© Julien Chamberland, 2018
Étude des biofilms dans les systèmes de filtration en
industrie laitière : mécanismes de formation,
caractérisation et stratégies de contrôle
Thèse
Julien Chamberland
Doctorat en sciences et technologie des aliments
Philosophiæ doctor (Ph. D.)
Étude des biofilms dans les systèmes de filtration en
industrie laitière : mécanismes de formation,
caractérisation et stratégies de contrôle
Thèse
Julien Chamberland
Sous la direction de :
Yves Pouliot, directeur de recherche
Steve Labrie, codirecteur de recherche
iii
Résumé
La formation de biofilms a longtemps été négligée pour expliquer la diminution des performances à long terme des systèmes de filtration industriels à long terme. Les paramètres opératoires de ces systèmes étaient orientés dans le but de maximiser les flux de perméation, sans égard à l’aspect microbien, et les stratégies de nettoyage utilisées ne ciblaient que l’encrassement chimique des membranes. Des biofilms peuvent pourtant se développer à leur surface, et leur tolérance croissante face aux méthodes classiques de nettoyage les rend particulièrement difficiles à contrôler à long terme. Ces travaux de doctorat avaient pour but de mettre en évidence les paramètres qui affectent la croissance des biofilms se formant à la surface des membranes de filtration et ce, afin d’élaborer une stratégie opératoire, applicable en industrie, pour limiter leur développement. Avant ce projet, quelques études avaient démontré la problématique des biofilms, mais celles-ci étaient limitées à des analyses réalisées par des méthodes de culture (microbiologie classique) ou à des observations par microscopie, laissant dans l’ombre la majorité de l’écosystème microbien se développant à la surface des membranes de filtration. C’est pourquoi le premier défi scientifique consistait à développer une méthode d’analyse dressant un portrait global des bactéries composant ces communautés. Une approche métagénomique ciblant le gène codant pour l’ARN ribosomique 16S (amplicon sequencing) a donc été développée à cette fin.
Cette méthode a permis de démontrer l’impact de facteurs tels que la nature du fluide filtré, le prétraitement thermique des fluides avant la filtration, la température d’opération, le type de matériau membranaire ou la durée opératoire sur la composition et la vitesse de formation des biofilms. La première partie des travaux a été réalisée à partir de membranes spiralées industrielles échantillonnées en fin de vie utile. Celles-ci ont d’abord révélé l’importance de la nature du fluide filtré sur la composition de l’écosystème bactérien persistant à la surface des membranes de filtration.
Ces premières observations industrielles ont ensuite été validées dans un environnement contrôlé à partir de systèmes modèles de filtration tangentielle ou de type « bioréacteur » imitant l’environnement de filtration et le processus d’encrassement microbiologique des membranes. Ces systèmes ont montré comment la réalisation d’une pasteurisation des fluides avant la filtration affecte les proportions des bactéries thermorésistantes et thermophiles à la surface des membranes de filtration. Leur croissance était particulièrement rapide lorsque la filtration était réalisée à haute température (> 40 °C). À ce titre, les systèmes devraient être opérés moins de 10 h consécutives à 50 °C pour éviter la prolifération de ces bactéries.
À la lumière de ces travaux, la température et la durée d’opération, ou encore, l’utilisation de membranes présentant une plus faible rugosité pour réaliser l’ultrafiltration de lactosérum sont des paramètres qui présentent un intérêt afin de ralentir le processus de formation des biofilms, voire de favoriser l’implantation d’une microflore
iv
« moins nuisible » à la surface des membranes. Cette thèse, réaliste au fait qu’il est probablement impossible d’éradiquer les biofilms des systèmes de filtration, s’inscrit dans un processus de réflexion sur la définition de la qualité microbiologique des produits laitiers industriels à l’ère de la métagénomique. Maintenant que les méthodes de détection moléculaires permettent une caractérisation précise des microorganismes de l’environnement laitier, la quasi-stérilité des systèmes autrefois recherchée n’est possiblement plus la solution la plus judicieuse pour assurer leur innocuité. Cette thèse amène ainsi une nouvelle vision sur les possibles méthodes de prévention des biofilms, lesquels pourraient se transformer en opportunité pour les industriels laitiers.
v
Abstract
Biofilm formation was neglected in the past years to explain long-term performance decrease in industrial filtration systems. Indeed, their operating parameters were selected to improve permeation fluxes as a priority without taking into consideration microbial issues, and the cleaning strategies mainly targeted chemical fouling. However, biofilms can be formed at the filtration membrane surface, and their increasing tolerance to classical cleaning solutions makes them difficult to control in a long-term purpose. This doctoral work was done to evidence the parameters that affect the formation of biofilms on filtration membranes, in order to design an industrial strategy limiting their growth.
Before this project, few studies had demonstrated the issue, but they were limited to classical culture-based approaches or to microscopy, which certainly overshadowed the major part of the bacterial ecosystem formed on filtration membranes. Solving this analytical issue and to draw a global portrait of the bacteria among these dairy biofilms represented the very first challenge to address. A targeted metagenomic approach targeting the 16S rRNA gene (amplicon sequencing) was developed.
This method enabled to characterize the impact of filtration operational parameters such as the nature of the filtered fluid, the heat-treatment of the feed prior filtration, the feed temperature, the membrane type used to perform filtration or the process duration on the formation speed or the composition of biofilms. The first series of experiments consisted in a preliminary study involving industrial spiral-wound filtration membranes sampled at the end of their useful lifetime. These membranes revealed how the nature of the filtered fluid affects the composition of bacterial communities persisting on membranes following membrane cleaning.
Industrial observations were later validated in a controlled environment through the conception of model filtration or bioreactor systems imitating the filtration environment and the membrane biofouling phenomenon. It was shown that the pasteurization of the feeds prior filtration increases the proportions of thermoduric and thermophilic bacteria on membranes. Their growth is particularly fast when filtration is performed at higher temperatures (> 40 °C). Consequently, filtration systems should never be operated more than 10 consecutive h at 50 °C to avoid the proliferation of these bacteria.
According to the results obtained for this thesis, operational parameters such as the feed temperature, the duration of the filtration process or the use of a smoother membrane surface to perform whey ultrafiltration exhibited potential to reduce the biofilm growth speed, or even to favor the adhesion of “less detrimental” bacteria on membranes. This thesis, realistic to the fact that it may be impossible to eradicate biofilms from filtration systems, is in line with the reflection process to define the microbial quality of dairy products in the metagenomic era. Molecular detection methods now enable an accurate characterization of microorganisms living in the dairy environment. Systems sterility pursued in the past is possibly no longer the best way to ensure food safety. The
vi
new vision presented in this thesis introduces a new philosophy to prevent the negative impacts of biofilms, which could be turn into an opportunity for the dairy industry.
vii
Table des matières
Résumé ... iii
Abstract ... v
Table des matières ... vii
Liste des tableaux ... xii
Liste des figures ... xiv
Liste des équations ... xvi
Liste des abréviations ... xvii
Remerciements ... xx
Avant-propos ... xxii
Chapitre 1 Introduction générale ... 1
Chapitre 2 État des connaissances ... 2
2.1 Éco-efficience ... 2
2.1.1 Amélioration de l’éco-efficience dans l’industrie laitière ... 2
2.2 Les procédés de filtration baromembranaires ... 2
2.2.1 Principales applications en industrie laitière ... 3
2.2.2 Éléments d’un système de filtration ... 4
2.2.3 Mesure de la performance d’un système de filtration ... 5
2.3 Encrassement des membranes de filtration ... 5
2.3.1 Principales sources d’encrassement ... 6
2.4 Biofilms ... 7
2.4.1 Définition d’un biofilm ... 7
2.4.2 Étapes de développement des biofilms ... 7
2.5 Biofilms laitiers ... 10
2.5.1 Composition des biofilms laitiers ... 11
2.6 Encrassement microbiologique de membranes de filtration ... 13
2.7 Stratégies de prévention et de contrôle des biofilms ... 13
2.7.1 Le nettoyage des membranes de filtration ... 13
2.7.2 Stratégies émergentes ... 14
2.8 Méthodes de caractérisation des biofilms ... 15
2.8.1 Méthodes chimiques ... 15
2.8.2 Méthodes de microbiologie classique ... 15
2.8.3 Méthodes génomiques... 16
viii
Chapitre 3 Contexte du projet ... 21
3.1 Problématique ... 21
3.2 Hypothèse de recherche ... 21
3.3 Objectifs spécifiques ... 21
Chapitre 4 Une approche de séquençage ciblant le gène codant pour l’ARNr 16S pour la caractérisation des biofilms formés sur des membranes spiralées utilisées dans l’industrie laitière ... 23
4.1 Résumé ... 23
4.2 Avant-propos ... 24
4.2.1 Publication et communications associées à ce chapitre ... 24
4.3 Abstract ... 25
4.4 Introduction ... 25
4.5 Materials and methods ... 26
4.5.1 Sampling industrial membranes ... 26
4.5.2 DNA extraction method ... 27
4.5.3 16S rRNA gene sequencing ... 29
4.5.4 Sequence accession number ... 30
4.5.5 Metadata processing and statistical analysis ... 30
4.6 Results ... 31
4.6.1 Ecological comparisons of the SWM ... 31
4.6.2 The composition of bacterial communities on dairy processing SWM... 32
4.7 Discussion ... 35
4.7.1 The effect of operating conditions ... 36
4.8 Conclusions ... 37
4.9 Acknowledgements ... 38
Chapitre 5 L’encrassement microbiologique de membranes d’ultrafiltration par des fluides laitiers : la caractérisation des bactéries pionnières par une approche de métabarcoding ... 39
5.1 Résumé ... 39
5.2 Avant-propos ... 40
5.2.1 Publication et communications associées à ce chapitre ... 40
5.3 Abstract ... 41
5.4 Introduction ... 41
5.5 Materials and methods ... 42
5.5.1 Ultrafiltration experiments: Laboratory-scale model system ... 42
5.5.2 Experimental conditions ... 43
ix
5.5.4 Sample collection ... 46
5.5.5 DNA extraction and high-throughput sequencing ... 46
5.5.6 Sequence accession number ... 46
5.5.7 Statistical analysis ... 46
5.6 Results ... 47
5.6.1 Characterization of the experimental filtration setup ... 47
5.6.2 Diversity among young communities on membranes and in filtered fluids ... 48
5.6.3 Influence of the nature of the filtered fluid ... 52
5.6.4 Feed temperature during UF ... 54
5.6.5 Effect of the bacterial environment of the filtration system ... 54
5.7 Discussion ... 54
5.7.1 Effect of fouling incidence on biofilm formation ... 54
5.7.2 Membrane bacterial profile as a function of dairy fluid properties ... 55
5.7.3 Influence of the environmental microflora of the dairy plant ... 56
5.8 Conclusions ... 56
5.9 Acknowledgements ... 57
Chapitre 6 L’impact du type de matériau membranaire sur la susceptibilité à l’encrassement microbiologique durant l’ultrafiltration de lait ou de lactosérum ... 58
6.1 Résumé ... 58
6.2 Avant-propos ... 59
6.2.1 Publication et communications associées à ce chapitre ... 59
6.3 Abstract ... 60
6.4 Introduction ... 60
6.5 Materials and methods ... 61
6.5.1 Experimental protocol ... 61
6.5.2 Characterization of the membrane surface properties ... 63
6.5.3 Membrane fouling characterization ... 63
6.5.4 Biofouling characterization ... 64
6.5.5 Statistical analysis ... 66
6.6 Results ... 66
6.6.1 Membrane surface properties and effects of membrane conditioning ... 66
6.6.2 Membrane performance during milk and cheese whey UF ... 68
6.6.3 Membrane biofouling assessment ... 70
6.7 Discussion ... 75
x
6.7.2 Impact of the surface properties on bacteria adhering on membranes ... 76
6.7.3 Mechanism suggested for biofilm formation on dairy filtration membranes ... 76
6.8 Conclusions ... 78
6.9 Acknowledgements ... 79
Chapitre 7 La température d’opération, un paramètre important pour retarder la formation des biofilms à la surface des membranes de filtration ... 80
7.1 Résumé ... 80
7.2 Avant-propos ... 81
7.2.1 Publication et communications associées à ce chapitre ... 81
7.3 Abstract ... 81
7.4 Introduction ... 81
7.5 Materials and methods ... 83
7.5.1 Milk source... 83
7.5.2 Biofilm reactor assembly and operation... 83
7.5.3 Bioreactor preparation ... 84
7.5.4 Membrane and milk sampling ... 84
7.5.5 Scanning electron microscopy ... 85
7.5.6 Targeted genomic analysis of the bioreactor microbiome ... 85
7.5.7 Statistical analysis ... 86
7.6 Results ... 86
7.6.1 The quantification of the number of 16S rRNA gene copies on membranes ... 86
7.6.2 The composition of bacterial communities formed on membranes... 87
7.6.3 The evolution of thebacterial diversity in the milk inside the bioreactor ... 91
7.7 Discussion ... 92
7.7.1 Operating at 50 °C, a race against spore-former bacteria ... 93
7.7.2 The cold temperature as a tool to decrease the biofilm formation speed ... 94
7.8 Conclusions ... 95
7.9 Acknowledgements ... 95
Chapitre 8 Conclusion générale... 97
8.1 Synthèse des résultats et observations ... 97
8.2 Contributions originales de la thèse... 98
8.2.1 Utilisation du séquençage à haut-débit pour la caractérisation des communautés bactériennes .... 98
8.2.2 Identification de microorganismes inattendus ... 98
8.2.3 Observations en systèmes modèles ... 99
xi
8.3.1 Impact des nouvelles connaissances sur la gestion des systèmes laitiers industriels ...101
8.3.2 Les nouvelles questions de recherches...102
8.3.3 Vers un nouveau paradigme dans le contrôle des biofilms en industrie laitière? ...102
xii
Liste des tableaux
Tableau 2.1 Les principales applications des procédés baromembranaires dans l’industrie laitière. ... 4
Tableau 2.2 La distribution des principales bactéries retrouvées dans l’usine laitière. ... 12
Tableau 2.3 Principales stratégies de séquençage métagénomique. ... 18
Tableau 4.1 Characteristics of the spiral-wound membranes sampled from dairy plants and their taxonomic diversity. ... 28
Tableau 4.2 Oligonucleotide sequences used for the amplification of the V6-V8 region of the 16S rRNA gene. ... 29
Tableau 4.3 Relative proportions (%) of the 25 most abundant OTU found on the spiral-wound membranes. . 33
Tableau 4.4 Parameters affecting the composition of bacterial biofilms on spiral-wound membranes sampled. ... 34
Tableau 5.1 Overview of flux changes (average permeate flux and total flux decline after 5 h) and microbial growth in dairy fluids over 5 h ultrafiltration. ... 48
Tableau 5.2 Characteristics of the samples analyzed and their diversity. ... 49
Tableau 5.3 Proportions (percentage of sequenced reads) of the ten most abundant bacterial genera found on ultrafiltration membranes after chlorinated alkaline cleaning. ... 51
Tableau 5.4 Governing factors affecting the diversity of pioneer colonizer bacteria observed on ultrafiltration membranes after 5 h of filtration. ... 52
Tableau 6.1 One-way and two-way ANOVA results for the membrane properties affected by the conditioning step and the membrane material type. ... 66
Tableau 6.2 Surface properties of virgin and conditioned membranes. ... 67
Tableau 6.3 The membrane material resistances. ... 69
Tableau 6.4 One-way and two-way ANOVA results for the number of 16S rRNA gene copies affected by the filtration time and the membrane material type. ... 70
Tableau 6.5 Ecological characteristics of membrane and retentate samples collected at the beginning of UF, after 5 h and 20 h of UF ... 71
Tableau 6.6 The correction factor calculated and applied to the number of 16S rRNA gene copies to estimate the number of bacteria in samples. ... 73
Tableau 7.1 Ecological metrics of communities formed on membranes at various temperatures. ... 88
Tableau 7.2 Relative proportions (%) of the major OTU observed on membranes used at 50 °C. ... 89
xiii
Tableau 7.4 Bacterial portrait of raw milks prior pasteurization. ... 91 Tableau 7.5 Ecological metrics of bacteria found in the milk inside the bioreactor. ... 92 Tableau 8.1 Impact des paramètres opératoires de filtration sur l’encrassement microbiologique des membranes de filtration utilisées dans l’industrie laitière. ... 97
xiv
Liste des figures
Figure 2.1 La sélectivité des différentes technologies de filtration, figure inspirée de Jirjis et al. [22]. ... 3 Figure 2.2 Présentation générale d’un système de filtration opéré à « chaud ». ... 4 Figure 2.3 Les étapes de formation d'un biofilm, figure inspirée de Bremer et al. [53]. ... 8 Figure 4.1 Rarefaction curves of the 16S rRNA gene (V6-V8 region) sequences extracted from the spiral-wound membranes sampled. ... 31 Figure 4.2 Combined stack chart and dendrogram presenting the proportion (%) of bacterial classes found on spiral-wound membranes sampled and the similarity between the samples (ThetaYC calculator). ... 35 Figure 5.1 Laboratory-scale membrane system designed to study biofilm formation; (1) feed tank, (2) temperature controlled water bath, (3) positive displacement diaphragm pump, (4) inlet pressure gauge, (5) filtration cells, (6) outlet pressure gauge, (7) restriction valve, (8) retentate flowmeter, (9) individual permeate collection for each cell and flux measurements. ... 43 Figure 5.2 Experimental design for the preparation of different dairy fluids from the same batch lot of raw milk. ... 45 Figure 5.3 Permeation flux changes during ultrafiltration of dairy fluids (±1 SE for n=3)... 47 Figure 5.4 Rarefaction curves of 16S rRNA gene sequences (V6-V8 region) extracted from membranes and dairy fluids prior to filtration experiments. ... 50 Figure 5.5 Combined stack chart and dendrogram presenting relative proportions (percentage of sequence reads) of major bacterial classes and genera on ultrafiltration membranes after the cleaning cycle performed after 5 h of ultrafiltration experiments. ... 53 Figure 6.1 Images obtained by stylus profilometry of conditioned membrane coupons (1 mm2). ... 67
Figure 6.2 Permeation flux decline (± SD, n = 3) during (A) pasteurized milk and (B) pasteurized cheese whey UF at 50 ˚C (TMP of 345 kPa). ... 68 Figure 6.3 Reversible (Rrev), irreversible (Rirrev) and total (Rtot) hydraulic resistances (± SD, n = 3) caused by 5 h
and 20 h UF of (A) pasteurized milk and (B) pasteurized cheese whey at 50 ˚C (TMP of 345 kPa). ... 69 Figure 6.4 Stacked chart presenting the estimated abundance of the major bacterial genera on cleaned membrane samples (log10 gene copies per cm2) and in dairy retentates (log10 gene copies per mL) at the beginning (0 h), after 5 h and 20 h of UF. ... 72 Figure 6.5 Mechanism suggested explaining the biofilm formation on dairy UF membranes. ... 78 Figure 7.1 Biofilm reactor consisting of a feed tank (1) maintained at 4 °C in an incubator (2), bacterial air vents (3), a peristaltic pump (4), a flow break (5), a CDC biofilm reactor (6), a temperature sensor (7), eight membrane holder rods (8), a stir bar (9), a stirring/hot plate (10) and a waste collector (11)... 84 Figure 7.2 Portrait of bacterial communities formed on membranes (A) and bacteria found in milk (B) inside the bioreactor at 15 °C or 50 °C during the processing time. ... 87
xv
Figure 7.3 Scanning electron microscopy images of biofilms formed on membranes after 20 h of operation at 50 °C in the bioreactor, before cleaning (A and B) and after cleaning (C). ... 93
xvi
Liste des équations
Équation 2.1 Définition de l'éco-efficience ... 2
Équation 2.2 Flux de perméation ... 5
Équation 5.1 The permeation flux ... 44
Équation 5.2 The avarage permeation flux ... 44
Équation 5.3 The total flux decline after 5 h ... 44
Équation 7.1 The growth rate, estimated from the number of 16S rRNA gene copies ... 86
xvii
Liste des abréviations
A230 : Absorbance à 230 nm
A260 : Absorbance à 260 nm
A280 : Absorbance à 280 nm
ADN : Acide désoxyribonucléique AHL : Homosérine lactone ANOVA : Analyse de la variance ARN : Acide ribonucléique
ARNr ou rRNA : ARN ribosomique (Ribosomal RNA) bW : Lactosérum décoloré (Bleached whey)
CIP : Nettoyage-en-place (Clean-in-place)
DGGE : Électrophorèse sur gel en gradient dénaturant (Denaturing gradient gel electrophoresis) eDNA : ADN extracellulaire (Extracellular DNA)
EDTA : Acide éthylène diamine tétraacétique
EPS : Substances polymériques extracellulaires (Extrapolymeric substances) fW : Lactosérum frais (Fresh whey)
HCl : Acide chlorhydrique
ITS : Espaceur interne transcrit (Internal transcribed spacer) JA : Flux de perméation moyen
Jt : Flux de perméation après « t » heure de filtration
IDF : Fédération international de laiterie (International dairy federation) LAB : Bactérie lactique acidifiante (Lactic acid bacteria)
NCBI : Centre américain pour les informations biotechnologiques (National center for biotechnology information) NF : Nanofiltration
NRE : Nombre de Reynolds
OTU : Unité taxinomique opérationnelle (Operational taxonomic unit) PAN : Polyacrylonitrile
PCA : Gélose pour dénombrement standard (Plate count agar) PCR : Réaction en chaîne par polymérase
PE : Polyéthylène PES : Polyéther sulfone
PERMANOVA : Analyse multivariée de la variance par permutation (Permutational multivariate analysis of
variance)
xviii PP : Polypropylène PS : Polysulfone PTFE : Polytétrafluoroéthylène PVC : Polychlorure de vinyle PVDF : Polyfluorure de vinylidène
Ra : Rugosité moyenne (Roughness average)
Rirrev : Résistance irréversible
Rm : Résistance membranaire
Rrev : Résistance réversible
Rtot : Résistance totale
RO : Osmose inverse (Reverse osmosis) Sobs : Nombre d’espèces observées
SDS : Laurylsulfate de sodium
SEM : Microscopie électronique à balayage (Scanning electron microscopy) SWM : Membrane de filtration spiralée (Spiral-wound membrane)
TES : Solution composée de Tris, d’EDTA et de sucrose
TFD : Pourcentage de perte de flux de perméation par rapport au flux initial (Total flux decline) TMP : Pression transmembranaire (Transmembrane pressure)
Tris : Trishydroxyméthylaminométhane UF : Ultrafiltration
xix
xx
Remerciements
Alors que je me voyais réaliser une carrière de consultant en fromagerie, c’est Yves Pouliot, mon directeur de thèse, qui m’a convaincu du fait que le monde de la recherche était fait pour moi. Merci Yves pour ta ténacité et pour m’avoir fait découvrir cette passion pour la recherche qui était en moi depuis longtemps. Merci pour l’immense confiance que tu m’as accordée au cours des dernières années et pour toute la place que tu m’as donnée au sein de ta chaire de recherche. Je fais partie des étudiants privilégiés
qui ont eu la chance de voyager durant leurs études, tant pour la science que pour des évasions personnelles. Tout au long de mes études, une chose semblait importante à tes yeux : mon bonheur. Tu demeures mon mentor professionnel, celui qui m’a fait comprendre l’importance de dire non aux centaines d’opportunités qui s’offrent à moi et surtout, celui qui ne compte pas les heures
pour assurer mon succès professionnel. Au cours des 4 dernières années, j’ai eu la chance de profiter de ta vision exceptionnelle, de partager ton enthousiasme, et aussi, d’entendre tes analogies savoureuses. Merci pour tout.
Je dois aussi beaucoup à Steve Labrie, mon codirecteur de recherche. Dès mes premières expériences en fromagerie, alors que je voulais mettre au point une culture lactique artisanale, Steve a fait preuve d’une patience infinie pour m’accueillir dans son bureau, même si sa porte était fermée, sans rendez-vous, parfois des heures, pour discuter de microbiologie laitière. Je tiens aussi à te remercier pour ton appui et tes encouragements lors de mon passage à la Fromagerie du campus. Bien que tous ceux qui s’y impliquent soient passionnés pour ce projet, c’est grâce à des professeurs comme toi qu’il a réellement pu prendre son envol au cours des dernières années.
Merci à Alain Doyen, dont j’ai eu la chance de côtoyer depuis le début de mes études supérieures et qui s’est avéré un excellent conseiller durant toute la durée de mes études. Merci de croire en moi, et merci pour tous ces fous rire lors de ces congrès à l’international.
Merci à Eric Dugat-Bony et à Manon Duquenne pour avoir accepté d’évaluer cette thèse sans hésitation. Merci à Bernard Pouliot, mon mentor de vie. Dire que le séminaire du baccalauréat me faisait faire des insomnies. Tu es celui qui m’a donné confiance, qui me permet de penser autrement et qui m’a enseigné l’importance de semer pour mieux s’élever. Merci pour ces belles pensées.
Merci aux étudiants de la Chaire de recherche en éco-efficience des procédés de transformation du lait et à ceux du Laboratoire de mycologie alimentaire pour votre bonne humeur, vos sourires… et tous ces œufs frais et pots de miels partagés! J’ai une pensée particulière pour Gabrielle Beaulieu-Carbonneau avec qui j’ai eu
xxi
beaucoup de plaisir à réinventer le monde de l’agroalimentaire. Et à Marie-Hélène Lessard, qui n’est jamais bien loin pour répondre à mes nombreuses questions.
Merci à ceux qui œuvrent dans l’ombre, mais dont la présence était essentielle au succès de cette thèse. Je pense à Diane Gagnon, à Pascal Lavoie, à Pierre Côté et à Mélanie Martineau.
Merci aux stagiaires qui se sont impliqués pour la réalisation de cette thèse : Laurence Pouliot, Émilie Nacaouelle et Thomas Messier.
Merci à tous les organismes subventionnaires qui ont contribué au financement de mes études : Novalait et la Commission canadienne du lait (bourse de maîtrise), le Fonds de recherche du Québec – Nature et technologies (bourse de doctorat), la Fondation Initia, la Faculté des Sciences de l’Agriculture et de l’Alimentation (FSAA) et ses partenaires (Institut canadien de science & technologie alimentaires, Fondation de technologie laitière du Québec inc., Saputo).
Merci à FIL-Canada qui, année après année, donne la chance à des étudiants de vivre des expériences exceptionnelles de congrès à l’international. Accompagner la délégation canadienne de la FIL à Rotterdam et à Belfast fut bien sûr un honneur, et une des expériences les plus formatrices de mon parcours universitaire. Enfin, merci à Catherine, ma chérie, qui fait de moi l’homme le plus heureux du monde. Tu es bien au courant que sans toi et ta compréhension, cette grande aventure n’aurait jamais eu lieu. Merci d’être aussi présente au quotidien pour me conseiller, me comprendre et m’encourager. Nous formons avec Charlie la plus belle équipe, c’est tout ce qui compte dans la vie.
xxii
Avant-propos
Le premier chapitre constitue une introduction générale à cette thèse. Le chapitre 2 est consacré à une revue de la littérature disponible au sujet de l’encrassement microbiologique des membranes de filtration avant le début des travaux de cette thèse et justifiant de fait son importance. Le chapitre 3 présente précisément la problématique à résoudre et les trois objectifs planifiés pour y parvenir.
Cette thèse contient 4 articles scientifiques. Trois sont déjà publiés dans des journaux reconnus alors que le quatrième est en cours de révision. Ces articles ont été rédigés en anglais et sont présentés aux chapitres 4 à 7. Julien Chamberland en est le premier auteur. Il a rédigé les quatre manuscrits et a réalisé les travaux au laboratoire, à l’exception de ceux du Chapitre 6, réalisés par Gabrielle Beaulieu-Carbonneau. Marie-Hélène Lessard a donné la formation nécessaire pour réaliser les travaux au laboratoire et a proposé la première version du protocole d’extraction d’ADN. Steve Labrie, Alain Doyen et Yves Pouliot ont aussi activement participé à la planification des travaux. Tous les coauteurs ont contribué à la relecture de ces manuscrits. Yves Pouliot, directeur de la Chaire de recherche industrielle CRSNG-Novalait en éco-efficience des procédés de
transformation du lait, a obtenu le financement pour la réalisation de cette thèse.
Le Chapitre 4, publié dans le journal Dairy science and Technology, a servi de preuve de concept au projet. L’analyse génomique de membranes industrielles, échantillonnées en fin de vie utile après un dernier cycle de nettoyage, a permis de faire la démonstration que certaines bactéries persistent aux séquences de nettoyage des membranes. Cette étape du projet a aussi permis de développer et d’optimiser l’approche de séquençage d’amplicons à haut débit utilisée tout au long du projet pour analyser les bactéries adhérant et se développant à la surface des membranes de filtration.
Pour la suite du projet, un système modèle de filtration tangentielle a été conçu afin de générer des échantillons de membranes dans un environnement contrôlé et des conditions opératoires variées. Ce système a d’abord permis d’identifier les bactéries pionnières initiant la formation des biofilms à la surface des membranes de filtration à différentes températures. Les résultats sont présentés au Chapitre 5. L’article associé à ce chapitre a été publié dans le Journal of Dairy Science.
Le Chapitre 6 présente un autre aspect étudié avec ce même système modèle : l’influence du type de matériau membranaire sur la composition des bactéries persistant à leur surface. Cette étape du projet a d’autant plus permis de bonifier la méthode d’analyse génomique en y incluant un volet quantitatif (PCR en temps réel). Un mécanisme de formation des biofilms a aussi été suggéré dans l’article publié dans le Journal of Membrane
Science. Pour ce chapitre, Laurent Bazinet s’est joint à l’équipe pour la planification des travaux au laboratoire
xxiii
Le dernier manuscrit, présenté au Chapitre 7, implique l’analyse de biofilms en cours de formation à la surface de membranes en contact avec du lait écrémé pasteurisé dans un système modèle de type « bioréacteur ». L’objectif de ce chapitre était de déterminer le moment à partir duquel les biofilms deviennent problématiques au cours d’un procédé de filtration, de déterminer s’il existe un moment idéal pour réaliser les cycles de nettoyage des membranes et ultimement, de vérifier si la réduction de la température d’opération permet de retarder cette durée d’opération critique.
Une conclusion générale est proposée au Chapitre 8. Elle présente les réalisations et l’originalité de cette thèse et ses retombées pour l’industrie laitière.
1
Chapitre 1 Introduction générale
Chez les humains comme à l’échelle bactérienne, l’union fait la force! Effectivement, peu importe le degré d’évolution, aucun organisme vivant n’a avantage à vivre seul. Chez les bactéries, la formation de biofilms est d’ailleurs une façon de vivre en communautés qui leur procure des mécanismes de défense supplémentaires face aux stress de leur environnement.
Dans l’industrie laitière, ce comportement des bactéries peut être positif. Il est grandement mis à profit dans les caves d’affinage des fromages où les biofilms formés sur des planches d’affinage auraient des effets inhibiteurs contre des bactéries pathogènes [1]. À l’inverse, la persistance des biofilms dans l’environnement laitier peut être problématique du fait de leur tolérance accrue aux procédures de nettoyage de l’industrie [2,3]. À long terme, ils peuvent représenter une source de contamination microbiologique ou enzymatique des produits transformés [4], tout en diminuant les performances des appareils ou des systèmes utilisés dans l’industrie en provoquant une diminution des flux d’écoulement [5].
Les surface internes des équipements opérés en continu (pasteurisateur, système de filtration, évaporateur) sont les plus propices à la formation de biofilms compte tenu de leur longue durée opératoire (parfois jusqu’à 20 heures) et de l’environnement stable et riche en nutriments dans lequel elles se situent [6]. Les membranes de filtration représentent un environnement particulièrement intéressant pour la formation de biofilms, car la TMP (pression transmembranaire) appliquée sur la membrane crée un flux convectif du fluide vers la membrane qui force les bactéries à y adhérer [7–10].
La problématique de ces biofilms formés à la surface des membranes de filtration avait déjà été démontrée avant d’initier les travaux présentés dans cette thèse [2,6,11–13]. Cependant, leur caractérisation n’avait été réalisée qu’avec des observations en microscopie et des méthodes de microbiologie classique, lesquelles ne permettent d’étudier qu’une infime fraction des écosystèmes microbiens environnementaux [14].
Dans une perspective d’éco-efficience, la formation de biofilms constitue un problème en ce sens que ces derniers contribuent à diminuer les performances des systèmes membranaires, nécessitent des conditions de nettoyage plus sévères et contribuent à raccourcir la durée de vie utile des membranes. Cette thèse avait donc pour but d’améliorer les connaissances entourant la formation des biofilms à la surface des membranes de filtration afin d’initier une réflexion pour le développement de stratégies visant à limiter leurs impacts négatifs. Il en résultera une amélioration des performances des systèmes de filtration à long terme et de la qualité des produits laitiers issus de procédés baromembranaires.
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Chapitre 2 État des connaissances
2.1 Éco-efficience
L’évaluation de l’éco-efficience d’un produit est une approche globale qui consiste à calculer la valeur économique de ce produit par rapport à la somme des impacts environnementaux liés à la fabrication de ce produit (Équation 2.1) [15].
Équation 2.1 Définition de l'éco-efficience
Éco-efficience= Valeur du produit ou service Somme des impacts environnementaux
L’analyse de cycle de vie (ACV) est la démarche structurée, définie par des normes internationales (ISO 14040 et ISO 14044), qui permet la réalisation cette évaluation [16,17].
2.1.1 Amélioration de l’éco-efficience dans l’industrie laitière
D’une logique mathématique simple, deux situations sont possibles pour améliorer la valeur d’éco-efficience d’un produit ou d’un service. D’une part, si la valeur du produit est constante, la somme de ses impacts environnementaux doit être réduite. En revanche, si l’impact environnemental d’un produit demeure stable, sa valeur doit augmenter. Un meilleur contrôle des biofilms pourrait entre autres améliorer la valeur d’un produit en améliorant sa qualité microbiologique ou en diminuant ses coûts de production par une meilleure performance des systèmes (meilleurs flux d’écoulement).
Il est bien connu que le lait est chèrement acquis d’un point de vue environnemental [18]; de nombreux efforts doivent être réalisés (réduction de l’utilisation de pesticides, amélioration de la biodiversité à la ferme, amélioration des techniques d’épandage du fumier) pour limiter les impacts environnementaux du secteur de la production laitière [19]. Du côté de la transformation, la valorisation du lait dans son intégralité tout en limitant les rejets (en moyenne 0,2 L à 10 L d’effluents générés par L de lait transformé [20]) sont les principaux éléments à considérer pour y arriver. La filtration baromembranaire, qui a contribué à l’amélioration de la productivité des industriels laitiers en diminuant leur utilisation des ressources, semble un outil indispensable.
2.2 Les procédés de filtration baromembranaires
Les procédés de filtration baromembranaires permettent la séparation de différentes molécules grâce à un gradient de pression qui agit à titre de force motrice au travers d’une membrane semi-perméable [21]. Les principaux procédés utilisés dans l’industrie alimentaire sont la microfiltration (MF), l’ultrafiltration (UF), la nanofiltration (NF) et l’osmose inverse (RO) [22,23]. Ces procédés sont sélectionnés en fonction de la taille des espèces à séparer (Figure 2.1) [22,23]. Avec la grande variabilité des molécules retrouvées dans le secteur
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alimentaire, les applications sont nombreuses pour la concentration, la clarification et la stabilisation des fluides alimentaires [22,23]. Ces procédés peuvent être réalisés sans apport d’énergie thermique comme l’exigeraient les procédés traditionnels d’évaporation ou de séchage [24].
Figure 2.1 La sélectivité des différentes technologies de filtration, figure inspirée de Jirjis et al. [22].
2.2.1 Principales applications en industrie laitière
Les principaux procédés baromembranaires utilisés dans l’industrie laitière sont l’UF (concentration des protéines du lait ou du lactosérum) et la RO (préconcentration des fluides laitiers avant séchage) [25]. D’autres applications sont présentées au Tableau 2.1.
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Tableau 2.1 Les principales applications des procédés baromembranaires dans l’industrie laitière. Technologie Taille des pores
(Seuil de coupure)*
Principales applications [22,26,27]
MF 0,1 à 10 µm Débactérisation ou retrait des protéines sériques dans le lait
UF 1 à 100 nm (10 à 100 kDa) Concentration du lait de fromagerie
Concentration et purification des protéines sériques du lactosérum NF 0,5 à 5 nm (0,1 à 1 kDa) Purification du lactose des perméats d’UF
RO - Préconcentration des fluides laitiers avant séchage Production d’eau pure à partir des fluides laitiers
*Note : La taille des pores est seulement utilisée pour caractériser les membranes de MF, alors que le seuil de coupure permet de caractériser les
membranes d’UF et de NF. Les membranes RO n’ont pas de pores ; les molécules d’eau passent au travers de la membrane par diffusion.
2.2.2 Éléments d’un système de filtration
Essentiellement, un système de filtration est composé d’une cuve d’alimentation où repose le fluide à filtrer, d’une unité de filtration et d’une pompe pour acheminer le fluide vers l’unité de filtration (Figure 2.2) [21]. Industriellement, les systèmes contiennent plusieurs unités de filtration en série et en parallèle (sur différents « stages ») [21].
Figure 2.2 Présentation générale d’un système de filtration opéré à « chaud ».
Au cours de la filtration, le fluide filtré est récupéré en deux fractions : le perméat (fraction filtrée) et le rétentat (fraction concentrée) [21,22]. Pour réguler la pression exercée sur la membrane, soit la TMP, une valve de
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restriction est installée à la sortie de l’unité de filtration [22]. Des échangeurs à plaques sont aussi prévus à l’entrée et à la sortie de l’unité de filtration pour contrôler la température d’opération et pour refroidir le rétentat après la filtration (Figure 2.2).
2.2.3 Mesure de la performance d’un système de filtration
La sélectivité des membranes et le flux de perméation sont les critères les plus importants pour décrire les performances des systèmes de filtration baromembranaires [22,28].
La sélectivité des membranes mesure en quelque sorte la qualité de rétention ou la capacité de rejet de certaines molécules [22]. Elle peut aussi être influencée par le seuil de coupure (molecular weight cut-off) de la membrane et le facteur de concentration [22].
Le flux de perméation (J), qui peut être mesuré en temps réel, se définit comme le volume ou la masse de perméat récolté (mp) par unité de temps (Δt) et de surface filtrante (A) (Équation 2.2) [22].
Équation 2.2 Flux de perméation
J = mp ∆t ∙ A
Le flux de perméation dépend du type de membrane, de la composition du fluide filtré (teneur en protéines, viscosité, pH) et des conditions opératoires (vélocité à la surface de la membrane, TMP, température d’opération, durée d’opération) [21,22]. Au cours d’un procédé de filtration, la diminution progressive des flux de perméation s’explique par la formation d’une couche d’encrassement à la surface des membranes de filtration [21].
2.3 Encrassement des membranes de filtration
L’encrassement des membranes constitue la principale problématique des technologies de filtration [6,24]. Il est dit « réversible », lorsqu’il peut être simplement retiré par un rinçage avec de l’eau, ou « irréversible », lorsqu’un lavage de la membrane est nécessaire pour la décolmater.
La couche d’encrassement des membranes peut être formée par plusieurs mécanismes, notamment par le simple dépôt de molécules à la surface de la membrane de filtration sous l’action de la TMP, par l’adsorption chimique, la cristallisation ou la gélification des espèces dues à un phénomène de polarisation de concentration [29]. L’encrassement peut être de nature chimique ou microbiologique (formation de biofilms).
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2.3.1 Principales sources d’encrassement
2.3.1.1 Encrassement chimique
Au sein de l’industrie laitière, les principaux constituants chimiques des fluides filtrés ont un potentiel d’encrassement des membranes [30–32].
Caséines
Principales protéines du lait, les caséines sous la forme colloïdale (micelles de caséines) adhèrent aux membranes pour former une couche d’encrassement réversible. Elles ont peu d’impact sur la performance des membranes à long terme [33].
Protéines sériques (α-lactalbumine et β-lactoglobuline)
Présentes à la fois dans le lait et le lactosérum, les protéines sériques (ou protéines du lactosérum) ont beaucoup d’affinité pour les matériaux membranaires, surtout à température élevée (> 40 °C) [34]. Elles y adhèrent naturellement en conditions statique ou dynamique [32,33,35]. Leur « pouvoir encrassant » est supérieur à un pH près du point isoélectrique de l’α-lactalbumine et de la β-lactoglobuline (~ pH 5), surtout dans des fluides à force ionique élevée comme le lactosérum acide, riche en calcium ionique [34–36].
Phosphate de calcium
Le phosphate de calcium est le sel laitier le plus préoccupant du point de vue de l’encrassement des membranes en raison de sa faible solubilité dans l’eau [35]. Il peut cristalliser (texture de gel) à la surface ou à l’intérieur des membranes de filtration et ce, peu importe les propriétés de surface des membranes [35]. La précipitation est facilitée en l’absence de caséines [35].
La solubilité du phosphate de calcium ionique dépend de la température et du pH du fluide filtré [29]. Elle est inversement proportionnelle à la température, ce qui limite son potentiel d’encrassement en filtrant à basse température (10 °C) [37,38]. Elle augmente aussi avec la diminution du pH [35].
Lactose
Le lactose est le principal sucre retrouvé dans le lait [39]. Comme mentionné précédemment, il ne peut être retenu que par les membranes de NF et de RO. Même s’il peut se retrouver parmi la couche d’encrassement réversible des membranes d’UF, sa solubilité dans l’eau le rend peu propice à l’encrassement des membranes [32].
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2.3.1.2 Encrassement microbiologique
Les systèmes de filtration industriels sont opérés sur des cycles de 24 h, durant lesquels se succèdent 20 h de production et 4 h de lavage [11]. La présence de nutriments à la surface des membranes (encrassement chimique) et le maintien d’un environnement stable (température, concentration en nutriments, pH) durant la longue durée opératoire permet la formation de biofilms à la surface des membranes de filtration [9,11,40]. Effectivement, les microorganismes présents dans les fluides en cours de filtration qui adhèrent aux membranes au début du procédé de filtration ont tout le temps nécessaire pour se développer et former des biofilms. La tolérance accrue des bactéries vivant sous forme de biofilms face à certains agents chimiques (biocides, agents oxydants, certains métaux), environ 1000 fois plus importante par rapport aux bactéries planctoniques, pose un problème évident pour assurer le succès des séquences de nettoyage des membranes [2,41].
2.4 Biofilms
2.4.1 Définition d’un biofilm
À sa plus simple expression, un biofilm est une communauté de bactéries (espèces variées, cellules mortes ou vivantes) imbriquées dans un réseau de substances polymériques extracellulaires (EPS) et fixées à une surface biotique ou abiotique où une source de nutriments est disponible [6,42]. À leur stade mature, les biofilms sont souvent visibles à l’échelle macroscopique ; la plaque dentaire, les infections ou les amas gluants dans les milieux humides (salles de bain, drains, réservoirs d’eau) en sont des exemples [43,44].
Les bactéries ont de nombreux avantages à vivre en groupe (protection contre l’environnement, coopérativité métabolique, acquisition de matériel génétique) plutôt que de demeurer seules, sous la forme planctonique [45]. Ceci expliquerait pourquoi les biofilms demeurent la forme de vie la plus répandue sur Terre [46]. Ils représentent des communautés bactériennes complexes qui, grâce à des mécanismes de communication intercellulaires (quorum sensing), répondent à leur environnement à la façon d’un être pluricellulaire, avec une homéostasie et un système circulatoire primitifs et un métabolisme coopératif [46].
2.4.2 Étapes de développement des biofilms
Les biofilms sont généralement formés en quatre étapes : la formation d’une couche de conditionnement, l’adhésion des bactéries pionnières, la maturation et la dispersion (Figure 2.3) [6,8,47].
2.4.2.1 Formation d’une couche de conditionnement
Des avis contraires ont été présentés dans la littérature par rapport à la nécessité de la formation d’une couche de conditionnement pour permettre l’adhésion des bactéries à une surface [48]. S’il est vrai que la couche de conditionnement puisse nuire à l’adhésion de certaines bactéries – c’est le cas de Staphylococcus aureus ou de Listeria monocytogenes en présence d’une surface contenant des protéines laitières –, la formation d’une
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couche d’encrassement chimique est généralement reconnue pour modifier les propriétés de surface et faciliter l’adhésion des bactéries [49–51], ou servir de source de nutriments pour assurer leur croissance [12,48,52].
Figure 2.3 Les étapes de formation d'un biofilm, figure inspirée de Bremer et al. [53].
2.4.2.2 Adhésion des bactéries pionnières
L’adhésion des bactéries pionnières à la couche d’encrassement des membranes de filtration est régie par plusieurs mécanismes. Dans une revue de littérature, Vanysacker et al. [8] ont signalé l’importance des interactions hydrophobes, polaires ou électrostatiques, la formation de complexes avec des adhésines ou la motilité des cellules dans ce processus. Même si l’adhésion des bactéries présente un certain hasard, certaines bactéries dites pionnières auraient un meilleur potentiel d’adhésion que les autres [54,55]. Dans les systèmes de traitement des eaux ou les réseaux d’aqueduc, ces bactéries appartiennent à l’embranchement (phylum) des Protéobactéries (notamment Pseudomonas sp. et Acinetobacter sp.) [56–58]. Retarder l’adhésion de ces bactéries pourrait potentiellement ralentir le développement des biofilms à la surface des membranes [57]. D’ailleurs, il est important de rappeler que les membranes de filtration représentent un endroit particulièrement propice au développement des biofilms puisque cet environnement fermé ne peut être nettoyé par une action mécanique et, comme mentionné en introduction, en raison d’une polarisation de concentration engendrée par le flux convectif du fluide vers la membrane qui accentue l’adhésion des bactéries à la couche d’encrassement formés à la surface des membranes [7–10]. De fait, une réduction de la concentration de polarisation engendrée
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par une plus grande turbulence et une plus faible TMP pourrait nuire à l’adhésion des bactéries, ou promouvoir leur détachement des membranes [7].
2.4.2.3 Développement des biofilms
L’étape de développement des biofilms est marquée par le moment où la division des cellules du biofilm contribue davantage au développement de la communauté que par l’adhésion de bactéries [59]. Autrement dit, cette étape est marquée par la multiplication exponentielle des cellules qui ont adhéré aux surfaces et par la construction d’un réseau d’EPS par ces dernières [6,46,47,60]. Grâce à la production d’EPS, les biofilms en cours de développement arrivent à modifier les propriétés de la surface sur laquelle ils se sont établis afin de faciliter l’adhésion des bactéries au plus faible potentiel d’adhésion (recrutement de nouvelles espèces) [8,57,61]. Les EPS ont de plus un rôle vital pour les biofilms, car ils procurent une force de liaison entre les cellules du biofilm. Ce sont ces molécules qui assurent le rôle de structure au sein du biofilm, qui renforcent aussi la force de liaison aux surfaces [6,62,63] et qui contribueraient à améliorer la protection des bactéries au sein des biofilms face à différents agents chimiques [62].
La présence seule d’EPS au sein du biofilm n’est cependant pas suffisante pour expliquer la tolérance accrue des biofilms par rapport aux cellules planctoniques face aux agents de nettoyage [2,64] ou à certains agents antimicrobiens [46]. L’exemple de Pseudomonas aeruginosa PAO1 le démontre. Chez cette bactérie, la production d’EPS est similaire pour les bactéries en mode « biofilm » ou celles sous la forme planctonique [65]. C’est plutôt la distribution du réseau d’EPS (glycocalyx) du biofilm qui favorise les liens entre les cellules et qui limite la perméabilité de la structure aux agents chimiques [62,65]. La densité de cette structure peut être affectée par les conditions hydrodynamiques dans lesquelles le biofilm est soumis [41,66] ; elle est beaucoup plus dense à haute turbulence [67,68]. Parallèlement, la structure organisée propre aux biofilms est aussi régie par un mécanisme de communication intercellulaire appelé « quorum sensing » [62]. En quelque sorte, le
quorum sensing permet la régulation du biofilm et surtout sa différenciation par rapport aux cellules
planctoniques dès les premières étapes de sa formation [62].
Brièvement, le quorum sensing repose sur la production de signaux moléculaires (autoinducteurs) par les bactéries du biofilm [69,70]. Les mieux connus sont les homosérine lactones (AHL) produites par les bactéries à Gram négatif [71]. Au fil du développement d’une communauté, la concentration en autoinducteurs augmente dans son environnement jusqu’à l’atteinte d’une concentration seuil. À partir de celle-ci, les bactéries du biofilm arrivent à exprimer des gènes spécifiques qu’elles ne pourraient exprimer sous leur forme planctonique [71]. Les phénotypes associés à ces gènes sont variés, allant de la production d’enzymes extracellulaires à la production de toxines, voire de lumière dans des cas précis [69].
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2.4.2.4 Atteinte du stade mature et dispersion des cellules dans l’environnement
Le biofilm atteint un stade mature dès la fin de sa phase exponentielle de croissance. Le ralentissement observé peut être dû à un simple manque d’espace, ou à un stress environnemental tel un accès plus limité aux nutriments [72,73]. À ce moment, la structure du biofilm peut céder sous une force de cisaillement ou par une action coordonnée des bactéries du biofilm (quorum sensing) [47,74,75]. Les cellules planctoniques relarguées peuvent par la suite coloniser de nouvelles surfaces et redémarrer le processus de formation d’un nouveau biofilm (Figure 2.3) [47].
L’étape de relâchement ou de division du biofilm est perceptible en cours de filtration lorsque l’augmentation du nombre de bactéries dans le rétentat est supérieure au facteur de concentration volumique du fluide filtré, prouvant une contamination du fluide lors du séjour dans l’unité de filtration [11]. Ce relâchement de cellules dans le rétentat peut devenir un problème d’innocuité si un biofilm contient des bactéries pathogènes telles
Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7 ou Staphylococcus aureus. [11,76].
2.4.2.5 Début du phénomène de persistance
Les biofilms sont de plus en plus difficiles à déloger au cours du temps [2]. Ceci pourrait être expliqué, entre autres, par le fait que les biofilms renferment des bactéries dormantes dites persistantes qui représenteraient jusqu’à 1 % des bactéries d’un biofilm mature [77]. Ayant un métabolisme ralenti, ces bactéries dormantes seraient moins sensibles face aux agents utilisés pour détruire les biofilms [78]. Beaucoup de questions demeurent sans réponse quant aux mécanismes qui régissent le nombre de bactéries persistantes contenues dans un biofilm [78]. Il est toutefois connu que leur nombre augmente à partir de la deuxième moitié de la phase exponentielle de croissance d’un biofilm [77]. Il serait intéressant de vérifier si l’impossibilité de retirer toutes les bactéries d’une surface à la suite d’un nettoyage-en-place (CIP) traditionnellement réalisé dans l’industrie alimentaire est effectivement due à la présence de ces bactéries au cœur des biofilms [3].
Il est important de distinguer le phénomène de persistance de celui de la résistance. Alors que la persistance est la capacité d’une faible proportion des bactéries d’un biofilm à tolérer un stress grâce à son état de dormance, la résistance réfère plutôt au fait que certaines bactéries possèdent des mécanismes de défense spécifiques à certains agents chimiques [78].
2.5 Biofilms laitiers
Il existe deux types de biofilms dans l’industrie laitière. D’abord, les biofilms environnementaux sont ceux qui se développent lentement sur toutes les surfaces humides qui ne sont jamais en contact avec les produits laitiers (drains, planchers, murs, plafonds) [53]. Les contaminations associées à ces biofilms sont indirectes.
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À l’inverse, les biofilms de procédé se développent sur les surfaces internes des équipements. Ils sont généralement peu diversifiés (dominés par peu d’espèces bactériennes) et se développent beaucoup plus rapidement, l’instant d’une journée de production [53,79]. Les biofilms de procédé sont les plus problématiques pour l’industrie.
2.5.1 Composition des biofilms laitiers
La composition des biofilms retrouvés dans l’industrie laitière dépend fortement de la température de l’environnement dans lequel ils se développent [5]. Des levures ainsi que des Archae peuvent constituer les biofilms laitiers [80,81]. Toutefois seules les bactéries seront considérées pour la suite de cette thèse en raison de leur prédominance dans les biofilms laitiers [53]. Il est possible de diviser les bactéries en trois groupes, selon leur température optimale de croissance : les psychrotrophes, les mésophiles et les thermophiles [5].
2.5.1.1 Bactéries psychrotrophes
Jusqu’à sa transformation, le lait est maintenu à 4 °C pour ralentir sa vitesse de dégradation par les microorganismes. Cette température favorise la croissance des bactéries psychrotrophes, principalement des bactéries à Gram négatif appartenant à la classe des γ-Protéobactéries dans laquelle on retrouve Pseudomonas (la plus courante [82,83]), Acinetobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, etc. [83,84]. Ces bactéries peuvent entre autres provenir des sources d’eau utilisées pour nettoyer les conduites de la ferme ou de l’usine laitière (Tableau 2.2) [12,85]. La plupart des psychrotrophes se développent entre 0 °C et 40 °C [5]. Certaines bactéries sporulantes sont psychrotrophes, notamment certaines espèces du genre Bacillus [86] ou
Paenibacillus [5].
2.5.1.2 Bactéries mésophiles
Comme les psychrotrophes, les mésophiles ont une température maximale de croissance d’environ 40 °C, mais leur température minimale est de 10 °C [5]. Plusieurs bactéries pathogènes sont mésophiles : Bacillus cereus,
Campylobacter spp., Cronobacter sakazakii, Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp. ou
Staphylococcus aureus [5,87]. Les cultures de bactéries lactiques acidifiantes (LAB) utilisés en fromagerie le
sont aussi : Lactobacillus spp., Lactococcus lactis, Leuconostoc spp. et Streptococcus thermophilus [85]. Ces dernières sont souvent retrouvées sur les surfaces des salles de fabrication fromagère (Tableau 2.2) [80,85]. Certaines bactéries mésophiles sont particulièrement résistantes aux traitements thermiques; ces bactéries sont dites thermorésistantes ou thermoduriques [5,85]. C’est le cas des Streptococcaceae tels que
Streptococcus thermophilus, qui résiste à la pasteurisation du lait, mais dont la température optimale de
croissance se trouve autour de 35 °C, selon la souche [79,88,89]. S. thermophilus peut se développer jusqu’à 52 °C, mais ne croît généralement pas à une température inférieure à 10 °C [88].
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Tableau 2.2 La distribution des principales bactéries retrouvées dans l’usine laitière.
Température Bactéries favorisées Équipements associés
< 20 °C Psychrotrophes (Acinetobacter, Corynebacterium, Klebsiella, Paenibacillus, Pseudomonas, Pseudoalteromonas)
Réservoirs de lait, systèmes de filtrations opérés à froid, équipements à la température de la pièce [5,80,82,90]
20-40 °C Mésophiles (Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc,
Streptococcus)
Équipements de fabrication fromagère [80,85,90], sections de refroidissement des pasteurisateurs [79,91]
> 40 °C Thermophiles (Anoxybacillus, Bacillus, Brevibacillus,
Geobacillus, Thermus)
Surfaces internes des évaporateurs, conduites d’entrée des tours de séchage ou des stérilisateurs, systèmes de filtration opérés à chaud, sources d’eau chaude [11,90,92–95]
2.5.1.3 Bactéries thermophiles
Enfin, les bactéries thermophiles, qui se développent dans les environnements chauds (entre 45 °C et 70 °C), sont peu nombreuses dans le lait cru [5,96]. Elles appartiennent le plus souvent à l’embranchement des Deinococcus-Thermus, tel que Thermus thermophilus, ou à celui des Firmicutes, plus précisément dans la famille des Bacillaceae (Anoxybacillus flavithermus, Bacillus spp., Geobacillus spp.) [90,93]. Étant très résistantes à de nombreux stress, elles survivent tout au long du parcours des fluides laitiers dans l’usine et se développent où les autres n’en ont pas la capacité [93,95]. De fait, elles dominent les surfaces des sorties de ligne de pasteurisation ou celles d’entrée des évaporateurs et des tours de séchage (Tableau 2.2) [93] et peuvent se retrouver dans les sources d’eau chaude de l’usine (Tableau 2.2) [95]. Étant peu diversifiées au sein de l’industrie laitière, ces bactéries forment généralement des biofilms mono-espèce [93]. Les Bacillaceae se démarquent par leur production d‘endospores, qui leur permettent de persister plus facilement dans les sections subséquentes aux traitements thermiques [93,97]. Le temps de génération rapide des Bacillaceae, d’environ 15 à 20 minutes, doit aussi être souligné [93,98].
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2.6 Encrassement microbiologique de membranes de filtration
A priori, les bactéries composant l’environnement laitier sont celles qui devraient adhérer et se développer à lasurface des membranes de filtration. Dans la littérature, Anand et al. [11] ont entre autres dénombré
Lactococcus spp., Lactobacillus spp., Pseudomonas spp., les coliformes et E. coli à la surface de membranes
de filtration industrielles. Dans l’industrie laitière, aucune étude n’a toutefois permis de regarder en dehors de ce qui est généralement attendu. Des portraits beaucoup plus précis ont été réalisés dans les industries de la désalinisation de l’eau de mer [99,100] et du traitement des eaux [57,58,101]. Globalement, à la surface de ces membranes, les Protéobactéries sont généralement pionnières, notamment les α- et les γ-Protéobatéries lors de la désalinisation ou la purification de l’eau [99,102] et les β-Protéobactéries (en plus des Planctomycetaceae et des Flavobacteriaceae tel que Chryseobacterium spp.) lors du traitement des eaux [101]. Plusieurs divergences ont toutefois été notées dans la littérature, probablement en raison de la variabilité des milieux étudiés et des prétraitements réalisés avant les études de filtration [57].
2.7 Stratégies de prévention et de contrôle des biofilms
La première stratégie utilisée en industrie pour prévenir la formation de biofilms à la surface des membranes de filtration demeure le lavage quotidien des membranes et la pasteurisation des fluides pour diminuer leur charge bactérienne. Pour le traitement d’eau par procédé baromembranaire, la modification de certains paramètres opératoires permettrait aussi de prévenir leur formation, soit en réduisant la TMP (Section 2.4.2.2) [7], en augmentant la vélocité du rétentat [66,103] ou en diminuant la température d’opération [93,104–107].
La modification des propriétés de surface aurait un potentiel intéressant pour limiter l’adhésion des bactéries aux surfaces polymériques [108,109], mais cette stratégie aurait peu d’impact sur le nombre de bactéries adhérées à plus long terme [52,110]. En fait, la modification des propriétés de surface permettrait de retarder l’adhésion des bactéries. Une fois installées, ce sont plutôt les propriétés de surface des bactéries (et des EPS qu’elles produisent) qui dirigeraient l’adhésion des suivantes [8,47,57,61]. De plus, comme la formation d’une couche d’encrassement chimique est très rapide lors de la filtration de fluides laitiers (environ 30 secondes lors de la MF du lait [111]), l’affinité qu’ont les bactéries pour les molécules encrassant la membrane doit aussi être considérée.
Enfin, l’efficacité des propositions précédentes est toutefois conditionnelle à la réalisation de lavages efficaces des membranes de filtration.
2.7.1 Le nettoyage des membranes de filtration
Au sein de l’industrie laitière, les lavages des membranes de filtration sont réalisés quotidiennement [6,31] après des cycles de filtration qui peuvent d’environ 20 h, ou jusqu’à ce que les performances des systèmes soient
en-14
deçà de leur seuil de rentabilité [6,11]. Les produits chimiques utilisés pour le nettoyage des membranes sont sélectionnés en fonction de la composition des fluides filtrés et des propriétés physico-chimiques de la couche d’encrassement [112]. Un traitement de nettoyage-assainissement efficace devrait :
Permettre la solubilisation complète des composantes de la couche d’encrassement ou le maintien en suspension de celles-ci
Avoir un pouvoir moussant modéré afin d’augmenter la turbulence
Avoir un bon pouvoir tampon pour maintenir l’efficacité des solutions de lavage Avoir un pouvoir assainissant
Être chimiquement compatible avec les membranes [112,113].
En règle générale, la procédure de nettoyage « classique » des membranes filtrant des fluides laitiers est réalisée en plusieurs étapes (lavage alcalin, traitement avec des agents surfactants, lavage acide, traitement enzymatique, deuxième traitement avec surfactants et assainissement) [2]. Pour certaines membranes, des oxydants forts (hypochlorite de sodium) peuvent être combinés au lavage alcalin pour améliorer son efficacité [113]. Les membranes polymériques composées de polyamide ou de polypropylène (PP) sont toutefois très sensibles aux agent oxydants et ne permettent pas un tel traitement [24,112,114]. Des stratégies de nettoyage spécifiques au contrôle des biofilms qui incluent l’utilisation simultanée d’enzymes et d’un surfactant (pénétration de la matrice du biofilm) [6,115], d’enzymes seules ou d’assainisseurs ont montré des effets substantiels pour la réduction du nombre de bactéries à la surface [2,116,117]. Cependant, aucun de ces traitements ne permet le retrait total des biofilms.
2.7.2 Stratégies émergentes
D’autres stratégies ont aussi été proposées dans la littérature pour prévenir la formation des biofilms, mais leur application en industrie n’a pas encore été démontrée. Parmi celles-ci figurent la contamination artificielle des membranes par un biofilm protecteur (bioengineering) [118], l’utilisation de molécules inhibant la communication intercellulaire (quorum sensing) [119] ou de bactéries produisant ces molécules [120,121]. Autrement, la littérature abonde de travaux réalisés sur le développement de nouveaux matériaux greffés de métaux (titane, argent, aluminium) ou de groupements chimiques divers inhibant la formation de biofilms [114]. Cette stratégie est intéressante pour la filtration d’eau, mais certainement moins efficace lors de la filtration de fluides laitiers en raison, comme mentionné précédemment, de la formation rapide d’une couche d’encrassement qui réduit l’impact des propriétés de surface des membranes [111].
Comme les bactéries sont vivantes, c’est leur comportement qui devrait être examiné pour arriver à les contrôler avant qu’elles ne développent une tolérance aux procédures de nettoyage [115]. Le développement de