Résumé Résumé

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Résumé

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Résumé

Les fibres amyloïdes sont des agrégats de protéines hautement organisés qui sont associés à une trentaine de maladies appelées amyloses, dont les maladies d'Alzheimer et de Parkinson et la maladie de la vache folle. L'amylose systémique à lysozyme est une amylose non-neuropathique héréditaire associée à sept variants de la protéine (Y54N, I56T, F57I, W64R, D67H, F57I/T70N et W112R/T70N). Ces protéines forment des fibres amyloïdes extracellulaires qui se déposent dans de nombreux tissus et organes tels que le foie, la rate et les reins. Il a été montré que les mutations I56T et D67H diminuent la stabilité et la coopérativité globale de la protéine. Ainsi, dans des conditions proches des conditions physiologiques, ces variants forment, in vitro, transitoirement un état intermédiaire dans lequel le domaine β et l'hélice C se déplient de manière coopérative, alors que le reste du domaine α conserve sa structure native. La formation d'interactions intermoléculaires entre les régions dépliées serait à l'origine du processus d'agrégation qui conduit à la formation et au dépôt de fibres amyloïdes dans les tissus des patients porteurs de ces mutations. Il a également été montré que la liaison de trois fragments d'anticorps à chaînes lourdes de camélidés (V

_H

H), dirigés contre le lysozyme humain de sauvage, inhibe in vitro la formation de fibres amyloïdes par les variants D67H et I56T. Ces trois V

H

H se lient à des régions différentes du lysozyme et inhibent la formation de fibres amyloïdes selon différents mécanismes.

Au cours de ce doctorat, seize nouveaux V

H

H spécifiques du lysozyme humain ont été générés. Des expériences de liaisons compétitives suivies par résonnance plasmonique de surface ont montré que les 16 V

H

H se lient à cinq épitopes distincts à la surface du lysozyme. Quatre d’entre eux sont capables de se lier au lysozyme dans les conditions utilisées in vitro pour induire la formation de fibres amyloïdes par les variants du lysozyme. Leur site de liaison a été déterminé par RMN. Deux d'entre eux reconnaissent des épitopes différents de ceux des trois V

H

H caractérisés précédemment. Des expériences d’échange H/D analysés par spectrométrie de masse ont montré que les 4 V

H

H ont des capacités différentes à restaurer la coopérativité globale du variant D67H du lysozyme. L’analyse de l’ensemble des résultats nous a permis d’identifier qu'elles sont les régions du lysozyme qui doivent être affectées par la liaison d'un V

_H

H afin de restaurer la coopérativité globale de la protéine. La liaison simultanée aux deux domaines (i.e. α et β) semble être le dénominateur commun de tous les V

_H

H restaurant la coopérativité globale du variant D67H. La liaison aux hélices B et C, ainsi que de l'interface des deux domaines semble aussi contribuer à la restauration de la coopérativité globale. A l'inverse, une liaison qui perturbe la partie N-terminale ne permet pas de restaurer la coopérativité globale de la protéine. La liaison d’un V

H

H, cAb-HuL9a, au variant D67H du lysozyme inhibe de manière similaire la formation de l’intermédiaire partiellement déplié, l'élongation de fibres amyloïdes préformées et la formation de fibres amyloïdes in vitro. Cette observation est en accord avec l’hypothèse selon laquelle, la formation de cet intermédiaire est à l’origine de l’amyloïdogénicité des variants du lysozyme.

Afin d'étudier les effets des mutations amyloïdogéniques récemment identifiées sur les propriétés du lysozyme et ainsi obtenir une meilleure connaissance du mécanisme de formation des fibres amyloïdes, il est nécessaire de produire ces variants en grande quantité. Les variants D67H, I56T et F57I sont produits dans Aspergillus niger. L'expression des variants dans ce micro-organisme est toutefois particulièrement chronophage alors que les rendements de production sont relativement faibles. Les tentatives d'utiliser d'autres systèmes de production tels que Pichia pastoris ou le système bacculovirus n'ont pas été concluantes. Aussi, dans le cadre de mon doctorat, j’ai étudié la possibilité de produire le variant D67H sous forme de corps d'inclusion dans Escherichia. coli. Un protocole permettant de produire 20 mg de protéine sous forme de corps d’inclusion par litre de culture a été développé.

Différents stratégies ont été testées pour replier la protéine à partir des corps d’inclusion. Cette

approche a permis d’obtenir une protéine ayant 90% d’activité spécifique du lysozyme. Le rendement

massique obtenu après repliement est néanmoins très faible.

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Summary

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Summary

Amyloid fibrils are highly organized protein aggregates, which are associated with nearly 30 diseases, referred to as amyloidosis and including Alzheimer and Parkinson diseases and the mad cow disease.

Lysozyme amyloidosis is a hereditary non-neuropathic systemic amyloidosis which is associated with seven variants of (Y54N, I56T, F57I, W64R, D67H, F57I/T70N and W112R/T70N). These proteins form extracellular amyloid fibrils that deposit in a wide range of tissues and organs such as liver, spleen and kidneys. It was shown that the D67H and I56T mutations cause a decrease in stability and in the global cooperativity of the protein. Consequently, under physiologically relevant conditions, these variants can transiently populate a partially unfolded state in which the β-domain and the C-helix are cooperatively unfolded while the rest of the α-domain remains native like. The formation of intermolecular interactions between the regions that are unfolded in this intermediate state are likely to be a fundamental trigger of the aggregation process that ultimately leads to the formation and deposition of fibrils in tissues. It was also shown that the binding of three variable domains of camelid heavy-chain antibodies (V

_H

Hs), raised against the wild type human lysozyme, inhibit in vitro the formation of amyloid fibrils by the lysozyme variants. These three V

H

Hs bind on different regions of lysozyme and act as amyloid fibril inhibitor through different mechanisms.

In the present work, sixteen new V

H

Hs specific of human lysozyme have been generated. Competitive binding experiments carried out by surface plasmon resonance have shown that they bind to five non- overlapping epitopes at the surface of lysozyme. Four of them are able to bind lysozyme under conditions used to trigger fibril in vitro amyloid fibril formation. Their binding sites have been mapped by NMR and interestingly two of them recognize two epitopes that are different from those of the three V

H

Hs previously characterized. H/D exchange experiments analyzed by mass spectrometry showed that the four V

H

Hs have different abilities to restore the global cooperativity of the amyloidogenic variants of the lysozyme. The analysis of all our results allows us to identify the regions of lysozyme that should be bound or affected via long range effect, in order to restore the global cooperativity. The connection of the two domains of lysozyme molecule (i.e. the α and β domains) seems to be an important factor to restore the global cooperativity. The perturbation of the B and C-helixes and to the interface between the domains seems also important. On the opposite, the perturbation of the N-terminal region seems unfavorable for the restoration of the global cooperativity. The binding of cAb-HuL9a to the D67H variant inhibits to a similar extent the formation of the intermediate species, the elongation of preformed fibrils and the formation of fibrils in solution. This observation is in agreement with the hypothesis that the formation of the intermediate state is the determinant factor that leads to the formation of amyloid fibrils.

In order to study the effects of the newly discovered amyloidogenic mutations on the properties of lysozyme and thus to get more insights in the mechanism of amyloid formation, it is necessary to produce them in large quantities. The D67H andI56T and F57I variants are currently produced in Aspergillus niger; the expression in this organism is, however, time consuming and the yield is very low.

The attempts to use alternative systems such as Pichia pastoris, and Bacculovirus have not been conclusive so far. Thus, I investigate the possibility to produce the D67H variant in inclusion body in Escherichia coli. A protocol allowing to produce 20 mg of protein in inclusion body per liter of culture was established. Several strategies have been investigated to refold the protein from the inclusion body.

A protein displaying 90% of the specific activity of lysozyme was recovered; the yield of refolded protein

is however very low. The protocol of refolding should be further optimized.

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Table des Matières

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Remerciements ... 3

Résumé ... 7

Summary ... 9

Liste des abréviations ... 15

Partie I : Les V

H

H comme sondes structurales pour l'étude du mécanisme de la formation des fibres amyloïdes par les variants amyloïdogéniques du lysozyme humain ... 19

I Introduction ... 19

I.1 Fibres amyloïdes et maladies associées ... 19

I.1.a Généralités ... 19

I.1.b Les amyloses à lysozyme ... 22

I.1.c La formation des fibres amyloïdes ... 25

I.2 Le cas du lysozyme ... 29

I.2.a Structure tridimensionnelle ... 29

I.2.b Caractérisation biophysique à l'équilibre du lysozyme humain et de ses variants ... 31

I.2.c Cinétiques de repliement du lysozyme humain et de ses variants ... 32

I.2.d Formation transitoire d'un intermédiaire partiellement déplié ... 34

I.3 Les V

H

H comme sondes structurales potentielles du mécanisme de formation des fibres amyloïdes ... 37

I.3.a L’utilisation des anticorps dans la thérapie des amyloses ... 37

I.3.b Les fragments d'anticorps à chaînes lourdes (V

H

H) ... 39

I.3.c Les V

H

H comme sondes structurales pour la caractérisation moléculaire du mécanisme de formation des fibres amyloïdes ... 41

I.3.d La place des V

H

H dans l’approche médicale : de potentiels outils diagnostiques et thérapeutiques ... 47

I.3.e L'ingénierie des V

H

H ... 49

II Objectifs du travail... 51

III Matériels et Méthodes ... 53

III.1 Génération de V

H

H spécifiques du lysozyme humain : immunisation et sélection ... 53

III.2 Expression et purification de seize V

H

H spécifiques du lysozyme humain... 53

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Table des Matières

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III.3 Production et purification des variants I56T et D67H du lysozyme humain ... 54

III.4 Mesure de l'affinité des V

H

H pour le lysozyme humain et ses variants par résonnance plasmonique de surface ... 55

III.5 Dénaturation thermique des V

H

H suivie par fluorescence intrinsèque et par dichroïsme circulaire ... 55

III.5.a Dénaturation suivie par fluorescence intrisèque ... 55

III.5.b Dénaturation suivie par dichroïsme circulaire ... 56

III.6 Dénaturation thermique des V

H

H suivie par la fluorescence de l'ANS lié ... 56

III.7 Mesure de l'affinité des V

H

H pour le lysozyme sauvage en présence d'urée par microcalorimétrie à titration isotherme ... 57

III.8 Cinétiques d'échange H/D du variant D67H suivies par spectrométrie de masse ... 58

III.9 Suivi de l'agrégation du variant D67H par diffusion de la lumière ... 59

III.10 Microscopie électronique à transmission ... 59

III.11 Suivi de l'élongation des fibres amyloïdes du variant D67H par microbalance à quartz ... 59

III.11.a Immobilisation des fibres amyloïdes sur la surface d'or du quartz... 59

III.11.b Elongation des fibres amyloïdes ... 60

III.11.c Vérification de l'attachement et de l'élongation des fibres immobilisées à la surface du quartz par microscopie à force atomique (AFM) ... 61

III.12 Cartographie des épitopes des V

H

H par résonnance magnétique nucléaire (RMN) ... 61

III.12.a Acquisition des spectres ... 61

III.12.b Méthode d'analyse ... 62

IV RESULTATS ... 63

IV.1 Sélection de V

H

H fonctionnels dans les conditions utilisées pour former des fibres amyloïdes avec les variants du lysozyme humain ... 63

IV.2 Production des V

H

H et du lysozyme ... 65

IV.3 Mesure de l'affinité des V

H

H pour le lysozyme sauvage et ses variants ... 65

IV.4 Etude de la stabilité des V

H

H ... 67

IV.5 Cartographie des épitopes liés par les quatre V

H

H sélectionnés ... 74

IV.6 Effets de la liaison des V

H

H sur la coopérativité globale du variant D67H dans des

conditions non-dénaturantes ... 84

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Table des Matières

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IV.7 Effets de la liaison des V

H

H sur la dénaturation thermique du variant D67H ... 91

IV.8 Effet de la liaison des V

H

H sur la cinétique de formation des fibres amyloïdes. ... 93

IV.9 Effet de la liaison des V

H

H sur la cinétique d'élongation des fibres amyloïdes ... 96

V Discussion ... 101

V.1 Cartographie des sites de liaison des V

H

H restaurant la coopérativité globale du variant D67H ... 101

V.2 Inhibition de la formation des espèces intermédiaires : le mécanisme privilégié pour l'inhibition de la formation de fibres amyloïdes ... 106

VI Conclusions/Perspectives ... 107

Partie II : Optimisation de la production des variants amyloïdogéniques du lysozyme humain ... 111

I Introduction ... 111

I.1 Pourquoi développer un nouveau système de production des variants du lysozyme humain ? ... 111

I.1.a Les différents systèmes de production déjà testés ... 111

I.1.b La production des variants du lysozyme humain chez E. coli : quelle est la problématique ?... 112

I.2 La production de protéines recombinantes sous forme de corps d’inclusion ... 113

I.2.a Les corps d’inclusion ... 113

I.2.b Le repliement des protéines produites sous forme de corps d’inclusion ... 114

II Objectif : Le repliement des variants du lysozyme à partir des corps d’inclusion ... 117

III Matériels et Méthodes ... 119

III.1 Expression du variant D67H du lysozyme humain sous forme de corps d’inclusion ... 119

III.2 Purification du variant D67H en conditions dénaturantes et réductrices ... 119

III.3 Retrait de la méthionine N-terminale ... 120

III.4 Dénaturation du variant D67H du lysozyme humain avec réduction des ponts disulfures ... 120

III.5 Repliement par dilution rapide du variant D67H du lysozyme ... 120

III.6 Repliement, par dialyse, du variant D67H du lysozyme ... 121

III.7 Estimation des quantités de structures tertiaires et secondaires formées par le

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Table des Matières

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variant D67H ... 121

III.8 Mesure d’activité du lysozyme ... 122

IV Résultats ... 123

IV.1 Constructions génétiques ... 123

IV.2 Optimisation des conditions de culture ... 123

IV.3 Optimisation de la purification du variant D67H à partir des corps d’inclusion ... 126

IV.4 Repliement oxydatif par dilution rapide du lysozyme produit sous forme de corps d'inclusion ... 127

IV.4.a Effet de la présence de différents additifs ... 127

IV.4.b Effet du retrait de la méthionine N-terminale sur la structure et la stabilité du variant D67H replié à partir des corps d'inclusion (Partie effectuée avec la contribution de Patrick Zirbes) ... 129