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Rôle du microARN-132 dans la maladie d'Alzheimer et les tauopathies connexes

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Academic year: 2021

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(1)

Rôle du microARN-132 dans la maladie

d’Alzheimer et les tauopathies connexes

Thèse

PASCAL SMITH

Doctorat en biologie cellulaire et moléculaire

Philosophiæ doctor (Ph.D.)

Québec, Canada

(2)
(3)

Les démences affectent des millions de personnes dans le monde et la forme la plus répandue est la maladie d’Alzheimer (MA). Malgré des décennies de recherches, il n’y a toujours pas de traitement efficace pour contrer cette maladie. Elle est caractérisée par deux marqueurs distincts : les plaques amyloïdes extracellulaires générées par le clivage de la protéine Amyloid Precursor Protein (APP) ainsi que les enchevêtrements neurofibrillaires formés de la protéine tau. Cette dernière est également dérégulée dans une vingtaine de maladies neurodégénératives appelées tauopathies.

Plusieurs études ont montré que les niveaux des microARNs (miRs) sont altérés chez des personnes atteintes de maladies neurodégénératives telles que la MA. Notamment, le miR-132 se retrouve à être l’un des plus réduit. Pour mieux comprendre l’implication des microARNs (miRs) dans la progression de la MA et les tauopathies, mon objectif de doctorat a été d’étudier le rôle du miR-132 sur la régulation de tau en utilisant aussi bien des outils in vitro que des méthodes in vivo.

Nous avons identifié in vitro un facteur d’épissage, PTBP2 pouvant réguler l’inclusion d’un exon important de tau. Ce facteur est augmenté et corrèle inversement avec l’expression de miR-132 chez un groupe de patients atteints de paralysie supranucléaire progressive (PSP), une maladie tauopathique.

À l’aide de tests comportementaux, nous avons également démontré qu’une abolition génétique de miR-132 chez la souris réduisait l’apprentissage et la mémoire qui sont des conséquences connues de la MA.

Enfin, nous avons établi que l’absence du miR-132 accélère la phosphorylation et l’agrégation de tau dans un modèle de souris Alzheimer. Nous avons démontré que miR-132 régule directement tau par son 3’Untranslated Region (3’UTR) et que l’expression de miR-132 corrèle avec différents tests cognitifs dans une cohorte de patients atteints de la MA. De plus, nous avons développé une approche thérapeutique prometteuse en utilisant ce miR comme agent de traitement dans le cerveau d’un modèle de souris Alzheimer.

(4)

Ces travaux ont contribués à la compréhension de la progression des maladies neurodégénératives multifactorielles telles que la MA.

(5)

Dementia affects millions of people worldwide and the most common form is Alzheimer’s disease (AD). After more than a century of research, there is no efficient cure for this neurodegenerative disease. There are two pathological hallmarks : senile plaques formed by beta-amyloid peptide deposits and neurofibrillary tangles composed of a hyperphosphorylated and aggregated protein called tau. Tau pathology is also found in twenty neurodegenerative diseases called tauopathies.

Studies have shown that miRNA expression profiles are deregulated in post-mortem brain tissues of patients. Of interest, miRNA-132 (miR-132) was the most downregulated. To understand the role of miRNAs in AD, my main goal was to study the involvement of miR-132 in tau regulation using in vitro tools and transgenic mice.

We have identified a splicing factor, PTBP2 which affects tau exon inclusion. This factor is upregulated in a subset group of tauopathic patients, (progressive supranuclear palsy (PSP)). The miR-132 level reduction was also correlated with the PTBP2 upregulation in this cohort of patients. In the second study, we have demonstrated that learning, memory formation and retention are altered in a miR-132 knockout mouse model.

Finally, we have found that a long-term loss of miR-132 promotes tau hyperphosphorylation and aggregation in AD mice. We have demonstrated that tau is a direct target of miR-132 and their expression levels in human correlate with different cognitive test scores from in AD patients. Finally, we have developed a miR-132-based therapeutic strategy in the AD mouse brain with promising results.

Taken together, these results have contributed to the better understanding of complex neurodegenerative diseases such as AD.

(6)
(7)

Résumé ... iii

Abstract ... v

Table des matières ... vii

Listes des tableaux ... xiii

Liste des figures ... xv

Liste des abréviations... xvii

Remerciements ... xxi

Avant-propos ... xxiii

Chapitre I : Introduction ... 1

1 Introduction ... 2

1.1 Historique et mise en contexte ... 2

1.2 La protéine tau ... 4

1.2.1 Particularité du gène de tau (MAPT) ... 4

1.2.2 Les isoformes de la protéine ... 5

1.2.3 L’épissage alternatif de tau ... 7

1.2.3.1 L’épissage du pré-ARNm ... 7

1.2.3.2 L’épissage alternatif ... 8

1.2.3.3 Les facteurs d’épissage PTBs ... 11

1.2.3.4 L’épissage de l’exon 2 et 3 de tau ... 12

1.2.3.5 Le 10e exon de tau et son épissage alternatif ... 13

1.2.4 Les modifications post-traductionnelles de tau ... 16

1.2.4.1 Les modifications autres que la phosphorylation ... 16

1.2.4.2 La phosphorylation de tau ... 17

1.2.4.2.1 Les kinases de tau ... 20

1.2.4.2.2 Les phosphatases ... 20

1.2.5 Les fonctions et partenaires de tau ... 21

1.2.5.1 La fonction majeure : régulation des microtubules ... 21

1.2.5.2 Le transport axonal ... 22

1.2.5.3 Les dendrites et la synapse ... 22

1.2.5.4 La régulation du cytosquelette d’actine ... 24

1.2.5.5 Interactions aux niveaux des membranes et d’organelles ... 25

1.2.5.6 La tau nucléaire ... 25

1.2.5.7 La propagation de la pathologie et sécrétion de tau ... 26

(8)

1.3.1 La classification ... 28

1.3.2 La maladie d’Alzheimer ... 31

1.3.2.1 Statistiques et généralités ... 31

1.3.2.2 La neuropathologie ... 32

1.3.2.3 Les plaques amyloïdes et le peptide Aß ... 33

1.3.2.4 Les enchevêtrements neurofibrillaires ... 36

1.3.3 La paralysie supranucléaire progressive (PSP, Progressive Supra-nuclear Palsy) 41 1.3.4 Les démences fronto-temporales avec syndrome parkinsonien liées au chromosome 17 (DFTP-17) ... 43

1.4 Les microARNs (miRs) ... 45

1.4.1 Définition et mise en évidence ... 45

1.4.2 La nomenclature ... 45

1.4.3 La voie canonique des microARNs chez les mammifères ... 46

1.4.4 Les voies alternatives ... 51

1.4.4.1 Les mirtrons et simtrons ... 51

1.4.4.2 Le cas du miR-451 ... 51

1.4.4.3 D’autres cas atypiques ... 52

1.4.5. Régulation et modification des microARNs ... 52

1.4.6. Les fonctions des microARNs ... 56

1.4.6.1 Les maladies associées : le(s) cancer(s) ... 56

1.4.6.2 Les miRs et le cerveau ... 58

1.4.6.3 le miR-9 ... 59

1.4.6.4 miR-124 ... 60

1.4.6.5 Le miR-125 et -134 ... 61

1.4.6.6. Le miR-132, le prototype de sa famille ... 63

1.5 Objectifs généraux de la thèse ... 67

Chapitre II : Le microARN-132 est impliqué dans l’épissage alternatif de tau ... 69

2. MicroRNA-132 loss is associated with tau exon 10 inclusion in progressive supranuclear palsy ... 70

2.1 RÉSUMÉ ... 71

2.2 ABSTRACT ... 72

2.3 INTRODUCTION ... 73

2.4 RESULTS ... 75

2.4.1 Identification of brain miRNAs that control tau isoform abundance ... 75

2.4.2 Changes in miR-132 and PTBP2 levels in PSP brain ... 77

2.4.3 PTBP2 is a direct target for miR-132 ... 78

2.4.4 Endogenous PTBP2 regulates tau isoform abundance ... 80

2.4.5 Developmental correlation between miR-132, PTBP2 and 4R-tau ... 81

2.5 DISCUSSION ... 83

2.6 MATERIAL AND METHODS ... 87

(9)

2.6.2 Cell line and transfections ... 87

2.6.3 Antibodies ... 88

2.6.4 Protein extraction and Western blot analysis ... 88

2.6.5 RNA extraction, PCR and quantitative RT-PCR... 88

2.6.6 Microarrays ... 88

2.6.7 Statistical methodologies ... 89

2.8 FUNDING ... 90

2.9 SUPPLEMENTAL MATERIAL INFORMATION ... 90

2.10 ACKNOWLEDGEMENTS ... 90

2.11 CONFLICTS OF INTEREST ... 90

2.12 REFERENCES ... 91

2.12 SUPPLEMENTAL MATERIAL INFORMATION ... 94

2.12.1 Microarray and data analysis ... 94

2.12.2 LNA-based antisense miRNA knockdown experiments ... 94

2.14 SUPPLEMENTAL MATERIAL REFERENCES ... 102

Chapitre III : Délétion de miR-132/212 et son impact sur le comportement de la souris ... 103

3. Memory formation and retention are affected in adult miR-132/212 knockout mice ... 104

3.1 RÉSUMÉ ... 105

3.2 ABSTRACT ... 106

3.2 INTRODUCTION ... 107

3.3 MATERIALS AND METHODS... 108

3.3.1. Mice ... 108

3.3.2. miRNA quantification ... 109

3.3.3. Western blotting ... 109

3.3.4. Morphological stainings ... 109

3.3.5. Behavior ... 110

3.3.5.1. SmithKline Beecham, Harwell, Imperial College, Royal London Hospital, Phenotype assessment (SHIRPA) ... 110

3.3.5.2. Open Field ... 111

3.3.5.3. Elevated Plus-Maze ... 112

3.3.5.4. Novel object recognition ... 112

3.3.5.5. Barnes Maze ... 113

3.3.5.6. Left-right discrimination learning (T-water Maze) ... 113

3.3.6. Statistical analyses ... 114

3.4 RESULTS ... 114

3.4.1. Validation of mouse model ... 115

3.4.2. Primary screening ... 116

3.4.3. Open-field ... 118

(10)

3.4.5. Novel object recognition... 120

3.4.6. Barnes maze ... 121

3.4.7. T-water maze ... 122

3.4.8. Biochemical analysis of proteins in memory formation ... 123

3.5. DISCUSSION ... 124

3.6. ACKNOWLEDGMENTS ... 126

3.7. CONFLICT OF INTEREST ... 127

3.8. REFERENCES ... 127

Chapitre IV : La déficience de miR-132/212 conduit au développement de la pathologie tau ... 133

4. miR-132/212 deficiency impairs tau metabolism and promotes pathological aggregation in vivo ... 134

4.1 RÉSUMÉ ... 135

4.2 ABSTRACT ... 136

4.3 INTRODUCTION ... 137

4.4 RESULTS ... 139

4.4.1 Abnormal tau metabolism in miR-132/212 knockout mice ... 139

4.4.2 Tau is a direct target for miR-132 ... 140

4.4.3 miR-132/212 loss accentuates tau hyperphosphorylation in diseased mice ... 142

4.4.4 Deletion of miR-132/212 promotes tau aggregation in mice ... 144

4.4.5 miR-132 treatment improves long-term memory in diseased mice ... 146

4.4.6 Analysis of miR-132 in Alzheimer’s disease ... 150

4.5 DISCUSSION ... 152

4.6 MATERIAL AND METHODS ... 156

4.6.1 Study approval ... 156

4.6.2 Human post-mortem tissues ... 156

4.6.3 Mice ... 157

4.6.4 Cell culture, transfection and mutagenesis ... 157

4.6.5 Real time quantitative RT-PCR ... 158

4.6.6 Western blotting ... 158

4.6.7 Immunochemistry ... 159

4.6.8 Antibodies... 159

4.6.9 Electronic microscopy ... 159

4.6.10 miRNA delivery studies in vivo ... 160

4.6.11 Memory tests ... 160 4.6.12 Statistics ... 161 4.6.13 Supplemental material ... 161 4.7 ACKNOWLEDGMENTS ... 161 4.8 CONFLICT OF INTEREST ... 161 4.9 REFERENCES ... 162 4.10.1 Methods ... 168

(11)

4.10.1.1 Physiological measurements ... 168

4.10.1.2 Tau aggregation assays ... 168

Chapitre V : Discussion ... 177

5. Discussion... 178

5.1 Le mécanisme de régulation de l’exon 10 par le miR-132/PTBP2 ... 179

5.2 Conséquences comportementales de la délétion du miR-132 in vivo ... 181

5.3 La délétion in vivo du miR-132/212 entraîne une accélération pathologique du métabolisme de tau ... 184

6. Conclusion et perspectives ... 191

Bibliographie ... 195

(12)
(13)

CHAPITRE I

TABLEAU 1.1 FACTEURS D’ÉPISSAGE POUVANT RÉGULER L’EXON 10 DE TAU ... 15 TABLEAU 1.2 RÉSUMÉ DES SITES PUTATIFS DE PHOSPHORYLATION DE TAU AINSI QUE DES KINASES ET DES

PHOSPHATASES RÉGULATRICES ... 19

CHAPITRE III

(14)
(15)

CHAPITRE I

FIGURE 1.1 COUPES DU TISSU CÉRÉBRAL D’AUGUSTE DETER. ... 3

FIGURE 1.2 REPRÉSENTATION DU GÈNE, DE L’ÉPISSAGE ALTERNATIF DE L’ARNM AINSI QUE DES ISOFORMES DE TAU RETROUVÉES DANS LE SNC HUMAIN ... 6

FIGURE 1.3 RÉACTIONS IMPLIQUÉES DANS L’ÉPISSAGE DE L’ARNM. ... 8

FIGURE 1.4 RÉGULATION DE L’ÉPISSAGE ALTERNATIF. ... 9

FIGURE 1.5 DIFFÉRENTS TYPES D’ÉVÉNEMENTS D’ÉPISSAGE ALTERNATIF ... 10

FIGURE 1.6 SÉQUENCES RÉGULATRICES EXONIQUES ET INTRONIQUES DE L’ÉPISSAGE DE L’EXON 10. ... 14

FIGURE 1.7 LOCALISATION DENDRITIQUE DE TAU ET SON IMPACT POTENTIEL. ... 24

FIGURE 1.8 LA CLASSIFICATION OU « CODE BARRE » DES TAUOPATHIES. ... 29

FIGURE 1.9 OBSERVATION MACROSCOPIQUE D’UN CERVEAU ADULTE SAIN ET D’UN CORTEX ATTEINT DE LA MA. ... 32

FIGURE 1.10 LES PLAQUES AMYLOÏDES. ... 34

FIGURE 1.11 LES DEUX VOIES DE CLIVAGE DE L’APP. ... 35

FIGURE 1.12 ENCHEVÊTREMENTS NEUROFIBRILLAIRES CHEZ UN PATIENT ATTEINT DE LA MA ... 36

FIGURE 1.13 TROIS STADES DE FORMATION DES ENCHEVÊTREMENTS NEUROFIBRILLAIRES DANS LE NEURONE ET LEUR PATRON DE PHOSPHORYLATION ASSOCIÉ. ... 37

FIGURE 1.14 STADES DE BRAAK DE LA PATHOLOGIE DE TAU DANS LA MA ... 39

FIGURE 1.15 MÉCANISME PROPOSÉ DE LA NEURODÉGÉNÉRESCENCE MÉDIÉE PAR TAU. ... 40

FIGURE 1.16 APERÇU NEUROPATHOLOGIQUE DE LA PSP. ... 42

FIGURE 1.17 BIOSYNTHÈSE DES MICROARNS CHEZ LES MAMMIFÈRES. ... 48

FIGURE 1.18 MÉCANISMES DE RÉPRESSION TRADUCTIONNELLE PAR LE COMPLEXE RISC. ... 50

FIGURE 1.19 SCHÉMATISATION DES MÉCANISMES QUI PEUVENT INFLUENCER LA MATURATION D’UN MICROARN. ... 54

FIGURE 1.20 POSITION DU LOCUS DE MIR-132/212 SUR LE CHROMOSOME 11 DE LA SOURIS. ... 63

CHAPITRE II FIGURE 21 MIRNA-MEDIATED REGULATION OF TAU EXON 10 SPLICING. ... 76

FIGURE 2.2 ABNORMAL MIR-132 AND PTBP2 LEVELS IN PSP BRAIN. ... 78

FIGURE 2.3 MIR-132 DIRECTLY TARGETS PTBP23’UTR. ... 79

FIGURE 2.4 PTBP2-MEDIATED REGULATION OF 4R:3R-TAU RATIOS. ... 81

FIGURE 2.5 CO-DEVELOPMENTAL REGULATION OF MIR-132,PTBP2 AND TAU EXON 10 INCLUSION. ... 82

SUPPLEMENTAL FIGURE 2.1 ... 95

SUPPLEMENTAL FIGURE 2.2 ... 96

(16)

CHAPITRE III

FIGURE 3.1 CHARACTERIZATION OF MIR-132/212KO MICE. ... 115

FIGURE 3.2 AUTOMATED OPEN-FIELD ACTIVITY IN MIR-132KO AND WT MICE. ... 118

FIGURE 3.3 ELEVATED PLUS-MAZE EXPLORATION IN MIR-132KO AND WT MICE. ... 120

FIGURE 3.4 NOVEL OBJECT RECOGNITION MEMORY IN MIR-132KO AND WT MICE. ... 120

FIGURE 3.5 BARNES MAZE ANALYSIS IN MIR-132KO AND WT MICE. ... 121

FIGURE 3.6 LEFT-RIGHT T-MAZE ACQUISITION AND REVERSAL IN MIR-132KO AND WT MICE. ... 122

FIGURE 3.7 REPRESENTATIVE WESTERN BLOT ANALYSIS OF ENDOGENOUS MECP2, PHOSPHO-CREB,CREB, AND BDNF IN 6 MONTH-OLD MIR-132KO AND WT MICE (N=8/GENOTYPE, MIXED GENDER). ... 123

CHAPITRE IV FIGURE 4.1 MIR-132/212 DEFICIENCY ALTERS TAU EXPRESSION AND PHOSPHORYLATION IN MICE. ... 140

FIGURE 4.2 TAU IS A DIRECT TARGET OF MIR-132. ... 141

FIGURE 4.3 MIR-132/212 DELETION PROMOTES TAU AGGREGATION. ... 143

FIGURE 4.4 MIR-132/212 KNOCKOUT IS PRONE TO AUTOPHAGY ALTERATION IN THE BRAIN. ... 145

FIGURE 4.5 LONG-TERM MEMORY IS AFFECTED IN DISEASED MICE LACKING MIR-132/212. ... 147

FIGURE 4.6 MIR-132 BRAIN INJECTIONS PARTIALLY RESCUE MEMORY DEFICITS IN 3XTG-AD. ... 149

FIGURE 4.7 MIR-132 CORRELATES WITH COGNITIVE DECLINE IN AD PATIENTS. ... 151

SUPPLEMENTAL FIGURE 4.1 OFFSPRING AND PHYSIOLOGICAL EVALUATION OF MIR-132/212KO MICE. ... 169

SUPPLEMENTAL FIGURE 4.2 SARKOSYL-INSOLUBLE TAU EXTRACTION FROM MIR-132/212KO MOUSE AND HUMAN POST MORTEM TISSUES. ... 170

SUPPLEMENTAL FIGURE 4.3 SPATIAL MEMORY EVALUATION OF 3XTG-AD MICE AT 6 MONTHS OF AGE. ... 171

SUPPLEMENTAL FIGURE 4.4 MIR-132/212 DELETION IN 3XTG-AD MICE AFFECTS LONG-TERM MEMORY RETENTION. ... 173

SUPPLEMENTAL FIGURE 4.5 POST MORTEM INTERVAL (PMI) DOES NOT AFFECT MIR-132 EXPRESSION. ... 174

SUPPLEMENTAL FIGURE 4.6 MIR-212 ALSO CORRELATES WITH COGNITIVE DECLINE IN AD PATIENTS. ... 175

CHAPITRE V FIGURE 5.1 SCHÉMA INTÉGRATEUR DES TRAVAUX DE THÈSE ... 193

(17)

Liste des abréviations

µm : micromètre

µg : microgramme

3’UTR : 3’ untranslated region

3xTg-AD mice : Souris triple transgénique (tau, APP, PS1) Aß : peptide beta-amyloïde

AD : Alzheimer’s disease

Ago: Argonaute

Akt/PKB: Protein kinase B

ALS: amyotrophic lateral sclerosis Als2: amyotrophic lateral sclerosis 2 ANOVA : Analyse of Variance

APP: Amyloid Precursor Protein ATG: Autophagy related gene ATPase: Adenosine triphospatase

BACE1: beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1 BAG2: BAG family molecular chaperone regulator 2

Bcl-2 : B-cell lymphoma 2 Bcl2l11 : BCL2-like 11

BDNF : Brain-derived neurotrophic factor

bp : base pair

BSA: Bovine Serum Albumin CA3/4 : Cornu Ammonis areas 3/4

CaCl2 : Chlorure de calcium

CamKII : Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II

CBD : Corticobasal degeneration CDK5: Cyclin-dependent kinase 5

cDNA: complementary Deoxyribonucleic acid CELF : CUG-BP and ETR-3-like factor (CELF) cKO : conditional Knockout

CREB : cAMP-response element binding protein cRNA : complementary Ribonucleic Acid

CS3 : Adobe Creative Suite 3 CSF : Cerebrospinal fluid Ct : Crossing threshold

Cterm : C-terminal

Ctrl : Control

CUGBP: CUG-binding protein

DAPI : 4', 6'-diamidino-2-phénylindole

DAVID: Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery DMSO : diméthylsulfoxyde

DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium DNA : Deoxyribonucleic acid

DTT: dithiothréitol

(18)

EGTA : ethylene glycol tetraacetic acid

ERK1/2 : Extracellular signal-regulated kinase 1/2 ETR-3 : Elav-type RNA-binding protein 3 EXD2 : exonuclease 3'-5' domain containing 2 FCS : Fetal Calf Serum

FDR: False Discovery Rate

FTDP-17 : Frontotemporal dementia and Parkinsonism linked to chromosome 17 FTLD-tau : Frontotemporal lobar dementia -tau

Gapdh: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GFAP: Glial fibrillary acidic protein

GO : Gene ontology

GSK3α : Glycogen synthase kinase 3 alpha GSK3ß : Glycogen synthase kinase 3 beta GTP: guanosine triphosphate

HCl : acide chlorhydrique HD : Huntington’s disease

HEPES : acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique hnRNP A1 : heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1

HRP : Horseradish peroxydase Hsp40 : Heat shock protein 40 IgG : Immunoglobuline G

IPA: Ingenuity Pathway Analysis IRES : Internal Ribosome Entry Site JNK1/2: c -Jun N-terminal kinases ½ KCl : Chlorure de potassium

KO : Knockout

KOH: Hydroxyde de potasssium

KPI domain : Kunitz protease inhibitor domain

L : Leucine

LC3-I/II : Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3-I/II LDS : Lithium dodecyl sulfate

Let-7a : lethal-7a

Limk1 : LIM domain kinase 1 LNA : Lock nucleic acid LPS : Lipopolysaccharide

M: méthionine

MAP2 : Microtubule associated protein 2 MAPK3: Mitogen-activated protein kinase 3 MAPT: Microtubule associated protein (tau) MCI: Mild cognitive impairment

MeCP2: methyl CpG binding protein 2

MEK1/2: Mitogen-activated protein kinase kinase 1/2 MgCl2 : Chlorure de magnésium

min : minute

miRNA : Micro Ribonucleic Acid

(19)

MMSE: Mini-mental State Examination MnPO: Median Pre-optic nucleus mRNA : Ribonucleic acid messenger NaCl: Chlorure de sodium

Nefl/m/h : neurofilament light/medium/heavy peptide Neuro2a : Neuroblastoma 2a NFTs : neurofibrillary tangles ng: nanogramme nm : nanomètre nM : nanomolaire NP-40 : Nonidet P-40 nt: nucléotide NT : non transfected P : Proline P0 : Postnatal day 0

PBS : Phosphate Buffer Saline PCR : polymerase chain reaction

PFA: Paraformaldéhyde

pH : potentiel hydrogène PMI : Post mortem Interval

PMSF: Phenylmethylsulfonyl fluoride PP1: Protéine phosphatase 1

PP2B/calcineurin : Protéine phosphatase 2B/calcineurin PP2A : Protéine phosphatase 2 A

PSP : Para supranuclear palsy

PTBP2/bPTB: polypyrimidine tract binding protein 2/ brain polypyrimidine tract binding protein

PTBP1/PTB/hnRNP I: polypyrimidine tract binding protein 1/ Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins

qRT-PCR: quantitative real-time PCR Rap2c : Ras-related protein 2c RAR- α : retinoic acid receptor alpha

REST: RE1-Silencing Transcription factor RIPA buffer : radioimmunoprecipitation assay buffer RISC : RNA-induced silencing complex RNA: Ribonucleic Acid

RNU19 : U19 small nucleolar RNA RPL32 : 60S ribosomal protein L32

Rufy3 : RUN And FYVE Domain Containing 3

S : Sérine

Scr : Scramble

Scube1 : signal peptide, CUB domain, EGF-like 1 SDS : sodium dodécylsulfate

SEM : Standard Error of Mean

Ser : Sérine

(20)

siRNA: small interfering Ribonucleic Acid

TauC: Total Tau

TEACl: Chlorure de tétraéthylammonium

Thr : Thréonine

Tnrc6c : trinucleotide repeat containing 6C Tris : trishydroxyméthylaminométhane

Tyr : Tyrosine

TUNEL: Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling UCHL1 : ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1

V : Valine

(21)

Je tiens tout d’abord à remercier mon directeur de thèse, le docteur Sébastien Hébert. Il m’a fait confiance comme tout premier étudiant tout juste après l’ouverture de son laboratoire. Il a su m’inspirer et m’indiquer la voie pour devenir un bon scientifique.

Je tiens également à remercier la professionnelle de recherche Claudia Goupil qui a su me faire part de son expérience de travail et de sa rigueur scientifique tout en gardant son rire et son sourire.

Je me dois de souligner l’apport important des membres actuels du laboratoire, mes complices, avec qui j’ai eu beaucoup de plaisir. Merci à Sepideh Parsi, Julia Hermandez-Rapp, Ana Sofia Francisco Correia ainsi que Francis Jolivette en qui j’ai trouvé plus qu’un collègue, mais aussi un bon ami. Je tiens aussi à remercier d’anciens collègues : Charlotte Delay, Véronique Dorval, Alexis Bretteville et Carl Julien; c’est grâce à eux aussi si j’ai pu élargir mes horizons scientifiques. Je remercie également la Société d’Alzheimer du Canada de m’avoir octroyé une bourse permettant de poursuivre mon doctorat.

De plus, je remercie mes parents qui m’ont aidé et encouragé durant mes longues études. Moi qui voulais avoir « un gros garage avec trois portes » quand j’étais plus petit, qui aurait pu croire qu’à l’âge adulte je terminerais un doctorat à l’université?

Un gros merci à ma conjointe Mélissa qui m’a soutenu tout au long de mes études graduées. Elle m’a souvent vu partir tôt le matin pour le travail pour ne revenir que parfois très tard. Je salue sa patience et sa résilience dans les moments où j’en avais grandement besoin.

Je souligne le travail des techniciens et les techniciennes en santé animale du CHUL, notamment, Isabelle Nolin, France Duclos ainsi que tous ceux de l’animalerie qui ont pris soin de nos souris.

(22)
(23)

Les travaux présentés dans cette thèse représentent six années d’efforts durant ma maîtrise et mon doctorat. Au début de mon parcours d’étudiant gradué, j’ai appris la culture cellulaire ainsi que les techniques de base courantes que voulait instaurer mon directeur de recherche dans son laboratoire. Durant ces années à la maîtrise, j’ai eu la chance de participer à trois différents papiers. Au cours du doctorat, j’ai pu collaborer dans six différents articles. Dans cette thèse, seuls trois articles concernant mon projet principal seront insérés en tant que chapitre. Les autres papiers sont annexés.

Le premier article concernant mon projet principal concerne la régulation de tau par miR-132 in vitro. Plus précisément, l’épissage alternatif de tau y est abordé. J’ai participé activement à la génération des données de l’article ainsi qu’à l’élaboration des figures du papier. Je tiens à mentionner que les extraits des tissus humains de la figure 2.2 ont été réalisés par d’autres collègues (l’ARN et les protéines ont été préparées par Claudia Goupil et Amelle Al Hashimi). Je souligne que l’élaboration du protocole de développement ainsi que l’extraction des protéines et de l’ARN ont été faites par Marie-Amélie Papon (figure 2.5). Le contenu dans la figure supplémentaire 2.1C a été réalisé par notre collaborateur francais le docteur Nicolas Sergeant. Les résultats présentés dans le tableau 2.2 ont été générés par la plateforme d’expression génique du CRCHU de Québec et analysés par Sébastien Hébert. Sébastien Hébert a conçu, analysé en partie, fait le montage final des figures et écrit l’article. Le papier a été publié en 2011 dans le journal Human Molecular genetics et sera présenté dans la thèse en tant que deuxième chapitre.

MicroRNA-132 loss is associated with tau exon 10 inclusion in progressive supranuclear palsy Smith PY, Delay C, Girard J, Papon MA, Planel E, Sergeant N, Buée L, Hébert SS,

Dans une deuxième étude, nous avons établi que la délétion génétique du locus miR-132/212 (miR-132 KO) a un effet délétère sur l’apprentissage et la formation de la mémoire, des fonctions cognitives affectées chez les personnes atteintes de la maladie d’Alzheimer. Le travail sur ce modèle murin (miR-132 KO) est le fruit d’une collaboration avec le docteur Richard H. Goodman ainsi que Stephen T. Magill. Nous avons travaillé en

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partie avec la plateforme comportementale du CHUL dirigé par le docteur Mohammed Filali afin de réaliser certains tests comportementaux tels que le Novel Object Recognition, Elevated Plus Maze, T-Water Maze, l’Automated Open field ainsi que l’acquisition des données SHIRPA. J’ai assuré le croisement, le maintien ainsi que du suivi de la colonie entière des souris miR-132 KO. J’ai réalisé les expériences, analysé les données et monté la figure finale découlant du test de mémoire spatiale, le labyrinthe de Barnes (Figure 3.5). J’ai également fait les immunobuvardages de la figure 3.7 ainsi que les mesures des niveaux de miR-132 et de miR-212 dans 5 régions cérébrales différentes. J’ai participé à la rédaction, à la révision et à la correction de l’article. Julia Hernandez-Rapp a réalisé les marquages en figure 3.1C ainsi qu’une partie de l’écriture du manuscrit, de sa révision et de sa correction. Sébastien Hébert a participé à la rédaction, à la révision et à la correction de l’article. Le papier a été publié dans Behavioural brain research en début 2015 et sera présenté dans le chapitre 3.

Memory formation and retention are affected in adult miR-132/212 knockout mice.

Hernandez-Rapp J, Smith PY, Filali M, Goupil C, Planel E, Magill T S, Goodman RH, Hébert SS.

Dans un troisième article, nous avons poursuivi notre première étude sur la régulation de tau par miR-132, cette fois-ci dans un modèle de délétion génétique du locus miR-132/212. Nous avons établi que le miR-132 intervient dans le métabolisme de la protéine tau. L’absence de miR-132/212 entraîne une augmentation de l’expression, de la phosphorylation et de l’agrégation de tau in vivo. Nous avons créé un nouveau modèle murin en croisant une souris Alzheimer (3xTg-AD) avec notre modèle de délétion de miR, la souris miR-132 KO. Les résultats de la figure 4.3 ont été générés et analysés par Françoise Morin ainsi que Francis Jolivette. Les immunomarquages de cette figure ont été réalisés par Julia Hernandez-Rapp. Nous avons fait collaboration avec le docteur Marie-Ève Tremblay et son équipe afin de réaliser la technique de microscope électronique sur les cerveaux des souris miR-132 KO. Julia Hernandez-Rapp a analysé ces images (Figure 4.4). Le comportement réalisé dans cette étude a été fait et analysé en partie par Claudia Goupil (Figure 4.5 et 4.6 ainsi que les figures supplémentaires 4.3 et 4.4). De plus, Claudia a

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également réalisé les chirurgies afin de surexprimer le miR-132 dans le cerveau dans le modèle de souris MA. Avec la collaboration du docteur Frédéric Calon ainsi que celle du docteur David Bennett, nous avons corrélé l’expression de miR-132/212 avec différents tests cognitifs réalisés dans une cohorte de patients atteints de la MA (Religious Order study, RUSH medical center). J’ai participé à tous les niveaux de cette étude, autant sur la gestion des colonies d’animaux, du suivi des groupes de souris, des tests ante- et post-mortem que de l’analyse des résultats, du montage des figures, de l’écriture du papier, de sa révision et de sa correction. L’article représente près de trois ans de travail. Le papier a été soumis pour révision dans le journal Human Molecular and Genetics. Il fera l’objet du chapitre 4.

miR-132/212 deficiency impairs tau metabolism and promotes pathological aggregation in vivo

Smith PY, Hernandez-Rapp J, Jolivette F, Lecours C, Bisht K, Goupil C, Parsi S, Morin F, Planel E, Bennett DA, Fernandez-Gomez F-J, Sergeant N, Buée L, Tremblay M-È, Calon

F, Hébert SS.

J’ai participé à six autres papiers durant ma thèse en annexe. Le premier papier consiste en un projet commencé durant le postdoctorat de mon directeur en Belgique. L’article a été publié dans le journal Human Molecular Genetics en 2010.

Genetic ablation of Dicer in adult forebrain neurons results in abnormal tau hyperphosphorylation and neurodegeneration Hébert SS, Papadopoulou AS, Smith P, Galas MC, Planel E, Silahtaroglu AN, Sergeant N, Buée L, De Strooper B.

Le deuxième papier est un projet connexe qui concernait l’épissage alternatif d’APP et le miR-124. L’article a été publié dans le journal Journal of Neurochemistry, paru en 2011.

In vivo regulation of amyloid precursor protein neuronal splicing by microRNAs. Smith P, Al Hashimi A, Girard J, Delay C, Hébert SS.

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modèle de délétion conditionnelle Dicer. Le papier a été publié en 2012 dans le journal PLOS ONE.

Gene Network and Pathway Analysis of Mice with Conditional Ablation of Dicer in Post-Mitotic Neurons. Dorval V, Smith PY, Delay C, Calvo E, Planel E, Zommer N, Buée L,

Hébert SS.

Dans une collaboration intradépartementale avec les docteur Didier Mouginot et Guy Drolet, nous avons participé à une étude électrophysiologique décrivant la régulation en tandem d’un canal sodique et d’une pompe sodique/potassique comme détecteur du sodium dans le cerveau. L’article a été publié en 2014 dans le journal Frontiers in Cellular Neuroscience.

Extracellular Na+ levels regulate formation and activity of the NaX/alpha1-Na+/K+-ATPase

complex in neuronal cells. Berret E, Smith PY, Henry M, Soulet D, Hébert SS, Toth K, Mouginot D (décédé), Drolet G.

Ce papier est le précurseur d’une autre étude liant le miR-124 et la régulation, ce même complexe protéique impliqué dans la régulation de l’homéostasie du sodium cérébral. L’article est en processus de révision dans le journal American Journal of Physiology.

microRNA-124 is a regulator of sodium homeostasis in neurons Berret E, Smith PY, Henry M, Drolet G, Mouginot D, Hébert SS.

Enfin, le dernier article explore le potentiel thérapeutique des miRNAs, particulièrement la famille du miR-16. Le papier a été soumis au journal Molecular Therapy pour révision en 2015.

Preclinical evaluation of miR-15/107 family members as multifactorial drug targets for Alzheimer’s disease. Parsi S, Smith PY, Goupil C, Dorval V, Hébert SS.

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1 Introduction

1.1 Historique et mise en contexte

En 1907, le médecin allemand Alois Alzheimer publia pour la première fois la description histologique post-mortem d’une patiente qu’il a suivie pendant quelques années dans son unité de soins à Francfort (Alzheimer et al. 1995; Alzheimer 1907). Auguste Deter souffrait de troubles de mémoire, de pertes de langage et de troubles comportementaux que le docteur Alzheimer qualifia de « maladie particulière du cortex cérébral ». À l’autopsie de son cerveau, il remarqua une atrophie générale, des changements artériosclérotiques au niveau de la vasculature du tissu cérébral et observa la présence de neurofibrilles pouvant être imprégnées par la méthode « argentique » de Bielschowky développée en 1902. Il constata également le dépôt d’une substance spéciale observable sans coloration dans le cortex.

Aujourd’hui, ces deux marqueurs neuropathologiques sont connus comme étant les enchevêtrements neurofibrillaires et les plaques amyloïdes extracellulaires (Figure 1.1). Ces deux lésions sont constituées de l’accumulation d’agrégats de protéines dérégulées. Dans les années 1980, le peptide amyloïde-β (Aβ) généré par le clivage protéolytique de l’Amyloid Precursor Protein (APP) a été identifié comme composante des plaques extracellulaires (Glenner and Wong 1984b). Quant aux enchevêtrements neurofibrillaires (NFT, pour neurofibrillary tangles), ils correspondent à l’hyperphosphorylation et à l’agrégation intraneuronale d’une protéine normalement associée au microtubule appelé tau (Grundke-Iqbal et al. 1986; Delacourte and Defossez 1986; Brion et al. 1985). En plus d’être une lésion dans la MA, cette protéine est associée à une vingtaine d’autres maladies démentielles qui sont regroupées sous l’appellation tauopathies.

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Figure 1.1 Coupes du tissu cérébral d’Auguste Deter.

Les plaques amyloïdes (a, b) et les enchevêtrements neurofibrillaires (c) du cortex cérébral de la patiente. Les dessins proviennent du travail d’Alzheimer (1911). Grossissement : X5 (a), X100 (b, c). Adaptée de (Graeber and Mehraein 1999).

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1.2 La protéine tau

La protéine tau (τ et aussi appelée Tubuline Associated Unit) a été identifiée pour la première fois dans les années 1970 comme un acteur important à la stabilisation des microtubules (Weingarten et al. 1975; Witman et al. 1976; Cleveland et al. 1977b, 1977a). Elle est classée parmi la famille des MAPs (Microtubule Associated Proteins). En plus d’être retrouvée chez l’humain (Goedert et al. 1989a), des homologues ont été identifiés chez le vers Caenorhabditis elegans (Goedert et al. 1996), la drosophile (Cambiazo et al. 1995), les rongeurs (Kosik and Finch 1987; Lee et al. 1988) et le singe (Nelson et al. 1996).

La protéine tau est exprimée dans les neurones du système nerveux central (SNC) et du système périphérique (SNP) (revue dans (Schoenfeld and Obar 1994)). Elle est également observée dans les cellules gliales en conditions pathologiques (Chin and Goldman 1996). Elle peut aussi être détectée à l’état de traces dans d’autres tissus tels que le cœur, le foie, les muscles, le pancréas, les testicules et les fibroblastes (Gu et al. 1996; Vanier et al. 1998; Ashman et al. 1992; Matsuyama and Bondareff 1994).

1.2.1 Particularité du gène de tau (MAPT)

Le gène humain codant pour tau est situé sur le bras long du chromosome 17 en position 17q21 et s’étend sur 140 000 paires de base (bps) (Neve et al. 1986). Deux haplotypes1 distincts du gène MAPT nommés H1 et H2 existent au sein de la population humaine. Cette différence consiste en un polymorphisme d’inversion sur environ 1 million de paires de base en position chromosomique 17q21.31 qui contient plusieurs gènes, dont celui de tau (Stefansson et al. 2005). En particulier, il existe une insertion/délétion de 238 bps du neuvième intron (del-In9) du gène MAPT et qui est associée à certaines maladies tauopathiques sporadiques (Baker et al. 1999; Pittman et al. 2005). En plus des variants génétiques, un gène sans intron appelé Saitohin (STH) a été mis en évidence dans l’intron 9 de MAPT (Conrad et al. 2002). Ce cadre de lecture ouvert code pour 128 acides aminés sans homologie et sans motif connu. Il est à noter que des séquences homologues d’ADN

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de ce gène sont retrouvées uniquement chez l’humain et les primates (Conrad et al. 2004; Holzer et al. 2004).

1.2.2 Les isoformes de la protéine

Le transcrit primaire de l’ARNm de tau contient 16 exons (Andreadis et al. 1992) (Figure 1.2). Trois transcrits peuvent être produits à partir du pré-ARNm primaire. Le premier est long de 6 kb et est exprimé principalement dans les neurones du SNC (Goedert et al. 1989b). Le deuxième est d’une longueur de 2 kb et produit une isoforme localisée dans le noyau cellulaire (Thurston et al. 1997). Le troisième (9 kb) est restreint à la rétine et au SNP (Nunez and Fischer 1997). Le premier ainsi que le dernier exon seront transcrits sans être traduits (région promotrice 5’ et 3’UTR, respectivement). Les exons 1, 4, 5, 7, 9, 11, 12, et 13 sont constitutifs, c’est-à-dire qu’ils sont inclus par défaut dans les ARNm de tau. Les exons 4A et 8 sont exclus des transcrits du SNC humain. Par contre, l’inclusion de l’exon 4A dans le système nerveux périphérique (SNP) donne une plus grande isoforme de tau appelée Big Tau (Georgieff et al. 1993). Cette inclusion favoriserait l’espacement des microtubules et augmenterait le diamètre des axones du SNP (Andreadis et al. 1996; Boyne et al. 1995). Quant à l’exon 8, il est inclus seulement dans les transcrits du cerveau bovin et de macaque (Himmler 1989; Nelson et al. 1996). En plus d’une séquence conventionnelle, l’exon 6 peut se retrouver inclus en deux variants tronqués de tau nommés 6p et 6d. Cette particularité est causée par deux sites différents d’épissage de l’exon 6 (Andreadis et al. 1993). Ces transcrits interrompus sont dépourvus de séquences codantes pour les domaines de liaison aux microtubules. Des ARNm de tau contenant ces variants de l’exon 6 sont faiblement exprimés dans le cerveau et le cervelet humain (Luo et al. 2004).

Enfin, l’épissage alternatif des exons 2, 3 et 10 génère 6 isoformes protéiques majeures de tau dans le SNC humain à l’âge adulte (Figure 1.2) (Andreadis et al. 1992). L’exon 3 ne peut être inclus sans la présence préalable de l’exon 2 dans le transcrit de tau (Andreadis et al. 1995). L’épissage alternatif de tau génère une protéine de 352 à 441 acides aminés selon le patron d’inclusion suivant : (-2-3-10; -2-3+10, +2-3-10; +2-3+10, +2+3-10, +2+3+10) (Figure 1.2).

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L’expression des isoformes de tau est finement régulée au cours du développement et plusieurs études ont démontré une altération de l’épissage alternatif dans certaines tauopathies. En effet, certaines mutations introniques dans le gène de tau seraient suffisantes pour modifier l’équilibre des isoformes, ce qui se traduirait par le développement des démences héréditaires (Andreadis 2005).

Figure 1.2 Représentation du gène, de l’épissage alternatif de l’ARNm ainsi que des isoformes de tau retrouvées dans le SNC humain

Le gène de tau contient 16 exons. Le premier et dernier exon ne sont pas transcrits. Les exons 1, 4, 5, 7, 9, 11, 12, 13 sont constitutifs de l’ARNm de tau. L’épissage alternatif des exons 2, 3 et 10 mène à l’expression des six isoformes majeures du système nerveux central montrées ci-dessus. L’exon 4A n’est inclus que dans le SNP et l’exon 8 n’est pas retrouvé dans le cerveau humain. Les variants de l’exon 6 (6c, 6d et 6 p) sont très faiblement exprimés chez l’humain. L’absence d’inclusion, l’ajout de l’exon 2 et 3 sont notés 0 N, 1 N et 2 N respectivement. Quant à l’exon 10, son épissage alternatif mène à l’incorporation de 3 ou 4 domaines répétés de liaison aux microtubules nommés R1 à R4. Traduit de (Sergeant et al. 2005).

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1.2.3 L’épissage alternatif de tau 1.2.3.1 L’épissage du pré-ARNm

L’épissage d’un pré-ARNm est un phénomène répandu chez les eucaryotes. Les segments codants (ou exons) pour les protéines sont alternés avec des séquences non codantes (les introns) (Berget et al. 1977; Chow et al. 1977). Il faut donc un système cellulaire hautement régulé qui excise les introns pour mettre bout à bout les exons codants pour la protéine. Avec les nouvelles technologies de séquençage d’aujourd’hui, il devient évident que les événements d’épissage soient plus fréquents dans les organismes complexes tels que les mammifères (Kim et al. 2004a; Kim et al. 2007b). En effet, une fonction de l’épissage alternatif serait d’augmenter significativement la complexité et les rôles joués par le protéome en donnant lieu à plusieurs transcrits à partir du même pré-ARNm (Nilsen and Graveley 2010; Irimia and Blencowe 2012).

L’épissage est réalisé par un ensemble de ribonucléoprotéines appelé splicéosome comprenant 150 protéines ainsi que cinq ribonucléotides (snRNP U1, U2, U4, U5 et U6) (Nilsen 2003). Également, un type plus rare et moins abondant de splicéosome dépendant du snRNP U12 coexiste avec le système majoritaire mentionné ci-dessus (revue dans (Patel and Steitz 2003)). Ces snRNP contiennent un ARN simple brin (ARNsn) guide ainsi que des protéines auxiliaires. L’excision des introns se fait par la reconnaissance de séquences spécifiques nommées sites d’épissage (Figure 1.3). Quatre éléments sont essentiels pour que l’épissage ait lieu : les sites d’épissage 5’ GU (en amont de l’intron), les sites 3’ AG (en aval de l’intron), le site de branchement ainsi que le tractus riche en polypyrimidine qui sont en amont des sites 3’ (Figure 1.3) (Black 2003; Collins and Guthrie 2000). Le processus d’épissage est une succession de deux étapes (attaques) de transestérification. La première étape débute lorsque le groupement 2’ hydroxyle de l’adénosine du site de branchement ira attaquer le site d’épissage en 5’ ce qui aura comme conséquence de libérer l’exon en position 5’. À ce moment, il y aura formation du lariat ou lasso intermédiaire. La deuxième étape de transestérification sera créée par une attaque du 3’ -OH de l’exon 5’ libéré précédemment sur le groupement phosphate du site 3’. Ainsi, les 2 exons seront ligués et le lariat ou lasso sera libéré au même moment (Figure 1.3) (Peebles et al. 1986; Collins and Guthrie 2000).

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Figure 1.3 Réactions impliquées dans l’épissage de l’ARNm.

(a) Séquences consensus contenues dans l’intron et qui sont nécessaires aux deux étapes de l’épissage. Les quatre éléments essentiels sont : le site d’épissage 5’ GU (donneur), le site 3’ AG (accepteur), le site de branchement ainsi que le tractus riche en polypyrimidine. (b) Les deux étapes séquentielles de transestérification. Le groupement 2’-OH du site de branchement attaque le phosphate au site d’épissage 5’ (en bleu). Après formation du lariat intermédiaire, le groupement 3’ hydroxyle (-OH) de l’exon libéré attaque le site d’épissage 3’ (en vert). Il en résulte un intron sous forme de lariat ou lasso ainsi que les 2 exons ligués ensemble. Adaptée de (Collins and Guthrie 2000).

La formation du splicéosome est régie par une suite de reconnaissances précises par les snRNPs et leurs protéines auxiliaires. Le snRNP U1 se lie au site d’épissage 5’ et le facteur d’épissage 1 SF1 (Splicing factor 1) se fixe au site de branchement. À ce moment, le facteur auxiliaire à snRNP U2 (U2AF, U2 auxiliaire factor) reconnaît le site d’épissage 3’ ainsi que le tractus de polypyrimidine (Berglund et al. 1997; Berglund et al. 1998). Par la suite, SF1 est remplacé par le snRNP U2 au site de branchement et le splicéosome devient ATP-dépendent. À cette étape, il y a recrutement du triplet U4/U6-U5 snRNP qui mène, après une réorganisation conformationnelle, à la formation du complexe catalytique nécessaire à l’épissage du pré-ARNm (Staley and Guthrie 1998; Wahl et al. 2009).

1.2.3.2 L’épissage alternatif

Chez les mammifères, la plupart des gènes contiennent des exons de petite taille (50-250 pbs) contrairement aux introns qui peuvent être de plusieurs milliers de paires de base. C’est donc dans le voisinage des exons qu’est fait l’assemblage du splicéosome. Ce type de reconnaissance est nommé la définition de l’exon ou exon definition en anglais

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(Berget 1995; Sterner et al. 1996). Cependant, chez les eucaryotes inférieurs où l’architecture du génome est caractérisée par des petits introns et de gros exons, il y aura préférablement définition de l’intron (Lang and Spritz 1983; Berget 1995). La décision d’exclure ou d’inclure un exon alternatif (épissage alternatif) repose sur la reconnaissance de séquences régulatrices secondaires contenues sur le pré-ARNm faite par des protéines appelées facteurs d’épissage. Ces éléments secondaires peuvent se retrouver dans l’exon ou dans l’intron et peuvent être facilitatrices (ESE, Exonic Splicing Enhancer; ISE, Intronic Splicing Enhancer) ou inhibitrices (ESS, Exonic Splicing Silencer; ISS Intronic Splicing Silencer) (Figure 1.4).

Figure 1.4 Régulation de l’épissage alternatif.

La décision de l’épissage alternatif est dépendante des éléments de régulation cis ainsi que le recrutement des facteurs d’épissage trans. Les éléments cis sont classés en quatre catégories en fonction de la localisation et de leur activité : les Exonic Splicing Enhancers (ESEs), les Exonic Splicing Silencers (ESSs), les Intronic Splicing Enhancers (ISEs) et les Intronic Splicing Silencers (ISSs). Les facteurs les plus souvent impliqués proviennent de la famille des protéines SR qui reconnaissent les ESEs ainsi que les hnRNPs qui reconnaissent eux les séquences ESSs pour inhiber l’épissage alternatif. Les motifs consensus des sites d’épissage sont montrés où la hauteur de chacune des lettres est en fonction de la fréquence retrouvée à cette position. Le pointillé représente la formation du complexe de définition de l’exon. Adaptée de (Matera and Wang 2014).

Les ESEs agissent en recrutant des protéines de la famille riches en sérine (S) et arginine (R), les protéines SR (serine/arginine-rich proteins) qui aident à la reconnaissance des sites d’épissage (Graveley 2000; Wang and Burge 2008). Les SR stabilisent également les interactions avec U1, U2AF et U2 ce qui facilite l’assemblage du splicéosome (Shen and Green 2006). Contrairement aux ESEs, les séquences ESSs aident au recrutement des protéines hnRNPs (heterogeneous nuclar ribonucléoproteins) qui peuvent bloquer l’accès aux sites d’épissage, aux snRNPs ou aux protéines SR ce qui favorisent l’exclusion d’un

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exon (Zhu et al. 2001; Zhou and Lou 2008; Zhu et al. 2008; Tange et al. 2001). Les séquences ESEs et ESSs ne semblent pas pouvoir être interchangeables, c’est-à-dire qu’un ESE dans un contexte ne pourrait pas devenir un ESS dans un autre (Fairbrother et al. 2002; Wang et al. 2004b). Quant aux éléments introniques de régulation, ils peuvent agir comme facilitateur ou inhibiteur en fonction de leur localisation et des protéines recrutées (Jin et al. 2003; Ule et al. 2006) (revue dans (Hui et al. 2005)). Enfin, la décision ultime de l’épissage alternatif est dépendante de la combinaison, de la compétition, de la concentration et de l’activité de chaque type de régulateur qui sont généralement les protéines SR et les hnRNPs (Mayeda et al. 1993; Zhu and Krainer 2000; Zahler et al. 2004). Il peut en résulter différents types d’événements allant de l’épissage d’un exon alternatif au maintien d’un intron dans l’ARNm mature ou de l’épissage de promoteur alternatif (Figure 1.5).

Figure 1.5 Différents types d’événements d’épissage alternatif

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supérieurs. (b) et (c) surviennent dans des cas où plus d’un site d’épissage sont reconnus à l’une des extrémités de l’exon. (d) La rétention d’un intron dans l’ARNm mature est l’un des événements d’épissage les plus rares chez les vertébrés et les invertébrés. D’autres mécanismes complexes moins fréquents sont possibles tels que l’épissage mutuellement exclusif de plusieurs exons (e), l’usage de promoteur alternatif (f) ainsi que de queue de polyadénylation alternative (g). Adaptée de (Keren et al. 2010)

1.2.3.3 Les facteurs d’épissage PTBs

Le facteur PTB (PTBP1, polypyrimidine tract binding protein) ou hnRNP I est une ribonucléoprotéine ubiquitaire. Il a été identifié pour la première fois dans des extraits nucléaires de cellule Hela en se liant préférentiellement au tractus riche en polypyrimidine situé tout juste en amont des sites d’épissage en 3’ (Garcia-Blanco et al. 1989; Patton et al. 1991). PTB a un effet généralement inhibiteur sur la reconnaissance des sites d’épissages et donc, favorise l’exclusion des exons. Il sert de régulateur de l’épissage alternatif pour une multitude de pré-ARNm (Chan and Black 1997; Gooding et al. 1998; Carstens et al. 2000). En plus des événements d’épissage, PTB peut servir de navette à l’ARNm du noyau vers le cytoplasme cellulaire et ainsi participer à d’autres processus tels que la polyadénylation, la stabilisation et l’initiation de la traduction de l’ARNm (Wollerton et al. 2004; Castelo-Branco et al. 2004; Jang and Wimmer 1990). Le facteur PTB contient quatre domaines de liaison à l’ARN ou RNA Recognition Motifs (RRM) (Oh et al. 1998). En se liant sur différents sites de la même molécule d’ARN, PTB peut conduire à la formation de boucle d’ARN ce qui serait critique pour inhiber l’accès aux autres facteurs d’épissage. Aussi, la liaison de PTB permet le recrutement ribosomal de l’initiation de la traduction de manière IRES (Internal Ribosome Entry Site) -dépendante (Mitchell et al. 2003; Petoukhov et al. 2006). L’ARNm de PTB est sujet à l’épissage alternatif puisque trois différentes isoformes existent. PTB1 est l’isoforme la plus courte, tandis que PTB2 et PTB4 contiennent une séquence additionnelle de 19 à 26 acides aminés entre les domaines RRM2 et RRM3 (Gil et al. 1991; Ghetti et al. 1992). Cette addition est causée par l’inclusion de l’exon 9 qui contient deux sites d’épissage 3’. Bien qu’elles soient similaires, ces isoformes de PTB sont exprimées à des niveaux différents selon le type cellulaire (Wagner et al. 1999) et peuvent avoir des activités d’épissage alternatif différentes (Wollerton et al. 2001).

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Il existe deux paralogues2 distincts qui ont une homologie de séquence de 70-80 % avec PTB. Le premier est le neural PTB (nPTB ou brPTB ou PTBP2) qui est exprimé dans le cerveau adulte, dans le muscle et dans les testicules (Ashiya and Grabowski 1997; Markovtsov et al. 2000; Polydorides et al. 2000). nPTB partage la même séquence de reconnaissance que PTB avec quelques différences au niveau de l’affinité. Tout de même, ils ont des fonctions redondantes. Il est à noter qu’en plus de s’autoréguler (Wollerton et al. 2004), PTB peut également réguler l’exclusion de l’exon 10 des transcrits de nPTB ce qui mènent son ARNm au système de dégradation Nonsense Mediated Decay3 (NMD). Il y

aura facilitation de la traduction de nPTB seulement lorsque PTB sera plus faiblement exprimé. Ce processus est en partie responsable d’un changement important dans le programme d’épissage alternatif menant à la différenciation neuronale (Boutz et al. 2007b; Makeyev et al. 2007). Le deuxième paralogue est ROD1 (Regulator Of Differentiation 1) qui aussi appelé PTBP3. Ce dernier est retrouvé préférentiellement dans les cellules hématopoïétiques (Yamamoto et al. 1999).

1.2.3.4 L’épissage de l’exon 2 et 3 de tau

Moins bien étudiés que l’exon 10, les exons 2 et 3 codent chacun pour une séquence de 29 acides aminés dans la portion n-terminale de la protéine qui est appelée le domaine de projection ou projection domain (revue dans (Buee et al. 2000)). L’exon 2 se retrouve inclus dans 4 des 6 isoformes majeures de tau observées dans le cerveau et son patron d’épissage favorise généralement son inclusion dans l’ARNm mature (Li et al. 2003). Son inclusion est détectée et corrèle dans le développement avec la présence du transcrit d’ARNm de tau de 9kb (Couchie et al. 1992; Goedert et al. 1992b). Bien que le patron d’épissage de l’exon 2 soit préférablement l’inclusion, plusieurs facteurs SR et hnRNPs testées in vitro l’excluent de l’ARNm de tau (revue dans (Andreadis 2005)). Les facteurs d’épissage SRp30c, htra2beta1, PTB et SRp55 facilitent son épissage tandis que les protéines CELF4, Nova1, SLM1, SLM2 et nPTB favorisent son inclusion (Stoss et al.

2Des gènes paralogues proviennent d’un gène ancestral commun suite à une duplication. Les deux copies ont divergés ce qui a induit l’apparition d fonctions différentes, sans rester de simples copies du même gène commun.

(39)

2001; Li et al. 2003). L’exon 3 est considéré comme exclus par défaut (Arikan et al. 2002). Cette particularité s’explique en partie par la présence d’un site faible de branchement ainsi qu’une région faible de polypyrimidine. L’inclusion de l’exon 3 est facilitée suite à l’épissage de l’exon 2 une fois que les autres sites d’épissage (plus forts) seront enlevés (Andreadis et al. 1995; Arikan et al. 2002). Il est à noter que la présence de l’exon 3 dans les isoformes de tau des neurones est faible (Wei and Andreadis 1998), mais que son inclusion est enrichie, entre autres, dans les enchevêtrements neurofibrillaires (Liu et al. 1993). Également, sa surexpression chez la souris transgénique cause des gliopathies sévères, une dégénération spinale (Higuchi et al. 2002) et inhibe la croissance des neurites (Luo et al. 2004). Les facteurs d’épissage SRp20, ASF, SRp30c, SWAP, htra2beta1 et Nova1 inhibent son inclusion et à l’inverse, les protéines SRp55 et SRp75 peuvent faciliter son insertion.

1.2.3.5 Le 10e exon de tau et son épissage alternatif

Le plus connu et le plus étudié des exons de tau est l’exon 10. Il code pour un des 4 domaines de liaisons (R1 à R4) aux microtubules en position carboxy-terminale (Figure 1.2) (Lee et al. 1989). Ces quatre motifs répétés hautement conservés de 18 acides aminés se retrouvent plus largement dans le domaine d’assemblage aux microtubules ou microtubule assembly domain de la protéine tau (Goedert et al. 1989b; Himmler et al. 1989). Il a été démontré que les isoformes contenant l’exon 10, donc 4 domaines de liaison (4R-tau), favorisent mieux la polymérisation des microtubules par rapport aux variants sans l’exon 10 (3R-tau) (Goedert and Jakes 1990). D’une manière intéressante, cette efficacité accrue des isoformes 4R viendrait d’une région entre les domaines répétés R1 et R2 (274KVQIINKK281) qui est propre aux protéines 4R-tau (Goode and Feinstein 1994). Chez l’humain, au stade embryonnaire, il n’y a que les isoformes 3R-tau qui sont exprimées en comparaison à l’âge adulte où les variants 3R et 4R sont observés avec un ratio d’environ 1:1 dans le cerveau (Takuma et al. 2003). Au stade embryonnaire chez la souris, seules les isoformes 3R-tau sont exprimées. L’inclusion des variants 4R se fait progressivement après la naissance jusqu’à ce qu’il y ait presque exclusivement des variants 4R à l’âge adulte (Kosik et al. 1989; Janke et al. 1999).

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L’exon 10, tout comme l’exon 2, montre un patron d’inclusion par défaut et son exclusion embryonnaire est probablement sous le contrôle d’un facteur d’épissage spécifique (Gao et al. 2000). Contrairement à la plupart des exons épissés alternativement qui contiennent seulement un site faible d’épissage, l’exon 10 en possède deux (un en position 5’ et l’autre en 3’) (D'Souza and Schellenberg 2002). Cette reconnaissance est d’autant plus complexe puisque l’exon 10 est bordé par les introns 9 et 10 qui sont particulièrement longs. La décision d’inclure l’exon 10 repose à la fois sur l’action des facteurs d’épissage et sur les séquences régulatrices de l’exon 10 et des introns 9 et 10. L’extrémité 5’ de l’exon 10 (côté du site d’épissage 3’) contient trois ESEs : un SC35-like enhancer, un polypurine enhancer (PPE) et un A/C-rich enhancer qui est suivi d’un ESS (Figure 1.6). À l’extrémité 3’ de l’exon, il y a un ESE entre le ESS et le site d’épissage 5’ (Figure 1.6). En plus des séquences exoniques, il y a dans l’intron 10 deux éléments en tandem, un ISS (E10+11 à E10+18) ainsi qu’un Intronic Splicing Modulator ou ISM (E10+19 à E10+26). Il a été démontré que ces motifs ont des effets opposés sur l’épissage alternatif de l’exon 10 (D'Souza and Schellenberg 2000). L’ISM n’est pas un facilitateur (enhancer), mais contrecarre l’effet de l’ISS sur le site d’épissage 5’. Plusieurs mutations familiales dans cette région ont été identifiées favorisant l’inclusion ou l’exclusion de l’exon 10 (Figure 1.6).

Figure 1.6 Séquences régulatrices exoniques et introniques de l’épissage de l’exon 10. L’exon 10 est représenté en lettres majuscules. Les introns 9 et 10 bordant l’exon 10 sont

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en lettres minuscules. Les éléments inclus dans l’exon sont : trois ESEs séquentiels (SC35-like, PPE, ACE) du côté du site d’épissage 3’, un ESS suivi d’une autre ESE du côté du site d’épissage 5’. Deux séquences au niveau de l’intron 10 peuvent également réguler l’épissage de l’exon 10 : un ISS ainsi qu’un ISM. À l’interface exon 10-intron 10, il y a une structure en tige-boucle. Les mutations indiquées en rouge indiquent une augmentation et celles en vert une diminution du ratio des isoformes 4R et 3R de tau. Les triangles représentent des délétions pathologiques. Adaptée de (Liu and Gong 2008)

Plusieurs facteurs d’épissage ont été identifiés comme régulateurs de l’inclusion ou de l’exclusion de l’exon 10 de tau. Les membres des familles de protéines SR, les hnRNPs ainsi que d’autres facteurs sont présentés dans le Tableau 1.1.

Tableau 1.1 Facteurs d’épissage pouvant réguler l’exon 10 de tau

Adapté de (Andreadis 2005) et de (Liu and Gong 2008).

Tableau 1. Facteurs d'épissage pouvant régulés l'exon 10 de Tau

Facteurs Autres noms Effet Référence

ASF SRSF1,SRp30a I ou E Shi et al. 2008; D'souza et al. 2006; Kondo et al. 2004; Gao et al. 2000 ( E) SC35 SRSF2, SRp30b I Hernandez et al. 2004; Qian et al. 2011 SRp20 SRSF3 E Yu et al. 2004

SRp75 SRSF4 E Wang et al. 2004; Wang et al. 2011 SRp40 SRSF5 N Yu et al. 2004

SRp55 SRSF6 E ou I

Yu et al. 2004; Wang et al. 2005; Yin et al. 2012 (I); Fernandez-Nogales et al. 2014 (I)

9G8 SRSF7 E Gao et al. 2007; Ding et al. 2012 SWAP SRSF8 E Gao et al. 2000

SRp30c SRSF9 I ou E Kondo et al. 2006; Wang et al. 2004 (E); Wang et al. 2005 (E)

hTra2β1 SRSF10 I Gao et al. 2000; Jiang et al.2003; Wang et al. 2004 SRp54 SRSF11 E Wu et al. 2006 PTB PTBP1, hnRNP I E Wang et al. 2004 nPTB PTBP2, brPTB N Wang et al. 2004 hnRNP A1 N Gao et al. 2000 hnRNPG Rbmx I Wang et al. 2004

U2AF2 E Wang et al. 2004

Nova1 E Wang et al. 2004

KSRP KHSRP E Wang et al. 2004 SLM1 Khdrbs2 E Wang et al. 2004 SLM2 Khdrbs3, T-STAR E Wang et al. 2004 CELF1 Brunol2, CUGBP1 N Dhaenens et al. 2011

CELF2 CUGBP2, ETR3,

Brunol3 E Dhaenens et al. 2011

CELF3 Brunol1, Tnrc4 I Wang et al. 2004, Chapple et al. 2007 CELF4 Brunol4 I Wang et al. 2004; Dhaenens et al. 2011

(42)

Il est également à noter que plusieurs des facteurs d’épissage, notamment les protéines SR, peuvent être phosphorylés ce qui ajoute un niveau de régulation supplémentaire à ces protéines. Par exemple, la phosphorylation d’ASF permet son interaction avec le pré-ARNm ainsi que d’autres facteurs d’épissage et facilite aussi la navette entre le noyau et le cytoplasme de la cellule (Xiao and Manley 1998). Plus récemment, il a été démontré que les facteurs PTBP1 et PTBP2 peuvent être SUMOylé in vitro dans des cellules HEK293T. De plus, la SUMOylation de PTBP2 est réduite chez des lignées cellulaires de gliomes humains (Han et al. 2014). Ces modifications post-traductionnelles ajoutées aux facteurs d’épissage complexifient encore plus un système hautement régulé.

1.2.4 Les modifications post-traductionnelles de tau

1.2.4.1 Les modifications autres que la phosphorylation

Plusieurs modifications post-traductionnelles ont été étudiées sur la protéine tau. La O-glycosylation est l’ajout d’un glucide complexe (O-linked N-acetylglucosamine) sur les chaînes latérales des acides aminés Sérine et Thréonine à proximité des résidus Proline. Elle est souvent en compétition avec la phosphorylation des résidus Ser et Thr ce qui suggère des effets opposés (revue dans (Kamemura and Hart 2003)). Cette modification pourrait jouer un rôle dans la localisation subcellulaire de tau (Lefebvre et al. 2003). Contrairement à la O -, la N-glycosylation est une modification anormale de tau retrouvée uniquement dans les enchevêtrements neurofibrillaires (Wang et al. 1996).

La protéine tau peut également être ubiquitinée. La conjugaison d’un groupement ubiquitine est observée sur tau contenue dans les enchevêtrements neurofibrillaires des patients atteints de la MA (Mori et al. 1987). L’ubiquitine sert principalement de signal de dégradation par le protéasome pour les protéines à courte demi-vie, anormales ou endommagées. Il peut également y avoir ajout d’un polypeptide SUMO ou Small Ubiquitin-like Modifier (Dorval and Fraser 2006; Takahashi et al. 2008). Ce processus de modification post-traductionnelle est similaire à celui de l’ubiquitine. Récemment, il a été démontré que la SUMOylation de tau à un résidu K340 est suffisante pour stimuler sa

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phosphorylation et son agrégation, mais réduit aussi son ubiquitination (Luo et al. 2014).

La protéine tau peut être acétylée par l’acétyl-coenzyme A sur les résidus K163, 174 et 180 in vitro (Min et al. 2010). Par ailleurs, l’acétylation du résidu K280 n’est seulement détectée que chez des patients atteints de la MA, de la PSP et de la CBD (Cohen et al. 2011; Irwin et al. 2012). L’ajout d’un groupement acétyle diminue son affinité pour les microtubules et ainsi favorise son agrégation (Cohen et al. 2011). Par contre, une autre étude a démontré que l’acétylation dans les domaines de liaison répétés de tau inhibe la phosphorylation de l’épitope reconnu par l’anticorps 12E8 (Ser262/356) et empêche l’agrégation de la protéine tau in vitro (Cook et al. 2014). De ce fait, l’acétylation a des conséquences différentes selon le résidu modifié. Par ailleurs, la protéine tau contenue dans les PHFs est méthylée sur des résidus lysine (Thomas et al. 2012). Cette modification est également retrouvée en condition physiologique et aurait un effet d’anti-agrégation (Funk et al. 2014).

La glycation est une modification où la partie aminée de la chaîne latérale de l’acide aminé réagit avec la portion carboxyle d’un sucre réducteur tel que le glucose. Elle est également retrouvée dans les enchevêtrements neurofibrillaires insolubles (Smith et al. 1994). De même, la transglutamination ou polyamination (Miller and Johnson 1995; Wilhelmus et al. 2009), la nitration (Reyes et al. 2008), l’acétylation (Cohen et al. 2011), l’oxydation (Landino et al. 2004), l’isomérisation (Zhou et al. 2000) ainsi que la troncation ou protéolyse de tau (Novak 1994; Park and Ferreira 2005) sont retrouvées en conditions pathologiques.

1.2.4.2 La phosphorylation de tau

Il est connu depuis la fin des années 1970 que tau est une phosphoprotéine (Cleveland et al. 1977a). La phosphorylation est la modification post-traductionnelle la plus retrouvée sur la protéine tau et affecte ses fonctions (voir section fonctions de tau 1.2.5). Sur son isoforme longue de 441 acides aminés (+2+3+10), il y a 85 sites potentiels de phosphorylation qui représentent environ 20 % des acides aminés de la protéine totale

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(revue dans (Noble et al. 2013)). Ces sites sont majoritairement des Sérines et des Thréonines suivis d’une Proline. Il y a également des Sérines et Thréonines seules ainsi que quelques résidus Tyrosines potentiellement accepteurs de phosphates (Tableau 1.2). Leur identification respective a été réalisée par l’utilisation d’anticorps spécifiques, par dégradation d’Edman ou par spectrométrie de masse (revue dans (Hanger et al. 2009)).

La dérégulation de la phosphorylation de tau chez les patients de MA peut être de deux types : l’hyperphosphorylation et la phosphorylation anormale de tau. L’hyperphosphorylation se caractérise par l’augmentation des protéines tau phosphorylées à un résidu précis en comparaison au pool ou bassin total de la protéine. Également, elle se définit par l’augmentation significative des groupements phosphate pour une protéine tau donnée (Ksiezak-Reding et al. 1992; Kenessey and Yen 1993; Kopke et al. 1993). Plusieurs anticorps ont été développés pour évaluer les sites spécifiques sujets à l’hyperphosphorylation. La phosphorylation anormale est l’ajout d’un groupement phosphate qui est uniquement retrouvé en conditions pathologiques, notamment dans les enchevêtrements neurofibrillaires. Les sites Ser212/Thr214, Thr231 et Ser422 sont considérés comme « pathologiques » (Mercken et al. 1992; Hoffmann et al. 1997; Jicha et al. 1997b; Hasegawa et al. 1996; Bussiere et al. 1999).

(45)

Tableau 1.2 Résumé des sites putatifs de phosphorylation de tau ainsi que des kinases et des phosphatases régulatrices

Adaptée de (Buee et al. 2000; Sergeant et al. 2008; Braithwaite et al. 2012; Martin et al. 2013b; Wang et al. 2013a; Hanger et al. 2009; Noble et al. 2013) ainsi que du lien

Figure

Figure 1.2  Représentation du gène, de l’épissage alternatif de l’ARNm ainsi que des  isoformes de tau retrouvées dans le SNC humain
Figure 1.3  Réactions impliquées dans l’épissage de l’ARNm.
Figure 1.5  Différents types d’événements d’épissage alternatif
Figure 1.6  Séquences régulatrices exoniques et introniques de l’épissage de l’exon 10
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