffes (rénale ou autres), le suivi des maladies auto- immunes, le suivi des sujets à VIH, les cirrhoses, la recherche des hypo ou hypergammaglolinémies, les syndromes néphrotiques etc… [10 ; 11]

L’immunoélectrophorèse permet l’identification des immunoglobulines monoclonales, marqueurs des gammapathies

détectées lors de l’électrophorèse des protéines [1 ; 12 ; 13].

11----4 Place de l’agarose (hydragel) dans l’électrophorèse en 11 4 Place de l’agarose (hydragel) dans l’électrophorèse en 4 Place de l’agarose (hydragel) dans l’électrophorèse en 4 Place de l’agarose (hydragel) dans l’électrophorèse en Biochimie Clinque Biochimie Clinque Biochimie Clinque Biochimie Clinque

A l’heure actuelle deux supports sont très largement utilisés en biologie clinique, l’acétate de cellulose et l’agarose.

L’acétate de cellulose, généralement coloré avec du rouge ponceau est couramment utilisé en routine.

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L’introduction de l’agarose au milieu des années quatre- vingts (80) a nettement amélioré la qualité de l’électrophorèse par :

∼ La possibilité d’utiliser aisément des colorants beaucoup plus sensibles que le Rouge Ponceau (amidoschwarz, violet acide…), permettant la détection de très petites bandes.

∼ La transparence initiale du gel, qui s’adapte à l’utilisation de système de révélation spécifique tels que les colorants lipidiques, les substrats enzymatiques ou des anticorps.

Le support d’agarose prend donc une part de plus en plus prépondérante en biologie clinique [14 ; 15 ; 16].

11----5 Les facteurs qui gouvernent une migration électrophorétique11 5 Les facteurs qui gouvernent une migration électrophorétique5 Les facteurs qui gouvernent une migration électrophorétique5 Les facteurs qui gouvernent une migration électrophorétique La vitesse d’une migration est fonction de plusieurs paramètres :

v = E x q/r x 1/h

v = Vitesse de migration q = charge électrique r = rayon de la molécule h = constante de viscosité E = champ électrique

Les principaux facteurs sont :

1-5-1Les caractéristiques de la molécule

Sa charge, sa forme, son poids moléculaire, sa tendance à la dissociation et son comportement amphotère. Ainsi plus le rapport q/r est élevé, plus la protéine migrera vite.

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1-5-2 Les caractéristiques du milieu

a- La force ionique

La conductivité est proportionnelle à la force ionique et le déplacement des molécules est inversement proportionnel à la force ionique.

Un tampon trop concentré donc de force ionique élevée, entraîne une bonne focalisation des fractions mais une migration courte et des fractions mal séparées.

Un tampon trop dilué donc de force ionique faible, entraîne une migration rapide mais des fractions floues et mal focalisées.

Etant donné que l’intensité du courant est proportionnelle à la force ionique, il est important de vérifier l’intensité initiale.

b- Température du tampon et température ambiante

Si la température du tampon et la température ambiante sont supérieures à 30°C, la migration sera longue et les fractions plus floues.

c- Le volume au tampon

La migration dépend du rapport E = V/L E = champ électrique

V = différence de potentiel

L = distance entre les deux électrodes

Lorsque le volume du tampon est trop important dans la cuve de migration la distance de la partie émergée du gel est diminuée, d’où une migration qui sera plus rapide. Lorsque le volume est

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insuffisant, la distance de la partie émergée est augmentée, d’où une migration courte.

d- La préparation du tampon

Le tampon doit être préparer ave une eau de bonne qualité (distillé ou déminéralisée). Une eau mal désionisée entraîne une augmentation de la force ionique donc un échauffement plus important pouvant donner des diffusions et une migration courte.

e- Le pH du tampon

Le pH impose la charge aux protéines.

∼ A pH basique les molécules s’ionisent négativement et migrent de la cathode vers l’anode.

∼ A pH acide les molécules s’ionisent positivement et migrent de l’anode vers la cathode.

Plus le tampon est basique, plus les molécules sont attirées vers l’anode.

f-Le courant d’électroendosmose

Il dépend de la nature du tampon, de son pH et de la charge même du support. Un support très chargé négativement et tamponné en milieu alcalin va attirer les cations de la solution tampon et créer un courant inverse qui entraîne les fractions les moins chargées dans le sens inverse de la migration.

g-La composition du gel

La migration des molécules dépend de la concentration en agarose. Le gel doit avoir une porosité permettant une mobilité

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suffisance. Le support doit être chimiquement inerte, homogène et présenter une bonne résistance mécanique.

1-5-3 Le dépôt

La focalisation des fractions dépend essentiellement de la finesse du dépôt et de la concentration en protéines.

1-5-4 Le temps de migration

La longueur de migration est proportionnelle au temps de migration.

1-5-5 Les conditions de migration voltage/intensité.

La longueur et la qualité de la migration dépendent du voltage appliqué. Un voltage et une intensité faibles entraînent une migration lente et des fractions diffuses. Un voltage élevé entraîne une migration plus rapide, mais également une intensité plus forte et donc un échauffement important. Le voltage sera un compromis déterminé en fonction de la force ionique du tampon [16 ; 17].

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CADRE DE TRAVAIL ET CADRE DE TRAVAIL ET CADRE DE TRAVAIL ET CADRE DE TRAVAIL ET

METHODE METHODE METHODE METHODE

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22----1.Cadr22 1.Cadr1.Cadr1.Cadreee e

Notre stage s’est déroulé dans les laboratoires du Centre National Hospitalier et Universitaire (CNHU-HKM) de Cotonou

Créé en 1962, le CNHU-HKM occupe une superficie de dix (10) hectares. De type pavillonnaire il avait à sa création une capacité de 350 lits. Il dispose actuellement d’une capacité de plus de 1000 lits répartis dans différents services tels que la chirurgie, la viscérale, la pédiatrie, la médecine, l’endocrinologie, la traumatologie, la chirurgie pédiatrique, le SMAU(Service Médical d’Accueil et des urgences),la cardiologie l’ophtalmologie, la génécologie obstétrique. Les services médico-techniques tels que : l’hématologie, la parasitologie-mycologie, la bactériologie- virologie, la banque de sang et la biochimie, ont été les lieux de notre stage.

Nous avons été beaucoup plus en biochimie car c’est dans ce laboratoire que nous avons effectué la pratique de notre rapport de stage.

Le service de biochimie du CNHU-HKM où se sont déroulés nos travaux est logé dans l’ancien bloc des laboratoires. Annexé d’une salle de prélèvement, il comporte un grand laboratoire et un petit laboratoire, un secrétariat, trois bureaux et une salle de garde avec ses dépendances.

Les diverses activités qui s’y déroulent font de lui un laboratoire de références au BENIN.

Les examens biochimiques de routine, l’enzymologie et les examens spéciaux relevant de l’hormonologie sont exécutés dans

2 2 2

2----CADRE DE TRAVAIL ET METHODE CADRE DE TRAVAIL ET METHODE CADRE DE TRAVAIL ET METHODE CADRE DE TRAVAIL ET METHODE

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ce laboratoire avec des appareils performants et un personnel bien qualifié.

Ce personnel dirigé par un professeur agrégé de biochimie clinique et deux surveillants est composé de six (06) ingénieurs en biologie, de deux (02) techniciens supérieurs, de dix (10) techniciens B, de deux secrétaires puis de cinq (05) agents de services hospitaliers.

22----2. Méthode 22 2. Méthode 2. Méthode 2. Méthode

Pour mettre en évidence nos observations au cours du stage nous avons choisi l’électrophorèse des protéines.

L’électrophorèse des protéines permet de bien identifier les fractions pathologiques à condition que la migration électro- phorétique soit bien réalisée.

Aussi devons-nous signaler que la densitométrie est obligatoire dans ce cadre, ce qui n’est pas le cas pour l’électrophorèse de l’hémoglobine ni pour l’immunoélectrophorèse.

La densitomètre d’un profil électrophorétique exige une migration qui tient compte rigoureusement des différents facteurs qui gouvernent une migration électrophorétique.

Principe

L’électrophorèse des protéines sériques est basée sur la séparation des protéines en milieu tampon alcalin (pH 8.5) par un champ électrique sur un support solide. Un gel d’agarose est utilisé comme le support solide. Il donne une séparation des constituants sériques humains en six fractions majeures de mobilités différentes : Albumine, alpha-1 globuline, Alpha-2 globuline, Bêta-1globuline, Bêta 2 globuline, gamma globuline.

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Nous avons utilités le kit HYDRAGEL PROTEIN(E) K20®

(Sebia, France). Chaque gel d’agarose contenu dans le Kit est prévu pour l’analyse de sept (7) échantillons et la boîte contient dix (10) gels.

Matériels

- Générateur de courant continu MG300;

- Cuve d’électrophorèse K20;

- Pipette de 10µl, 200µl et 1ml ; - Embouts jaune et bleu ;

- Bacs de fixation, de coloration et de décoloration ;

- Applicateur HYDRAGEL K20 SEBIA, contenant le porte applicateur HYDRAGAEL K20 ;

- Densitomètre ;

- Incubateur –sécheur IS-80.

- Papiers filtres fins ,

- Applicateurs sept dents prêt à l’emploi ;

Réactifs

L’électrophorèse sur gel d’agarose des protéines sériques a été réalisée grâce à l’utilisation du Kit HYDRAGEL PROTEIN(E) K20 qui fournit tout le réactif nécessaire :

- Gel d’agarose prêt à l’emploi ;

- Tampon tris barbital en solution concentrée ; - Colorant d’amidoschwarz

- Autres accessoires nécessaires mais non fournis : l’eau distillée ; le Fluidil.

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Mode opératoire

Préparation de la solution tampon :

Chaque flacon de tampon concentré de 100 ml est complété à 1000 ml avec de l’eau distillée ou déminéralisée.Le tampon ainsi préparé contient : Tris barbital pH 8,5+/- 0.3 et azoture de sodium.

Le tampon concentré peut être conservé à la température ambiante ou au réfrigérateur.

Le tampon dilué est stable pendant 1 mois au réfrigérateur à 4°C La cuve K20 est constituée de deux compartiments pouvant contenir chacun 150 ml de solution tampon.

Préparation de la solution de coloration :

- Prendre un flacon (20ml) de solution concentrée d’Amidoschwaz.

- Ajouter 60 ml de diluant colorant ; - Bien mélanger ;

- Compléter à 300 ml avec de l’eau distillée ou déminéralisée ;

- Mélanger parfaitement pendant 10 ml minutes ;

Le colorant est prêt à l’emploi.

Migration :

- poser le porte applicateur HYDRAGEL K20 à plat sur la paillasse et relever le chariot porte applicateur ;

- déposer 120µl d’eau distillée sur le plateau du porte applicateur dans le tiers inférieur du cadre sérigraphié ; - sortir le gel de son emballage ;

(36)

- éliminer rapidement l’excès de liquide en surface, en effleurant le gel avec un papier filtre fin ;

- placer le gel (face orientée vers le haut) sur le plateau du porte applicateur contre la barrette à l’intérieur du cadre sérigraphié ;

- abaisser chariot du porte applicateur en position intermédiaire ;

- poser un applicateur à plat sur la paillasse, la face numérotée (puits) vers le haut ;

- déposer 10µl du sérum dans chaque puits. Le chargement de l’applicateur ne doit pas excéder 2 minutes et doit être utilisé immédiatement après le chargement ;

- éliminer la protection des dents de l’applicateur et le placer en position n°5 sur le porte applicateur ;

- ramener le chariot porte applicateur en butée à l’aide de la manette pour amener l’applicateur au contact du gel ; - après 40 secondes d’applications tourner la manette du

porte applicateur pour relever l’applicateur et le jeter ; - placer le gel dans la cuve d’électrophorèse ,selon la

polarité indiquée sur le gel, l’extrémité inférieure de migration du gel coté cathodique .Le gel est plongé dans le tampon (face orientée vers le bas) sur une distance de 1cm de chaque coté ;

- brancher la cuve au générateur.

Les conditions de migrations sont les suivantes :

(37)

TABLEAU I : Facteurs impliqués dans la migration

CONDITIONS DE MIGRATION CONDITIONS OPERATOIRES CONDITIONS DE MIGRATION CONDITIONS OPERATOIRESCONDITIONS DE MIGRATION CONDITIONS OPERATOIRES CONDITIONS DE MIGRATION CONDITIONS OPERATOIRES

Volume de tampon par compartiment 150 millilitres Volume total de tampon 300 millilitres Temps de migration 22 minutes Voltage constant 90 volts

Ampérage de départ (par gel) 12 milliampères

- Après migration, arrêter le générateur, débrancher la cuve et sortir le gel.

Fixation – coloration- décoloration du gel :

Nous avons adopté la fixation à la chaleur, le gel est séché sous air chaud à 80°C dans l’incubateur–sécheur (IS-80) jusqu'à séchage complet pendant au moins 10 minutes.

Le gel refroidi est d’ abord immergé dans la solution de coloration pendant 4 minutes, puis dans trois bains successifs de solution de décoloration (sans excéder 3 minutes par bain), jusqu’à obtention d’un fond parfaitement clair.

Le gel est ensuite séché dans l’étuve IS-80 pendant 15 minutes.

(38)

Lecture :

LLa migration ainsi réalisée est prête pour une lecture à 570 LL nm au densitomètre Hyrys-2 permettant de définir les concentrations relatives (en pourcentages et en gramme /litre) de chaque fraction.

(39)

RESULTATS RESULTATS RESULTATS RESULTATS

gÜÉ|á|¢Åx ctÜà|x gÜÉ|á|¢Åx ctÜà|x gÜÉ|á|¢Åx ctÜà|x gÜÉ|á|¢Åx ctÜà|x ^:

(40)

17

RAPPORT DE STAGE – LICENCE PROFESSIONNELLE - 2008

333

3----1 Migration Electrophoréti1 Migration Electrophoréti1 Migration Electrophoréti1 Migration Electrophorétique normaleque normaleque normale que normale

Figure Figure Figure

Figure 1111 : MIGRATION ELECTROPHORETIQUE NORMALE : MIGRATION ELECTROPHORETIQUE NORMALE : MIGRATION ELECTROPHORETIQUE NORMALE : MIGRATION ELECTROPHORETIQUE NORMALE

La figure 1 est le résultat d’une migration de l’électrophorèse des protéines sériques. Pour cette image les conditions optimales prescrites pour une migration électrophorétique sur HYDRAGEL K20 en biologie clinique ont été bien respectées.

L’intégration au densitomètre Hyrys-2 de l’électrophorégramme de l’échantillon n°1 de cette migration nous a permis d’avoir les

3 3 3

3---- RESULTATS RESULTATS RESULTATS RESULTATS

(41)

différentes fractions protéiques dans les proportions suivantes (figure 2) :

Albumine 52.2 % (soit 38,2 g/l) ; Alpha-1 3.2 % (soit 2.3g/l) ; Alpha-2 9.3% (soit 6.8 g/l) Bêta-1 6.5 % (soit 4.7 g/l) Bêta-2 3.2% (soit 2.3g/l) Gamma 25.6 % (soit 18.7g/l)

(42)

Figure-2 : Electrophoregramme de l’échantillon de sérum N°-1

333

3----2 Anomalies Relevées lors des Migrations Electrophoretiques2 Anomalies Relevées lors des Migrations Electrophoretiques2 Anomalies Relevées lors des Migrations Electrophoretiques2 Anomalies Relevées lors des Migrations Electrophoretiques

3-2-1 Modification du volume de tampon

Figure 3: Volume supérieur au volume normal (200 ml par compartiment au lieu de 150 ml)

Figure 4: Volume de tampon inférieur au volume normal (100 ml par compartiment au lieu de 150 ml)

(43)

La figure 3 est le résultat de l’utilisation de volumes de tampon différents de celui indiqué par le fabriquant.

Un volume de tampon supérieur au volume normal (figure 3) donne une migration plus étalée par rapport à la figure-1 alors qu’un volume insuffisant (figure 4) montre une migration plus courte.

Dans le premier cas (Figure 3), le profil du même échantillon-1 nous donne une surestimation (albumine=57.9 % au lieu de 52.2%) ou une sous-estimation (Gammaglobuline 17.3% au lieu de 25.6 %) du pourcentage des différentes fractions isolées.

Dans le second cas (Figure 4) ces mêmes fractions sont mal séparées et difficilement identifiables à l’électrophorégramme.

(44)

Figure 5 : Electrophorégramme de l’échantillon de sérum N°-1

(45)

Figure 6: Electrophorégramme de l’échantillon de sérum N°1

(46)

3-2-2 : Modification du temps d’application de l’échantillon

Figure 7: Temps d'application (de dépôt) supérieur au temps normal (1 minute au lieu de 40 secondes)

Lorsque le temps de dépôt appelé encore temps d’application de l’échantillon est plus long (1minute) nous obtenons (Figure 7) après la coloration, une image plus foncée par rapport à celle de la figure 1.

Albumine 57.9% au lieu de 52.2 % Alpha-1 2.2 % au lieu de 3.2 % Alpha-2 10.7 % au lieu de 9.3 % Bêta-1 9.5 % au lieu de 6.5 % Bêta-2 3.2 % et 3.2 % Gamma 16.5 % au lieu de 25.6 %

(47)

Figure 8: Electrophorégramme de l’échantillon de sérum N°1

(48)

3-2-3: Modification de l’intensité

Figure 9: intensité supérieure (18mA) Figure 9: intensité supérieure (18mA)Figure 9: intensité supérieure (18mA) Figure 9: intensité supérieure (18mA)

Avec une intensité supérieure (18 milliampères) nous avons une migration trop longue (figure 9). L’électrophorégramme montre 7 fractions (figure 10) au lieu de six fractions et l’identification est difficile.

(49)

Figure 10 : Electrophoregramme de l’échantillon de sérum N°1

(50)

Figure 11 Figure 11 Figure 11

Figure 11 : Intensité inférieure (8 milliampères): Intensité inférieure (8 milliampères): Intensité inférieure (8 milliampères): Intensité inférieure (8 milliampères)

Une intensité faible (8 milliampères) donne une migration courte. La lecture densitométrique de l’échantillon de sérum N°1 donne seulement quatre (4) fractions (figure 12) au lieu de six (6).

(51)

Figure12 : Electrophorégramme de l’échantillon de sérum N°1

(52)

3-2-4 Préparation de la solution de coloration avec l’eau de robinet

Figure 13 : colorant reconstitué à l’eau de robinet: colorant reconstitué à l’eau de robinet: colorant reconstitué à l’eau de robinet: colorant reconstitué à l’eau de robinet

Quand la solution de coloration est préparée à l’eau de robinet l’image obtenue est faiblement colorée (Figure) et les différentes fractions protéiques sont à peine identifiables.

L’électrophorégramme n’a pas été possible.

(53)

3-2-5: Temps de décoloration allongé

Figure 14 : Temps de décoloration allongé (7minutes par bain): Temps de décoloration allongé (7minutes par bain): Temps de décoloration allongé (7minutes par bain): Temps de décoloration allongé (7minutes par bain)

Lorsque le temps de décoloration est allongé, les bandes de migration sont à peine visibles.

(54)

3-2-6 : Utilisation d’un gel d’agarose périmé

Figure 15 Figure 15Figure 15

Figure 15 : Migration réalisée avec un support périmé: Migration réalisée avec un support périmé: Migration réalisée avec un support périmé : Migration réalisée avec un support périmé

L’électrophorèse réalisée avec un support périmé ne permet pas la mise en évidence de tous les échantillons déposés. C’est ce que montre la figure 7 où nous avons utilisé toujours les sept (7) échantillons de sérum de départ mais après décoloration, quatre (4) seulement ont été révélés. Un support périmé n’aurait certainement plus une bonne porosité permettant une mobilité suffisante des molécules de protéine.

(55)

3-2-7 : Modification du temps de migration

Figure 16 Figure 16Figure 16

Figure 16 : Temps de migration allongé (35 minutes): Temps de migration allongé (35 minutes): Temps de migration allongé (35 minutes): Temps de migration allongé (35 minutes)

Avec un temps de migration différents de celui indiqué par le fabriquant, les différentes fractions protéiques sont mal séparées (figure 16) et l’électrophorégramme est difficilement interprétable (figure 17).

(56)

Figure 17 : Electrophorégramme de l’échantillon de sérum N°1: Electrophorégramme de l’échantillon de sérum N°1: Electrophorégramme de l’échantillon de sérum N°1 : Electrophorégramme de l’échantillon de sérum N°1

(57)

3-2-8 : Temps de migration réduit

Figure 18

Figure 18Figure 18

Figure 18 : Temps de migration réduit (15 minutes): Temps de migration réduit (15 minutes): Temps de migration réduit (15 minutes) : Temps de migration réduit (15 minutes)

Un temps de migration réduit donne des bandes de migration courtes Figure 18 et l’électrophorégramme montre seulement quatre fractions au lieu de six (6) avec un temps normal (22 minutes)

(58)

Figure 19 : Electrophorégramme de l’échantillon sérum N°1: Electrophorégramme de l’échantillon sérum N°1: Electrophorégramme de l’échantillon sérum N°1: Electrophorégramme de l’échantillon sérum N°1

(59)

La comparaison de l’électrophorégramme de la migration faite dans les conditions prescrites par le fabriquant de HYDRAGEL K20 et celle de la migration réalisée avec un volume de tampon supérieur sur le sérum n°1 est présentée dans le Tableau II ci-dessous :

Différentes fractions Différentes fractions Différentes fractions Différentes fractions protéiques

protéiques protéiques protéiques

Migration faite avec Migration faite avec Migration faite avec Migration faite avec : : : : Volume Normal

Volume Normal Volume Normal Volume Normal

Migration Migration Migration Migration faite

faite faite

faite avec: Volume avec: Volume avec: Volume avec: Volume Supérieur

Supérieur Supérieur Supérieur

% g/l % g/l

Albumine 52,2 38,2 57,9 42,3

Alpha-1 3,2 2,3 1,5 1,1,

Alpha-2 9,3 6,8 10,7 7,8

Bêta-1 6,5 4,7 8,4 6,1

Bêta-2 3,2 2,3 4,2 3,1

Gamma 25,6 18,7 17,3 12,6

Rapport :

Gamma / albumine 0,49 0,30

Différence relative de

concentration de l’albumine 10,73%

Différence relative de concentration des gamma globulines

48,41%

TABLEAU II TABLEAU IITABLEAU II

TABLEAU II : : : : Comparaison des résultats de deux migrations électrophorétiques avec des volumes de tampon différents

LES FACTEURS INFLUENCANT UNE MIGRATION ELECTROPHORETIQUE