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Rôle du récepteur nucléaire de la progestérone dans la ventilation chez des souris en développement

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Academic year: 2021

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Rôle du récepteur nucléaire de la progestérone dans

la ventilation chez des souris en développement

Mémoire

Catherine Potvin

Maîtrise en médecine expérimentale

Maître ès sciences (M.Sc)

Québec, Canada

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Résumé

La progestérone stimule la respiration chez le rat en développement. Le rôle du récepteur nucléaire de la progestérone (nPR) dans ces effets est inconnu. Nous vérifions l’hypothèse que le nPR contribue au contrôle respiratoire en comparant la réponse ventilatoire à l’hypoxie (RVH) et les irrégularités respiratoires de souris Progesterone receptors knock-out (PRKO) à celles de souris sauvages (WT) âgées de 1 (P1) et 4 jours (P4). La ventilation minute est mesurée en normoxie (fraction inspirée d’oxygène (FiO2)=21% pour 10 minutes) et en hypoxie (FiO2=14%, 12% et

10% pour 20 minutes chacune) par pléthysmographie à corps entier. En normoxie, l’inactivation du nPR n’affecte ni les paramètres ni les irrégularités respiratoires. En hypoxie à 14%, l’inactivation du nPR diminue le volume courant et le nombre d’apnées des P1 et augmente le nombre d’apnées post-soupir des P4. Le nPR intervient de façon O2- et âge- dépendant dans la régulation respiratoire des souris

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Table des matières

RÉSUMÉ ... III TABLE DES MATIÈRES... V LISTE DES TABLEAUX ... VII LISTE DES FIGURES ... IX LISTE DES ABRÉVIATIONS ... XI REMERCIEMENTS ... XV AVANT-PROPOS ... XVII

I. INTRODUCTION ... 1

1.1 LA PROBLÉMATIQUE ... 2

1.2 L’IMMATURITÉ DU SYSTÈME DE CONTRÔLE RESPIRATOIRE ... 3

1.2.1 Le contrôle de la respiration ... 3

1.2.2 Les manifestations de l’immaturité du système respiratoire ... 5

1.3 LES STIMULANTS RESPIRATOIRES ... 7

1.3.1 Les méthylxanthines ... 8

1.3.2 La progestérone : un stimulant respiratoire chez l’humain ... 8

1.3.3 La progestérone : un stimulant respiratoire chez l’animal nouveau-né ... 9

1.4 LA PROGESTÉRONE ... 10

1.4.1 Les récepteurs nucléaires ... 10

1.4.2 Les récepteurs membranaires ... 11

1.4.3 Implication de la progestérone au niveau du contrôle respiratoire chez les nouveau-nés ... 12

1.5 HYPOTHÈSE ... 13

1.6 OBJECTIFS ... 14

II. MATÉRIEL ET MÉTHODE ... 15

2.1 LES GROUPES ÉTUDIÉS ... 16

2.2 LA PLÉTHYSMOGRAPHIE À CORPS ENTIER ... 16

2.3 LE PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL ... 19

2.4 ANALYSES ... 21

2.4.1 Identification du génotype et du sexe par PCR ... 21

2.4.2 Analyse des paramètres ventilatoires et des irrégularités respiratoires ... 24

2.4.3 Analyses statistiques ... 25

III. RÉSULTATS ... 27

3.1 CARACTÉRISTIQUES PHYSIQUES DES GROUPES ÉTUDIÉS ... 28

3.2 EFFET DE L’INACTIVATION DU RÉCEPTEUR NUCLÉAIRE DE LA PROGESTÉRONE SUR LES PARAMÈTRES RESPIRATOIRES ... 29

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3.2.2 En condition d’hypoxie ... 32

3.3 EFFET DE L’INACTIVATION DU RÉCEPTEUR NUCLÉAIRE DE LA PROGESTÉRONE SUR LES IRRÉGULARITÉS RESPIRATOIRES ... 36

3.3.1 En condition de normoxie ... 36

3.3.2 En condition d’hypoxie ... 39

IV. DISCUSSION ... 43

4.1 LES RÉSULTATS OBTENUS EN REGARD DE LA LITTÉRATURE ACTUELLE ... 45

4.1.1 Paramètres physiques ... 45

4.1.2 Paramètres et irrégularités respiratoires en condition de normoxie ... 46

4.1.3 Paramètres et irrégularités respiratoires en condition d’hypoxie ... 47

4.2 RÔLE DU TAUX PLASMATIQUE DE PROGESTÉRONE ... 48

4.3 DISTRIBUTION DES RÉCEPTEURS DE LA PROGESTÉRONE ... 49

4.4 EXPRESSION DE NEUROTRANSMETTEURS AU NIVEAU CENTRAL ... 49

4.5 RÔLE DU RÉCEPTEUR MEMBRANAIRE DE LA PROGESTÉRONE ... 51

4.6 CONSIDÉRATIONS MÉTHODOLOGIQUES ... 51

4.7 PERSPECTIVES CLINIQUES ... 52

V. CONCLUSION ... 53

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Liste des tableaux

Tableau 1 : Produits utilisés dans l’exécution des PCR.

Tableau 2 : Caractéristiques des différentes étapes de PCR et d’électrophorèse. Tableau 3 : Caractéristiques physiques des groupes utilisés.

Tableau 4 : Paramètres respiratoires et masse de nos souris nouveau-nées WT et de

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Liste des figures

Figure 1 Contrôle respiratoire.

Figure 2 Courbe temporelle d’une réponse ventilatoire à l’hypoxie chez un rat âgé de 7 jours de vie.

Figure 3 Aspect développemental de la réponse ventilatoire à l’hypoxie du nouveau-né humain et du nouveau-né rat.

Figure 4 Exemple typique d’apnée spontanée et post-soupir.

Figure 5 Récepteurs de la progestérone.

Figure 6 Insertion du gène LacZ dans l’exon 1 du gène des récepteurs nucléaires de la progestérone.

Figure 7 Schéma du montage de pléthysmographie à corps entier.

Figure 8 Formule mathématique permettant le calcul du volume courant.

Figure 9 Schéma du déroulement d’une expérience.

Figure 10 Représentation d’analyses permettant de déterminer le génotype et le sexe.

Figure 11 Exemple d’apnée spontanée et post-soupir chez un P1 WT soumis à une hypoxie de 12%.

Figure 12 Paramètres ventilatoires en condition de normoxie.

Figure 13 Métabolisme en condition de normoxie.

Figure 14 Évolution de la fréquence respiratoire aux différents niveaux d’hypoxie.

Figure 15 Évolution du volume courant aux différents niveaux d’hypoxie.

Figure 16 Évolution de la ventilation minute aux différents niveaux d’hypoxie.

Figure 17 Nombre d’irrégularités respiratoires en condition de normoxie.

Figure 18 Durée moyenne des irrégularités respiratoires en condition de normoxie.

Figure 19 Nombre d’irrégularités respiratoires en condition d’hypoxie.

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Liste des abréviations

AP Apnée de prématurité

CO2 Dioxyde de carbone

FiO2 Fraction inspirée d’oxygène

FR Fréquence respiratoire

GABA Acide gamma aminobutyrique

mPR Récepteur membranaire de la progestérone

O2 Oxygène

pH20 Pression de vapeur d’eau

PN N jours de vie

nPR Récepteur nucléaire de la progestérone

PRKO Progesterone receptors knock-out

RVH Réponse ventilatoire à l’hypoxie

SNC Système nerveux central

SNP Système nerveux périphérique

E Ventilation minute

O2 Consommation d’oxygène

CO2 Production de dioxyde de carbone

VT Volume courant

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Remerciements

Comme le dit un proverbe africain : « Pour qu’un enfant grandisse il faut tout un village ». Il en va de même de l’accomplissement de ma maîtrise.

Merci à tous ceux qui m’ont partagé leur amour pour la science. Merci pour ces discussions animées, pour ces échanges riches qui ont stimulé ma curiosité. Merci pour les questions soulevées, pour les articles suggérés. Merci pour cette générosité de temps. Merci à ceux qui ont contribué à l’enrichissement de ce milieu d’apprentissage. Merci à ceux qui m’ont appris à développer davantage mon originalité.

Merci à tous ceux qui ont eu la patience de m’expliquer leur pensée de façon constructive. Merci à ceux qui ont pris le temps de bien m’enseigner les techniques que je ne connaissais pas et de me corriger au besoin. Merci à tous ceux qui ont écouté et répondu à mes questions, car il y en aura bien eu quelques-unes.

Merci à ceux qui ont eu la patience incroyable de m’aider avec les problèmes informatiques.

Merci à ceux qui ont été là dans les moments difficiles. Merci pour l’écoute, l’empathie, le réconfort, le soutient. Merci à ceux qui n’ont pas cherché à me juger, mais qui ont tenté de me faire sourire.

Merci à tous ceux qui ont su comprendre mes horaires qui n’étaient pas toujours faciles. Merci à ceux qui ont su écouter attentivement mes multiples présentations orales.

Finalement et surtout, je tiens à remercier ceux qui ont rendu la réalisation de cette maîtrise possible. Ceux qui m’ont donné cette chance dans le moment où j’en avais le plus besoin. Ceux qui ont su être là dans les meilleurs moments comme dans les pires. Merci de cette opportunité. Merci pour le temps investi, pour l’inspiration, mais surtout merci pour la confiance.

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Avant-Propos

Cette maîtrise en médecine expérimentale s’annonçait dès le départ comme un vrai défi de par les échéanciers serrés que je m’étais fixés. Et quel défi ce fut!

Premièrement, cette expérience m’a permis de découvrir le monde des laboratoires, un univers qui me paraissait de moins en moins familier plus j’apprenais à le connaître de par la complexité des techniques et des produits qu’il renferme. Je suis maintenant à même de comprendre l’immensité du travail qui se cache derrière les publications que nous lisons sur une base régulière lorsque nous sommes en clinique.

Deuxièmement, à travers le parcours de ce projet, j’ai réalisé mes premières présentations orales et avec affiche dans le cadre de congrès et d’activités académiques. Non seulement ces expériences ont été incroyablement formatrices sur le plan de la communication, mais elles m’ont aussi permis de comprendre davantage l’importance de la nécessité de liens entre la recherche clinique et fondamentale.

Au final, l’accomplissement de cette maîtrise aura non seulement marqué un passage important dans mon cursus académique, mais elle aura aussi été le terrain où j’ai pu apprendre plusieurs leçons de vie importantes qui me serviront assurément dans mes projets futurs.

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1.1 La problématique

Les nouveau-nés prématurés présentent une immaturité du système de contrôle respiratoire. Celle-ci se traduit par une faible réponse ventilatoire aux stimuli naturels que sont l’oxygène (O2) et le dioxyde de carbone (CO2) et par des

irrégularités respiratoires [1] qui se manifestent souvent sous la forme d’apnées de prématurité (AP). Bien que les AP ne soient pas considérées comme des maladies, mais plutôt comme un phénomène physiologique lié au développement, elles augmentent la morbidité néonatale [2, 3] et prolongent la durée d’hospitalisation des nouveau-nés [4]. Cette problématique est d’autant plus importante d’un point de vue de santé publique lorsqu’on sait qu’annuellement plus de 15 millions d’enfants dans le monde naissent avant terme (<37 semaines d’aménorrhée) et que les naissances prématurées sont en progression [5] mondialement et dans la région de Québec [6].

Les traitements actuels des AP ne sont pas libres de toutes complications. Les supports ventilatoires et d’oxygénothérapie amplifient le risque de dysplasie bronchopulmonaire, de trauma trachéaux, de rétinopathies sévères et de leucomalacie périventriculaires [7]. L’administration de CO2 est une avenue étudiée, mais elle ne

figure pas encore parmi la gamme de modalités thérapeutiques utilisées [8]. Ainsi, les traitements pharmacologiques sont considérés plus sécuritaires. Les méthylxanthines (caféine, aminophylline, théophylline) sont connues depuis plus de 40 ans pour réduire la fréquence des AP [9, 10]. Cependant, elles ne sont pas efficaces dans tous les cas [11, 12]. C’est en cherchant de nouveaux stimulants respiratoires que la progestérone a été proposée [13]. Par contre, cette hormone n’a jamais été testée chez le nouveau-né vu le manque de connaissances sur ses effets respiratoires et ses mécanismes d’actions chez cette population de patients.

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1.2 L’immaturité du système de contrôle respiratoire

1.2.1 Le contrôle de la respiration

La régulation respiratoire (Figure 1, page 4) se fait aux niveaux du système nerveux périphérique (SNP) et du système nerveux central (SNC) de manière inconsciente afin de maintenir un apport en O2 et un rejet de CO2 adéquats selon les

besoins de l’organisme [14]. Le centre respiratoire, retrouvé au niveau du bulbe rachidien du tronc cérébral, est composé de plusieurs groupes de neurones. Le groupe ventral comprend des neurones nécessaires à l’inspiration et l’expiration. Il correspond au noyau ambigus et ses régions adjacentes. C’est dans ce groupe de neurones que l’on retrouve le complexe de pre-Bötzinger au niveau de la médulla ventrolatérale rostrale qui possède les neurones capable de générer le rythme respiratoire [15]. L’adaptation de ce rythme par les centres respiratoires se fait selon les stimuli des pressions partielles artérielles d’O2 et de CO2 qui sont détectés au

niveau périphérique et central.

Les chémorécepteurs périphériques, principalement les corps carotidiens et aortiques, détectent les variations de pression partielle artérielle d’O2, et dans une

moindre mesure, celles de CO2. Ils sont situés respectivement au niveau de la

bifurcation des carotides et de la crosse aortique [16]. Les corps carotidiens relaient leurs informations au SNC via le nerf du sinus carotidien, une branche du nerf glossopharyngien (IX) [17] jusqu’au noyau du tractus solitaire situé dans le tronc cérébral. Les corps aortiques relaient leurs informations au même endroit via le nerf aortique, une branche du nerf vague (X). Au niveau du SNC, le CO2 est le principal

stimulant respiratoire. Il est détecté dans le tronc cérébral au niveau de la medulla oblongata par des chémorécepteurs centraux.

Le groupe dorsal de neurones correspond aux sous-noyaux ventrolatéraux du noyau du tractus solitaire [17]. Le groupe dorsal de neurones du centre respiratoire reçoit les signaux sensoriels des chémorécepteurs centraux, des chémorécepteurs

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périphériques et des barorécepteurs périphériques. Ces deux derniers y sont relayés respectivement par les nerfs glossopharyngiens et vagues [14].

Finalement, les influx nerveux issus des centres respiratoires sont transmis aux différents muscles de la respiration dont le diaphragme via le nerf phrénique issu des racines cervicales C3-C4-C5.

Figure 1 : Contrôle respiratoire.

Cette figure montre les différents organes responsables de la chémodétection, des afférences des stimuli respiratoires et des efférences des commandes motrices respiratoires chez l’humain. L’oxygène

est détecté au niveau périphérique par les corps carotidiens, situés à la bifurcation des carotides, et les corps aortiques, situés dans la crosse aortique. Ces chémorécepteurs envoient ensuite respectivement

leur influx nerveux au groupe de neurones respiratoires dorsal dans le tronc cérébral par les nerfs du sinus carotidiens (une branche du nerf IX) via le ganglion pétreux et les nerfs aortiques (une branche

du nerf X) via le ganglion nodal. Dans le tronc cérébral, le noyau du tractus solitaire intègre les afférences qu’il reçoit et les transmets au groupe de neurones respiratoires ventral. Au sein de ce

dernier, le complexe pre-Bötzinger génère le rythme respiratoire et le communique aux organes effecteurs de la respiration tel le diaphragme via le nerf phrénique ou les muscles intercostaux [18].

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1.2.2 Les manifestations de l’immaturité du système respiratoire

Lors d’une exposition à l’hypoxie, une diminution de la concentration en oxygène artérielle, le nouveau-né a une réponse ventilatoire biphasique. Cette réponse est commune aux mammifères nouveau-nés [16]. Elle est caractérisée par une augmentation initiale de la ventilation minute ( E) (phase initiale) suivi d’une baisse

de celle-ci (état stable) souvent à des niveaux égaux ou inférieurs à ceux de départ (Figure 2, ci-dessous). La phase initiale résulte d’une stimulation des chémorécepteurs périphériques (principalement les corps carotidiens) alors que l’état stable est secondaire à une inhibition essentiellement d’origine centrale qui provient du pont et du thalamus [19]. Plusieurs neurotransmetteurs inhibiteurs sont impliqués, notamment l’adénosine dont les méthylxanthines antagonisent les effets. La réponse ventilatoire à l’hypoxie (RVH) connait une maturation quand le nouveau-né vieillit (Figure 3, page 6) et ce, autant au niveau de phase initiale que de l’état stable [20]. La RVH peut varier selon le sexe [21] et la sévérité de l’hypoxie [22].

Figure 2 : Courbe temporelle d’une réponse ventilatoire à l’hypoxie chez un rat âgé de 7 jours de vie.

Exemple d’une réponse ventilatoire à l’hypoxie (fraction inspirée d’oxygène : FiO2 = 12%) chez un rat

âgé de 7 jours de vie [20]. L’exposition hypoxique engendre une stimulation initiale de la ventilation suivie d’une dépression de celle-ci. Cet aspect est dit « biphasique ».

(24)

Le métabolisme de l’animal doit être pris en compte lors de l’analyse de la RVH. En condition de normoxie, la ventilation minute de l’animal est proportionnelle à sa consommation d’oxygène. Lorsqu’il est exposé à une hypoxie, l’animal augmente sa ventilation, soit le rapport entre sa ventilation minute et sa consommation d’oxygène. Cette augmentation peut être causée de trois façons, soit 1) une augmentation de l’amplitude des mouvements respiratoires, dite hyperpnée, 2) une diminution du métabolisme ou 3) une combinaison de ces réponses. Les nouveau-nés humains et rats utilisent préférentiellement la deuxième option. Ainsi, pour mesurer la ventilation chez ces nouveau-nés, il faut non seulement connaître la variation de la ventilation minute, mais aussi les valeurs du métabolisme [23].

Figure 3 : Aspect développemental de la réponse ventilatoire à l’hypoxie du nouveau-né humain et du nouveau-né rat.

Exemple d’une réponse ventilatoire à l’hypoxie (RVH) à plusieurs âges chez un nouveau-né humain (fraction inspirée d’oxygène : FiO2 = 15%) et chez un rat (FiO2 = 8-10%). La RVH chez un prématurés

humain de 32 semaines de gestation (encadré bleu gauche) est similaire à celle d’un rat nouveau-né de 3-5 jours de vie (encadré bleu droit) alors que pour un nouveau-né humain à terme (encadré rouge gauche), elle est similaire à celui d’un rat nouveau-né de 7-10 jours de vie (encadré rouge droit). Aussi,

la RVH mature plus le nouveau-né vieillit (encadrés rouges en regard des encadrés bleus respectifs des nouveau-nés humains et rats) [24].

Chez le nouveau-né humain prématuré, les apnées sont très fréquentes. En effet, 90% des nouveau-nés pesant moins de 1000 grammes en présentent. La prévalence diminue ensuite plus le nouveau-né vieillit, avec un taux de 50% chez les nouveau-né pesant moins de 1500 grammes [13, 25]. Une apnée est définie par a) une

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pause respiratoire d’au moins 15 à 20 secondes [26] ou b) une pause de plus de 10 secondes associée à une bradycardie (fréquence cardiaque < 80 battements/minute) ou une désaturation en O2 [27].

Chez l’animal, une apnée se définit par une pause respiratoire d’une longueur d’au moins deux cycles respiratoires normaux. Une apnée peut être spontanée ou suivre un soupir (Figure 4, ci-dessous). Un soupir est une inspiration d’au moins deux fois l’amplitude du volume courant (VT) d’une respiration normale [28]. Comme la

RVH, les apnées sont sujettes à une maturation. En effet, le nombre d’apnées spontanées et post-soupirs diminue lorsque l’âge de l’animal augmente [20].

Figure 4 : Exemple typique d’apnée spontanée et post-soupir.

A)

B)

Apnée spontanée enregistrée en condition de normoxie (A) et apnée post-soupir enregistrée en condition d’hypoxie (fraction inspirée d’oxygène : FiO2 = 10%) (B) chez un raton âgé de 10 jours de

vie [28].

1.3 Les stimulants respiratoires

Parmi les traitements des irrégularités respiratoires figurent des modalités d’intervention d’origine mécaniques, physiques et pharmacologiques. Les méthylxanthines sont les stimulants respiratoires les plus utilisés pour le traitement des apnées de prématurité [13].

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1.3.1 Les méthylxanthines

Les méthylxanthines (caféine, aminophylinne, théophilline), des stimulants respiratoires, sont connues pour réduire la fréquence des apnées de prématurité depuis plus de 40 ans [9, 10]. Elles antagonisent les récepteurs de l’adénosine, un nucléoside impliqué dans plusieurs fonctions biologiques comme la régulation du rythme cardiaque, du système immunitaire, du sommeil et de l’angiogenèse pour ne nommer que celles-là [29]. Globalement, elles augmentent la sensibilité des chémorécepteurs au CO2, augmentent la performance des muscles respiratoires et excitent le système

nerveux central [30]. La caféine constitue le meilleur traitement actuel des apnées de prématurité de par son efficacité à réduire leur incidence et l’utilisation de ventilation mécanique, sa faible toxicité et ses effets bénéfiques à long terme [30, 31]. Cependant, certaines apnées sont résistantes aux méthylxanthines [32]. Des traitements alternatifs sécuritaires et efficaces sont donc investigués. Il a notamment été suggéré que la progestérone puisse être une de ces options thérapeutiques.

1.3.2 La progestérone : un stimulant respiratoire chez l’humain

Chez l’homme, la progestérone a été utilisée avec succès pour le traitement de certains patients atteints de maladie pulmonaire obstructive chronique et d’apnée obstructive du sommeil [33]. Chez la femme, elle provoque une augmentation de la ventilation minute et de la RVH durant la grossesse. Aussi, la péri-ménopause et la ménopause, des périodes où il y a une diminution des hormones sexuelles [34], sont associées à une augmentation progressives des problèmes respiratoires liés au sommeil. Les femmes en post-ménopause ont en effet un index d’apnées-hypopnées plus important que les femmes en pré-ménopause [35]. L’amélioration de ces problèmes respiratoires suite aux traitements d’hormonothérapie combinée (œstrogène et progestérone) confirme un rôle des hormones sexuelles dans le contrôle respiratoire [36]. De plus, de jeunes femmes souffrant de syndrome d’hypoventilation congénital ont vu leur réponse ventilatoire au CO2 améliorée [37] sous traitement de

desogestrel, un contraceptif oral contenant de la progestine, une progestérone synthétique. Chez les adultes, les effets de la progestérone sur le système respiratoire

(27)

sont produits à la fois par une action aux niveaux des composantes périphériques et centrales [38]. La littérature sur les effets stimulants de la progestérone au niveau respiratoire chez les enfants est moins abondante. Certains cas seulement sont rapportés. Notamment, deux enfants âgés de quelques mois atteints du syndrome d’hypoventilation congénital ont diminués leurs besoins en ventilation mécanique suite à l’administration d’acétate de médroxyprogestérone [39].

1.3.3 La progestérone : un stimulant respiratoire chez l’animal

nouveau-né

Les rongeurs nouveau-nés sont utilisés depuis longtemps pour l’étude du contrôle du système respiratoire. Leur patron de développement neurologique et respiratoire sont connus et la maturation de leur RVH a un aspect similaire à celle du prématuré humain (voir Figure 3, page 6). Plusieurs études ont évalué l’effet au niveau du système respiratoire d’une augmentation de la progestérone plasmatique chez le rongeur nouveau-né. Il a été démontré que la progestérone administrée de façon aigue à des rats nouveau-nés augmente les deux phases de la RVH, particulièrement chez les rats d’âge inférieur à 7 jours de vie alors qu’elle n’a pas d’effet sur les paramètres respiratoires en condition de normoxie [40]. Chez les rats de 1 jour de vie, elle réduit aussi la fréquence des apnées en condition de normoxie et d’hypoxie. Les effets de la progestérone sur le système respiratoire sont de plus dose-dépendant [41]. L’administration chronique de progestérone via le lait maternel produit aussi des effets sur la respiration [28]. Des rats nouveau-nés âgés de 10 jours de vie provenant de mères ayant reçu un apport supplémentaire en progestérone ont présenté une augmentation de la RVH (surtout lors de l’état stable) et une diminution de la fréquence et de la durée des apnées en condition d’hypoxie sans que les paramètres respiratoires ou les irrégularités respiratoires en condition de normoxie n’aient été modifiés. Les mécanismes par lesquels la progestérone produit ces effets au niveau du système respiratoire ne sont pas encore élucidés [34]. En particulier, le type de récepteurs, soit nucléaire ou membranaire, qui entraîne cette stimulation est inconnu.

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1.4 La progestérone

La progestérone figure parmi les drogues à investiguer dans la recherche de nouveaux stimulants respiratoires [13]. La progestérone est une hormone issue du cholestérol [17]. Elle est lipophile et peut donc diffuser librement à travers les membranes plasmatiques de toutes les cellules du corps incluant celles du SNC. Elle est synthétisée dans les ovaires, les glandes surrénales et le placenta [33], mais aussi dans le SNC et le SNP, d’où son appellation de neurostéroïde [33, 42]. La progestérone est avant tout connue pour ses effets sur le système reproducteur. Elle provoque notamment des changements de l’endomètre utérin afin de le préparer pour la gestation et cause le développement des tissus mammaires en vue de la lactation. Il semble de plus qu’elle ait un rôle important à jouer dans plusieurs aspects du système nerveux comme la remyélinisation [43], la neuroprotection [44] et la stimulation respiratoire. Elle agit en activant différents types de récepteurs (Figure 5, page 11), notamment les nucléaires et les membranaires.

1.4.1 Les récepteurs nucléaires

Dans la cellule, la progestérone lie des récepteurs nucléaires (nPR) dont il existe deux sous-types, PR-A et PR-B. Ils sont synthétisés par épissage alternatif à partir du gène des récepteurs nucléaires de la progestérone [17]. Les nPR sont à ce jour les récepteurs de la progestérone dont les effets sont les plus étudiés et les mieux connus [45]. La liaison des nPR entraîne leur activation et enclenche ainsi un processus de transcription pour certains gènes. La transcription est le processus par lequel de l’ARN messager est créé à partir d’ADN. L’ARN produit peut ensuite être traduit par les ribosomes de la cellule en des protéines qui modifient l’activité cellulaire. C’est l’effet génomique. Les nPR peuvent aussi se déplacer au niveau de la membrane cellulaire et du cytoplasme cellulaire pour agir au niveau de voies de signalement impliquant des kinases [46]. Dans le SNP, les nPR sont retrouvés au niveau du corps carotidien [47]. Dans le SNC, ils sont dispersés dans plusieurs structures impliquées dans le contrôle de la respiration [45], notamment

(29)

l’hypothalamus, le thalamus, l’hypocampe, le noyau hypoglosse, plusieurs structures limbiques et préoptiques et le noyau du tractus solitaire [38, 48].

Figure 5 : Récepteurs de la progestérone.

La progestérone (P) n’est pas seulement synthétisée au niveau périphérique par les glandes surrénales, les ovaires et le placenta, mais aussi par des neurones au niveau du SNC et du SNP. La

progestérone peut lier deux types de récepteurs, soit les récepteurs non classiques parmi lesquels figurent les récepteurs membranaires de la progestérone (mPR), les récepteurs membranaires (25-DX)

et les récepteurs Sigma-1, soit les récepteurs classiques aussi dits nucléaires (nPR). En liant les récepteurs nucléaires, la progestérone modifie l’activité de la cellule par l’élément de réponse de la

progestérone (PRE) en agissant au niveau de l’expression génique. Adaptée de [49].

1.4.2 Les récepteurs membranaires

La progestérone peut aussi lier des récepteurs membranaires. Ils sont situés sur la membrane cellulaire et exercent leur action via une protéine G. Il en existe cinq sous-types, soit mPRα, mPRβ, mPRδ, mPRε et mPRγ qui ont des localisations et fonctions différentes [50]. Par exemple, mPRα est surtout localisé dans les tissus reproducteurs alors que mPRβ et mPRδ sont distribués presque d’exclusivement dans des tissus neuronaux comme le cervelet, le thalamus ou la moelle épinière [45, 51]. Leurs effets au niveau du système de contrôle de la respiration sont inconnus.

(30)

1.4.3 Implication de la progestérone au niveau du contrôle

respiratoire chez les nouveau-nés

Chez le fœtus, une grande proportion de la progestérone à laquelle il est exposé est fabriquée par le placenta. Cette source placentaire reste la plus importante pour le nouveau-né à la naissance. Par contre, les concentrations en progestérone diminuent de façon importante dans les premiers jours de vie. En effet, il a été démontré que la concentration de progestérone diminue d’un facteur de 32 durant les premières 36 heures de vie (différence entre la quantité de progestérone plasmatique prélevée au cordon ombilical au moment de l’accouchement et la quantité de progestérone des prélèvements plasmatiques des nouveau-nés à 36 heures de vie) [52]. Des questions quant à l’implication du retrait prématuré de cette hormone au niveau des différents systèmes immatures des nouveau-nés qui naissent avant terme ont ainsi émergés [53]. Bien que les études chez des modèles animaux évoquent des bénéfices potentiels de la progestérone au niveau du système respiratoire immature, aucune donnée n’existe à ce jour sur l’utilisation de la progestérone pour le traitement des apnées de prématurité chez les nouveau-nés humains. Le manque de connaissances concernant les mécanismes d’action par lesquels la progestérone produit ses effets au niveau du système respiratoire limite son utilisation. Les actions stimulantes de la progestérone sur la respiration sont-elles le résultat d’une liaison de la progestérone à ses récepteurs nucléaires? Le manque de spécificité des antagonistes des récepteurs de la progestérone limite leur utilisation dans l’identification du rôle de ces récepteurs dans la stimulation du système respiratoire. En effet, ces antagonistes ne sont pas sans action sur les récepteurs des autres hormones stéroïdiennes [54]. Par exemple, un des antagonistes des récepteurs nucléaires, la mifépristone, a aussi un effet antagoniste sur les récepteurs des glucocorticoïdes et des canaux calciques. Il en est de même pour les substances spécifiques aux récepteurs membranaires de la progestérone telles que le 18a-methylprogesterone qui ont tous une certaine affinité avec les récepteurs nucléaires de la progestérone [55].

(31)

1.5 Hypothèse

Pour étudier le rôle des récepteurs nucléaires de la progestérone dans le contrôle de la respiration en période néonatale, l’utilisation d’un modèle génétiquement modifié plutôt que pharmacologique permettra d’identifier de façon spécifique le rôle de ces récepteurs dans la ventilation chez des souris en développement. Dans ce projet, des souris ayant un bagage génétique modifié par l’insertion d’un gène rendant inactifs les deux isoformes PR-A et PR-B des récepteurs nucléaires de la progestérone (Figure 6, ci-dessous) sont comparées à des souris sauvages dites wild type (WT) [1].

Figure 6 : Insertion du gène LacZ dans l’exon 1 du gène des récepteurs nucléaires de la progestérone.

Stratégie de ciblage génétique qui permet l’inactivation du gène LacZ dans l’exon 1 du gène codant pour les récepteurs nucléaires de la progestérone [56].

Cette inactivation se fait en insérant un gène lacZ par recombinaison homologue dans l’exon 1 du gène des récepteurs nucléaires de la progestérone [56]. Chez l’humain, ce gène se trouve sur le chromosome 11 et chez la souris il se trouve sur le chromosome 9 [42]. Les souris PRKO (Progesterone receptors knock-out)

(32)

adultes utilisées proviennent d’une colonie déjà présente au laboratoire établie grâce à trois individus (1 mâle homozygote et 2 femelles hétérozygotes) du laboratoire de J. Lydon (Baylor College of Medicine, Houston, Texas) où elles ont été élaborées.

Nous faisons l’hypothèse que le récepteur nucléaire de la progestérone est impliqué dans la ventilation chez les souris en développement.

1.6 Objectifs

L’objectif général est d’identifier le rôle du récepteur nucléaire de la progestérone dans la ventilation de souris nouveau-nées WT et PRKO âgées de 1 et 4 jours de vie (P1 et P4) par pléthysmographie à corps entier. Les objectifs secondaires sont d’identifier le rôle de ce récepteur dans :

1- Les paramètres respiratoires en condition de normoxie. 2- Les paramètres respiratoires en condition d’hypoxie (RVH). 3- Les irrégularités respiratoires en condition de normoxie. 4- Les irrégularités respiratoires en condition d’hypoxie.

Ces objectifs seront analysés en regard : 5- Du génotype (WT et PRKO). 6- De l’âge (P1 et P4).

(33)
(34)

2.1 Les groupes étudiés

Les souris PRKO adultes ont été obtenues de J. Lydon (Baylor College of Medicine, Houston, Texas). La colonie du laboratoire est composée de mâles homozygotes, de femelles hétérozygotes et de souris adultes WT de souche C57bl6. Les animaux sont soumis à un cycle jour/nuit de 12 heures à une température ambiante de 21ºC et ont de la nourriture et de l’eau ad libitum. Les souris femelles homozygotes étant infertiles [57], les nouveau-nés PRKO proviennent de l’accouplement des femelles adultes hétérozygotes âgées de 6-8 semaines. Pour l’accouplement, elles sont mises en cage avec des mâles homozygotes PRKO pendant plusieurs jours. L’état gestationnel est confirmé par une augmentation de la masse abdominale de la souris. Durant la gestation, les femelles sont laissées seules et tranquilles dans leur cage. La même méthode est utilisée pour les animaux WT. Le jour de la naissance est considéré comme le jour 0 (P0). Les nouveau-nés sont laissés avec la mère jusqu’à ce qu’ils soient utilisés pour le protocole. Chaque nouveau-né est utilisé pour un seul enregistrement à P1 ou P4. Les nouveau-nés enregistrés à P1 sont âgés entre 15 et 30 heures de vie et les nouveau-nés enregistrés à P4 sont âgés entre 87 et 102 heures de vie.

Pour obtenir une puissance statistique de 90%, avec une différence minimale entre les groupes de 15%, un écart-type de 20% et un p<0,05, un nombre d’environ quinze souris par groupe est suggéré. Les groupes étudiés sont WT mâles, WT femelles, PRKO mâles et PRKO femelles, et ce, pour les P1 et les P4.

2.2 La pléthysmographie à corps entier

La fréquence respiratoire (FR) et le volume courant (VT) sont enregistrés par

pléthymosgraphie à corps entier. Ils permettent de calculer la ventilation minute (VE)

( E = FR*VT). Pour l’enregistrement de la respiration, l’animal est introduit dans une

(35)

réduisant ainsi respectivement les effets du stress et des substances pharmacologiques sur le système respiratoire de l’animal. Le principe de l’enregistrement sous-tend que l’air inspiré par l’animal est réchauffé et humidifié par son passage dans les voies respiratoires jusqu’aux alvéoles. Cela crée une différence de pression à l’intérieur de la chambre de pléthysmographie qui sera captée par un détecteur de pression [58]. La transformation inverse se produit lorsque l’air est expiré créant une déviation de pression opposée à celle de l’inspiration. Dans ce projet, comme le système sera ouvert, et non fermé, une différence de débit plutôt que de pression sera causée par la respiration. En intégrant la valeur de débit, il est possible de calculer le changement de volume équivalent. Les valeurs de pressions de la chambre de l’animal sont comparées aux valeurs d’une chambre de référence afin de rendre le système de mesure indépendant des changements brusques de pression survenant sur le site d’enregistrement [59]. L’enregistrement de la respiration permet aussi de déterminer la fréquence et le type d’apnées [16]. Des chambres de pléthysmographie de volume d’environ 18,5 cm3 (Figure 7, page 18) ont été construites étant donné que leur

volume ne doit pas dépasser de plus de trois à quatre fois le volume de l’animal [60].

Le poste de travail comporte plusieurs éléments soit un débitmètre (modèle 4140; TSI, Shoreview, MN) permettant de mesurer le débit d’air entrant dans la chambre, un analyseur de pression de vapeur d’eau (pH2O) (RH 300, Sable systems

International, Las Vegas, NV, U.SA) qui enregistre la pH2O et un capteur de pression

différentielle (Emka Technologies, Paris, France) qui enregistre les différences de pressions causées par la respiration de l’animal entre la chambre contenant l’animal et la chambre de référence. Ces mesures sont nécessaires au calcul du volume courant (Figure 8, page 18) qu’il faut aussi diviser par la masse de l’animal afin d’éviter des différence de croissance inter- et intra-individuelle [1]. La pompe (Qubit Systems, Kingston, ON, Canada) à la fin du circuit permet d’échantillonner l’air sortant. Finalement, des analyseurs d’O2 et CO2 (AEI, technologies, Pittsburgh, PA, USA)

entrant et sortant permettent de recueillir les données nécessaires aux calculs du métabolisme.

(36)

Figure 7 : Schéma du montage de pléthysmographie à corps entier.

Avant d’arriver à l’animal, l’air ambiant ou le mélange d’air ambiant et d’azote utilisé pour les périodes d’hypoxie doit traverser une pompe, un analyseur d’O2, un analyseur de CO2 et un débimètre.

La chambre est maintenue à température constante. La différence de débit enregistrée est ensuite intégrée en volume. À la sortie de la chambre, les valeurs de pH2O, d’O2 et de CO2 sont mesurés par

des analyseurs spécifiques. Ces valeurs permettront de calculer le volume courant. Ces différentes données sont enregistrées minute par minute par le logiciel IOX software. Un tracé respiratoire de

l’animal est aussi enregistré par ce logiciel.

Figure 8 : Formule mathématique permettant le calcul du volume courant.

Valeurs permettant le calcul du volume courant. PT et PK: intégrale de la lecture du volume

courant et de la lecture du capteur de pression utilisée pour la calibration (ʃv); VK : volume d’air injecté

dans la chambre pour la calibration (μl); TR et TC: température de l’animal et de la chambre (kelvin);

PB: pression barométrique (mmHg), PC: pression de vapeur d’eau dans la chambre (mmHg); PR:

pression de vapeur d’eau à la température corporelle (mm Hg) [58].

Les appareils du poste de travail sont ajustés selon certaines valeurs préétablies. Le débit d’air entrant est réglé à 80 ml/min. La pompe à la fin du circuit est ajustée à 40 ml/min. La température de la chambre est réglée à 32ºC pour les P1 et P4 [61] et est maintenue constante par un système de contrôle de la température (Physitemp, Clifton, USA). Puis, chacun des appareils est calibré. La calibration du

(37)

capteur de pression se fait par l’injection de 10 μl d’air dans la chambre (VK dans la

Figure 8, page 18). Le système d’acquisition mesure l’intégrale (aire sous la courbe) de la déviation induite (PK dans la Figure 8) par l’injection d’air. Les analyseurs d’O2

et de CO2 (AEI technologies, Napercille, IL, USA) sont calibrés à l’aide d’une

bombonne de gaz dont la concentration est certifiée.

2.3 Le protocole expérimental

Le protocole suivant a été approuvé par le comité de protection des Animaux de l’Université Laval selon les directives du Conseil Canadien de protection des animaux. L’expérimentateur est aveugle quant au génotype des souris nouveau-nées. Les nouveau-nés sont enregistrés entre 7-17 heures pour éviter une trop grande variabilité d’âge étant donné qu’ils n’ont que quelques dizaines d’heures de vie. Les animaux d’une portée sont tous utilisés à un même âge.

Le nouveau-né est d’abord pesé puis mis dans la chambre de pléthysmographie pendant 10 minutes pour une première période d’adaptation (Figure 9, page 20). Sa température buccale est ensuite prise avec un thermomètre (Thermocouple Thermometer, Barrington, IL, USA) et le nouveau-né est réintroduit dans la chambre pour 10 minutes additionnelles pour une deuxième période d’adaptation. Ensuite, la respiration est enregistrée pendant 10 minutes en condition de base (normoxie, FiO2 = 21%) Puis, l’animal est exposé à trois niveaux différents

d’hypoxie (FiO2 = 14±0,2%, 12±0,2% et 10±0,2%). L’hypoxie est créée par un

mélange d’air ambiant et d’azote. La concentration d’O2 désirée dans la chambre est

atteinte en ≈ 2 minutes. Chaque hypoxie dure 20 minutes. L’ensemble des signaux sont enregistrés sur l’ordinateur (IOX, Emka Technologies, Paris, France). La valeur moyenne des différents paramètres est reportée minute par minute. La pompe de sous-échantillonnage est allumée pour quelques minutes à la fin de la période de normoxie et de chaque période d’hypoxie pour mesurer les valeurs d’O2 et de CO2

(38)

Le ratio entre la production de CO2 ( CO2) et la consommation d’O2 ( O2)

est calculé. Les valeurs de métabolisme sont ajustées pour la masse des animaux afin de pallier aux différences intra- et interindividuelles de croissance.

Figure 9 : Schéma du déroulement d’une expérience.

Lors du protocole, l’animal est placé dans la chambre pour une période d’adaptation de 30 minutes durant lesquelles un enregistrement de 10 minutes est effectué en condition de base (normoxie, FiO2 =

21%). L’enregistrement se poursuit avec trois hypoxies successives (FiO2 = 14%, 12% et 10%) durant

chacune 20 minutes.

Une fois l’enregistrement terminé, les nouveau-nés P1 et P4 sont respectivement sacrifiés par décapitation et surdose de kétamine/xylazine (Wyeth, St-Laurent, Québec, Canada/ Bayer Health care, Ontario, Canada). Une oreille de chaque animal est prélevée et mise à 4ºC. Elle servira à déterminer le génotype et le sexe du nouveau-né.

(39)

2.4 Analyses

2.4.1 Identification du génotype et du sexe par PCR

La technique de polymerase chain reaction (PCR) permet une amplification rapide et spécifique de segments d’ADN. Elle est ici utilisée pour déterminer le génotype et le sexe [62] des souris nouveau-nées. Le sexe chez la souris peut être identifié de façon anatomique en regardant la distance entre l’urètre et l’anus, mais cette technique est peu précise chez les nouveau-nés. La technique du PCR consiste en trois étapes, soit la dénaturation, l’hybridation et l’élongation. Ces étapes sont communes peu importe le gène à identifier. La dénaturation permet à la double hélice d’ADN de se dérouler et de se séparer en 2 brins, permettant ainsi la fixation des amorces spécifiques lors de l’hybridation. Finalement, l’élongation de la chaine correspond à l’ajout de bases aux nucléotides correspondant. Lorsque ce cycle de trois étapes est terminé, il recommence plusieurs fois afin d’amplifier de façon exponentielle le segment désiré du gène. La séquence des amorces utilisées (Tableau 1, page 22), la durée des différentes étapes et le nombre de cycles d’amplification (Tableau 2, page 22) dépendent du gène à amplifier.

Pour réaliser un PCR, il faut extraire l’ADN des tissus, ici, les morceaux d’oreilles prélevés des souris nouveau-nées, en les mélangeant avec une solution de lyse alcaline. Après avoir fait bouillir ce mélange pendant 30 minutes à 95ºC, on le neutralise avec du Tris-HCl. Puis, 1 μl de chacun des échantillons digérés contenant l’ADN du spécimen est mélangé avec 24 μl du mélange de produits approprié et déposé dans le thermocycleur PTC-100 Programmable Thermal Controller (MJ Research, Inc). Lorsque le PCR est terminé, 5 μl de colorant dye blue 6X sont ajoutés à chaque tube contenant les amplicons afin de permettre leur visualisation dans les puits du gel d’agarose. Une préparation d’ADN standard est utilisée pour déterminer la taille des fragments amplifiés. Une fois l’électrophorèse terminée, une photo du gel d’agarose est prise (geldoc G:Box apparatus - Sysgene) (Figure 10, page 23). Les produits de PCR sont détectés grâce à la présence du SYBR safe (Invitrogen).

(40)

Tableau 1 : Produits utilisés dans l’exécution des PCR.

Produits Concentration génotype PCR PCR sexe

Eau sans nucléase X X

ThermPol Reaction Buffer (tampon) 10X X X

Pre-mixed dNTPs (nucléotides) 2,5 mM X X

Amorce P1(sens)

5’-TAG ACA GTG TCT TAG ACT CGT TGT TG-3’ 25 μM X

Amorce P3 (anti-sens)

5’-GAT GGG CAC ATG GAT GAA ATC-3’ 25 μM X

Amorce PRLacZ (anti-sens)

5’-CTT CAC CCA CCG GTA CCT TAC GCT-3’ 25 μM X

Amorce sexR (anti-sens)

5’- CTG AAG CTT TTG GCT TTG AG-3’ 25 uM X

Amorce sexF (sens)

5’- CCA CTG CCA AAT TCT TTGG-3’ 25 uM X

Taq polymerase (ADN polymérase) 5000 unités/ml X X

Le PCR pour déterminer le génotype nécessite l’utilisation d’eau sans nucléase, de ThermoPol Buffer, de Pre-mixed dNTPs d’amorces P1, P3 et PRLacZ et de Taq polymerase. Le PCR pour déterminer le

sexe nécessite l’utilisation d’eau sans nucléase, de ThermPol Reaction Buffer, de Pre-mixed dNTPs, d’amorces sexR et sexF et de Taq polymerase.

Tableau 2 : Caractéristiques des différentes étapes de PCR et d’électrophorèse.

PCR Étape Température (°C) Durée (minutes) Génotype Dénaturation 94 3 Amplification (40 cycles) Dénaturation 94 1 Hybridation 60 2 Élongation 72 1 Élongation finale 72 10

Électrophorèse (gel 1,7%) - 45 à 75 volts et 45 à 120 volts

Sexe Dénaturation 94 5 Amplification (35 cycles) Dénaturation 94 0.33 Hybridation 54 1 Élongation 72 0.66 Élongation finale 72 10

Électrophorèse (gel 2%) - 90 à 100 volts

Pour les deux types de PCR, il y a d’abord une étape de dénaturation de l’ADN suivie de cycles d’amplification. Ces cycles d’amplification sont composés d’étapes successives de dénaturation, hybridation et élongation. Lorsque tous les cycles sont terminés, il y a une étape finale d’élongation.

(41)

Figure 10 : Représentation d’analyses permettant de déterminer le génotype et le sexe.

A)

B)

En A), l’échantillon 948 a seulement une bande d’une taille de 590 paires de bases et provient d’un animal WT (+/+). L’échantillon 961 possède seulement une bande d’une taille de 148 paires de bases

et provient d’un animal PRKO homozygote (-/-). L’échantillon 962 possédant les deux bandes est hétérozygote (+/-). En B), l’échantillon 831 a seulement une bande de taille de 331 paires de bases et provient donc d’un animal de sexe féminin. L’échantillon 832 possède les deux bandes de taille de 331

(42)

Les amorces P1 et P3 génèrent une bande de taille de 590 paires de bases correspondant au gène non muté des récepteurs nucléaires de la progestérone, soit l’allèle sauvage alors que les amorces P1 et PrLacZ génèrent une bande de taille de 148 paires de bases correspondant à la présence des récepteurs mutés et donc inactifs des récepteurs nucléaires de la progestérone. La présence des deux bandes indique que la souris est hétérozygote [56]. Une bande de taille de 331 paires de bases générée par les amorces sexF et sexR indique la présence du chromosome X alors qu’une bande de taille de 302 paires de bases générée par les deux mêmes amorces indique la présence du chromosome Y. Un animal de sexe féminin (XX) est donc identifié s’il a seulement la bande de taille de 331paires de bases alors que les animaux de sexe masculin (XY) ont les deux bandes [62].

2.4.2 Analyse des paramètres ventilatoires et des irrégularités

respiratoires

Pour l’enregistrement en condition de normoxie, les minutes d’enregistrement où l’animal est agité sont rejetées. La moyenne des divers paramètres (fréquence respiratoire, volume courant et ventilation minute) est ensuite calculée avec les minutes restantes. La fréquence respiratoire (FR) est exprimée en FR/min, le volume

courant (VT) est exprimé en ml/100g et la ventilation minute ( E = FR*VT) est

exprimée en ml/min/100g. La consommation d’oxygène et la production d’oxygène sont exprimées en unités par 100 grammes de poids. En condition d’hypoxie, les résultats de la RVH sont exprimés en pourcentage de changement par rapport à la normoxie. La moyenne des paramètres respiratoires minute par minute permet d’illustrer de façon temporelle l’évolution de la fréquence respiratoire, du volume courant et de la ventilation minute pour chacun des niveaux d’hypoxie. Les résultats en condition d’hypoxie sont ensuite séparés en phase initiale et en état stable. Pour la phase initiale, la valeur de la deuxième minute enregistrée est utilisée comme valeur pic des paramètres respiratoires pour chacune des périodes d’hypoxie. L’état stable est calculé en faisant la moyenne des cinq dernières minutes d’enregistrement pour chacune des périodes d’hypoxie.

(43)

Les apnées sont analysées durant les minutes d’enregistrement où le tracé respiratoire est stable et régulier. Les apnées spontanées sont définies comme une pause respiratoire équivalente à deux cycles respiratoires réguliers. Les apnées post-soupirs sont définies comme un arrêt de la respiration qui survient après une inspiration ayant un volume courant d’au moins deux fois supérieur à celui d’une respiration normale (Figure 11, ci-dessous). En condition de normoxie, les apnées sont analysées durant les 10 dernières minutes de cette période qui correspondent à la période d’enregistrement (voir Figure 9, page 20). En condition d’hypoxie, les apnées sont analysés lors de l’état stable, soit, durant les 5 dernières minutes d’enregistrement de chaque hypoxie. Le nombre d’apnée total est calculé en additionnant le nombre d’apnées spontanées et post-soupir.

Figure 11 : Exemple d’apnée spontanée et post-soupir chez un P1 WT soumis à une hypoxie de 12%.

Cette figure présente une apnée spontanée de 3 secondes suivie quelques instants après par une apnée post-soupir d’un peu plus de 4 secondes.

2.4.3 Analyses statistiques

Le logiciel GraphPad Prism 6 est utilisé pour toutes les analyses subséquentes. Les valeurs sont présentées en moyenne ± SEM. En normoxie, les différences au niveau des masses, des températures corporelles, des paramètres respiratoires et des valeurs de métabolisme entre les groupes expérimentaux sont testées en utilisant des ANOVA à 2 facteurs avec le génotype et le sexe comme variables indépendantes. Le nombre moyen de nouveau-nés par portée est calculé pour chacun des groupes en utilisant un test de student pour valeurs non-pairées. En condition d’hypoxie, les paramètres respiratoires sont testés en utilisant des ANOVA à 2 facteurs avec le

(44)

génotype et le sexe comme variables indépendantes pour chaque période d’hypoxie (14%, 12% et 10%) et pour chacune des phases de la RVH, soit la phase initiale et l’état stable. L’expression des résultats de la RVH en pourcentage de changement par rapport aux valeurs enregistrées en normoxie (normalisation des valeurs par rapport à leur valeur de base) ne rend pas nécessaire la réalisation d’ANOVA de mesures répétées.

Quant aux irrégularités respiratoires, des ANOVA à 1 facteur sont utilisés avec le génotype, le sexe et l’âge comme valeurs indépendantes. Chaque type d’apnée est exprimé en nombre d’évènements par 10 minutes. La durée totale des apnées est rapportée en seconde par 10 minutes.

(45)
(46)

3.1 Caractéristiques physiques des groupes étudiés

Le Tableau 3 ci-dessous présente les masses et les températures corporelles pour chacun des groupes étudiés. Un effet génotype est visible chez les P1 (p˂0.001) et P4 (p˂0.05) alors que les animaux PRKO ont des masses plus élevées que celles des WT. Aucun effet sexe ni aucune interaction génotype*sexe ne sont observés.

Tableau 3 : Caractéristiques physiques des groupes utilisés.

Masse (g) et température corporelle initiale (ºC) des nouveau-nés WT et PRKO mâles (♂) et femelles (♀) âgés de 1 et 4 jours de vie (P1-P4). Un effet génotype existe chez les P1 et P4 au niveau de la masse alors que les PRKO ont des masses supérieures à celles des WT. Aucun effet sexe n’est noté.

Moyenne ± SEM. Sexe Nombre de portées WT

(+/+) PRKO (-/-) génotype Effet Effet sexe

Masse (g) P1 ♂ 8 1.5 ± 0.1 (n=15) 1.7 ± 0.1 (n=14) p ˂ 0.001 ns ♀ 8 1.5 ± 0.1 (n=15) 1.7 ± 0.1 (n=12) P4 ♂ 7 2.7 ± 0.2 (n=16) 3.1 ± 0.2 (n=16) p ˂ 0.05 ns ♀ 7 2.8 ± 0.1 (n=16) 3.2 ± 0.3 (n=12) Température corporelle initiale (ºC) P1 ♂ 7 31.8 ± 0.3 31.9 ± 0.3 ns ns ♀ 7 32.0 ± 0.3 31.4 ± 0.4 P4 ♂ 8 32.7 ± 0.2 32.6 ± 0.1 ns ns ♀ 8 32.4 ± 0.3 32.9 ± 0.4

(47)

3.2 Effet de l’inactivation du récepteur nucléaire de la

progestérone sur les paramètres respiratoires

3.2.1 En condition de normoxie

La Figure 12 en page 30 présente les valeurs des paramètres respiratoires en condition de normoxie. Pour la fréquence respiratoire, aucun effet génotype ni sexe n’est noté à P1 ou P4. Aucune interaction génotype*sexe n’est notée. Pour le volume courant, aucun effet génotype n’est noté à P1 ou P4. Un effet sexe est présent à P1 (p˂0.05) alors que les femelles ont des valeurs supérieures à celles des mâles. Cet effet n’est pas présent à P4. Aucune interaction génotype*sexe n’est notée. Pour la ventilation minute, aucun effet génotype n’est noté à P1 ou P4. Un effet sexe est présent à P1 (p˂0.01) alors que les femelles ont des valeurs supérieures à celles des mâles. Cet effet n’est pas présent à P4. Aucune interaction génotype*sexe n’est notée.

Pour la consommation d’O2, aucun effet génotype n’est noté (Figure 13, page 31).

Un effet sexe est noté à P4 (p˂0.05) alors que les femelles ont des valeurs plus élevées que celles des mâles. Aucune interaction génotype*sexe n’existe. Pour la consommation de CO2, un effet génotype est noté à P4 (p˂0.05) alors que les PRKO

ont des valeurs inférieures à celles des WT. Un effet sexe est observé chez les P1 (p˂0.05) alors que les femelles ont des valeurs supérieures à celles des mâles. Pour le ratio entre la production de CO2 et la consommation d’O2, un effet génotype est noté

chez les P4 (p˂0.05) alors que les PRKO ont des valeurs inférieures à celles des WT. Aucune interaction génotype*sexe n’est significative.

(48)

Figure 12 : Paramètres ventilatoires en condition de normoxie.

Valeurs de fréquence respiratoire, volume courant et ventilation minute des nouveau-nés âgés de 1 et 4 jours de vie en condition de normoxie. Aucun effet génotype n’est noté pour aucun de ces paramètres. Un effet sexe est noté pour le volume courant et la ventilation minute chez les P1. Les femelles ont alors des valeurs supérieures à celles de mâles. Aucune interaction génotype*sexe n’est

significative.

(49)

Figure 13 : Métabolisme en condition de normoxie.

Consommation d’O2, production de CO2 et ratio entre la production de CO2 et la consommation d’O2

des nouveau-nés âgés de 1 et 4 jours de vie en condition de normoxie. Un effet génotype est noté au niveau de la production de CO2 et du ratio entre la production de CO2 et la consommation d’O2 chez

les P4 alors que les PRKO ont des valeurs moins importantes que les WT. Un effet sexe est noté chez les P1 au niveau de la production de CO2 et chez les P4 au niveau de la production d’O2 alors que les

femelles ont des valeurs supérieures à celles des mâles. Aucune interaction génotype*sexe n’est significative.

(50)

3.2.2 En condition d’hypoxie

Les Figures 14-15-16 montrent respectivement en page 33, 34 et 35 l’évolution de la fréquence respiratoire, du volume courant et de la ventilation minute en réponse aux trois niveaux d’hypoxie de 14%, 12% et 10%. Comme le démontre ces figures, nos souris nouveau-nées possèdent une RVH biphasique, et ce, chez les mâles comme chez les femelles âgés de 1 et 4 jours de vie.

Pour la fréquence respiratoire, aucun effet génotype n’est noté ni pour la phase initiale ni pour l’état stable à P1 et P4. Aucun effet sexe n’est observé pour la phase initiale. Un effet sexe est noté au niveau de l’état stable à une hypoxie de 10% à P1 (p˂0.05) et P4 (p˂0.01) alors que les femelles ont des valeurs inférieures à celles des mâles. Aucune interaction génotype*sexe n’est notée.

Pour le volume courant, aucun effet génotype n’est noté pour la phase initiale ni à P1 ni à P4. Un effet génotype (p˂0.05) est noté à P1 pour l’état stable à une hypoxie de 14% alors que les PRKO ont des valeurs inférieures à celles des WT. Un effet sexe est observé pour la phase initiale à P1 à une hypoxie de 12% (p˂0.05) et à P4 à une hypoxie de 10% (p˂0.05) alors que les femelles ont des valeurs inférieures à celles des mâles. Un effet sexe est noté au niveau de l’état stable à P1 aux hypoxies de 14% (p˂0.05), 12% (p˂0.01) et 10% (p˂0.01) et à P4 aux hypoxies de 14% (p˂0.05), 12% (p˂0.05) et 10% (p˂0.05) alors que les femelles ont des valeurs inférieures à celles des mâles. Aucune interaction génotype*sexe n’est notée.

Pour la ventilation minute, aucun effet génotype n’est noté ni pour la phase initiale ni pour l’état stable et ce ni à P1 ni à P4. Un effet sexe est noté au niveau de la phase initiale à P1 à une hypoxie de 12% (p˂0.05) et à P4 à une hypoxie de 10% (p˂0.05) alors que les femelles ont des valeurs inférieures à celles de mâles. Un effet sexe est aussi noté au niveau de l’état stable à P1 aux hypoxies de 14% (p˂0.01), 12% (p˂0.001) et 10% (p˂0.001) et à P4 aux hypoxies de 12% (p˂0.05) et 10% (p˂0.01) alors que les femelles ont des résultats inférieurs à ceux des mâles. Aucune interaction génotype*sexe n’est notée.

(51)

Figure 14 : Évolution de la fréquence respiratoire aux différents niveaux d’hypoxie.

Fréquence respiratoire exprimée minute par minute en pourcentage de changement par rapport à la normoxie des mâles et des femelles âgés de 1 et 4 jours de vie pour les trois périodes d’hypoxie de 14%, 12% et 10% durant chacune 20 minutes. Aucun effet génotype n’est présent ni pour la phase initiale ni pour l’état stable de la RVH. Aucun effet sexe n’est

(52)

Figure 15: Évolution du volume courant aux différents niveaux d’hypoxie.

Volume courant exprimé minute par minute en pourcentage de changement par rapport à la normoxie des mâles et des femelles âgés de 1 et 4 jours de vie pour les trois périodes d’hypoxie de 14%, 12% et 10% durant chacune 20 minutes. Aucun effet génotype n’est présent pour la phase initiale de la RVH. Un effet génotype est présent à P1 pour l’état stable de la RVH à une hypoxie de 14% alors que les PRKO ont des valeurs inférieures à celles de WT. Un effet sexe est visible pour la phase initiale à P1 à une hypoxie de 12% et à P4 à une hypoxie de 10%. Un effet sexe est visible au niveau de la phase de l’état stable à P1 et P4 pour les trois niveaux d’hypoxie. Dans tous les cas, les femelles ont des valeurs

(53)

Figure 16 : Évolution de la ventilation minute aux différents niveaux d’hypoxie.

Ventilation minute exprimée minute par minute en pourcentage de changement par rapport à la normoxie des mâles et des femelles âgés de 1 et 4 jours de vie pour les trois périodes d’hypoxie de 14%, 12% et 10% durant chacune 20 minutes. Aucun effet génotype n’est présent ni pour la phase initiale ni pour l’état stable de la RVH. Un effet sexe est visible pour

(54)

3.3 Effet de l’inactivation du récepteur nucléaire de la

progestérone sur les irrégularités respiratoires

3.3.1 En condition de normoxie

Le nombre d’apnées total, spontanées, post-soupir et des soupirs sont présentés dans la Figure 17 en page 37. Comme les mâles et les femelles ne démontrent pas de différences (p˂0.05), leurs résultats sont mis en commun. Pour le nombre d’apnées total, aucun effet génotype n’est observé. Un effet âge est noté alors que les P4 WT (p˂0.05) ont des valeurs inférieures à celles des P1 WT. Pour le nombre d’apnées spontanées, aucun effet génotype n’est observé. Un effet âge est visible chez les P4 WT (p˂0.01) et P4 PRKO (p˂0.05) alors qu’ils ont des valeurs inférieures à celles des P1. Pour le nombre d’apnées post-soupir, aucun effet génotype n’est observé. Un effet âge est présent chez les P4 WT (p˂0.05) alors qu’ils ont des valeurs inférieures à celles des P1. Pour le nombre de soupir total, aucun effet génotype ni sexe n’est observé.

La durée des apnées totales, spontanées et post-soupir sont présentées dans la Figure 18 en page 38. Les résultats des mâles et femelles ont ici aussi été mis en commun. Pour la durée totale des apnées, aucun effet génotype n’est observé. Un effet âge est noté alors que les P4 WT (p˂0.05) ont des valeurs moins élevées que les P1 WT. Pour la durée des apnées spontanées, aucun effet génotype n’est observé. Un effet âge est visible chez les P4 WT (p˂0.001) et P4 PRKO (p˂0.001) alors qu’ils ont des valeurs inférieures à celles des P1. Pour la durée des apnées post-soupir, aucun effet génotype n’est observé. Un effet âge est présent chez les P4 WT (p˂0.05) alors qu’ils ont des valeurs inférieures à celles des P1 WT.

(55)

Figure 17 : Nombre d’irrégularités respiratoires en condition de normoxie.

Nombre total d’apnées, nombre d’apnées spontanées, d’apnées post-soupirs et des soupirs chez les nouveau-nés âgés de 1 et 4 jours de vie en condition de normoxie. Aucun effet génotype n’est noté. Les résultats des mâles et des femelles ont été mis en communs, car ils ne montraient pas de différence

significative. Un effet âge est noté chez les WT pour le nombre total d’apnées, le nombre d’apnées spontanées et d’apnées post-soupir. Un effet âge est aussi noté chez les PRKO pour le nombre

d’apnées spontanées. Les P4 ont tous des valeurs inférieures à celles des P1. Moyenne ± SEM.*: p<0.05 vs P1, **: p<0.01 vs P1.

(56)

Figure 18 : Durée moyenne des irrégularités respiratoires en condition de normoxie.

Durée totale des apnées, durée des apnées spontanées et des apnées post-soupir chez les nouveau-nés âgés de 1 et 4 jours de vie en condition de normoxie. Aucun effet génotype n’est noté. Les résultats des mâles et des femelles ont été mis en communs, car ils ne montraient pas de différence significative. Un

effet âge est noté chez les WT pour la durée totale des apnées, la durée des apnées spontanées et la durée des apnées post-soupir. Un effet âge est noté chez les PRKO pour la durée des apnées

spontanées. Les P4 ont tous des valeurs inférieures à celles des P1. Moyenne ± SEM.*: p<0.05 vs P1; ***: p<0.001 vs P1.

(57)

3.3.2 En condition d’hypoxie

Le nombre d’apnées total, spontanées, post-soupir et des soupirs en condition d’hypoxie sont présentés dans la Figure 19 en page 41. Comme les mâles et les femelles ne démontrent pas de différences significatives (p˂0.05), leurs résultats sont mis en commun. Pour le nombre d’apnée totale, un effet génotype est présent à P1 à une hypoxie de 12% (p˂0.01) et 10% (p˂0.05) alors que les PRKO ont des valeurs inférieures à celles des WT. Un effet âge est présent chez les WT aux hypoxies de 14% (p˂0.01), 12% (p˂0.01) et 10% (p˂0.05) alors que les P4 ont des valeurs inférieures à celles des P1. Pour le nombre d’apnées spontanées, un effet génotype est présent à P1 à une hypoxie de 12% (p˂0.05) et 10% (p˂0.01) alors que les PRKO ont des valeurs inférieures à celles des WT. Un effet âge est noté à une hypoxie de 14% chez les WT (p˂0.001) et PRKO (p˂0.01), 12% chez les WT (p˂0.001) et PRKO (p˂0.05) et 10% chez les WT (p˂0.001) et PRKO (p˂0.05) alors que les P4 ont des valeurs inférieures à celles des P1. Pour le nombre d’apnées post-soupir, un effet génotype est présent à P1 à une hypoxie de 14% (p˂0.01), 12% (p˂0.01) et 10% (p˂0.05) alors que les PRKO ont des valeurs inférieures aux WT. Un effet génotype est présent à P4 (p˂0.05) à une hypoxie de 14% alors que les PRKO ont des valeurs supérieures à celles des WT. Un effet âge est noté à une hypoxie de 14% pour les WT (p˂0.01) et PRKO (p˂0.05) et à 12% (p˂0.05) pour les WT. Pour les WT, les valeurs des P4 sont inférieures à celle des P1 alors que celles des P4 PRKO sont supérieures. Pour le nombre de soupir, aucun effet génotype ni sexe n’est observé.

Les durées de ces mêmes irrégularités respiratoires sont présentées dans la Figure 20 en page 42. Les résultats des mâles et femelles ont ici aussi été mis en commun. Pour la durée des apnées totale, aucun effet génotype n’est présent. Un effet âge est observé à une hypoxie de 14% chez les WT (p˂0.01) et PRKO (p˂0.05) et à 12% chez les WT (p˂0.05) et PRKO (p˂0.01) alors que les P4 ont des valeurs inférieures aux P1. Pour la durée des apnées spontanées, aucun effet génotype n’est présent. Un effet âge est noté à une hypoxie de 14% chez les WT (p˂0.01) et PRKO (p˂0.01), à 12% chez les WT (p˂0.001) et PRKO (p˂0.001) et à 10% chez les WT (p˂0.001) et PRKO (p˂0.001) alors que les P4 ont des valeurs inférieures aux P1. Pour la durée des apnées post-soupir, aucun effet génotype n’est présent. Un effet âge

(58)

est noté à une hypoxie de 14% chez les WT (p˂0.001) et PRKO (p˂0.05), à 12% chez les WT (p˂0.01) et PRKO (p˂0.001) et à 10% chez les WT (p˂0.001) alors que les P4 ont des valeurs inférieures à celles des P1.

Figure

Figure 1 : Contrôle respiratoire.
Figure 2 : Courbe temporelle d’une réponse ventilatoire à l’hypoxie chez  un rat âgé de 7 jours de vie
Figure 3 : Aspect développemental de la réponse ventilatoire à l’hypoxie du  nouveau-né humain et du nouveau-né rat
Figure 4 : Exemple typique d’apnée spontanée et post-soupir.
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