HniverRité de Sherbrooke
Etude de l'expression des constituants de la lame basale au cours de la différenciation des cellules de la lignée intestinale humaine Caco-2/15
par
Pierre H. Vachon
Département d'anatomie et de biologie cellulaire
Mémoire présenté à la Faculté de médecine en vue de l'obtention du grade de
maître ès sciences (M.Sc.)
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ISBN 0-315-61248-7
" Each of us : a cell of awareness, imperfect and incomplete.
Genetie blends with mortal sentiments, On a fortune hunt that1s far too fleet.
If you choose a ready guide in some celestial voice; If you choose not to decide,
you still have made a choice; If you choose from phantom fears
and kindness that can kill,
I will choose a path that is clear I will choose free will ... " - FREE WILL : paroles de Neil Pert, du
groupe Rush (album "Permanent Waves11 ,
1980).
11 Wheels within wheels in a spiral array,
a pattern so grand and complex.
Time after time we loose sight of the way Our causes cannot see their effects ... " - NATURAL SCIENCE (idem).
11 Et pourtant, elle tourne ! 11
- Galilée (1564-1642).
n E
=
mc2 n~ABLE DES MATIERES
I'itre i
Table des matières . . . iii
Liste des illustrations . . . vi
Liste des abréviations . . . ix
Résumé . . . x
I - INTRODUCTION • • • • • . . • . • • • . . • • • • . • • . • • • • • . . • . . . • • • • • • • . . • • • • • • • . • • 1
1. Différenciation de l'épithélium intestinal humain... 1
1.1 Polarisation et différenciation entérocytaires ... 3
1.2 Modèles in vitro pour l'étude de la différenciation et des fonctions entérocytaires ... 4
1.2.1 Les lignées intestinales humaines d'origine cancéreuse . . . 5
1.2.2 La lignée cellulaire Caco-2 ... 7
2. Régulation de la différenciation de l'épithélium intestinal . 8 2. 1 Rôles de la lame basale . . . 10
2.2 Composition de la lame basale ... 12
2.2.1 Le collagène de type IV ... 12
2. 2. 2 La laminine . . . 15
2. 2. 3 La f ibronectine . . . 16
2.3 Rôles des principaux constituants de la lame basale dans la cytodifférenciation de l'épithélium intes-tinal . . . 17
iv.
3. Objectifs généraux du projet de recherche 21
II- MATERIEL ET METHODES . . . 23
1. culture des cellules Caco-2/15 . . . • . . . • . . . 23
2. Etudes morphologiques et ultrastructurales ...•...•.... 24
2.1 Microscopie à contraste de phase ... 24
2.2 Microscopie électronique à balayage ... 24
2.3 Microscopie électronique à transmission ... 27
3. Irnmunodétection de la sucrase-isomaltase et des principaux constituants de la lame basale . . . 28
3. 1 Préparation du matériel . . . 28
3. 2 Anticorps utilisés . . . • . . . • . . . 30
3.3 Procédure pour l'irnmunofluorescence indirecte ... 33
4. Irnmunodétection du C-IV dans un matériel extracellulaire isolé d'une culture de cellules Caco-2/15 •... 35
III- RESULTATS . . . • . . . . 37
1. Différenciation des cellules Caco-2/15 ...•.•... 37
1.1 Observations morphologiques et ultrastructurales ... 37
1. 2 Formation de dômes . . . • . . . 48
1.3 Expression de la sucrase-isomaltase 50 2. Expression des principaux constituants de la lame basale lors de la différenciation des cellules Caco-2/15 ... 52
2.1 Expression du collagène de type IV ...•... 52
2. 2 Expression de la laminine . . . • . • . . . • . . . • • 57
2.4 Immunodétection du collagène de type IV dans du matériel extracellulaire isolé d'une culture de
v.
cellules Caco-2/15 . . . 65
IV- DISCUSSION . . . 68
1. Différenciation des cellules de la lignée Caco-2/15 ... 68
1.1 Polarisation cellulaire structurale 1.2 Polarisation cellulaire fonctionnelle 1.3 Hétérogénéité dans la différenciation cellulaire de 69 73 la lignée Caco-2/15 . . . 76
1. 4 Conclusions . . . 77
2. Expression des principaux constituants de la lame basale par la lignée Caco-2/15 . . . 78
2.1 Expression du collagène de type IV ... 80
2. 2 Expression de la laminine . . . 83
2.3 Expression de la fibronectine ... 86
2.4 Hétérogénéité dans l'expression des principaux constituants de la lame basale chez les cellules Caco-2/ 15 . . . 88
2.5 Déposition in vitro de matériel extracellulaire ... 89
2. 6 Conclusions . . . 91
V- CONCLUSION GENERALE . . . 94
REMERCIEMENTS 99 REFERENCES . . . • 101
vi.
LISTE DES ILLUSTRATIONS
Figures
1. Structure moléculaire de la lame basale et de ses principaux
constituants 11
2. Organigramme de la préparation des échantillons pour la
micro-scopie électronique à balayage et à transmission ... 26 3. Etude par microscopie à contraste de phase de l'évolution de la
morphologie des cellules Caco-2/15 au cours de la
différen-ciation entérocytaire . . . 38
4. Evolution de l'apparence de la bordure en brosse des cellules Caco-2/15 lors de la différenciation entérocytaire analyse ultrastructurale par microscopie électronique à balayage ... 40 5. Polarisation structurale des cellules Caco-2/15 études par
microscopie optique . . . 42 6. Evolution des caractéristiques de polarisation des cellules
Caco-2/15 analyse ultrastructurale par microscopie électro-nique à transmission
7. Complexes de jonction, bordure en brosse et matériel extra-cellulaire : analyse ultrastructurale par microscopie électro-nique à transmission
8. Etude par microscopie à contraste de phase de la formation de dômes par les cellules Caco-2/15 en culture
44
47
vü.
9. Evolution de l'expression de la sucrase-isomaltase (SI) au cours de la différenciation entérocytaire des cellules
Caco-2/15 : détection par immunofluorescence indirecte 51 10. Expression du collagène de type IV (C-IV) et de la
sucrase-isomaltase (SI) au cours de la différenciation des
cellules Caco-2/15 détection en double marquage par
immune-fluorescence indirecte 54
11. Expression de la laminine (LAM) et de la sucrase-isomaltase
(SI) au cours de la différenciation des cellules
Caco-2/15 : détection en double marquage par immunofluorescence
indirecte 58
12. Expression de la fibronectine (FN) et du collagène de type IV
(C-IV) au cours de la différenciation des cellules Caco-2/15
détection en double marquage par immunofluorescence indirecte 62 13. Détection du C-IV dans un matériel extracellulaire déposé en
culture par les cellules Caco-2/15 immunofluorescence
in-directe in situ 66
Tableaux
1. Les constituants de la lame basale et leurs fonctions ... 13 2. Irrununofluorescence indirecte sur des coupes transversales de
cellules Caco-2/15 et d'intestin grêle foetal humain: anticorps monoclonaux (de souris) et polyclonaux (de lapin) utilisés pour l'étude de l'expression de la sucrase-isomaltase (SI), du col-lagène de type IV (C-IV), de la laminine (LAM) et de la
3. Imrnunofluorescence indirecte sur des coupes transversales de cellules Caco-2/15 et d'intestin grêle foetal humain : réac-tivité des anticorps dirigés contre le collagène de type IV
viii.
(C-IV) et la sucrase-isornaltase (SI) ... 56 4. Imrnunofluorescence indirecte sur des coupes transversales de
cellules Caco-2/15 et d'intestin grêle foetal humain : réac-tivité des anticoprs dirigés contre la larninine (LAM) et la sucrase-isornal tase (SI) . . . 60 5. Imrnunofluorescence indirecte sur des coupes transversales de
cellules Caco-2/15 et d'intestin grêle foetal humain : réac-tivité des anticorps dirigés contre la fibronectine (FN) et la sucrase-isornal tase (SI) . . . 64
BB BSA
c
C-IV DMEM FBS FN HEPES LAM PBS PC SC SILISTE DES ABREVIATIONS
bordure en brosse
albumine sérique bovine atteinte de la confluence collagène de type IV
milieu d'Eagles modifié de Dulbecco sérum bovin foetal
fibronectine
4-(2-hydroxyéthyl)-1-piperazineéthanesulfonate laminine
tampon phosphate salin
jours de culture à post-confluence (1 à 40) stade de sous-confluence
sucrase-isomaltase
~TUDE DE L'EXPRESSION DES CONSTITUANTS DE LA LAME BASALE AU COURS DE LA DIFFERENCIATION DES CELLULES DE LA LIGNEE INTESTINALE HUMAINE CAC0-2/15.
par
Pierre H. Vachon
Mémoire présenté à la Faculté de médecine en vue de l'obtention du grade de maître ès sciences (M.SC.), Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Qc.
RESUME
Pour ce travail, nous avons cherché à déterminer l'utilité de la lignée intestinale humaine d'origine cancéreuse Caco-2/15 pour l'étude in vitro de l'expression des constituants de la lame basale, ainsi que leur implication possible dans les mécanismes cellulaires et molécu-laires de la différenciation entérocytaire. Dans un premier temps, nous avons évalué les propriétés de polarisation et de différenciation des cellules Caco-2/15 en culture. Pour ce faire, nous avons effectué des analyses morphologiques ainsi qu'ultrastructurales, et nous avons également étudié par immunofluorescence indirecte l'expression de la sucrase-isomaltase (SI), un marqueur de la différenciation entéro-cytaire. Nos observations ont indiqué que ces cellules se différencient spontanément à l'atteinte de la confluence, en présence d'un milieu de culture contenant du glucose. Cette différenciation de type entéro-cytaire est un processus graduel qui s'effectue dans le temps et selon un patron hétérogène ("mosaïque"). En effet, les cellules Caco-2/15 se polarisent progressivement et expriment de façon concomitante la SI, mais une hétérogénéité dans la polarisation et l'expression de la SI est évidente entre les cellules au sein de la monocouche cellulaire. Après 30 jours de culture à post-confluence, le processus est terminé et la presque totalité des cellules exhibent les principales caractéristiques morphologiques, fonctionnelles et immunocytochimiques associees aux entérocytes pleinement différenciés de l'intestin grêle foetal humain. D'ailleurs, l'hétérogénéité dans la différenciation entérocytaire ne semble plus évidente.
Dans un second temps, nous avons étudié l'expression in vitro des trois principaux constituants des lames basales: le collagène de type IV (C-IV), la laminine (LAM) et la fibronectine (FN). Cette étude a été effectuée par immunofluorescence indirecte à l'aide d'une batterie d'anticorps mono- et polyclonaux spécifiques. Nos observations laissent supposer que la capacité à exprimer chacun de ces trois constituants est liée au degré de différenciation des cellules. Par ailleurs, nous avons observé une hétérogénéité dans l'expression de ces constituants qui semble refléter le patron de type mosaïque de la différenciation des cellules Caco-2/15. La distribution basale du C-IV et de la LAM semble prérequise à l'initiation du processus de la différenciation entérocytaire. La LAM, particulièrement, influencerait ce processus. Cependant, nos observations indiquent que le C-IV et la LAM exprimés par les cellules Caco-2/15 sont possiblement de nature différente à ceux exprimés dans l'intestin grêle foetal humain. Une analyse ultra-structurale des cellules Caco-2/15 nous a révélé la présence de matériel extracellulaire qui est associé aux membranes cytoplasmiques latérales inférieures et basales. Des études préliminaires suggèrent que le C-IV détecté à la base des cellules se retrouverait dans ce matériel qui semble exhiber un degré d'organisation peu élaboré.
Dans l'ensemble, la lignée intestinale humaine Caco-2/15 démontre un potentiel énorme en tant que modèle in vitro pour l'étude des facteurs susceptibles d'influencer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le processus de la différenciation entérocytaire humaine, incluant les constituants de la matrice extracellulaire.
I-INTRODUCTION
1. Différenciation de 11épithélium intestinal humain.
Chez 11adulte, la muqueuse de 11intestin grêle est revêtue d1un
épithélium simple cylindrique qui se regénère et se différencie perpétuellement selon une séquence bien établie (GORDON, 1989; GRAND et al., 1976; KLEIN et McKENZIE, 1983). Les cellules souches pluripotentielles et indifférenciées sont localisées à la base des cryptes et constituent la source du renouvellement épithélial. Ces cellules prolifèrent et génèrent des cellules filles qui se différencient entre les second et dernier tiers supérieurs des cryptes. Ces cellules filles montrent des signes de maturité à la sortie des cryptes, mais ce n1est qu1une fois rendues à la mi-hauteur des
villosités que celles-ci exhibent les caractéristiques des cellules épithéliales matures de 11intestin. On distingue quatre principaux types
cellulaires qui composent cet épithélium : a) les cellules absorbantes polarisées (ou entérocytes) qui sont majoritaires, b) les cellules oligomuqueuses (ou caliciformes}, c) les cellules entéroendocrines, et d) les cellules de Paneth (qui se différencient et demeurent dans les cryptes) (GORDON, 1989; GRAND et al., 1976; LEBLOND, 1981; MENARD, 1989a). Lorsqu1arrivées à 11apex des villosités, les cellules
épithéliales montrent des signes de dégénérescence et sont subséquemment libérées dans la lumière intestinale, laissant ainsi la place aux cellules épithéliales qui suivent (KLEIN et McKENZIE, 1983; LEBLOND,
2.
1981). Ce phénomène du renouvellement de l'épithélium intestinal est commun à tous les vertébrés (DAUCA et al., 1990; GORDON, 1989; LEBENTHAL et LEE, 1983).
La séquence des principaux événements qui caractérisent le développement intestinal est également comparable d'une espèce animale à l'autre, même si la chronologie diffère passablement (DAUCA et al., 1990; LEBENTHAL et LEE, 1983; MENARD, 1989b; MENARD et CALVERT, 1990). Chez l'homme, le développement de l'intestin à déjà été le sujet d'excellentes revues (BUSTAMANTE et KOLDOVSKY, 1981; COLONY, 1983; GRAND et al., 1976; MENARD, 1989a et 1989b). Contrairement aux rongeurs, les caractéristiques anatomiques et fonctionnelles intestinales sont acquises tôt dans la vie foetale de l'homme. Dès la neuvième semaine de gestation, la villogénèse est amorcée dans l'intestin proximal par infiltration mésenchymateuse de l'épithélium pluristratifié. La formation des villosités procède ensuite selon un gradient proximal-distal jusqu'aux environs de 12 semaines. A ce stade, tout l'intestin grêle est recouvert de petites villosités qui sont revêtues d'un épithélium simple cylindrique. Parallèllement à ce développement morphologique, l'expression des activités digestives associées aux entérocytes augmente graduellement. Entre 15 et 20 semaines de gestation, l'organisation anatomique ainsi que les capacités digestives de l'intestin foetal humain (incluant le côlon) sont similaires à celles retrouvées d~ns l'intestin grêle adulte.
Par conséquent, deux événements distincts de la cytodifférenciation épithéliale sont observés dans l'intestin a) celui associé au développement de l'organe et qui consiste en la conversion d'un endoderme pluristratifié et indifférencié en un épithélium simple
3.
~ylindrique fonctionnel, et b) celui associé au renouvellement continuel de l 1épithélium le long de 11axe crypte-villosité à partir des cellules
souches. L1intestin représente donc un modèle biologique très attrayant
pour l'étude de la différenciation cellulaire et des mécanismes qui la contrôlent (GORDON, 1989; HAFFEN et al., 1989b; KEDINGER et al., 1987).
1.1 Polarisation et différenciation entérocytaires.
La différenciation de type entérocytaire consiste en une polarisation structurale et fonctionnelle des cellules absorbantes de l'épithélium intestinal. Cette polarisation cellulaire est caractérisée par a) une morphologie de type cylindrique, b) la présence d'une bordure en brosse fonctionnelle à la surface apicale, c) la présence de complexes de jonction bien développés, et d) 11expression des fonctions
de transport vectoriel apical-basal. Ces traits confèrent à l'entérocyte ses fonctions d1absorption sélective (CHENG et LEBLOND, 1974; GRAND et
al., 1976; LEBLOND, 1981; MOLITORIS et NELSON, 1990; RODRIGUEZ-BOULAN et NELSON, 1989).
Cependant, c'est principalement l'expression d'enzymes digestifs spécifiques qui caractérise les entérocytes pleinement différenciés (MENARD, 1989a; MOOG, 1981; SEMENZA et al., 1988). Ces enzymes, qui sont typiquement associés à la bordure en brosse des cellules, incluent entre autres la sucrase-isomaltase, la lactase, la tréhalase, la glucoamylase et la dipeptidylpeptidase (MENARD, 1989a; MOOG, 1981). De ceux-ci, la sucrase-isomaltase (SI) est l'enzyme qui a été le plus étudié et caractérisé (BEAULIEU et al., 1989; HAURI et al., 1985; SEMENZA et al., 1988). D'ailleurs, la SI représente un excellent marqueur de la
4.
dlfférenciation entérocytaire, puisqu'elle permet de distinguer les entérocytes différenciés de ceux qui sont indifférenciés et/ou dédifférenciés, ainsi que de distinguer les entérocytes foetaux des entérocytes adultes {BEAULIEU et al., 1989 et 1990b; CZERNICHOW et al., 1989; HAURI et al., 1985; SEBASTIO et al., 1987; SEMENZA et al., 1988; TRIADOU et ZWEIBAUM, 1985; ZWEIBAUM et al., 1983 et 1984).
1.2 Modèles in vitro pour l'étude de la différenciation et des fonctions entérocytaires.
L'établissement de modèles in vitro pour l'étude du développement et de la cytodifférenciation de l'intestin est une préoccupation importante pour les chercheurs impliqués dans ce domaine de recherche. En effet, il existe toujours le besoin d'isoler les multiples phénomènes qui sont observés in vivo dans le but de mieux les comprendre et les caractériser (KEDINGER et al., 1987; MENARD, 1989b; QUARONI, 1989; ZWEIBAUM et CHANTRET, 1989). A titre d'exemple, la culture organotypique avec un milieu minimal sans sérum permet d'isoler le tractus digestif des nombreuses influences qui proviennent du foetus en développement. Cela favorise ainsi l'étude des facteurs hormonaux susceptibles d'influencer la morphogénèse intestinale (KEDINGER et al., 1987; MENARD, 1989a et 1989b; MENARD et CALVERT, 1990). Dans un même ordre d'idées, l'étude de la différenciation et des fonctions entérocytaires se trouverait grandement facilitée si les cellules épithéliales de ce type pouvaient être cultivées in vitro, dans des conditions physiologiques minimales mais permissives (KEDINGER et al., 1987; QUARONI, 1989; QUARONI et al.,
5.
Chez les rongeurs, les lignées cellulaires intestinales normales (foetales, néonatales ou adultes) qui ont été établies jusqu'à maintenant ne conservent que très peu ou pas du tout les caractéristiques fonctionnelles et/ou différenciées des entérocytes (QUARONI, 1989; QUARONI et al., 1979; ZWEIBAUM et CHANTRET, 1989). Par ailleurs, l'établissement de lignées intestinales humaines dans un milieu de culture minimal permissif s'est avéré d'une difficulté pratiquement insurmontable (CHOPRA et al., 1987; QUARONI, 1989; QUARONI
et al., 1979). Paradoxalement, des progrès dans ces avenues ont été cependant obtenus grâce à la facilité relative à établir des lignées cellulaires humaines dérivées de tumeurs (FOGH et TREMPE, 1975; RUTZKY, 1985; ZWEIBAUM et CHANTRET, 1989).
1.2.l Les lignées intestinales humaines d'origine cancéreuse.
Depuis l'établissement de la toute première lignée cellulaire humaine dérivée d'un adénocarcinôme du côlon (FOGH et TREMPE, 1975), plus de 60 lignées de ce type ont été établies et rapportées (RUTZKY,
1985; ZWEIBAUM et CHANTRET, 1989). L'intérêt croissant pour celles-ci vient du fait que les cellules de certaines de ces lignées peuvent se polariser et/ou se différencier en culture (ROUSSET, 1986; ZWEIBAUM et CHANTRET, 1989). En effet, malgré leur origine néoplasique et le fait qu'elles soient dérivées du côlon adulte, certaines de ces lignées cellulaires exhibent des traits morphologiques et fonctionnels propres aux entérocytes de l'intestin grêle humain (ROUSSET, 1986; ZWEIBAUM et CHANTRET, 1989).
6.
caractérisées. Un système de classification qui comprend quatre catégories ou types a d'ailleurs été suggéré (CHANTRET et al., 1988; ZWEIBAUM et CHANTRET, 1989). Approximativement la moitié des lignées intestinales humaines d'origine cancéreuse qui ont été caractérisées correspondent au type IV. Les cellules de ces lignées ne se polarisent ni ne se différencient en culture, et ne peuvent non plus être induites à le devenir. Elles ne forment pas de monocouche cellulaire : plutôt, elles croissent
pluristratifié.
de façon anarchique et forment un feuillet
Les cellules des lignées de type III possèdent la propriété de se polariser spontanément à l'atteinte de la confluence. Quoiqu'elles n'arrivent pas à se polariser pleinement comme des entérocytes, elles exhibent malgré tout des signes d'expression des fonctions de transport vectoriel par la formation de dômes. Ces cellules forment des monocouches cellulaires au niveau desquelles on retrouve des jonctions de type zonula occludens ainsi qu'une bordure en brosse plus ou moins développée.
Au moins trois des lignées connues sont de type II. En culture, ces cellules se comportent normalement tout comme celles des lignées de type IV. Cependant, elles peuvent être induites à se polariser et/ou à se différencier en présence d'un milieu de culture dépourvu de glucose. Par contre, les degrés de polarisation ou de différenciation de ces cellules n'atteignent pas ceux des entérocytes pleinement différenciés.
Enfin, les lignées intestinales humaines d'origine cancéreuse de type I sont celles qui possèdent la propriété de se différencier pleinement et de façon spontanée à l'atteinte de la confluence, en présence d'un milieu de culture contenant du glucose. Jusqu'à
maintenant, une seule lignée de ce type a été identifiée r.aco-2.
1.2.2 La lignée cellulaire Caco-2.
7.
la lignée
La lignée intestinale humaine Caco-2 a été établie en 1974 par FOGH et al. (1977a et 1977b). Ce sont PINTO et al. (1983) qui ont été les premiers à étudier les propriétés de cette lignée cellulaire en culture. Les cellules de la lignée Caco-2 se différencient spontanément in vitro et exhibent toutes les caractéristiques des entérocytes pleinement différenciés de l'intestin grêle foetal humain. En effet, les cellules Caco-2 différenciées ont une morphologie cylindrique, exhibent une bordure en brosse ainsi que des complexes de jonction bien développés, forment une monocouche cellulaire au sein de laquelle des dômes sont observés, accumulent le glycogène, et expriment au niveau de leur bordure en brosse les enzymes digestifs typiques des entérocytes de l'intestin grêle, dont entre autres la SI (qui n'est pas exprimée normalement dans le côlon adulte) (BEAULIEU et al., 1990b; GRAND et al., 1976; GRASSET et al., 1984; MATSUMOTO et al., 1990; PINTO et al., 1983; ROUSSET et al., 1985; ZWEIBAUM et al., 1983). Par ailleurs, les propriétés de ces enzymes sont différentes de celles synthétisées par les entérocytes de l'intestin grêle adulte, mais similaires (sinon identiques) à celles exprimées par les cellules absorbantes de l'intestin foetal (BEAULIEU et al., 1989 et 1990b; HAURI et al., 1985; MATSUMOTO et al., 1990; ROUSSET et al., 1989). De plus, les cellules Caco-2 exhibent les caractéristiques du transport des sucres et de la sécrétion de lipoprotéines normalement associées aux entérocytes foetaux
8.
(BLAIS et al., 1987; TRABER et al., 1987).
Cette propriété des cellules Caco-2 de se différencier pleinement fait de cette lignée un outil de choix pour l'étude in vitro de la différenciation et des fonctions entérocytaires {PINTO et al., 1983; ROUSSET, 1986; ZWEIBAUM et CHANTRET, 1989). Par exemple, CHANTRET et al. (1988), GRASSET et al. (1985), de même qu'HILDAGO et al. (1989), ont utilisé cette lignée pour l'étude de la polarisation et de la perméabilité épithéliales, ainsi que pour l'étude des fonctions de
transport vectoriel apical-basal. La lignée Caco-2 a également servi de modèle pour des études sur l'endocytose et l'exocytose polarisées par les entérocytes (HUGHSON et al., 1989; HUGHSON et HOPKINS, 1990; TRABER et al., 1985). Enfin, elle a été utilisée pour étudier la régulation de la différenciation entérocytaire (LABURTHE et al., 1987; SEBASTIO et al., 1987; ROUSSET et al., 1986) ainsi que la régulation de l'expression de la SI (BEAULIEU et al., 1989 et 1990b; SEBASTIO et al., 1987; ROUSSET et al., 1989).
Par conséquent, la lignée Caco-2 constitue un modèle très attrayant pour l'étude in vitro des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le processus de la différenciation entérocytaire, chez l'homme.
2. Régulation de la différenciation de l'épithélium intestinal.
La majorité de nos connaissances sur la régulation du développement des fonctions intestinales provient d'études effectuées chez des modèles animaux (DAUCA et al., 1990; GORDON, 1989; KEDINGER et al.,
9.
1987; MENARD et CALVERT, 1990). Chez l'homme, peu d'études ont été ~ffectuées jusqu'à maintenant sur les mécanismes de la régulation de la morphogénèse et de la différenciation de l'intestin. Certaines évidences rapportées récemment indiquent que des hormones (comme les glucocorticoïdes) et des facteurs de croissance (comme le facteur de croissance épidermique) peuvent influencer la prolifération et la différenciation de l'épithélium intestinal foetal humain (MENARD, 1989a et 1989b). Chez les rongeurs, il a été clairement établi que l'hydrocortisone et le facteur de croissance épidermique sont impliqués dans la modulation de la maturation intestinale foetale ou néonatale (KEDINGER et al., 1987; MENARD et CALVERT, 1990). C'est également chez les rongeurs (ainsi que chez le poulet) qu'il a été démontré que les signaux primaires d'induction du développement et de la cytodifférenciation de l'intestin résultent d'interactions entre le mésenchyme et l'épithélium (HAFFEN et al., 1987; KEDINGER et al., 1988; MASUI, 1982; MATSUCHITA, 1984; FUKAMACHI et TAKAYAMA, 1980). Ces interactions épithélio-mésenchymateuses agiraient de plus à titre d'effecteurs des influences hormonales (CUNHA et al., 1983; HAFFEN et al., 1987, 1989a et 1989b; KEDINGER et al., 1988; SANDERS, 1987; STALLMACH et al., 1989). Certaines évidences indiquent que les interactions épithélio-mésenchymateuses joueraient également un rôle important dans le développement et la cytodifférenciation de l'intestin humain (BELL et WILLIAMS, 1988; HAFFEN et al., 1989a et 1989b; LACROIX et al., 1984). D'ailleurs, le mésenchyme de l'intestin foetal humain possèderait un pouvoir inducteur encore plus grand que celui des
rongeurs (HAHN et al., 1987a; LACROIX et al., 1984).
10.
interactions demeurent toujours inconnus. On s'accorde à dire que le mésenchyme jouerait un rôle permissif de même qu1instructif pour la
morphogénèse et la cytodifférenciation de l'intestin (HAFFEN et al., 1989a et 1989b; KEDINGER et al., 1988; MENARD et CALVERT, 1990). Cependant, un rôle crucial dans ces interactions a été proposé pour la lame basale et ses constituants, de par leur localisation stratégique à l'interface épithélio-mésenchymateuse dans plusieurs organes en développement (BERNFIELD et al., 1984; BISSEL et BARCELLOS-HOFF, 1987; HAFFEN et al., 1989a et 1989b; HAY, 1984; KEDINGER et al., 1988; SANDERS, 1983 et 1987; TIMPL et DZIADEK, 1986).
2.1 Rôles de la lame basale.
Les lames basales apparaissent comme des feuillets minces de matrices extracellulaires spécialisées, que l'on retrouve typiquement sous-jacents aux tissus épithéliaux de même qu'endothéliaux (Figure 1 A). Chez les animaux vertébrés, les lames basales sont reconnues pour jouer un rôle critique dans 11embryogénèse ainsi que dans l'ontogénèse
des différents organes (BERNFIELD et al., 1984; HAY, 1984; LEBLOND et INOUE, 1989; SANDERS, 1983; SCHITTNY et YURCHENCO, 1989; TIMPL, 1989; TIMPL et DZIADEK, 1986). D'ailleurs, il semble de plus en plus évident que les lames basales influencent l'adhésion, la migration, la polarisation et la différenciation des cellules (BEN-ZE'EV, 1986; BISSEL
et al., 1982; KLEINMAN et al., 1987; MARTIN et al., 1988; MARTINEZ-HERNANDEZ, 1988; McDONALD, 1989; FIENTA et al., 1989; TIMPL, 1989; WATT, 1986). Ces rôles des lames basales seraient attribuables à l'action spécifique et/ou combinée de certains de leurs constituants
Figure 1. Structure moléculaire de la lame basale et de ses principaux constituants.
~, représentation schématisée d'un épithélium simple cylindrique reposant sur une lame basale (LB) typique. ~, modèle structural du collagène de type IV. Ce collagène non fibrillaire est composé de chaînes al(IV) et a2(IV) assemblées de façon à former un hétérotrimère [al{IV)]2a2{IV) qui rappelle la forme d'un bâton de hockey. a,
triple-hélice a·
,
NCl, domaine globulaire carboxy-terminal NCl; 7s, domaine amine-terminal 7s. ~, modèle structural de la laminine. Cette macromolécule est composée de trois chaînes (A, Bl, B2) assemblées de façon à former un hétérotrimère cruciforme. a, triple-hélice a·,
les domaines linéaires ("rod-like") sont représentés par le symbole "O"; les liens disulfides sont indiqués par des petits traits. Q; modèle structural de la fibronectine. Cette macromolécule est formée de deux polypeptides similaires mais non identiques. Ceux-ci sont liés entre eux par des ponts disulfides (petits traits) à leur région carboxy-terminale. Les gonflements représentent les domaines fonctionnels retrouvés dans les deux polypeptides.!!,
modèle du "mesh network" formé par le C-IV dans les lames basales. Les cercles pleins représentent les associations entre domaines NCl formant les dimères; les gros traits représentent les associations latérales entre domaines 7s formant les tétramères. Dans ce modèle, on retrouve également des associations latérales {flèches) entre monomères de C-IV.Les illustrations ne sont pas à l'échelle. Elles ont été adaptées de BECK et al. (1990), DUFOUR et al. (1986), EKBLOM (1989), ENGEL (1989), LEBLOND et INOUE (1989), et de SCHITTNY et YURCHENCO (1989).
11.
A
ac.
12.
(Tableau l; ABRAHAMSON, 1986; BERNFIELD, 1989; BISSEL et BARCELLOS-HOFF, 1987; MARTIN et al., 1988; TIMPL et DZIADEK, 1986).
2.2 Composition de la lame basale.
L'identification des constituants macromoléculaires des lames basales a été le sujet de nombreux travaux depuis plusieurs années. Jusqu'à maintenant, sept constituants spécifiques aux lames basales ont été identifiés et caractérisés : le collagène de type IV (C-IV), l'entactine, la laminine (LAM), le nidogène (qui serait en fait l'entactine), la protéine BM-40, ainsi que des protéoglycans de type héparan sulfate et chondroitine sulfate (Tableau 1; ABRAHAMSON, 1986; DAMJANOV, 1990; LEBLOND et INOUE, 1989; MARTIN et al., 1988; TIMPL, 1989). La fibronectine (FN), une glycoprotéine des matrices extracellulaires, est également retrouvée dans les lames basales (Tableau 1; LAURIE et al., 1982; LAURIE et LEBLOND, 1983; MARTIN et al., 1988). Le C-IV et la LAM sont considérés comme des constituants principaux, étant donné qu'ils y sont retrouvés en quantités importantes. A ce titre, il en est de même pour la FN (ABRAHAMSON, 1986; BERNFIELD, 1989; HAY, 1984; LEBLOND et INOUE, 1989; MARTIN et al., 1988; TIMPL, 1989). Par conséquent, nous allons porter une attention particulière à ces trois macromolécules.
2.2.1 Le collagène de tyPe IV.
Le C-IV est une glycoprotéine au poids moléculaire important (600 ,
Entactine
Fibronectine (FN)
Laminine (LA.M)
Nidogène
Protéoglycans 2
Uaison du cakiurn; se lie possiblement au C~IV et à !'HSPG; ne se He probablement pas à la LAM et au nidogène
Formation de l'échaffaud structural; de l'HSPG, de la de la IAM et du nidogène; attachement des cellules
cellulaire; liaison à LA.M
Attachement cellulaire; déplacement/mouvement ,.. . ..,-'-''"'"'u'"' liaison au C~ IV et à l'HSPG
Liaison au C~IV, à l'HSPG, au nidogène et à attachement cellulaire; promotion de promotion de polarisation/ différenciation mouvement cellulaire
Attachement cellulaire; au C~IV, à la LAM et à
FN; identité possible avec l'entactine
Barrière de filtration chargée; liaison à la LAM et C~IV; liaison aux cellules
de Abrahamson (1986), Martin et al (1988), Schittny et Yurchenco Timpl
14.
et a2(IV) génétiquement distinctes (de 170 kDa chacunes), qui composent un hétérotrimère [al(IV)]2a2(IV). Les trois chaînes sont assemblées en
forme de triple hélice de type a, dont le domaine carboxy-terminal
("NCl") est composé des domaines globulaires individuels de chaque chaîne et dont le domaine amino-terminal ("7s") se trouve à un certain angle du reste de la macromolécule, résultant en une forme structurale qui s'apparente à celle d'un bâton de hockey (Figure 1 B; LEBLOND et INOUE, 1989; MARTIN et al., 1988; TIMPL, 1989).
Le rôle principal du C-IV est de former l'échaffaud structural des lames basales (LEBLOND et INOUE, 1989; MARTIN et al., 1988; TIMPL, 1989). Les domaines NCl et 7s procurent les sites principaux à partir desquels se forment les dimères et les tétramères (DUNCAN et al., 1983; TIMPL, 1989; TSILIBARY et CHARONIS, 1986; YURCHENCO et FURTHMAYR, 1984; YURCHENCO et RUBEN, 1987). Ces deux structures oligomériques subissent in situ une stabilisation par des liens disulfides et sont ensuite convertis en aggrégats supramoléculaires insolubles. Deux modèles structuraux pour l'assemblage du C-IV dans les lames basales ont été proposés celui du réseau hexagonal (YURCHENCO et al., 1986; YURCHENCO et FURTHMAYR, 1984), qui est essentiellement basé sur des données ultrastructurales in vitro, et celui du "mesh network" (Figure 1 E; LEBLOND et INOUE, 1989), qui est surtout basé sur des études ultrastructurales in vivo de lames basales. Malgré le fait que la validité de ces deux modèles soit encore débattue (LEBLOND et INDUE, 1989; SCHITTNY et YURCHENCO, 1989; TIMPL, 1989), il est clairement établi que c'est à même l'échaffaud structural du C-IV que s'ajoutent les autres constituants pour former les lames basales in situ (ABRAHAMSON, 1986; LEBLOND et INOUE, 1989; MARTIN et al., 1988; TIMPL,
15.
1989). En effet, le C-IV peut lier la LAM, les protéoglycans, la FN,
ainsi que le nidogène/entactine (GRANT et al., 1989; LAURIE et al.,
1986; TIMPL, 1989; WOODLEY et al., 1983). Enfin, les cellules pourraient
s'attacher aux lames basales en liant spécifiquement le C-IV via un récepteur cellulaire (Tableau 1; AUMAILLEY et TIMPL, 1986; BERNFIELD,
1989; BUSET et al., 1987; HAHN et al., 1990; KLEINMAN et al., 1981;,
LISCIA et al., 1988; MARTIN et al., 1988; MONTGOMERY, 1986; TIMPL,
1989).
2.2.2 La laminine.
La LAM est une glycoprotéine volumineuse (900 kDa) et très complexe composée de trois chaînes polypeptidiques génétiquement distinctes, soit les chaînes A (400 kDa), Bl (220 kDa) et B2 (220 kDa) (BECK et al.,
1990; HUNT, 1989; KLEINMAN et al., 1985; MARTIN et al., 1988). Ces trois
chaînes s'assemblent de façon à former un hétérotrimère cruciforme aux nombreux domaines structuraux et fonctionnels (Figure 1 C). Le domaine a-hélical de la LAM est retrouvé à même le "bras long" de cette 11croix11•
Ce bras long se termine par un domaine globulaire large qui origine de la région carboxy-terminale de la chaîne A. Les trois autres bras de la
11croix11 sont formés par les régions amine-terminales de chacune des
trois chaînes et se terminent également par des domaines globulaires. De plus, on retrouve au niveau de ces "bras courts" divers domaines linéaires (11rod-like11) . C'est d'ailleurs dans ces régions linéaires que
l'on retrouve des sous-domaines fortement apparentés à des domaines fonctionnels de certains facteurs de croissance (ENGEL, 1989). Enfin,
16.
liens disulfides entre les trois chaînes.
De nombreuses études sur les relations structure-fonction des domaines de la LAM ont été effectuées au cours des dernières années (BECK et al., 1990; KLEINMAN et al., 1985; KLEINMAN et WEEKS, 1989; TIMPL, 1989; VON DER MARK et KUHL, 1985). On retrouve dans la région terminale du bras long des sites actifs d'adhésion cellulaire (via récepteur), de promotion de la migration cellulaire (neurones), et de liaison aux protéoglycans. Au niveau des bras courts, on retrouve un second site d'attachement cellulaire (via récepteur), un site de promotion de la prolifération cellulaire, des sites de liaison pour le nidogène/entactine, des sites impliqués dans l'auto-assemblage de la molécule, et des sites de liaison pour le C-IV. Tous ces sites spécifiques, selon qu'ils sont accessibles ou non lorsque la LAM est assemblée dans la lame basale, font que cette macromolécule joue un rôle dans l'adhésion, la croissance, la polarisation, la migration et la différenciation des cellules (Tableau 1; BECK et al., 1990; EKBLOM, 1989; KLEINMAN et al., 1987; MARTIN et al., 1988; TIMPL, 1989). Par ailleurs, la LAM participerait également dans l'assemblage des lames basales, quoique à un degré beaucoup moindre que le C-IV (BECK et al., 1990; KLEINMAN et al., 1985; LAURIE et al., 1986; MARTIN et al., 1988; SANDERS, 1983; WOODLEY et al., 1983; YURCHENCO et al., 1986).
2.2.3 La fibronectine.
La FN est probablement la plus étudiée des macromolécules de la matrice extracellulaire (DUFOUR et al., 1986; HYNES, 1986; RUOSLAHTI, 1988; YAMADA, 1989). Cette glycoprotéine (de 450 kDa) est retrouvée sous
17.
deux formes. La FN dite sérique est présente dans les liquides interstitiels ainsi que dans le sérum, sous forme soluble. La FN dite cellulaire est retrouvée aux niveau des matrices extracellulaires et des lames basales, sous forme insoluble (ABRAHAMSON, 1986; DUFOUR et al., 1986; HYNES, 1986; LAURIE et al., 1982; MARTIN et al., 1988).
Deux chaînes polypeptidiques similaires (mais non identiques) de 220 kDa chacune composent la FN (Figure 1 D). Celles-ci sont liées ensemble par des liens disulfides entre leurs domaines carboxy-terminaux. Plusieurs domaines structuraux et fonctionnels sont retrouvés au sein de ces chaînes. Un site de liaison pour les protéoglycans est présent dans la région amino-terminale ainsi que dans la région carboxy-terminale de chaque polypeptide. On retrouve également un site de liaison à tous les types de collagène et un site d'attachement cellulaire (via récepteur) dans les domaines centraux des deux chaînes. Les activités spécifiques ou combinées de ces domaines fonctionnels confèrent à la FN la capacité d'influencer l'adhésion ainsi que la migration des cellules (Tableau 1). Cependant, son rôle exact dans les lames basales n'est toujours pas clairement défini. A tout le moins, cette macromolécule participerait dans le maintien structural des lames basales ainsi qu'à l'attachement des cellules à ces dernières (ABRAHAMSON, 1986; HYNES, 1986; LAURIE et al., 1986; MARTIN et al., 1988; RUOSLAHTI, 1988; WOODLEY et al., 1983;
YAMADA, 1989).
2.3 Rôle des principaux constituants de la lame basale dans la cytodifférenciation de l'épithélium intestinal.
18.
organes chez les vertébrés a incité plusieurs groupes de chercheurs, intéressés au développement de l'intestin, à investiguer le rôle de la lame basale et de ses constituants dans l'organogénèse du tractus digestif. Par exemple, BEAULIEU et al. (1990a) ont étudié par irnrnunofluorescence indirecte la distribution du C-IV, de la LAM et de la FN, entre autres, au cours du développement de l'intestin grêle foetal humain. Dès la huitième semaine de gestation, ces trois macromolécules sont retrouvées au niveau de l'interface épithélio-mésenchyrnateuse. Entre la neuvième et la vingtième semaine, chacun de ces trois constituants est détecté tout le long de la lame basale intestinale. Selon ces auteurs, l'initiation de la cytodifférenciation et de la morphogénèse de l'intestin humain seraient subséquentes à la formation d'une lame basale propre. Chez les rongeurs, des études similaires dans l'intestin foetal (SENIOR et al., 1988; SIMON-ASSMANN et al, 1986) et adulte (ABRAHAMSON et CAULFIELD, 1985; LAURIE et al., 1982; LAURIE et LEBLOND, 1983; QUARONI et al., 1978; WEISER et al., 1989) ont mené à des conclusions semblables. Par conséquent, la lame basale à la jonction épithélio-mésenchyrnateuse participerait au développement et à la cytodifférenciation de l'intestin des mammifères. Cependant, il n'est toujours pas établi si cette participation consiste en un rôle permissif ou inductif (BEAULIEU et al., 1990a; CARROLL et al., 1988; HAFFEN et al., 1989a; HAHN, 1988; KEDINGER et al., 1988).
La majorité des études sur l'influence de la lame basale et de ses constituants ont été effectuées in vitro avec des cultures primaires ou des lignées cellulaires d'intestin de rongeurs. HAHN et al. (1987a) ont démontré que du matériel extracellulaire isolé biochimiquement de l'intestin humain (contenant entre autres du C-IV, de la LAM et de la
19.
FN) facilite et prolonge la survie de cultures primaires intestinales de souris néonatales. De même, les travaux de MONTGOMERY (1986) ont indiqué que des préparations mixtes de divers types de collagènes permettent une meilleure prolifération ainsi qu'une certaine polarisation d'entérocytes foétaux de rats isolés par dissociation de la muqueuse. CARROLL et al. (1988) ont démontré que les cellules de la lignée intestinale IEC-6 de rat (QUARONI et al., 1979) pouvaient se différencier lorsque cultivées sur des extraits de lames basales de souris. HAHN (1988), ainsi que HAHN et al. (1990), ont également observé que des lignées cellulaires et des cultures primaires d'intestin de rat (foetal ou néonatal) démontrent une plus grande affinité à s'étaler en présence de lames basales isolées et arrivent même à se différencier.
Individuellement, les principaux constituants des lames basales exhibent in vitro diverses influences sur les entérocytes foetaux ou néonataux de rongeurs. Le C-IV favorise grandement l'attachement cellulaire et, jusqu'à un certain degré, la prolifération. Il est permissif à la différenciation entérocytaire mais il n'agit pas comme inducteur (HAFFEN et al., 1989a et 1989b; HAHN, 1988; HAHN et al., 1987b et 1990; MONTGOMERY, 1986). La LAM, cependant, agit comme un promoteur de la polarisation structurale et de la différenciation, en plus de favoriser l'attachement et la prolifération des entérocytes (HAHN, 1988; HAHN et al., 1990). Par contre, la FN ne permet pas la différenciation entérocytaire même si les entérocytes s'y attachent avidement (HAHN, 1988; HAHN et al., 1987b et 1990). Dans tous les cas, la présence combinée du C-IV et de la LAM représente la condition la plus favorable à l'attachement, la prolifération et la différenciation des entérocytes (HAHN, 1988; HAHN et al., 1987b). Toutes ces observations confirment
20.
ainsi des données obtenues avec d'autres modèles cellulaires épithéliaux {ABRAHAMSON, 1986; BECK et al., 1990; DUFOUR et al., 1986; KLEINMAN et al., 1985; MARTIN et al., 1988; TIMPL, 1989).
Chez l'humain, le rôle de la lame basale et de ses constituants dans l'intestin a été avant tout étudié dans l'optique de la cancérogénèse calo-rectale. En effet, une lame basale anormale ou incomplète est associée aux tumeurs invasives (ABRAHAMSON, 1986; BURTIN et al., 1982; DAMJANOV, 1990; HUNT, 1989; IOZZO, 1984 et 1988; LIOTTA et al., 1986; MARTINEZ-HERNANDEZ, 1988; TERRANOVA et al., 1986; TRYGGVASON et al., 1987). Les travaux de BOYD et al. (1988 et 1989), ainsi que ceux de DANEKER et al. (1987, 1989a et 1989b), ont démontré un lien entre la différenciation histologique exhibée in vivo chez la souris et le degré d'aggressivité in vitro envers des lames basales reconstituées, chez des lignées intestinales humaines d'origine cancéreuse de type III et/ou IV. Cependant, RICHMAN et BODMER (1988) ont dénoté l'importance des interactions épithélio-mésenchymateuses dans l'influence de cette différenciation histologique in vivo pour certaines lignées cellulaires de type II et/ou III. De plus, il a été clairement démontré que les cellules des lignées appartenant à ces deux catégories déposent in vitro un matériel extracellulaire qui peut influencer le comportement de lignées plus aggressives en culture (BELLOT et al., 1985; BOYD et al., 1988). Des essais d'adhésion ont d'ailleurs révélé que seules les lignées les moins aggressives in vivo chez la souris peuvent adhérer à la LAM ou à la FN in vitro, et que la LAM permet un meilleur étalement que la FN. Des expériences similaires avec des lames basales reconstituées ont donné des résultats semblables (BOYD et al., 1988; DANEKER et al., 1989a et 1989b). Somme toute, ces résultats tendent à
21.
démontrer que le degré de différenciation entérocytaire chez l'humain peut être modulé par la lame basale et ses constituants. Dans cet ordre d'idées, BUSET et al. (1987) ont observé que des cultures primaires de cellules épithéliales de côlon adulte humain peuvent également s'attacher et proliférer, jusqu'à un certain degré, sur des préparations de C-IV ou de lames basales reconstituées. Ils n'ont cependant pas vérifié s'il y avait différenciation cellulaire ou non.
Ainsi, peu de données in vitro sont disponibles en ce qui a trait au rôle de la lame basale et de ces principaux constituants dans la cytodifférenciation
maintenant, seules de des
l'épithélium intestinal humain. Jusqu'à lignées intestinales humaines d'origine cancéreuse de type II, III ou IV ont été utilisées à titre de modèles et l'emphase n'a jamais réellement été mise sur l'influence des constituants des lames basales dans le processus de la polarisation et de la différenciation entérocytaires (BELLOT et al., 1985; BOYD et al., 1988 et 1989; CHANTRET et al., 1988; DANEKER et al., 1987, 1989a et 1989b; TIMPL et DZIADEK, 1986; ZWEIBAUM et CHANTRET, 1989).
3. Objectifs généraux du projet de recherche.
A la lumière de la littérature, il ne fait aucun doute que l'on connait peu de choses sur l'implication des constituants de la lame basale dans les mécanismes cellulaires et moléculaires de la différenciation entérocytaire chez l'humain. D'ailleurs, des études à ce sujet n'ont jamais été entreprises avec des modèles in vitro de la différenciation entérocytaire, comme la lignée intestinale humaine
22.
Caco-2.
Par conséquent, les objectifs du projet de recherche sont les suivants:
établir les propriétés in vitro de polarisation et de différen-ciation cellulaires d'une lignée-clone (Caco-2/15) qui a été dérivée récement de la lignée cellulaire Caco-2.
déterminer l'utilité de cette lignée Caco-2/15 comme modèle in vitro pour l'étude de la différenciation et des fonctions entérocytaires.
vérifier si les cellules de cette lignée expriment in vitro les trois principaux constituants de la lame basale intestinale (soit le C-IV, la LAM et la FN).
analyser l'expression de ces trois constituants en fonction du processus de la différenciation entérocytaire chez la lignée Caco-2/15.
Ces quatre objectifs nous permettront de déterminer l'utilité de la lignée intestinale humaine d'origine cancéreuse Caco-2/15 cormne modèle pour l'étude de l'expression des constituants de la lame basale et de leur implication dans le processus de la différenciation entérocytaire.
11-MATERIEL ET METHODES
1. Culture des cellules Caco-2/15.
Le clone Caco-2/15, obtenu du docteur A. Quaroni {Cornell University, Ithaca, NY, USA), est dérivé de la lignée cellulaire Caco-2 {Arnerican Type Culture Collection, Rockville, MD, USA; HTB 37). Les cellules ont été cultivées dans des pétris de lOOmm (Falcon Plastics, Los Angeles, CA, USA) avec le milieu DMEM (Gibco Canada, Burlington, Ontario) contenant 10% de FBS {Flow Laboratories, Mississauga, Ontario), 4mM de glutamine, 20mM d'HEPES, 100 U/ml de pénicilline et 100 µg/ml de streptomycine. Les pétris (contenant chacun lOml de milieu de culture) ont été incubés à 37°C dans une atmosphère composée de 95% d'air et 5% de C02 • Les milieux ont été renouvellés aux 48 heures.
Le maintient de la lignée a été assuré par des passages successifs des cellules. A un stade équivalant à 80% de confluence, le milieu de culture était remplacé par une solution de 0.25% trypsine-0.53mM EDTA (dans le tampon PBS, à pH 7.4). Après 1 minute, la solution de trypsine était retirée puis remplacée par 0.5ml de la même solution. Les pétris étaient alors incubés à 37°C pendant 10 minutes. Les cellules ainsi dissociées étaient ensuite resuspendues de façon homogène dans un volume final de 5ml de milieu de culture puis réparties à raison d'un ml de suspension cellulaire par pétri contenant lOml de milieu (dilution 1/5). Toutes les études décrites dans ce travail ont été effectuées sur des cellules entre les passages 53 et 78. Les stades de sous-confluence
24.
(SC; 30-50% de confluence), confluence (C), ainsi que 5, 10, 20, 30 et 40 jours à post-confluence (PC) ont été étudiés.
2. Etudes morphologiques et ultrastructurales.
2.1 Microscopie à contraste de phase.
L'observation des cultures de cellules Caco-2/15 a été effectuée à l'aide d'un microscope à contraste de phase Wild Leitz (Heerbrugg, Suisse) équipé pour la photographie optique. L'aspect général des cellules de même que la présence de dômes ont été les deux principaux points d'étude. Des photographies représentatives ont été prises sur films de type Panatomic 32 ASA (Kodak).
2.2 Microscopie électronique à balayage.
La préparation des échantillons a été basée sur la méthode décrite par BOYDE et al. (1972) mais adaptée de façon à tenir compte des différents paramètres pouvant influencer la qualité de la fixation, tels qu'énumérés et commentés par VISSCHER et ARGENTIERI (1987).
En premier lieu, une pré-fixation in situ de 15 minutes (à 23°C) a
été effectuée en remplaçant la moitié du milieu par un volume égal d'une solution pré-incubée (37°C) de 2.8% glutaraldéhyde tamponnée avec du cacodylate de sodium 0.2M (pH 7.2). Cette étape avait pour but d'améliorer l'intégrité des structures de surface de même qu'intracellulaires (BOYDE et al., 1972; SHAY et WALKER, 1980; VISSCHER
25.
et ARGENTIERI, 1987). Les cultures ont ensuite été fixées avec 2.8% glutaraldéhyde dans O.lM cacodylate de sodium {pH 7.2) pendant 30 minutes (23°C), puis rincées trois fois dans du cacodylate de sodium O.lM et post-fixées pendant 60 minutes (à 23°C) au tétroxyde d'osmium 2%
(dans le tampon O.lM cacodylate de sodium). Après trois lavages avec le cacodylate de sodium, deux carrés de l.Ocm2 ont été découpés du fond du
pétri. Les carré-échantillons ainsi obtenus ont ensuite été soumis à une déshydratation séquentielle à l'aide de concentrations croissantes d'éthanol (5 minutes à 40%, 5 minutes à 70%, 5 minutes à 80%, 5 minutes à 95% et 3x5 minutes à 100%). Pour la microscopie électronique à balayage (voir Figure 2), un des deux carré-échantillons a été séché selon la technique du "critical point drying" (ANDE~SON, 1951). Cette méthode consiste à débarasser l'échantillon de l'alcool par lavages successifs avec un niveau constant de C02 liquide (à 22°C et sous une
pression de 900lbs) puis de sublimer le gaz aux pressions et températures critiques de celui-ci {1300lbs et 42°C), tout en évitant une condensation d'eau qui serait dommageable pour l'échantillon. Un appareil Critical Point Dryer (Ladd Research Industries, Burlington, VT, USA) a été utilisé et chaque carré-échantillon a été traité pour une durée totale de 45 minutes.
Chacun des carrés a été monté sur un porte-échantillon d'aluminium (Ladd) en le fixant à l'aide d'un ruban circulaire adhésif (recto et verso) et d'un peu de peinture d'argent (J.B.E.M. Services, Dorval, Québec). L'échantillon ainsi monté a ensuite été recouvert d'or par évaporation {BOYDE et al., 1972) pendant deux minutes, avec un courant de 40mA et sous une pression de 0.3 mbars. Un appareil S150B Sputter Coater (Edwards Canada, Oakville, Ontario) a été utilisé. Enfin, les
Figure 2. Organigramme de la préparation des échantillons pour la micro-scopie électronique à balayage et à transmission.
1
Culture de cellules Caco 2/15 (Pétri 1 OOmm)
1-
+
1. Pré-fixation in situ (15 min; 23°C)
+
2. Fixation (30 min; 23°C)
+
3. Post-fixation (60 min; 23°C)
+
4. Découpage de deux carrés-échantillons (1 cm2)
-
+
1 CARRÉS A et B 1
+
5. Déshydratation séquentielle
à
l'éthanol (40-100%) 1CARRÉA1+
6A. 11Critical point drying"
lcARRÉBI
+
6B. Première imprégnation d'Epon
26.
+
(Pétri 30mm, 23°C; 25 mbars; 3h)7
A
Montage des carrés-échantillons+
BA
Recouvrementà
l'or par évaporation MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUEA BALAYAGE
+
7B. Seconde imprégnation d'Epon (Pétri 30mm, 23°C; 25. mbars; 3h)
+
SB. Polymérisation (60°C; 48h)
+
9B. Détachement de la monocouche cellulaire enrobée
+
découpage en échantillons de 9-16 mm 2 chacun+
1 OB. Enrobage dans l'Epon (dans moules)
+
11 B. Coupes semi-fines..---1 BLOCS-ÉCHANTILLONS 1+
12B. Coupes ultra-fines+
1 MICROSCOPIE OPTIQUE 1+
MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE A TRANSMISSION27.
échantillons ont été observés à 15kV à l'aide d'un microscope électronique à balayage Stereoscan 120 (Cambridge Canada, Montréal, Québec) équipé d'une caméra N2000 (Nikkon). Des photographies représentatives des échantillons ont été prises sur films Kodak de type Plus-X Pan 125 ASA.
2.3 Microscopie électronique à transmission.
Suite à la déshydratation séquentielle, un des deux carré-échantillons a été imprégné d'Epon (LX-112; Ladd) dans un pétri de 30mrn {Falcon) pendant 3 heures à 23°C (voir Figure 2). Cette première imprégnation, effectuée sous une pression atmosphérique contrôlée (25mbars), sert à débarasser l'échantillon de l'alcool tout en évitant la ré-oxygénation de l'Epon. Le carré-échantillon a ensuite été transféré dans un second pétri pour être ré-imprégné dans des conditions identiques. Après cette seconde imprégnation, le tout a été incubé pendant 48 heures (à 60°C) afin de permettre la polymérisation du milieu d'inclusion. Le pétri a ensuite été immergé plusieurs fois dans l'azote liquide puis cassé pour libérer le carré-échantillon. La monocouche cellulaire enrobée a pu être détachée de son support en plastique et celle-ci a été découpée en petits rectangles de 9 à l6mm2 • Enfin, ces
derniers ont été déposés dans des moules (J.B.E.M.) pour être à leur tour enrobés.
Des coupes de 800°A ont été obtenues à l'aide d'un couteau de diamant (Diatome, Bienne, Suisse) monté sur un ultramicrotome OmU3 (C. Reichert, Autriche). Les coupes ont ensuite été récupérées sur des treillis de cuivre de 200 mesh (Ladd) et colorées à l'acétate d'uranyle
28.
1.0%-chlorure de sodium 0.89% (dans H20 bidistillée; WATSON, 1958), puis
au citrate de plomb 2.66% (dans NaOH lN:eau bidistillée 16:84; REYNOLDS, 1963). Les coupes ont été observées à 60kV avec un microscope électronique à transmission EM 300 (Philips Electronics, Scarborough, Ontario) équipé pour la micrographie.
Avant d'effectuer les coupes ultra-fines pour la microscopie électronique, une observation en microscopie optique a tout d'abord été effectuée. Des coupes d'un µm d'épaisseur ont été obtenues à l'aide d'un couteau de verre (LKB, Stockholm-Bromma I, Suède) monté sur un ultramicrotome Reichert OmU3. Les coupes ont été déposées sur lames à microscope (Fisher) et colorées au bleu de méthylène 1%:borax 1%:azur II 1% (1:1:1). Enfin, les coupes ont été montées avec l'Eukitt (MDS, Pointe-Claire, Québec). L'examen et la photographie ont été effectués à l'aide d'un microscope Photomicroscope II (Zeiss, Oherkochen, RFA) et les films utilisés ont été de type Panatomic 32 ASA (Kodak).
3. Immunodétection de la sucrase-isomaltase e~ constituants de la lame basale.
3.1 Préparation du matériel.
des principaux
Pour vérifier l'activité des anticorps et évaluer leur réactivité, nous avons tout d'abord testé ceux-ci sur des coupes d'intestin grêle foetal humain. Des portions de jéjunum (de foetus agés entre 15 et 20 semaines de gestation) ont été ouverts longitudinalement, lavés dans le PBS froid et séchés sur papier filtre 3M (Whatman, Angleterre). Les
29.
tissus ont ensuite été déposés verticalement dans un petit cylindre d'aluminium rempli d'O.C.T. ("Optimum Cutting Temperature embbeding compound"; Miles Tek, Elkhart, IN, USA) puis immédiatement congelés dans l'azote liquide. Les bloc-spécimens ont été conservés à -70°C.
La méthode de préparation des cultures de cellules Caco-2/15, pour l'obtention de coupes en congélation, a été adaptée à partir de celle décrite par QUARONI (1986). Aux stades étudiés, les cultures ont été lavées trois fois avec du PBS froid puis grattées délicatement (à l'aide d'un policeman) dans lml d'O.C.T .. Les suspensions de monocouches ont ensuite été recueillies dans des petits cylindres en aluminium pour être immédiatement congelées dans l'azote liquide. Les bloc-spécimens ont été conservés à -70°C.
Des coupes de 4µm d'épaisseur ont été obtenues à l'aide d'un couteau d'acier de 120mm (American Opticals, Buffalo, NY, USA) monté sur un microtome Histostat Cryostat (Reichert) pré-réfrigéré à -22°C. Les coupes en congélation ont été étalées par différence de température sur des lames à microscope (recouvertes de gélatine et maintenues à 23°C) en apposant les lames directement sur les coupes froides. Les coupes ont ensuite été séchées à l'air ambiant pour au moins 1 heure (mais jamais plus que 90 minutes) puis conservées à -70°C.
La procédure de préparation des lames gélatinisées a été effectuée telle que décrite par HARLOW et LANE (1988). Les lames à microscope (Fisher Scientific, Montréal, Québec) ont été trempées pendant 30 minutes dans une solution de méthanol:chloroforme (1:1), essuyées méticuleusement et immergées pendant 30 secondes dans une solution à 1% de gélatine de peau de veau (dans l'eau bidistillée contenant 0.02% d'azide de sodium et ajustée à un pH de 7.5). Les lames ainsi traitées
30.
ont ensuite été séchées à l'air ambiant pour la nuit et conservées à 4°C jusqu'à usage. Des lames fraîches ont été préparées à chaque semaine.
3.2 Anticorps utilisés.
Le tableau 2 donne la liste complète de tous les anticorps qui ont été testés.
Pour détecter l'expression de la sucrase-isomaltase (SI), deux anticorps monoclonaux de souris dirigés spécifiquement contre la SI humaine ont été testés : le HSI 9 (BEAULIEU et al., 1990b; spécifique pour la sous-unité sucrase de l'enzyme) et le HSI 14 (QUARONI, 1986 et BEAULIEU et al., 1989; spécifique pour la sous-unité isomaltase). Ces deux anticorps ont démontré des patrons de marquage semblables (pour l'intestin grêle foetal humain ou pour les cellules Caco-2/15) et seul le HSI 14 a été utilisé dans ce travail.
Un total de douze anticorps ont été utilisés pour détecter l'expression du collagène de type IV (C-IV)
a) anticorps polyclonaux de lapin l'AB 748 est un antisérum commercial dirigé contre le C-IV humain (Chemicon International, El Segundo, CA, USA); l'anti-NCl (TSILIBARY et CHARONIS, 1986), un antisérum purifié par chromatographie d'affinité (PA), èst dirigé contre le domaine NCl du C-IV et nous a été donné par le docteur E.C. Tsilibary (University of Minnesota, Minneapolis, Minn., USA); et enfin, l'anti-CIV (YURCHENCO et RUBEN, 1987) est un autre antisérum purifié par affinité qui a été un don du docteur P.D. Yurchenco (University of Medecine and Dentistry of New-Jersey, Piscataway, NJ, USA).
3L
Jmmunofhmirescence b;1{U1recte §UI' des c.oupe~ trnnsversa!es de
celhdes
Caco~et d'intesUn_grêle foetal humain: anticorps monoclonaux souris) et polydonaux (de lapin) utilisés de l'expression de sucrase-ismnaltase (SI), du
collagène de
type
la laminine(LAM) et
(FN)
1 ,souns SI Fou A BSA
J~
"
"
"
"
AS C~IV F Oll A BSA 1/100
ASPA iO Il Il
1/25
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"
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LA
iO ABLOTIO
1/100M3F7
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1/100 1042 il Il'"
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1/100 1043''
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n Il F FBS1/50
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anti-LAMPA Q~ ASPA"
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~1r1AB souns LA''
A MAB 1921"
q~ il f:~"
2E8"
"
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"
"
"
'""
li''
HFN 7,1 sourisLA
FN
F BSA FN-15"
"
"
" " FN-3E2"
"
"
"
"
1 Abréviations: A, acétone; antisérum; ASPA, purifié par affinité; BLOITO,
lait en poudre sans matières grasses; BSA, albumine sérique bovine; F, formaldéhyde; FBS, sérum bovin LA,, liquide ascitique; ivlH, milieu d'hybridô:me.
2 Dilutions déterminées empiriquement 1, et
at
(1989); 2, Engvall et (1986);3, Foellmer et aL 4, Havenith et (1987); 5, Odermatt et al. (1984); 6, Quaroni 7, 8, Sundar]laj et 'Willson. 9, Tsilibary et Chamnis 10, 11, Yurchenco et Ruben · ne s'applique pas.