THESE
Pour l’obtention du grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS
(Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées) (Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)
Ecole Doctorale : Bio-Santé
Secteur de Recherche : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie Présentée par :
Najate Benamer
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Etude des propriétés et de l’impact fonctionnel de
canaux potassiques dans les fibroblastes cardiaques
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Directeur de Thèse : Pr Jean-François FAIVRE
************************Soutenue le 2 Décembre 2009 devant la Commission d’Examen
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JURY
A. Coulombe Dir.de recherche CNRS, Hôpital Salepétrière, Paris Rapporteur S. Richard Dir. de recherche INSERM, Univ. de Montpellier Rapporteur
F. Becq Pr. des Universités, Univ.de Poitiers Examinateur A. Bril Dir. adjoint de l’Inst. de Rech. SERVIER, Paris Examinateur R. Fischmeister Dir. de recherche INSERM, Université Paris-Sud Examinateur JF. Faivre Pr. des Universités, Univ. de Poitiers Examinateur
TABLE DES MATIERES
LISTE DES ABRÉVIATIONS ... 6
AVANT-PROPOS... 9
INTRODUCTION ... 10
A Le Cœur ... 10
I Anatomie et structure ... 10
II Fonctions et propriétés... 12
1 Au cœur de la circulation sanguine ... 12
2 Mécanique du cœur ... 12
a Automatisme et conduction cardiaque ... 13
b Couplage excitation-contraction ... 14
1 Les cellules myocytaires ... 16
a Les cardiomyocytes... 16
b Les cellules nodales ... 17
2 Les cellules non-myocytaires : structure et fonction... 18
a Les cellules musculaires lisses ... 18
b Les cellules endothéliales... 19
c Les fibroblastes ... 19
B Les fibroblastes ... 20
I Fibroblastes cardiaques : propriétés cellulaires ... 20
1 Propriétés structurales ... 20
a Origine ... 20
b Structure et organisation ... 21
2 Propriétés électrophysiologiques ... 22
a Les canaux potassiques ... 22
b Les canaux cationiques non sélectifs ... 23
c Les canaux protons... 24
3 Propriétés mécaniques... 24
II Fibroblastes cardiaques : au cœur du fonctionnement du cœur ... 26
1 Le renouvellement de la MEC ... 26
a La matrice extra-cellulaire (MEC) ... 27
b Les MMPs... 28
2 Les voies de communication entre les fibroblastes et l’environnement. ... 29
a Les récepteurs exprimés par les fibroblastes ... 29
b Les facteurs sécrétés par les fibroblastes... 30
b1 Les cytokines ... 30
b2 Les peptides vasoactifs et facteurs de croissance... 30
c Communications intercellulaires ... 31
c1 Couplage fibroblaste-fibroblaste... 31
c2 Couplage fibroblaste-cardiomyocyte... 32
III Fibroblastes cardiaques : acteurs du remodelage cardiaque ... 33
1 Modifications phénotypiques des fibroblastes cardiaques ... 35
a Différenciation en myofibroblastes ... 35
b Stimuli à l'origine de la différenciation ... 36
2 Modifications de la prolifération et des fonctions de sécrétion des fibroblastes cardiaques ... 37
a Prolifération... 37
b Renouvellement de la MEC ... 39
c Propriétés de sécrétion ... 41
3 Effet sur le fonctionnement cardiaque ... 43
a Les différents types de fibrose... 43
b Causes de la fibrose... 44
c Conséquences fonctionnelles ... 45
IV Conclusion : les fibroblastes cardiaques, cibles thérapeutiques potentielles ... 45
2 Pharmacologie fonctionnelle ... 47 C La Sphyngosine-1-phosphate ... 49 I Généralités ... 49 1 Origine et synthèse de la S1P ... 49 2 Classification ... 50 3 Distribution ... 51 4 Pharmacologie... 51
a Les agonistes des récepteurs à la S1P... 52
c Les inhibiteurs des sphingosine kinases ... 53
5 Signalisation ... 54
II S1P au sein du cœur... 56
1 S1P au sein du système cardiovasculaire : expression, signalisation, fonction... 56
a S1P et cardiomyocyte... 56
b S1P et cellules endothéliales ... 57
c S1P et cellules musculaires lisses... 58
d S1P et fibroblastes... 59
2 Effets cardioprotecteurs potentiels de la S1P ... 60
POSITION DU PROBLEME ... 63
MATERIELS ET METHODES ... 65
A Dissociation et culture cellulaires... 65
I Méthode d'isolement cellulaire des fibroblastes cardiaques de souris... 65
1 Isolement des fibroblastes ... 65
2 Mise en culture des fibroblastes... 68
II Méthode d'isolement cellulaire des fibroblastes cardiaques humains ... 68
B Techniques de biologie moléculaire et de biochimie... 69
I « Reverse Transcription and Polymerase Chain Reaction » (RT-PCR) ... 69
1 Principe... 69
2 Extraction des ARN ... 69
3 Transcription inverse des ARN en ADN complémentaires (ADNc) ... 69
4 Réaction de PCR ... 70
5 Séparation électrophorétique des produits de PCR... 70
II PCR (« Polymerase chain reaction ») quantitative à haut rendement ou TLDA (« TaqMan Low Density Custom Array ») ... 71
1 Principe... 71
2 Protocole ... 71
III Western-Blot... 72
1 Principe... 72
2 Extraction et dosage protéique ... 72
3 Séparation des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes... 72
4 Electrotransfert... 73
5 Immunodétection des protéines d'intérêt ... 74
6 Les anticorps utilisés... 74
C Technique de fluorescence... 75 I Immunomarquage indirect ... 75 1 Principe... 75 2 Protocole ... 75 3 Anticorps utilisé ... 76 D Technique d'électrophysiologie ... 76 I Le patch-clamp... 76 1 Principe... 77
a La configuration cellule attachée ... 77
b La configuration cellule-entière ... 77
c La configuration « inside-out » ... 78
d La configuration « outside-out » ... 79
2 Dispositif expérimental... 79
4 Molécules testées ... 82
5 Méthode de mesure ... 82
a Equations de Goldman, Hodgkin et Katz ... 82
b Perméabilité cation/anion ... 83
c Probabilité d'ouverture ... 83
E Technique de mesure de la prolifération ... 84
I Test MTT (bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium) ... 84
1 Principe... 84
2 Protocole ... 85
II Test de prolifération au bleu de méthylène ... 85
1 Principe... 85
2 Protocole ... 85
F Technique de mesure de la migration cellulaire ... 85
I Mesure de la migration en chambre de Boyden ... 86
1 Principe... 86
2 Protocole ... 86
G Technique d'étude des propriétés de sécrétion... 87
I Mesure de la sécrétion d'IL-6 par ELISA... 87
1 Principe... 87
2 Protocole ... 88
II Dosage du collagène par le kit SIRCOL assay ... 89
1 Principe... 89
2 Protocole ... 89
H Analyse statistiques ... 90
RESULTATS ... 91
A Analyse des types cellulaires présents dans nos cultures ... 91
I Validation de la pureté en fibroblastes des cultures cellulaires ... 91
II Etude de la différenciation des fibroblastes en myofibroblastes ... 93
1 Etude de l’expression de l'α-SMA par Western-Blot... 93
2 Etude de l’expression de l'α-SMA et de la fibronectine par immunomarquage ... 94
B Analyse moléculaire des fibroblastes ventriculaires de souris... 95
I Expression des gènes de fibroblastes ventriculaires de souris par PCR quantitative à haut rendement .... 95
1 Analyse d’expression des gènes par PCR quantitative à haut rendement ... 95
2 Etude de l’expression de SUR2 et Kir6.1 par RT-PCR ... 97
II Etude de l'expression protéique des unités SUR2 et Kir6.1 ... 98
1 Analyse de l’expression protéique des unités SUR2 et Kir6.1 par Western-blot ... 98
2 Analyse de l’expression protéique des unités SUR2 et Kir6.1 par immunomarquage ... 100
C Analyse des propriétés électrophysiologiques et pharmacologiques du canal SUR2/Kir6.1 ... 101
I SUR2/Kir6.1 : Caractéristiques en configuration « inside-out » ... 102
1 Propriétés électrophysiologiques du canal SUR2/Kir6.1... 102
2 Propriétés pharmacologiques du canal SUR2/Kir6.1 ... 103
II SUR2/Kir6.1 : Caractéristiques en configuration cellule entière ... 105
III SUR2/Kir6.1 : Effet de la Sphingosine-1-phosphate (S1P)... 107
1 Mesure d'une conductance potassique sensible au glibenclamide ... 107
2 Comparaison des conductances sensibles au glibenclamide activés par le pinacidil et la S1P.. 108
3 Analyse de la conductance activée par la S1P au cours du temps ... 109
4 Effets des inhibiteurs des récepteurs S1P1 et S1P3 sur le courant activé par la S1P ... 110
5 Etude de l'expression protéique du récepteur de type III à la S1P (S1P3) ... 111
D Effet de la modulation du canal SUR2/Kir6.1 et du récepteur S1P3 sur la fonction du fibroblaste cardiaque... 112
I Effet sur la prolifération des fibroblastes cardiaques ... 112
II Effet sur la sécrétion d'IL-6... 114
III Effets sur la sécrétion du collagène ... 115
E Analyse de l’expression et de la fonctionnalité du canal SUR2/Kir6.1 dans les fibroblastes
auriculaires humains ... 117
I Obtention de fibroblastes auriculaires humains ... 117
II Analyse Moléculaire de SUR2/Kir6.1 dans les fibroblastes humains... 118
1 Etude de l’expression de SUR2 et Kir6.1 par RT- PCR ... 118
2 Etude de l’expression protéique des unités SUR2 et Kir 6.1 par Western-Blot ... 119
III Analyse Fonctionnelle du canal SUR2/Kir6.1 dans les fibroblastes humains ... 119
IV Analyse de la différenciation des fibroblastes auriculaires humains ... 120
DISCUSSION-PERSPECTIVES ... 122
A Expression des gènes codant des sous-unités canalaires... 122
B Propriétés du canal SUR2/Kir6.1... 124
C La S1P, potentiel modulateur physiologique du canal SUR2/Kir6.1 ... 126
D Modulation de la fonction des fibroblastes par activation par le pinacidil ou la S1P du canal SUR2/Kir6.1 ... 127
E Modulation de la migration des fibroblastes par la S1P ... 128
F S1P3 : une potentielle cible thérapeutique des fibroblastes cardiaques... 128
G Analyse de l’expression fonctionnelle du SUR2/Kir6.1 dans les fibroblastes humains ... 130
CONCLUSION... 131
BIBLIOGRAPHIE ... 133
LISTE DES ABRÉVIATIONS
-A-ABC-transporteurs ATP binding cassette
ADN Acide désoxyribonucléique
ADNc Acide désoxyribonucléique complémentaire
Ag II Angiotensine II
AMPc Adénosine monophosphate cyclique
ANP Atrial Natriuretic Peptide
ARN Acide ribonucléique
ARNm Acide ribonucléique messager
-B-
BDM 2, 3-Butane- Dione 2-Monoxime
Bet Bromure d’éthidium
bFGF basic Fibroblast Growth Factor
BKCa Big K potassium channel
BNP Brain Natriuretic Peptide
BSA Bovine Serum Albumine
-C-
CML Cellules musculaires lisses
CNP Peptides natriurétique de type C
-D-
DAG Diacylglycérol
DHS DL-threo-dihydrosphingosine
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DMS Diméthylsphingosine
DMSO Dimethyl sulfoxyde
dNTP dinucléotide triphosphate
DTT Dithiotheritol
-E-
ECL Enhanced chemiluminescence
EDG Endothelial Differentiation Gene
EDTA Ethylen Diamine Tetraacetic Acid
EGTA Ethyleneglycol-bis (β-amino-ethyl ether) N, N, N’, N’, Tetra acetic acid
EPDC Endothelial Pericarde Derived Cells
ERK Extracellular signal-regulated Kinase
-F-
FGF Fibrolast Growth Factor
FTY720 fingolimod, 2-amino-2-(4-octylphenyl)ethyl)-1,3propanediol hydrochloride
-G-
GAPDH Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase
GM Ganglioside Monoside
-H-
HEPES N-2-Hydroxyethyl-Piperazine-N’-2-Ethane Sulfonic acid
HMG-CoA 3-Hydroxy-3 methylglutaryl conenzime A
5-HT 5 HydroxyTryptamine
-I-
IL Interleukine
Ito Transient outward current
-J-
JNK
JTE-013 (1-(1,3-Dimethyl-4-(2methylethyl-1H-pyrazolo(3,4-b)pyridin-6-yl)-4-(3,5-dichloro-4-pyridinil)-semicarbazide)
-K-
Kir x.x Inward rectifier K+ channel (Canal potassium rectifiant entrant)
KO Knock Out
KRP-203
(2-amino-2-{2-(4-(3-benzyloxyphenylthio)-2-(chlorophenyl)ethyl}-1,3-propanediol hydrochloride)
Kv x.x Voltage-dependant K+ channel (Canal potassium voltage dépendant)
-L-
LPA Lysophosphatidique acide
-M-
MAPK Mitogen-Activated-Protein-Kinase
MEC Matrice Extracellulaire
MIP Mechanically Induced Potentials
M-MLV-RT Moloney Murine Leukaemia Virus Transcriptase
MMP Métalloprotéinases
MTT bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium
-N-
NF-KB Nuclear factor kappa B
NO Monoxyde d’azote
-P-
PBS Phosphate Buffer Saline
P13-K PhosphoInositide-3-Kinase
PCR Polymerase Chain Reaction
PDGF Platelet Derived Growth Factor
PIP2 Phosphatidyl Inositol 4, 5 bis Phosphate
PKA Protein Kinase A
PKC Protein Kinase C
PLC Phospholipase C
-R-
RIPA Radioimmunoprécipitation assay
RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
-S-
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
SEW2871 (5-(4-Phenyl-5-trifluoromethylthiophen-2-yl)-3-(3-trifluoromethylphenyl)-(1,2,4)-oxadiazole)
siRNA small interfering RNA
α-SMA α-Smooth Muscle Actine
S1P Sphingosine-1-Phosphate
SUR x Sulfonylurea receptor (Récepteur aux sulfonylurées)
SVF Serum de Veau Fœtal
-T-
TBS Tris Buffered Saline
TGF-β Transforming Growth Factor-β
TIMP Tissu inhibitor of MetalloProteinases
TLDA TaqMan Low Density Array
TNF-α Tumor Necrosis Factor-α
TRPC Transient Receptor Potential Canonical
TRPM Transient Receptor Potential Melastatin
-V-
VPC23019 ((R)-phosphoric acid mono-(2-amino-2-(3-octyl-phenylcarbamoyl)-ethyl)-ethyl)ester)
AVANT-PROPOS
Après avoir réalisé mon Master à l'Université de Bordeaux, j'ai eu l'opportunité d'intégrer le laboratoire de physiologie et pharmacologie des canaux ioniques de l'Université de Poitiers. Ma motivation première a été de pouvoir intégrer une équipe qui s'intéresse à la physiologie cardiovasculaire, et dont l'un des axes de recherche consiste à mieux caractériser et comprendre les propriétés et les fonctions d'un type cellulaire particulier, les fibroblastes cardiaques. Mon projet de thèse s'est intégré dans cette thématique, et a plus précisément consisté à approfondir les connaissances des caractéristiques électrophysiologiques de ces cellules et leur impact sur la fonction fibroblastique.
Ma thèse ayant pour modèle d'étude les fibroblastes cardiaques, nous allons dans un premier temps décrire brièvement les propriétés structurales et fonctionnelles du cœur afin de présenter le fibroblaste dans son environnement tissulaire.
Les caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles des fibroblastes cardiaques décrites dans la deuxième partie de cette introduction permettront de révéler ces cellules en tant qu'acteurs du fonctionnement du cœur en condition physiologique mais également au cours de son remodelage physiopathologique.
Au cours de ma thèse, une partie de mes travaux a consisté à évaluer les propriétés de la sphingosine-1-phosphate (S1P), un sphingolipide possédant des effets cardioprotecteurs en tant que modulateur potentiel des propriétés électrophysiologiques et fonctionnelles des fibroblastes. La troisième partie de cette introduction nous permettra de présenter les caractéristiques et propriétés de la S1P et de ses récepteurs ainsi que ses effets dans les principaux types cellulaires cardiaques et à l'échelle du cœur.
INTRODUCTION
A Le Cœur
Le cœur est un organe musculaire creux qui assure la propulsion du sang dans le système circulatoire afin de le distribuer dans l’ensemble de l’organisme. Contrairement au système rénal, aux poumons ou au cerveau dont l'activité au cours de la vie utérine a une importance non vitale, le cœur dès l'apparition des premières ébauches embryonnaires, joue un rôle indispensable dans le développement du fœtus.
I Anatomie et structure
Le cœur est composé de deux oreillettes dans la partie supérieure et deux ventricules dans la partie inférieure (figure I-1).
Figure I-1 : Anatomie macroscopique de la face antérieure du cœur entier
D’après Marieb et Branstom, 1996
Les deux oreillettes et les deux ventricules sont séparés respectivement par le septum inter-auriculaire et par le septum inter-ventriculaire. Entre les oreillettes et les ventricules se trouvent les valves atrio-ventriculaires dont le rôle est de permettre au sang de circuler à sens
Veine cave supérieure Artère coronaire droite Oreillette droite Ventricule droit Veine cave inférieure Aorte Artère pulmonaire Artère coronaire antérieure interventriculairee Veine cardiaque principale Ventricule gauche Veine cave supérieure Artère coronaire droite Oreillette droite Ventricule droit Veine cave inférieure Aorte Artère pulmonaire Artère coronaire antérieure interventriculairee Veine cardiaque principale Ventricule gauche
unique dans le cœur. Ces valves sont insérées sur la paroi du ventricule correspondant par des cordages attachés à des protubérances musculaires appelées piliers ou muscles papillaires.
L'oreillette et le ventricule droit constituent le « coeur droit ». L'oreillette droite est séparée du ventricule droit par la valve atrio-ventriculaire droite nommée valve tricuspide. Cette valve est formée d'un anneau et de trois valvules, inférieure, antérieure et interne.
L'oreillette et le ventricule gauche constituent le « cœur gauche ». L'oreillette gauche présente les orifices des quatre veines pulmonaires et est séparée du ventricule gauche par la valve atrio-ventriculaire gauche nommée valve mitrale. Cette valve est composée par l’anneau mitral et deux valvules mitrales, interne et externe.
La paroi du cœur est constituée de trois tuniques comprenant de l’extérieur vers l’intérieur, le péricarde qui est une tunique séreuse, le myocarde qui compose la tunique musculaire, et enfin l’endocarde formant une muqueuse (figure I-2).
Figure I-2 : Les tuniques de la paroi du cœur
Marieb et al, 1999
Le péricarde est une double enveloppe qui entoure le cœur. L'enveloppe externe fibreuse est le péricarde fibreux et est bordée à sa face intérieure par une séreuse, le péricarde pariétal. Le péricarde viscéral ou épicarde est une seconde couche séreuse qui constitue en partie la paroi cardiaque et qui est formée de cellules mésothéliales et d’un tissu conjonctif constitué de fibroblastes et de cellules adipeuses qui rendent la texture de la face externe du cœur lisse et glissante. Un liquide séreux remplit l'espace péricardique entre ces deux couches pour lubrifier et diminuer les forces de frottement lors de la contraction cardiaque.
La couche moyenne du cœur est constituée d'un tissu musculaire spécialisé appelé myocarde qui correspond à la partie véritablement active du cœur. Elle est formée de cellules musculaires striées organisées en réseau où les jonctions intercellulaires constituent les stries scalariformes. Ces fibres musculaires forment des faisceaux entrelacés qui entourent en
spirale les cavités cardiaques. Le myocarde représente l’essentiel de la masse du cœur et est à l’origine de son action de pompe.
L’endocarde est composé d’un endothélium reposant sur une couche de tissu conjonctif formé de fibroblastes, de collagènes et de fibres élastiques. C’est un tissu très fin qui tapisse l’ensemble des cavités cardiaques, des valves et des parois des vaisseaux du cœur. C'est un tissu lisse et brillant qui permet le passage du sang avec peu de turbulences et qui sert de protection aux parois des vaisseaux.
II Fonctions et propriétés
1 Au cœur de la circulation sanguine
Le cœur, véritable pompe de l’appareil cardiovasculaire, va assurer la propulsion du sang dans la circulation sanguine de tout l’organisme. Le cœur droit permet la circulation pulmonaire et reçoit le sang veineux désaturé en oxygène en provenance de l’ensemble des tissus de l’organisme à l’exception des poumons. Le sang pénètre dans l'oreillette droite par les veines caves supérieure et inférieure et l'orifice du sinus coronaire. Le ventricule droit va éjecter le sang dans l'artère pulmonaire. Au niveau des capillaires pulmonaires, le sang s’enrichit en oxygène et se débarrasse du gaz carbonique récupéré auprès des tissus métaboliquement actifs grâce à des échanges de gaz avec l'air contenu dans les alvéoles pulmonaires. La circulation systémique est assurée quant à elle par le cœur gauche qui va recueillir le sang riche en oxygène sortant des poumons par les veines pulmonaires pour l’acheminer vers tous les autres organes par l’intermédiaire de l’aorte, première artère à la sortie du ventricule gauche.
Cette fonction se fait grâce à une structure anatomique efficace où les cavités du cœur communiquent par des orifices comprenant les valves antireflux, un système d’excitation automatique et de mécanique contractile.
2 Mécanique du cœur
L’une des caractéristiques fondamentales du cœur est sa propriété d’autorythmicité. L‘automatisme cardiaque et la coordination de la contraction du cœur entre les quatre cavités sont dus à des cellules myocardiques particulières, les cellules nodales et les tissus
conducteurs. Les cellules nodales produisent à intervalles réguliers et spontanément un signal électrique à l’origine du potentiel d’action qui en se propageant de cellules en cellules va entraîner la contraction du cœur. Les tissus conducteurs acheminent cette onde d’excitation au travers des différentes structures cardiaques et conditionnent la séquence de contraction des oreillettes puis des ventricules.
Une présentation générale des principes fondamentaux du fonctionnement cardiaque me permettra de définir le contexte dans lequel s'inscrit mon travail.
a Automatisme et conduction cardiaque
Le tissu nodal constitue le support de l’automatisme cardiaque. Ces cellules produisent spontanément des potentiels d’action, ce qui entraîne la dépolarisation et la contraction des cardiomyocytes. Au niveau macroscopique, le tissu nodal est formé de deux amas de cellules qui sont le nœud sinusal (ou nœud de Keith et Flack) situé dans la paroi postérieure de l’oreillette droite, contre le septum inter-auriculaire et le nœud atrio-ventriculaire (ou nœud de Tawara) qui se trouve dans la partie supérieure de la cloison inter-ventriculaire. Les cellules du nœud atrio-ventriculaire se prolongent par des fibres qui constituent le faisceau de His qui se divise en deux branches distinctes, une pour chaque ventricule dans lequel elles se ramifient en un réseau dit de fibres de Purkinje (figure I-3).
Figure I-3 : Système de conduction du cœur
D’après Marieb et Branstom, 1996
Ventricule droit Oreillette droite Nœud sino-atrial Nœud atrio-ventriculaire Oreillette gauche Fibres de Purkinje Branche du faisceau de His Ventricule gauche Ventricule droit Oreillette droite Nœud sino-atrial Nœud atrio-ventriculaire Oreillette gauche Fibres de Purkinje Branche du faisceau de His Ventricule gauche
Ces cellules nodales, après avoir atteint leur potentiel maximal diastolique, initient une phase de dépolarisation lente jusqu’à ce que le potentiel de membrane atteigne le seuil de déclenchement d’un potentiel d’action. La propagation de ces potentiels d’action de cellule à cellule va permettre les contractions rythmiques du cœur.
Les canaux ioniques responsables de l’activité électrique du cœur étant nombreux et ne faisant pas l’objet de mon étude, leur description ne sera pas traitée. Je me limiterai à une description générale du fonctionnement du cœur afin de replacer mon travail dans un contexte physiologique de base.
Le processus physiologique de stimulation du cœur naît dans le nœud sinusal avec une fréquence de décharge d’environ 75 fois par minute chez l’homme. Sa fréquence étant plus élevée que celle des autres éléments automatiques du cœur, c’est le nœud sinusal qui impose le rythme de toutes les cellules contractiles cardiaques. Ce rythme défini comme étant le rythme sinusal détermine la fréquence cardiaque dans les situations physiologiques. A partir du nœud sinusal, l’excitation se propage le long des oreillettes par les jonctions communicantes ou canaux jonctionnels, jusqu’au nœud atrio-ventriculaire où l’influx est retardé d’environ 100 ms ce qui permet aux oreillettes de terminer leur contraction avant le début de la contraction ventriculaire. La stimulation est ensuite relayée dans le faisceau de His qui constitue le seul lien électrique entre les oreillettes et les ventricules puis traverse les branches de Tawara et le faisceau de purkinje avant de parcourir le septum interventriculaire jusqu’à l’apex du cœur. La contraction du ventricule a lieu environ 200 ms après celle des oreillettes étant donné le temps de propagation de l’onde de dépolarisation. Après chaque excitation les cellules cardiaques présentent une période réfractaire qui correspond au temps nécessaire pour pouvoir répondre à une nouvelle stimulation.
b Couplage excitation-contraction
La transmission du potentiel d’action le long du sarcolemme de chaque cellule va provoquer un raccourcissement du sarcomère à l'origine de la contraction. Lors de la dépolarisation membranaire se produit un influx calcique depuis le milieu extracellulaire vers le cytoplasme via les canaux calciques dépendant du potentiel de type L. Cette entrée d’ions va alors permettre la libération de calcium de stocks intracellulaires en activant des récepteurs à la ryanodine présents à la surface du réticulum sarcoplasmique. Ce mécanisme est connu
sous le nom de « calcium-induced calcium release ». Les ions Ca2+ vont alors se lier à la troponine C et générer un changement de conformation du complexe troponine-tropomyosine. Les sites actifs d’actine ainsi libérés, vont activer l’ATPase des têtes de myosine et permettre une libération d’énergie nécessaire au glissement des myofilaments de myosine par rapport au myofilaments d’actine. La réduction de la longueur des sarcomères au sein des cardiomyocytes associée à leur synchronisation génère une contraction (Bers, 2002) (figure I-4).
Figure I-4 : Couplage excitation-contraction
D’après (Bers, 2002)
III Les différents types cellulaires présents dans le cœur
Le myocarde est composé de cellules myocytaires et non-myocytaires dont la cohésion est assurée par un squelette fibreux formé par la matrice extracellulaire (MEC) (figure I-5). L’organisation et la proportion de chaque type cellulaire ainsi que les interactions entre chaque composant vont influer sur le développement et la fonction du cœur. Les cardiomyocytes, à la base de l’activité contractile du cœur, occupent environ 75 % du volume myocardique, mais ils représentent en nombre seulement 20 % des cellules cardiaques. La majorité des autres cellules sont des cellules dites non-myocytaires, parmi lesquelles on
distingue les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses et les fibroblastes (Baudino et al., 2006).
Figure I-5 : Représentation schématique des interactions entre les différents types cellulaires du cœur et la MEC
D’après Baudino et al, 2006
Les fibroblastes représentent à eux seuls 70 % des cellules cardiaques, et jouent un rôle clef dans la régulation du fonctionnement du cœur normal et au cours du remodelage cardiaque observé lors des pathologies du cœur (Baudino et al., 2006).
1 Les cellules myocytaires
a Les cardiomyocytes
Les cardiomyocytes isolés ont une forme grossièrement cylindrique d’environ 100 µm de long et 10 µm de large avec un noyau central (figure I-6). Chaque fibre musculaire est composée de plusieurs cellules myocardiques soudées les unes aux autres par des disques intercalaires formant un véritable syncytium fonctionnel. Ces disques contiennent des desmosomes qui favorisent la cohésion intercellulaire et des jonctions communicantes qui permettent aux cytoplasmes des cellules adjacentes de communiquer les uns avec les autres et d’assurer un continuum électrique tout le long de la fibre musculaire.
Cellule musculaire lisse
Artère Cellule endothéliale Lumière du capillaire Péricytes Fibroblastes Myocyte Capillaire Membrane basale Mastocyte
Récepteur du collagène DDR2, intégrines Récepteur de surface, cadhèrines, connexines
Cellule musculaire lisse
Artère Cellule endothéliale Lumière du capillaire Péricytes Fibroblastes Myocyte Capillaire Membrane basale Mastocyte
Récepteur du collagène DDR2, intégrines Récepteur de surface, cadhèrines, connexines
Figure I-6 : Microphotographie d’un cardiomyocyte en microscopie électronique
Extrait de http://www.bu.edu/histology/p/22501loa.htm
Comme déjà mentionné dans le paragraphe excitation-contraction, les cardiomyocytes sont à la base de l’activité contractile du cœur et assurent le travail mécanique du cœur. On distingue par observation microscopique une succéssion de bandes claires et sombres correspondant à l’enchevètrement des filaments fins et épais. Le myofilament fin est composé d'actine enroulée autour d'une protéine fibrillaire, la tropomyosine et du complexe de troponines dont la troponine C qui fixe le calcium. Le myofilament épais est composé principalement de myosine. C’est le glissement des deux filaments l'un par rapport à l'autre qui va assurer le raccourcissement des sarcomères et donc la contraction.
b Les cellules nodales
Les cellules nodales représentent des cellules de type musculaire mononuclées possédant un noyau central et un cytoplasme relativement pauvre en myofibrilles disposés en périphérie. Ces cellules se trouvent au niveau du nœud sinusal, du nœud atrio-ventriculaire, des faisceaux de His et des fibres de Purkinje.
Comme nous l’avons vu précédemment, les cellules nodales ont un rôle de pacemaker qui établit le rythme global en condition physiologique, et elles forment le système de conduction spécialisé du cœur en propageant les potentiels d'action dans l'ensemble du muscle cardiaque.
2 Les cellules non-myocytaires : structure et fonction
a Les cellules musculaires lisses
Les cellules musculaires lisses sont des cellules irrégulières en forme de bâtonnet avec habituellement un seul noyau. Elles possèdent une longueur moyenne de 100 µm pour un diamètre de 15 µm. Ces cellules musculaires lisses (CML) sont constitutives de la paroi des vaisseaux sanguins. La paroi du cœur possède ses propres vaisseaux sanguins qui irriguent le myocarde et permettent la circulation du sang dans les profondeurs du muscle cardiaque. Ce réseau vasculaire cardiaque se nomme le réseau coronaire (figure I-7).
Figure I-7 : Réseau coronaire
Marieb et al, 1999
Le cœur est irrigué de l'extérieur vers l'intérieur par les artères coronaires qui naissent de l'aorte dans le creux des valves aortiques sigmoïdes antérieures. La coronaire droite se distribue au ventricule droit et à la face postérieure du cœur La coronaire gauche après un tronc commun court se divise en artère circonflexe et interventriculaire antérieure qui irrigue la plus grande partie du myocarde. Les artères épicardiques se trouvent à la surface du cœur et donnent naissance aux artères intramyocardiques qui plongent dans l'épaisseur du muscle. Les veines coronaires se jettent dans le sinus coronaire qui s'ouvre dans l'oreillette droite.
Les vaisseaux sanguins sont formés généralement de trois tuniques distinctes et qui sont de l’extérieur vers l’intérieur l’intima, la média et l’adventice. Les CMLs vasculaires se trouvent essentiellement dans la media dont la proportion et l'organisation varient en fonction des vaisseaux. Les artères élastiques comme l'aorte et ses branches principales correspondent
aux vaisseaux de grand diamètre. Leur média est constituée de plusieurs lames élastiques concentriques entre lesquelles on trouve des CML particulières appelées cellules rameuses. Les artères coronaires possèdent des CMLs entre l'intima et la média.
Les CMLs par leur contraction et relaxation vont moduler le diamètre des vaisseaux afin de réguler le débit sanguin et la pression artérielle.
b Les cellules endothéliales
Ce sont des cellules polygonales d’environ 1 µm d’épaisseur et 20 µm de largeur avec un noyau. Elles reposent en général sur une membrane basale et sont unies entre elles par des desmosomes et des jonctions serrées. Les cellules endothéliales recouvrent l’intérieur des vaisseaux sanguins (intima) et des cavités cardiaques. Ce sont les principales cellules de l’endocarde qui forment un revêtement lisse pour les cavités du cœur et qui recouvrent les valves cardiaques.
Elles jouent un rôle essentiel dans le contrôle du tonus vasculaire. Le principal messager vasodilatateur produit par la cellule endothéliale est le monoxyde d’azote (NO). En condition basale la cellule produit peu de NO. Néanmoins des facteurs tels que la force de frottement du sang sur les parois des vaisseaux (force de cisaillement) augmentent sa synthèse. L’augmentation de la vitesse du sang accroît la force de cisaillement. Ceci va stimuler la production du NO, entraîner une relaxation des CML qui provoque une augmentation du diamètre du vaisseau et normalise la force de cisaillement.
Ces cellules jouent également un rôle dans l’hémostase. En effet les cellules endothéliales sont douées de propriétés anti-thrombotiques et anti-plaquettaires pour empêcher la formation de caillots et permettre la circulation du sang. Ces cellules inhibent l'agrégation plaquettaire par la sécrétion de la prostacycline PGI2 qui est un puissant agent inhibiteur de l'agrégation plaquettaire, vasodilatateur et anti-thrombotique. La cellule endothéliale exprime également à sa membrane la thrombomoduline qui s'oppose à la formation de thrombine.
c Les fibroblastes
Comme nous l’avons déjà mentionné, les fibroblastes représentent quantitativement la population cellulaire majoritaire dans le cœur. Ces cellules jouent un rôle de soutien et contribuent aux propriétés structurales, biochimiques, mécaniques et électriques du cœur. L’essentiel des études concernant le fonctionnement cardiaque se focalisant sur les
cardiomyocytes, les fibroblastes et leur rôle dans la physiologie cardiaque ont fait comparativement l’objet de peu d’études dans la littérature. Néanmoins, la mise en évidence de leur rôle dans le fonctionnement du cœur normal et durant le remodelage cardiaque a généré un intérêt grandissant pour ce type cellulaire depuis une dizaine d’années. Les fibroblastes cardiaques étant notre modèle d’étude biologique, leurs propriétés structurales et fonctionnelles en condition normale mais également au cours de pathologies cardiaques font l’objet de la partie suivante qui lui est totalement consacrée.
B Les fibroblastes
I Fibroblastes cardiaques : propriétés cellulaires
Dans un premier, temps afin de mieux comprendre le rôle de ces cellules dans la fonction du cœur en condition physiologique et au cours du remodelage cardiaque, nous allons nous intéresser aux caractéristiques cellulaires des fibroblastes cardiaques en abordant leurs propriétés structurales, électrophysiologiques et mécaniques.
1 Propriétés structurales
a Origine
Ces cellules sont issues de cellules souches mésenchymateuses provenant du pro-épicarde qui sont également à l'origine des chondroblastes, des adipoblastes, des ostéoblastes et des myoblastes (Perez-Pomares et al., 2002) ; (Moorman and Christoffels, 2003). Ces cellules mésenchymateuses vont donner les cellules dérivées de l’épicarde (EPDC) qui vont alors acquérir les caractéristiques phénotypiques des fibroblastes sous la régulation d’un ensemble de facteurs de croissance dont le « platelet derived growth factor » (PDGF) et le « fibroblast growth factor » (FGF) (Kalluri and Neilson, 2003) ; (Perez-Pomares et al., 2002).
Au cours du développement cardiaque, le nombre de fibroblastes augmente. En effet des études ont montré que l’épaisseur de la paroi ventriculaire du cœur de nouveau-né augmente pour s’adapter à une élévation de la pression systolique par multiplication du
nombre de fibroblastes cardiaques et par stimulation de la synthèse de fibres de collagène qui vont permettre la cohésion entre les fibroblastes et les cardiomyocytes (Borg et al., 1984).
b Structure et organisation
Sur le plan structurel, les fibroblastes ont un corps cellulaire fusiforme ou étoilé avec de longs prolongements cytoplasmiques. Ces cellules ont un noyau ovoïde et allongé avec un ou deux nucléoles et un cytoplasme peu visible avec un réticulum endoplasmique rugueux et un appareil de golgi étendus (figure I-8).
Figure I-8 : Microphotographie d’un fibroblaste en microscopie électronique
Extrait de http://www.bu.edu/histology/p/20801ooa.html
En condition pathologique, les fibroblastes peuvent se différencier en myofibroblastes, cellules intermédiaires entre les fibroblastes et les cellules musculaires lisses. A l'exception des valves cardiaques, ces cellules sont absentes du cœur sain (Sun and Weber, 2000). L'origine de ces cellules est controversée. Elles proviendraient soit des fibroblastes interstitiels et adventitiels soit des cellules de la moelle osseuse (Powell et al., 1999b). Cependant, au niveau du cœur, une étude a montré que les cellules souches de la moelle osseuse se différencient en fibroblastes et que les myofibroblastes apparaissant après l'infarctus sont issus des fibroblastes endogènes (Yano et al., 2005).
2 Propriétés électrophysiologiques
Les fibroblastes suite à une stimulation électrique ne génèrent pas de potentiel d’action et sont donc considérés comme des cellules non-excitables. Cependant, des études récentes ont montré que la modification des propriétés électrophysiologiques des fibroblastes pouvait affecter les propriétés de conduction de réseaux cellulaires contenant des cardiomyocytes (Feld et al., 2002). Outre leur effet sur les propriétés de conduction de préparations cellulaires hétérogènes, l'impact potentiel de l'électrophysiologie des fibroblastes sur l’excitabilité cardiaque fait l’objet de plus en plus d'études. L'ensemble de ces travaux est développé et discuté dans le chapitre suivant.
a Les canaux potassiques
L'expression et la fonctionnalité de canaux potassiques a été caractérisées dans les fibroblastes cardiaques. Walsh et collaborateurs en 2008 ont ainsi montré par la technique de patch-clamp en configuration entière, la présence de canaux potassiques dépendants du potentiel dans les fibroblastes ventriculaires de rats nouveau-nés (Walsh and Zhang, 2008). Environ 60 % des fibroblastes expriment un courant potassique transitoire sortant (Ito pour « transient outward current »). Ce courant est inhibé d'environ 70 % par 100 µM de flecainide, et 50 % par 1 mM de BaCl2. Il est également diminué d'environ 30 % par la stimulation de la protéine kinase C alors que la stimulation de la protéine kinase A n'a pas d'effet. Lexpression de la sous-unité Kv1.4, a été révélée dans cette étude et pourrait être à l’origine de ce courant transitoire.
D’autres études ont également mis en évidence dans des fibroblastes ventriculaires de rat adulte, l’expression et la fonctionnalité de conductances potassiques dépendants du voltage (Kv) et de type rectifiant entrant (Kir) (Chilton et al., 2005;Shibukawa et al., 2005). Des analyses par RT-PCR et PCR quantitative ont permis de révéler parmi les sous-unités Kv1.x, une forte expression du gène codant Kv1.6 dans les fibroblastes et une expression plus faible des gènes codant Kv1.1, Kv1.2 et Kv1.5. Pour les gènes codant les sous-unités Kir, seuls ceux codant les sous-unités Kir2.1 et Kir6.1 sont présents. D'après ces résultats, les sous-unités Kv1.6 et Kir2.1 pourraient être à l'origine respectivement des courants potassiques sensibles au potentiel et rectifiants enregistrés dans les fibroblastes. Chilton et collaborateurs ont également observé que des variations de la concentration extracellulaire en potassium vont influer sur certaines fonctions physiologiques des fibroblastes : une diminution de la
concentration extracellulaire en potassium stimule la prolifération alors qu'une augmentation la ralentit. Ainsi la modulation de l'activité des canaux potassiques peut influer sur la prolifération des fibroblastes cardiaques.
Des études portant sur les caractéristiques électrophysiologiques des fibroblastes cardiaques humains ont révélé la présence d'une conductance potassique sensible au calcium (BKCa). Cette conductance est inhibée par 200 nM d'iberiotoxine et 1 µM de paxilline mais n'est pas sensible à 10 µM de glibenclamide et à 200 nM d'apamine. La conductance unitaire de ce canal est de 162 pS. De plus l'activité du canal enregistrée en configuration cellule attachée est augmentée par 10 µM de ionomycine, un ionophore calcique. L'expression de la sous unité α du canal potassique sensible au calcium (BKCa) a été confirmée par western blot (Wang et al., 2007).
b Les canaux cationiques non sélectifs
Une conductance cationique non sélective activée par des peptides natriurétiques de type C (CNP) a été enregistrée dans des fibroblastes ventriculaires de rat (Rose et al., 2007). L'activation de ce courant est liée au récepteur de type C et dépend de l'activation de la phospholipase C. Ce courant est inhibé par le gadolinium, le SKF96365 et le 2-APB dont l'application est également connue pour inhiber des canaux cationiques de type TRP (transient receptor potential). L'expression de gènes codant des canaux TRP dans les fibroblastes cardiaques a été évaluée par RT-PCR et a révélé la présence de TRPC2, TRPC3, TRPC5, TRPV2, TRPV6, TRPM4, TRPM7 (Rose et al., 2007).
Des études menées par Kamkin et collaborateurs en 2003 ont également révélé la présence de canaux mécano-sensibles portés par une conductance cationique non sélective, lors de la mise en évidence de variations de potentiel de membrane de fibroblastes atriaux de rats soumis à des stimulations mécaniques. Ces travaux ont montré que la compression des fibroblastes va entraîner leur dépolarisation par l'activation d'une conductance cationique non sélective alors que l’étirement mécanique va entraîner leur hyperpolarisation probablement par la diminution de la conductance activée par la compression (Kamkin et al., 2003a;Kiseleva et al., 1996). Ces variations de potentiel membranaire décrites dans les fibroblastes cardiaques sont nommées « mechanically induced potentials » (MIPs) et sont impliquées dans le processus de feedback mécano-électrique décrit dans le paragraphe « propriétés mécaniques des fibroblastes ».
c Les canaux protons
Au sein de notre équipe, El Chemaly et collaborateurs en 2006 ont enregistré l'activité de canaux protons dépendants du potentiel dans des fibroblastes atriaux humains. Ces canaux très sensibles aux variations de pH entre le milieu intra et extracellulaire, s'activent lentement lors de la dépolarisation. Le courant est caractérisé par une phase d'activation transitoire rapide suivi d'un plateau. L'amplitude du courant transitoire sortant est d'autant plus grande que la différence entre le pHi et le pHe est élevée (El Chemaly et al., 2006).
Ces travaux montrent également une implication de ces canaux dans le contrôle du potentiel membranaire des fibroblastes cardiaques. Ces canaux protons permettraient de protéger les fibroblastes cardiaques de l'acidité intracellulaire notamment lors de phénomène d'ischémie-reperfusion en permettant l'extrusion des protons intracellulaires.
Ces quelques données des propriétés électrophysiologiques des fibroblastes nécessitent d’être approfondies afin de mieux comprendre leur rôle sur les propriétés fonctionnelles des fibroblastes. Les fibroblastes étant une source majeure de molécules bioactives, une meilleure caractérisation de leurs propriétés électrophysiologiques permettrait également de mieux comprendre le couplage excitation-sécrétion. L'un de nos objectifs a donc été de développer les connaissances sur ces propriétés électrophysiologiques et leur impact sur la fonction des fibroblastes dans le fonctionnement cardiaque. Ces travaux seront détaillés dans la partie « résultats ».
3 Propriétés mécaniques
Le tissu cardiaque est constamment soumis à des étirements et tensions mécaniques, transmis aux fibroblastes cardiaques par l’intermédiaire de la matrice extracellulaire (MEC). Les fibroblastes sont sensibles à ces signaux par l'intermédiaire de plusieurs facteurs comprenant les canaux ioniques mécano-sensibles, que nous venons de décrire et les intégrines qui sont à la fois des molécules assurant l'adhésion cellulaire à la MEC et des récepteurs permettant la transduction de signaux. Les changements mécaniques vont alors déclencher dans les fibroblastes cardiaques plusieurs voies de signalisation dont les MAPK, la PI3kinase et la voie JAK/STAT (Aota and Yamada, 1997) ; (Ingber, 2002) qui vont influer sur la structure et la fonction de ces cellules, (MacKenna et al., 2000) et stimuler l’expression
de certains gènes dont ceux codant les facteurs de transcription c-fos et fra1 (van Wamel et al., 2000).
L’effet des modifications mécaniques sur la signalisation et la fonction des fibroblastes ont fait l’objet de nombreuses études dans la littérature. Par exemple, Chiquet et collaborateurs ont observé que dans les fibroblastes cardiaques, les tensions répétées activent les protéines Rho ainsi que leur effecteur ROCK impliqué dans l'assemblage de l’actine. La voie RhoA/ROCK ainsi que la dynamique de l'actine semble donc être impliquée dans l'induction de l'expression de gènes spécifiques des composants de la MEC lors d'une stimulation mécanique (Sarasa-Renedo and Chiquet, 2005) ; (Chiquet et al., 2007) ; (Chiquet et al., 2009). Par ailleurs, l’étirement mécanique augmente le ratio de l'expression du collagène III par rapport au collagène I dans des fibroblastes cardiaques de rats ainsi que le taux d' ARNm du collagène III après douze heures de stimulation mécanique (Carver et al., 1991). L'étirement mécanique peut également stimuler la transcription du procollagène α1 ainsi qu'une sécrétion du TGF-β. L'inhibition par un antagoniste de TGF-β entraîne un blocage de la stimulation du promoteur du procollagène α1 par l’étirement mécanique, ce qui montre que l'augmentation de l'expression du procollagène α1 est dépendante de TGF β lors de la stimulation mécanique (Lindahl et al., 2002).
Papakrivopoulou et collaborateurs en 2004 se sont aussi intéressés aux voies de signalisation impliquées dans la stimulation de l'expression du gène codant le procollagène α1 lors de stimulation mécanique. Des pics de phosphorylation des protéines ERK 1/2, p38kinases et p46/54 sont observés 10 à 20 min après une application constante de tension mécanique. Au bout de vingt quatre heures de stimulation mécanique, l'expression du gène codant le procollagène α1 est augmentée de deux fois. Ces travaux suggèrent que l'augmentation de l'expression du procollagène α1 nécessite l'activation de ERK 1/2, alors que la voie p38MAPK régule négativement l'expression de ce gène dans les fibroblastes cardiaques. Ces voies semblent donc être essentielles dans la régulation de la synthèse de la MEC induite par les tensions mécaniques (Papakrivopoulou et al., 2004).
De nombreux travaux montrent par ailleurs que les fibroblastes peuvent répondre aux variations mécaniques par des modifications électriques. Comme nous l'avons décrit précédemment, les fibroblastes vont répondre aux contractions spontanées du myocarde par des changements de leur potentiel membranaire et agir en tant que transmetteurs de signaux mécano-électriques. Ce phénomène nommé « mechanically induced potentials (MIP) » est impliqué dans le mécanisme du feedback mécano-électrique. Ce mécanisme permettrait
d'ajuster la fréquence des contractions cardiaques aux variations de pression subies par les parois cardiaques. En condition pathologique, le feedback mécano-électrique serait un stimulateur mécanique des arythmies cardiaques (Kohl et al., 1999). Le procédé entraînant la modulation de l'activité pacemaker des cellules cardiaques suite aux variations du potentiel membranaire des fibroblastes reste peu connu, mais pourrait impliquer un couplage via les jonctions gap entre les fibroblastes et les cellules sinusales (Kamkin et al., 2003b). Plusieurs hypothèses permettraient d'expliquer l'activation par les compressions mécaniques de canaux ioniques dans les fibroblastes atriaux. Les modifications mécaniques pourraient être transmises par des changements de tension de leur membrane (Sachs and Morris, 1998); (Zhang et al., 2000). Le cytosquelette pourrait également être impliqué dans la conduction du stress mécanique jusqu’aux canaux ioniques. En effet, lors de la dépolymérisation du réseau d'actine par la cytochalasin D, une diminution de l'amplitude des MIPs est observée dans les fibroblastes cardiaques (Kamkin et al., 2003c). Cet effet est contrecarré par l'application intracellulaire du Mg-ATP qui stimule la polymérisation d'actine (Chhabra et al., 2000) suggérant un rôle du cytosquelette dans la transmission de ces signaux mécano-électriques.
II Fibroblastes cardiaques : au cœur du fonctionnement du cœur
En condition physiologique, les fibroblastes cardiaques ont un rôle central dans le fonctionnement du cœur normal qui est régulée par des interactions dynamiques et coordonnées avec les autres types cellulaires. Ces fibroblastes sont en effet une source importante de molécules bioactives et des composants de la MEC qui constituent les éléments à la base de la transmission des signaux mécaniques, chimiques et électriques entre les différents types cellulaires.
1 Le renouvellement de la MEC
Les fibroblastes contrôlent l’homéostasie de la MEC par la sécrétion de métalloprotéinases (MMP) qui assurent un équilibre entre synthèse et dégradation de ses composants. Nous verrons dans l’analyse des phénomènes de remodelage comment les facteurs sécrétés par les fibroblastes contribuent à la modulation du renouvellement de la
MEC. Auparavant, il convient de mettre en place les acteurs de ces processus, à savoir la MEC et les MMPs.
a La matrice extra-cellulaire (MEC)
La MEC est un réseau dynamique qui assure la cohésion tissulaire et la communication intercellulaire au sein du myocarde. Elle est principalement composée d’une matrice organique appelée substance fondamentale composé de glycosaminoglycanes au sein de laquelle sont enchâssées différentes protéines structurelles comme le collagène et des glycoprotéines comme la laminine et la fibronectine (figure I-9). Les fibroblastes synthétisent principalement le collagène de type I et III et la fibronectine. Le collagène de type IV et VI, la laminine et les protéoglycanes sont surtout produits par les cardiomyocytes.
Figure I-9 : Structure de la MEC
Modifié d’après http://herkules.oulu.fr
La substance fondamentale est un milieu transparent ayant les propriétés d’un gel semi-fluide formant une zone d’échange de métabolites avec le système circulatoire. Cette substance est formée de glycosaminoglycanes qui sont de longues chaînes polysaccharidiques non ramifiées, rigides et étirées. Elles peuvent s’associer avec des protéines pour former les
protéoglycanes qui à leur tour s’assemblent en édifices complexes encore plus volumineux. Ces structures sont liées au collagène et servent au maintien de l’intégrité et de l'architecture de la MEC. Les protéoglycanes représentent environ 10% du poids et 75% du volume de la MEC. Elles sont très hydratées, ce qui permet de faciliter le transport des molécules hydrophiles et la migration des cellules.
Les propriétés mécaniques de la substance fondamentale sont renforcées par les fibres de collagène qui est une glycoprotéine composée de trois chaînes en forme de super-hélice. Le cœur adulte comprend cinq types de collagène (I, III, IV, V, VI). Le collagène de type I et III représente respectivement 80 % et 10 % du collagène total. Le collagène s’associe en fibrilles qui eux-mêmes vont former des molécules plus grosses pour soutenir la structure du tissu musculaire cardiaque et assurer une résistance à la tension tissulaire. Le collagène permet la transmission de force au sein du myocarde et assure la structure tridimensionnelle du tissu lors du cycle relaxation-contraction.
Les glycoprotéines structurales sont des molécules formées essentiellement de chaînes protéiques reliées aux polysaccharides ramifiés. Elles comprennent des molécules formant des fibrilles dont la fibronectine et des protéines non filamenteuses dont la laminine qui sert de lien entre la MEC et le cytosquelette. La fibronectine est une glycoprotéine à deux chaînes reliées à leur extrémité C terminale par deux ponts disulfures. Cette glycoprotéine possède des sites de liaison avec le collagène, les protéoglycanes et la membrane basale des fibroblastes via les intégrines. Elles sont impliquées dans le développement embryonnaire et ont également un rôle dans l’organisation de la MEC en contrôlant la disposition et l’orientation du collagène, et contribuent à la fixation et à l’adhérence du cytosquelette des cellules à la MEC. La laminine est un composé majeur des membranes basales des cardiomyocytes formé par l'association de trois chaînes. Elles assurent des jonctions entre la membrane cellulaire et les autres éléments de la membrane basale en s‘accrochant à des molécules d’adhésion spécifiques.
b Les MMPs
L'organisation de la MEC résulte d'un équilibre entre la synthèse et la dégradation des protéines constitutives de la MEC. Cette dégradation des composants de la MEC nécessite l'expression et l'activité d'enzymes protéolytiques, les « matrix métalloprotéinases » (MMPs) (Raffetto and Khalil, 2008). Les MMPs forment une famille d'endoprotéinases contenant un
motif capable de lier le zinc. L'activité des MMPs est inhibée par des inhibiteurs spécifiques les « tissue inhibitors of metalloprotéinases » (TIMPs). Actuellement environ vingt familles de MMPs sont identifiées. Elles sont toutes sécrétées sous forme latente et nécessitent un clivage de leur domaine propeptidique par des serines protéases pour acquérir leur activité protéolytique. Les fibroblastes cardiaques expriment les MMP-1 et MMP-13 ou collagénases qui clivent le collagène fibrillaire en fragments, les MMP-2 et MMP-9 ou gélatinases qui dégradent la fibronectine et le collagène de type IV, et la MMP-3 ou stromélysines qui dégradent les protéoglycanes, la laminine et la fibronectine. Un ensemble de facteurs chimiques, physiques et environnementaux régule l'expression de ces MMPs en induisant l'expression de leur gène ou en activant la forme latente de la proenzyme. La MMP-2 est constitutivement sécrétée par les fibroblastes cardiaques (Siwik et al., 2001) ; (Husse et al., 2007) ; (Guo and Piacentini, 2003). L'expression de MMP-9 par les fibroblastes est faible en conditions physiologiques (Brown et al., 2007) ; (Porter et al., 2004b).
2 Les voies de communication entre les fibroblastes et l’environnement.
a Les récepteurs exprimés par les fibroblastes
Le fibroblaste possède une multitude de récepteurs qui sont à l'origine de sa très grande réactivité. Parmi ces récepteurs, on trouve :
- les récepteurs pour les cytokines notamment les récepteurs de type I et II du TNF-α (tumor necrosis factor-α) et de type I et II du TGF-β (Transforming growth factor-β) (Porter et al., 2004a), le récepteur à l’IL-1 (interleukine-1) et le complexe hétérodimérique gp130/IL-6R permettant la fixation de l’IL-6 (interleukine-6) (Tsuruda et al., 2002) ; (Fredj et al., 2005a). - les récepteurs de type 1 et 2 à l'Ag II (angiotensine II) (Anavekar and Solomon, 2005) et de type A et B de l'ET-1 (endothéline 1) avec une prédominance de l'isoforme B (Asano et al., 2002)
- l'isoforme β2 du récepteur adrénergique (Turner et al., 2003) ; (Yin et al., 2003) - les récepteurs à la sérotonine de type 5-HT2A et 5-HT2B (Jaffre et al., 2004)
- les récepteurs à la bradykinine (Villarreal et al., 1998).
- les deux récepteurs de type A et B des peptides natriurétiques (Lin et al., 1995)
- les récepteurs à différents lysophospholipides dont la LPA (lysophosphatidique acide) et la S1P (sphyngosine-1-phosphate). Les récepteurs à la S1P faisant l’objet de notre étude, ils seront décrits dans la dernière partie de cette introduction.
Les stimuli environnementaux vont être intégrés par les fibroblastes via ces récepteurs et influer sur la régulation de la fonction des fibroblastes.
b Les facteurs sécrétés par les fibroblastes
Les fibroblastes sont des cellules sécrétoires qui en plus des composants de la MEC, peuvent synthétiser de nombreux facteurs. Ces facteurs peuvent avoir une action autocrine en influant directement sur les propriétés des fibroblastes telles que la régulation de la synthèse des composants de la MEC mais également la prolifération des fibroblastes (Camelliti et al., 2005). Ils peuvent également avoir un effet paracrine en modifiant les propriétés phénotypiques et fonctionnelles des autres types cellulaires du cœur (Manabe et al., 2002) (figure I-10).
b1 Les cytokines
Dans le cœur, le TNF-α et le TGF-β sont principalement sécrétés par les fibroblastes L'IL-1β a été détectée dans des cultures de fibroblastes de rat et de souris non stimulés tandis que les cultures de fibroblastes humains ne semblent pas en sécréter dans des conditions basales (Ancey et al., 2002) ; (Turner et al., 2007d). Il a également été observé que l'expression constitutive d'une protéine G 13 induit une expression de l'IL-1β par l'activation de la voie ROS/NF-kappaB dans des fibroblastes de rats nouveaux-nés (Nagamatsu et al., 2006). Les cultures de fibroblastes cardiaques humains de rat et de souris secrètent l'IL-6 en conditions basales (Ancey et al., 2002) ; (Fredj et al., 2005a) ; (Turner et al., 2007d) ; (LaFramboise et al., 2007). Les voies de signalisation impliquées dans l'expression du gène codant l'IL-6 sont les voies ERK, p38 MAPK, NF-KappaB et PI3K/Akt (Nagamatsu et al., 2006) ; (Yin et al., 2003) ; (Turner et al., 2007d).
b2 Les peptides vasoactifs et facteurs de croissance
L'Ag II, élément actif du système rénine angiotensine est un puissant vasoconstricteur qui joue un rôle central dans la régulation de la pression artérielle. La rénine va cliver l'angiotensinogène en Ag I qui va à son tour être clivée par l'enzyme de conversion en Ag II. Les fibroblastes cardiaques possèdent l'ensemble des éléments permettant la synthèse de l'Ag II (Sano et al., 1998) ; (Sanghi et al., 2005).
L'ET-1, un peptide vasoconstricteur dérivé de l'endothélium peut également être sécrété par les fibroblastes cardiaques de rats ((Fujisaki et al., 1995) ; (Suzuki et al., 1997).
Son expression peut être stimulée par l'ET-1 lui-même par la voie ROS/ERK/AP-1 (Cheng et al., 2003).
Le VEGF est une glycoprotéine dimérique capable de s'associer à la MEC par des interactions avec des protéoglycanes. Il agit principalement sur les cellules endothéliales vasculaires et joue un rôle important dans l'angiogenèse. Les fibroblastes cardiaques humains (Weiss et al., 2004) ; (Rossini et al., 2008) et de rats (Kelly et al., 2003) expriment le gène codant le VEGF et sont capables de sécréter la protéine mature. Laframboise et collaborateurs en 2007 ont également observé que le VEGF est le facteur de croissance le plus exprimé dans le surnageant de fibroblastes cardiaques de rats (LaFramboise et al., 2007).
Figure I-10 : Principaux facteurs autocrines et paracrines sécrétés par les fibroblastes cardiaques. Les flèches rouges représentent les effets autocrines et les flèches vertes
paracrines
c Communications intercellulaires
c1 Couplage fibroblaste-fibroblaste
Des études immunohistochimiques ont révélé la présence des connexines 43 et 45 sur des cultures de fibroblastes cardiaques de rat et une absence de connexine 40 (Gaudesius et
Cardiomyocyte Fibroblaste PROLIFERATION REGULATION DE LA MEC Cytokines Ag II ET-I Facteur de croissance CMLs Cellule endothéliale Cardiomyocyte Fibroblaste PROLIFERATION REGULATION DE LA MEC Cytokines Ag II ET-I Facteur de croissance CMLs CMLs Cellule endothéliale Cellule endothéliale
al., 2003). L’expression de ces connexines entre fibroblastes peut varier en fonction de l’espèce étudiée. En effet, une expression des connexines 40 et 43 et une absence de la connexine 45 ont été révélées par RT-PCR et Western-Blot sur des cultures de fibroblastes cardiaques de souris. Un couplage fonctionnel, par la technique de gap-frap et de transfert de jaune lucifer, a également été montré sur ces cultures de fibroblastes (Louault et al., 2008).
Des différences d’expression de connexines ont aussi été observées en fonction de la localisation des fibroblastes et du type de tissu. Par exemple, des études in vivo sur le couplage entre fibroblastes du nœud sinusal de lapin ont révélé une présence majoritaire de connexine 40 (Camelliti et al., 2004b). Ces auteurs se sont par ailleurs, intéressés au couplage entre les fibroblastes dans des conditions pathologiques, et ont évalué l'expression de connexines sur des fibroblastes ventriculaires de cœur de mouton infarci. Les fibroblastes expriment les connexines 43 et 45 avec des variations d'expression au cours du temps. La connexine 45 apparaît quelques heures après l'infarctus et son expression augmente pour atteindre un pic au bout d'une semaine, tandis que la connexine 43 apparaît plus tardivement, et atteint son pic d'expression au bout de quatre semaines (Camelliti et al., 2004a).
Afin d'évaluer la fonctionnalité du couplage sur de longues distances entre les fibroblastes, Gaudesius et collaborateurs en 2003 ont évalué la distance de transmission d'une stimulation électrique sur des cultures de fibroblastes. Ils ont observé que la propagation du signal électrique peut se faire sur des distances atteignant 300 µm (Gaudesius et al., 2003).
Les fibroblastes peuvent donc communiquer par l’intermédiaire d’un réseau connecté par des connexines dont la nature peut varier en fonction de l'espèce étudiée, du type et de l'état du tissu.
c2 Couplage fibroblaste-cardiomyocyte
Des immunomarquages spécifiques ont permis de révéler l'expression des connexines 43 et 45 dans des co-cultures de fibroblastes et de cardiomyocytes ventriculaires de rat au niveau de points de connexion entre les deux types cellulaires (Gaudesius et al., 2003). Une communication structurelle et fonctionnelle entre les fibroblastes et les cellules sinusales a également été observée dans le nœud sinusal de lapin. Ce couplage se ferait par l'intermédiaire de la connexine 45 (Camelliti et al., 2004b) ; (Kohl, 2003) ; (Kohl, 2004).
Rook et collaborateurs en 1989 ont été les premiers à observer un couplage électrique entre fibroblastes et cardiomyocytes. Ils ont réalisé des enregistrements unitaires de jonction gap d'une conductance de 29 pS entre des fibroblastes et des cardiomyocytes (Rook et al.,
1989). Cette valeur de conductance est proche de celle établie pour les communications via la Cx 45.
Une autre étude a également suggéré la présence d'un couplage électrique entre les fibroblastes et cardiomyocytes. En effet, Feld et collaborateurs ont observé que la transfection d'un canal potassique dépendant du potentiel de type Kv1.3 dans les fibroblastes entraîne des blocs de conduction dans des co-cultures de fibroblastes et cardiomyocytes (Feld et al., 2002).
Les travaux menés par Rücker-Martin et collaborateurs ont montré une mise en place de jonctions via des connexines 43 dans des co-cultures de cardiomyocytes et de fibroblastes auriculaires humains. De plus ils ont observé que la prolifération des fibroblastes inhibe le processus de dédifférenciation des cardiomyocytes et entraîne une perte de leur excitabilité (Rucker-Martin et al., 2002).
Ces travaux suggèrent que les cardiomyocytes et les fibroblastes sont capables de former des jonctions gap fonctionnelles. Les fibroblastes à travers ces communications électriques seraient donc capables de générer une discontinuité de la conduction du signal électrique à l'origine d'arythmies (Kawara et al., 2001) ; (Spach and Boineau, 1997) et d’affecter la structure et la fonction des cardiomyocytes (Gaudesius et al., 2003) ; (Goshima, 1970).
III Fibroblastes cardiaques : acteurs du remodelage cardiaque
En conditions pathologiques, les fibroblastes sont impliqués dans le remodelage cardiaque par leur capacité à sécréter des facteurs de croissance, des cytokines inflammatoires, des protéines de la MEC et des MMPs. Ils sont également sensibles à un ensemble de stimuli environnementaux comme l’étirement mécanique, les variations d’oxygène ainsi que les facteurs de croissance, les hormones et les cytokines sécrétées par les cellules cardiaques environnantes (régulation paracrine) et les fibroblastes eux-mêmes (régulation autocrine).
La réponse des fibroblastes cardiaques à ses différents facteurs peut conduire à différents processus (Porter and Turner, 2009a) (figure I-11) dont :
