Effets du traitement à l’hémine sur l’expansion et la
différenciation des cellules souches hématopoïétiques
Mémoire
Catherine Giroux
Maîtrise en médecine moléculaire
Maître ès sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
Effets du traitement à l’hémine sur l’expansion et la
différenciation des cellules souches hématopoïétiques
Mémoire
Catherine Giroux
Sous la direction de :
Yannick Doyon, directeur de recherche
Josée Laganière, codirectrice de recherche
iii Résumé
L’hémine humaine, connue commercialement sous l’appellation Normosang® ou Panhematin® est un produit utilisé comme agent thérapeutique pour le traitement des attaques aigües de porphyrie, maladie génétique affectant la biosynthèse de l’hème. Récemment, le traitement d’une patiente atteinte d’anémie hémolytique auto-immune sévère et de réticulocytopénie a été pris en charge par un médecin hématologue d’Héma-Québec. Le traitement de cette patiente au Normosang® a entre autres contribué à l’augmentation de son nombre d’érythrocytes et a contribué au rétablissement de son état de santé. Nous avons ainsi entrepris ce projet dans le but d’évaluer les effets de l’hémine sur l’expansion et la différenciation des cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon dans un milieu de culture favorisant la différenciation érythroïde. Le suivi de l’expansion montre que l’hémine semble avoir un effet positif sur la croissance des cellules lors de leur différenciation érythroïde. Les résultats montrent que l’hémine semble aussi avoir un effet sur les précurseurs érythroïdes engagés dans l’érythropoïèse. L’analyse de la différenciation montre que l’hémine semble stimuler la différenciation érythroïde, ainsi que l’énucléation. L’approfondissement de ces connaissances pourrait ultimement permettre d’élargir le spectre d’application clinique du Normosang®.
iv Abstract
Human hemin, commercialized as Normosang® or Panhematin®, is a therapeutic agent approved for the treatment of acute attacks of porphyria, a genetic disease causing a malfunction of the heme biosynthesis pathway. Recently, the treatment of a patient with severe autoimmune hemolytic anemia and reticulocytopenia was managed by a hematologist from Héma-Québec. The treatment of this patient with Normosang® has, among other things, contributed to the increasing erythrocyte levels and contributed to the complete recovery of this patient. The aim of this project was to evaluate the effects of hemin on the expansion and differentiation of hematopoietic cord blood stem cells in a culture media favoring erythroid differentiation. Results show that hemin has a positive effect on cell growth during their erythroid differentiation. The results show that hemin also appears to have an effect on erythroid precursors. Differentiation analysis points to a possible role for hemin in the stimulation of erythroid differentiation as well as enucleation. More knowledge on the subject could ultimately support a larger spectrum of clinical applications.
v Table des matières
Résumé ... iii
Abstract ... iii
Table des matières ... v
Liste des figures ... viii
Liste des tableaux ... ix
Liste des abréviations ... x
Remerciements ... xii
1. Introduction ... 1
1.1 Les cellules souches ... 1
1.1.1 Bref historique des cellules souches... 1
1.1.2 Définition des cellules souches ... 1
1.1.3 Cellules souches hématopoïétiques ... 2
1.1.3.1 Cellules souches de sang de cordon ombilical ... 3
1.1.3.2 Hématopoïèse ... 3
1.1.3.3 Érythropoïèse ... 5
1.1.4 Applications thérapeutiques des cellules souches ... 8
1.2 L’hémoglobine, l’hème et molécules reliées ... 9
1.2.1 L’hémoglobine ... 9
1.2.2 L'hème………...………10
1.2.2.1 L’hémopexine ... 10
1.2.2.2 Catabolisme de l’hème ... 11
1.2.3 L’hémine ... 12
1.2.3.1 Mécanisme d’action et fonction de l’hémine ... 13
1.2.3.2 L’hémine comme agent thérapeutique ... 15
1.3 Modèles cellulaires ... 16
1.3.1 Cellules de leucémie myéloïde chronique K562 ... 16
1.3.2 Cellules souches de sang de cordon ... 16
1.3.3 Les globules rouges in vitro ... 17
1.3.4 Hyperthermie ... 20
1.4 Le système sanguin ... 20
vi
1.4.2 Les maladies du système hématopoïétiques ... 21
1.5 Héma-Québec ... 21
1.5.1 Cas clinique ayant motivé la présente étude ... 22
1.5.2 Origine et intérêt du projet ... 23
2. Hypothèse ... 25
3. Objectifs ... 26
4. Matériels et méthodes ... 28
4.1 Modèle d’étude ... 28
4.2 Sources de cellules souches CD34+ ... 28
4.2.1 Traitement de sang de cordon ombilical ... 28
4.2.2 Protocole ISHAGE ... 29
4.2.3 Sélection des cellules CD34+ ... 30
4.3 Culture cellulaire ... 31
4.3.1 Milieux de culture ... 31
4.3.2 Conditions de culture ... 31
4.3.3 Suivi de la viabilité et de l’expansion ... 32
4.3.4 Détermination qualitative de la production d’hémoglobine ... 33
4.4 Analyse phénotypique par cytométrie en flux ... 33
4.4.1 Anticorps utilisés ... 33
4.4.2 Marquage extracellulaire ... 34
4.4.3 Analyses des données ... 35
4.5 Analyse morphologique ... 36
4.5.1 Coloration Wright-Giemsa ... 36
4.5.2 Analyse des stades de différenciation érythroïde... 37
4.5.3 Détermination de l’énucléation ... 37
5. Résultats ... 39
5.1 Effet de l’hémine sur les cellules modèles K562 ... 39
5.1.1 Dose réponse ... 39
5.1.2 Impact du traitement à l’hémine sur la production d’hémoglobine et la différenciation érythroïde des cellules K562 ... 41
5.1.3 Comparaison de l’effet de l’hémine sur les cellules K562 en conditions de culture normales et en conditions d’hyperthermie légère ... 43
vii
5.2 Effets de l’hémine sur les cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon dans
le milieu de culture maison Héma-Québec ... 45
5.2.1 Effets de l’hémine lorsqu’ajoutée en début de culture ... 45
5.2.1.1 Caractérisation phénotypique de la différenciation érythroïde ... 48
5.2.1.2Viabilité des cellules totales ... 49
5.2.1.3Expansion des cellules totales ... 46
5.2.1.4 Morphologie cellulaire ... 53
5.2.1.5 Caractérisation de la modulation de l’énucléation ... 55
5.2.2 Effets de l’hémine lorsqu’ajoutée plus tard en cours de culture ... 57
5.2.2.1 Caractérisation phénotypique de la différenciation érythroïde ... 59
5.2.2.2Viabilité des cellules totales ... 60
5.2.2.3Expansion des cellules totales ... 58
6. Discussion ... 62
6.1 L’hémine influence l’expansion et la viabilité des cellules de leucémie myéloïde chronique K562 ... 62
6.2 L’hémine influence l’expansion et la différenciation des cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon ... 64
6.3 Perspectives ... 68
7. Conclusion ... 71
viii Liste des figures
Figure 1.1 -L’hématopoïèse ... 5 Figure 1.2 -L’érythropoïèse ... 8 Figure 1.3 -Prise en charge de l’hème et de l’hémine par l’hémopexine ... 13 Figure 4.1 -Stratégie d’analyse des cellules pour l’identification des CD34+, des CD71+ et des CD235+ ... 36 Figure 5.1 -Effet de différentes concentrations d’hémine sur l’expansion et la viabilité des cellules K562 ... 41 Figure 5.2 -Impact d'un traitement à l'hémine sur la production d'hémoglobine chez les K562 ……….... 42 Figure 5.3 -Effet de l'hémine sur la viabilité et l'expansion des cellules K562 en condition normale et en condition d'hyperthermie………45 Figure 5.4 -MFI de l’expression du marqueur CD235a chez les précurseurs érythroïdes
traités à l’hémine ……….………….……..48
Figure 5.5 - Effet de l'hémine sur la viabilité des précurseurs érythroïdes ……..……….49
Figure 5.6 – Effet de l'hémine sur l'expansion des précurseurs érythroïdes ... 51
Figure 5.7 -Morphologie des précurseurs érythroïdes traités à l’hémine ... 55
Figure 5.8 -Différenciation érythroïde des précurseurs érythroïdes traités à l’hémine au jour 11 de culture ... 59 Figure 5.9 -Effet d’un traitement à l’hémine ajoutée au jour 11 de culture sur l’expansion et la viabilité des précurseurs érythroïdes ... 61
ix Liste des tableaux
Tableau 4.1 -Liste des anticorps utilisés pour le marquage des précurseurs érythroïdes ... 34 Tableau 5.1 -Expansion cellulaire des précurseurs érythroïdes en présence
d'hémine………....53 Tableau 5.2 -Comparaison des cellules nucléées et énucléées dans le milieu maison Héma-Québec……….. 58
x Liste des abréviations
7-AAD – 7-amino-Actinomycin D ADN – Acide désoxyribonucléique AO – Acridine orange
APC - Allophycocyanin
ARE – Antioxydant Responsive Element ARN – Acide ribonucléique
ARNm - Acide ribonucléique messager ATCC – American Type Culture Collection ATP – Adénosine tri-phosphate
BIT – Bovine serum albumin Insulin Transferrin BFU-E – Burst Forming Unit –Erythroid
BSA – Bovine Serum Albumin (albumine de sérum bovin) CFU-E – Colony Forming Unit –Erythroide
CO – Monoxyde de carbone CO2 – Dioxyde de carbone
DAPI – 4’, 6-diamino-2-phénylindole DMSO –Diméthylsulfoxyde
EDM – Erythroid Differentiation Medium (milieu de différenciation érythroïde) EDTA – Ethylenediaminetetraacetic
EPO - Érythropoïétine
FBS – Fetal Bovine Serum (sérum fétal de bœuf) Fe – Fer
FITC - Fluorescein
FMO – Fluorescence Minus One (fluorescence moins un) Ge – Groupe sanguin Gerbich
GPC – Glycophorine C
GVHD – Graft Versus Host Disease (maladie du greffon contre l’hôte) HO – Hème oxygénase
HSA – Human Serum Albumin (albumine sérique humaine) HSP – Heat shock protein (protéine de choc thermique) HLA – Human Leucocyte Antigen
CSH – Cellule Souche Hématopoïétique IgG – Immunoglobuline G
IL – Interleukine
IMDM – Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium
ISHAGE – International Society For Hematotherapy And Graft Engineering LDL – Low Density Lipoprotein
LRP/CD91 – Low-density-lipoprotein Receptor-related Protein/CD91
MFI – Median Fluorescence Intensity (médiane de l’intensité de fluorescence) Mk – Mégacaryocyte
NK – Natural Killer PE - Phycoerythrin
xi ROS – Reactive Oxygen Species
RPM – Rotation par minute
RPMI – Roswell Park Memorial Institute medium SCF – Stem Cell Factor
SOx – Stress oxydatif
xii Remerciements
Je tiens tout d’abord à remercier Josée Laganière, ma directrice de recherche, pour m’avoir proposé ce projet de recherche qui sort de l’ordinaire, ce fut un beau défi! Merci pour tes conseils, ta confiance en moi et l’autonomie que tu m’as laissée tout au long du projet. Je te remercie aussi de m’avoir fait sortir de ma zone de confort, autant au niveau personnel que scientifique.
Je tiens aussi à remercier l’équipe de recherche : Yelena Boccacci pour les travaux effectués sur les K562 qui ont mené aux résultats présentés dans ce mémoire; Mathieu Drouin pour toute l’aide apportée en ce qui concerne les techniques de culture cellulaire; Nellie Dumont pour avoir continué les expérimentations dans le milieu de culture EDM; ainsi que Pascal Rouleau, Marie-Ève Rhéaume, Geneviève Laflamme et Lusiné Bozoyan pour toute l’aide apportée, les nombreux échanges et les judicieux conseils. Merci d’avoir facilité mon apprentissage et de m’avoir fait cheminer en tant que scientifique.
Je remercie aussi tous les autres membres de la recherche et développement d’Héma-Québec d’avoir facilité et rendu agréable la poursuite de ce projet de maîtrise. Un merci tout particulier aux auxiliaires de laboratoire, qui facilitent quotidiennement notre travail.
Merci aussi à Maryse St-Louis de m’avoir accueillie dans son équipe pour mes stages de premier cycle et de m’avoir permis de poursuivre mon cheminement académique au sein d’Héma-Québec.
Un merci spécial à Josée Lavoie pour m’avoir encadrée, guidée, conseillée, encouragée et écoutée depuis mon tout premier stage chez Héma-Québec. Merci aussi d’avoir écouté toutes mes histoires rocambolesques et de m’avoir donné tous ces conseils!
Je termine en remerciant mes parents, mon frère, mes amis et ma famille qui m’ont toujours encouragé, qui se sont intéressés à ce que je faisais et qui m’ont poussé à constamment me dépasser et m’améliorer. Un merci particulier à mes parents pour votre support inconditionnel!
1 1. Introduction
1.1 Les cellules souches
1.1.1 Bref historique des cellules souches
Il est reconnu par la communauté scientifique, qu’Ernest McCulloch et James Till ont démontré avec les preuves scientifiques les plus solides, l’existence des cellules souches. En effet, leurs travaux sur les souris dans les années soixante ont permis de définir les fonctions et les propriétés des cellules souches hématopoïétiques [1, 2]. Parmi les travaux les plus importants à ce jour on retrouve ceux menés par Martin Evans et Matt Kauffman en 1981, qui ont permis d’identifier, d’isoler et de cultiver des cellules souches embryonnaires provenant de blastocystes de souris [1, 3]. Puis, en 1998, James Thomson, a réussi à isoler des cellules souches embryonnaires humaines et de les cultiver en laboratoire. Ces nouvelles connaissances permettent désormais en théorie de pouvoir produire en laboratoire tout type de cellule humaine [1, 3]. C’est pourquoi, depuis ces découvertes majeures, les travaux sur les cellules souches ne continuent d’évoluer et de se multiplier dans divers domaines de recherche.
1.1.2 Définition des cellules souches
Les cellules souches sont des cellules d’un grand intérêt scientifique et médical. Ce sont des cellules autant retrouvées au stade embryonnaire qu’au stade adulte, dont peuvent découler plusieurs types de cellules spécialisées. Elles sont donc jeunes et immatures. Les cellules souches sont définies par deux caractéristiques : la capacité d’auto-renouvellement et le potentiel de différenciation [1, 4, 5]. Il est connu que plus une cellule est différenciée, plus elle perd sa capacité d’auto-renouvellement. La capacité d’auto-renouvellement consiste en une division cellulaire dont la cellule mère donne naissance à deux cellules filles totalement identiques. Cela permet de conserver un réservoir de cellules souches tout au long de la vie de l’organisme [5]. Le potentiel de différenciation consiste en une transformation de la cellule souche vers une cellule dite différenciée, donc spécialisée et ayant une fonction unique. Cela est possible selon l’environnement auquel est exposé la cellule, c’est-à-dire les stimuli qu’elle va percevoir et qui vont modifier ses voies de signalisation grâce à la présence
2
entre autres de cytokines, de facteurs de croissance et de facteurs de transcription, ainsi qu’à l’expression de ses gènes [5]. Ce ne sont donc pas toutes les cellules souches qui possèdent le même potentiel de différenciation. Il existe d’ailleurs différents types de cellules souches selon leur capacité d’auto-renouvellement et de différenciation. Les cellules souches les plus primitives sont les cellules souches dites totipotentes. Ces cellules ont la capacité de donner naissance à tout type de cellules pouvant constituer un organisme viable. Ces cellules ne sont présentes qu’au stade embryonnaire, c’est-à-dire du zygote au blastocyste, puisqu’elles constituent les annexes embryonnaires [1]. Par la suite, il y a les cellules souches dites pluripotentes. Ces cellules ont la capacité de se différencier en presque tous les types cellulaires. Elles sont dérivées des trois feuillets germinaux et sont donc présentes dans l’organisme seulement au stade embryonnaire, soit lors de la formation initiale de l’embryon [4]. Ensuite, il y a les cellules souches multipotentes qui peuvent quant à elles se différencier en divers types cellulaires [1], mais sont déjà engagées dans une voie de différenciation, comme par exemple les cellules souches hématopoïétiques. Enfin, il y a les cellules souches unipotentes. Ce type de cellule souche n’est présent qu’après la naissance et est localisé dans le tissu d’intérêt. Ce type de cellule souche ne peut se différencier qu’en un seul type cellulaire de même nature possédant une seule fonction tout en s’auto-renouvelant, tel que les cellules souches musculaires qui se différencient uniquement en cellules musculaires [1].
1.1.3 Cellules souches hématopoïétiques
Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) ont la propriété d’être multipotentes [1], elles ont donc la capacité d’auto-renouvellement et de différenciation. Les CSH peuvent donc proliférer et se différencier et sont à l’origine de tous les types de cellules hématopoïétiques matures, tels que les érythrocytes, les plaquettes ou les lymphocytes, qui constituent le système sanguin [6]. Le processus de formation et de renouvellement de ces différentes cellules se nomme hématopoïèse. Suivant le stade de cellule souche, l’hématopoïèse donne lieu à la production de progéniteurs. Les progéniteurs sont des cellules engagées dans une lignée de différenciation, soit myéloïde ou lymphoïde et se différencient ultimement en précurseurs. Les précurseurs vont ensuite permettre la production de cellules hématopoïétiques matures [6]. Les sources de CSH chez l’humain sont multiples. La moelle
3
osseuse constitue la source principale de cellules souches hématopoïétiques. On retrouve aussi des cellules souches hématopoïétiques dans le sang périphérique. [6]. Enfin, le sang de cordon est une source de cellules souches de plus en plus utilisée de nos jours à des fins médicales.
1.1.3.1 Cellules souches de sang de cordon ombilical
Plus récemment, les cellules souches collectées à partir du sang de cordon ombilical sont devenues une source intéressante de CSH à des fins thérapeutiques. Normalement traité comme un déchet biologique, le sang de cordon est désormais reconnu comme étant une source riche en CSH [7]. Cette source de CSH est principalement utilisée pour traiter des personnes dont les cellules de la moelle osseuse sont affectées, dans le cas d’une aplasie ou d’un cancer par exemple et qui sont en attente d’une greffe de cellules souches [6, 7]. Elles peuvent donc être utilisées autant pour la greffe autologue qu’allogénique [6]. Par contre, cette source très intéressante de cellules souches possède aussi ces limitations. En effet, une unité de sang de cordon, c’est-à-dire qui provient d’un seul cordon ombilical, possède un nombre de cellules souches assez limité. Ainsi, dû à une faible présence de cellules souches, il est difficile de greffer un patient adulte avec succès. Le sang de cordon est donc une option envisagée pour le traitement de patients pesant moins de 50 kg, majoritairement des enfants [7]. Par leur potentiel d’auto-renouvellement et de différenciation, ainsi que leur accessibilité, les CSH issues du sang de cordon représentent d’ailleurs une source intéressante de CSH à des fins de recherche.
1.1.3.2 Hématopoïèse
Le processus de production et de renouvellement des diverses cellules sanguines se nomme hématopoïèse. Ce processus inclut la différenciation des CSH en des cellules sanguines plus matures ayant une seule fonction spécialisée (Figure 1.1) [8, 9]. La majorité des cellules souches hématopoïétiques humaines possèdent le marqueur phénotypique CD34+ à leur surface [6]. L’expression de ce marqueur sera par la suite perdue en cours de différenciation. L’hématopoïèse se déroule à différents endroits selon le stade de développement [9]. Lors du développement embryonnaire, les CSH sont produites dans la région de
l’aorte-gonade-4
mésonéphros [9]. Elles vont par la suite migrer vers le placenta et le foie entre 5 et 12 semaines suivant la conception pour compléter leur maturation [9]. Entre 12 semaines suivant la conception et la naissance, les CSH vont plutôt migrer vers la rate pour leur maturation [9]. Enfin, près de la naissance, les CSH vont se diriger vers la moelle osseuse pour compléter leur maturation [8, 9]. Suivant la naissance, la moelle osseuse devient l’unique site de l’hématopoïèse [8, 9]. Durant ce processus, les cytokines et les facteurs de croissances présents dans l’environnement extracellulaire et l’expression génique propre aux cellules déterminent la voie dans laquelle elles vont poursuivre leur différenciation [6]. Les CSH les plus primitives peuvent ainsi engager leur différenciation vers deux grandes lignées, la lignée myéloïde ou la lignée lymphoïde. À partir du progéniteur lymphoïde commun, la différenciation dans la voie lymphoïde mène à la formation des lymphocytes B, des lymphocytes T, ainsi que des cellules Natural Killer (NK) [6]. Les cellules souches engagées dans la voie myéloïde peuvent quant à elles s’engager, à partir du progéniteur myéloïde commun, vers la voie menant à la production d’érythrocytes ou de mégacaryocytes responsables de la production de plaquettes ou celle menant à la production des granulocytes et des monocytes [6]. Ainsi, les cellules en différenciation passent par plusieurs stades intermédiaires. Chacun de ces stades donne lieu à un répertoire de cellules de plus en plus différenciées, engagées de plus en plus définitivement dans leur lignée. L’ultime stade de différenciation donne lieu à un seul type cellulaire, ayant une seule fonction spécialisée [8]. Ces cellules adoptent d’ailleurs des phénotypes et des caractéristiques en évolution durant la différenciation, jusqu’à ce qu’elles deviennent matures. Ce sont ces phénotypes, plus précisément les marqueurs phénotypiques retrouvés à la surface des cellules, qui permettent de suivre l’évolution de l’hématopoïèse. Ces différentes cellules progénitrices ou précurseurs possèdent ainsi un potentiel de prolifération et de différenciation qui diffèrent entre ces stades de maturation. [6] À maturité, les cellules quittent la moelle osseuse pour se diriger vers le système sanguin, où elles pourront exercer leurs fonctions. L’hématopoïèse est un processus qui se déroule tout au long de la vie d’un être humain, ce qui permet le renouvellement constant des cellules sanguines [8].
5
Figure 1.1 L’hématopoïèse
L’hématopoïèse débute avec les CSH ayant les propriétés d’auto-renouvellement et de différenciation. Lors de leur différenciation, les cellules perdent leur potentiel d’auto-renouvellement et peuvent s’engager dans l’une ou l’autre des voies de différenciation : la voie lymphoïde ou la voie myéloïde.
1.1.3.3 Érythropoïèse
L’érythropoïèse est le processus de l’hématopoïèse qui permet la production des globules rouges, aussi connus sous le nom d’érythrocytes [10]. Elle se déroule donc dans la moelle osseuse. L’érythropoïèse débute via les cellules souches hématopoïétiques qui produisent les progéniteurs érythroïdes. Les progéniteurs les plus primitifs sont les burst forming
unit-erythroid (BFU-e) [6]. Les BFU-e produisent ensuite les colony forming unit-erythroid (CFU-e) [6]. Les CFU-e sont donc les progéniteurs les plus tardifs et produisent les précurseurs érythroïdes, qui eux, passent par de multiples étapes de différenciation érythroïde pour former les réticulocytes [6, 10]. L’érythropoïèse est largement régulée par l’érythropoïétine (EPO) [11]. En fait, l’EPO stimule l’érythropoïèse en liant et activant le
6
récepteur EPO à la surface des progéniteurs érythroïdes [11, 12]. Lors de l’apparition de ce récepteur, les cellules sont définitivement engagées dans la voie de différenciation érythroïde. Plus spécifiquement, l’EPO favorise la prolifération, la différenciation et la survie de ces progéniteurs, via diverses voies de signalisation [11, 12]. De plus, l’effet combiné de l’EPO et du facteur de croissance stem cell factor (SCF), favorise l’expansion des progéniteurs érythroïdes [11]. Au cours de ce processus de différenciation, des changements phénotypiques apparaissent à la surface des cellules. Cela se traduit par l’apparition ou la disparition de certains récepteurs de surface [13]. Tout d’abord, l’expression du marqueur CD34 est rapidement perdue chez les progéniteurs érythroïdes [14]. L’expression du marqueur CD71 (récepteur de la transferrine) se fait plus primitivement chez les cellules impliquées dans l’érythropoïèse. Effectivement, l’expression du marqueur CD71 est plus élevée chez les progéniteurs érythroïdes plus primitifs, soit les BFU-e [14]. Son expression décroît au cours de la différenciation érythroïde et il y a perte de ce marqueur lors de la maturation finale des précurseurs érythroïdes en réticulocytes [8, 14]. Au contraire, l’expression du marqueur CD235a (glycophorine A) se fait plus tardivement au cours de la différenciation érythroïde [13]. Ainsi, CD235a est absent au stade de progéniteur érythroïde et son apparition est remarquée au stade de précurseur érythroïde [13]. L’apparition de CD235a se fait donc chez les cellules érythroïdes plus matures et ce phénomène est accompagné d’une hémoglobinisation des cellules [13]. Ces deux marqueurs permettent donc de suivre l’évolution de la différenciation des cellules impliquées dans l’érythropoïèse. De plus, les cellules engagées dans l’érythropoïèse subissent de nombreux changements morphologiques tout au long des étapes de différenciation érythroïde (Figure 1.2). Les CSH impliquées dans l’érythropoïèse sont majoritairement retrouvées sous forme de progéniteurs érythroïdes produisant par la suite les précurseurs érythroïdes : les érythroblastes. On les retrouve initialement au stade de proérythroblaste. À ce stade, les cellules sont très grosses et plus ou moins rondes. La chromatine prend beaucoup de place dans la cellule et le pH du cytoplasme est acide étant donné sa richesse en ARN [15]. Par la suite, on retrouve le stade érythroblaste basophile, où les cellules ont diminué en taille et où le cytoplasme est toujours acide [15]. Ensuite, lors du stade érythroblaste polychromatophile, les cellules ont encore un peu diminué en taille et la chromatine commence à se condenser vers la paroi cellulaire [10, 15]. C’est à ce moment que le cytoplasme commence à devenir basique, étant donné la
7
synthèse d’hémoglobine [10]. Suivant cela, les cellules passent au stade d’érythroblaste acidophile, qui est le dernier stade avant l’énucléation. Ainsi, les cellules ont encore diminué en taille, la chromatine est très condensée à la paroi cellulaire et le cytoplasme est plutôt basique et constitue la majorité de la cellule. C’est à ce stade que la cellule va expulser son noyau, phénomène appelé énucléation [10, 15]. Enfin, les cellules atteignent le stade de réticulocyte. Les réticulocytes ainsi formés dans la moelle osseuse, ont diminué en taille et contiennent toujours leurs organelles, soit les mitochondries et les ribosomes [10]. Les réticulocytes vont par la suite quitter la moelle osseuse pour rejoindre la circulation sanguine, afin de procéder à la maturation finale en érythrocytes [10]. Les cellules vont ainsi acquérir une forme circulaire et biconcave facilement identifiable. C’est cette transformation morphologique qui va engendrer la perte des organelles, la diminution de taille et la stabilité membranaire et qui va faire en sorte que les réticulocytes maturent en érythrocytes pouvant désormais exercer leurs fonctions [10].
8
Figure 1.2 L’érythropoïèse
L’érythropoïèse débute avec une cellule au stade de proérythroblaste. Elle passe ensuite par les stades d’érythroblaste basophile, polychromatophile et acidophile. Enfin, il y a le stade de réticulocyte nucléé, où le noyau est expulsé en fin de maturation pour former le réticulocyte. Photos obtenues par Catherine Giroux à travers l’expérimentation.
1.1.4 Applications thérapeutiques des cellules souches
Les cellules souches, particulièrement les cellules souches hématopoïétiques, lorsque greffées chez le patient, ont le potentiel de reconstituer le système hématopoïétique [6]. Il est donc possible, suivant un traitement de chimiothérapie à forte dose affectant le système hématopoïétique, de reconstituer ce système grâce à une greffe de cellules souches. La greffe peut-être autologue, c’est-à-dire que les cellules souches proviennent du patient lui-même. La greffe peut aussi être allogénique, donc les cellules proviennent d’un donneur apparenté à l’égard du système Human Leucocyte Antigen (HLA) [6]. Les greffes autologues et
9
allogéniques ont ainsi des portées thérapeutiques et potentiellement curatives dans les cas de leucémie ou de différents types de myélomes par exemple [6].
1.2 L’hémoglobine, l’hème et molécules reliées 1.2.1 L’hémoglobine
L’hémoglobine est une hémoprotéine présente dans les érythrocytes. Elle est globalement composée d’une association symétrique de deux dimères identiques de globine, formant au final un tétramère. Chaque molécule de globine contient une molécule d’hème liant un atome de fer [16]. L’hémoglobine est responsable de transporter l’oxygène à travers le corps humain, via une liaison réversible de l’atome de fer à l’oxygène [16]. Plus spécifiquement, la nature des sous-unités de globines varie selon l’état des cellules. Lors du stade de développement fœtal, les dimères de globine sont composés de globine alpha et de globine gamma, donnant l’hémoglobine fœtale (α2γ2) [16]. À l’âge adulte les dimères de globine sont
composés de globine alpha et de globine beta, donnant l’hémoglobine adulte (α2β2) [16]. Le
gène de l’alpha globine est situé sur le chromosome 16, tandis que les gènes de la beta globine et de la gamma globine sont situés sur le chromosome 11 [16]. Ainsi, la régulation de ces gènes se fait selon l’état de développement de l’organisme. À la naissance, le gène de la gamma globine qui était préalablement exprimé est régulé à la baisse et le gène de la beta globine commence à être exprimé. Le gène de l’alpha globine reste quant à lui constitutivement exprimé. On remarque donc le changement d’un phénotype d’hémoglobine fœtale vers un phénotype d’hémoglobine adulte suivant la naissance [16]. Au cœur de chaque sous-unité de globine du tétramère se situe une cavité qui permet de lier par des forces non covalentes la molécule d’hème. L’hème est constitué d’un anneau porphyrine qui contient en son centre un atome de fer [16]. C’est cet atome de fer qui permet la liaison de l’oxygène à la molécule d’hémoglobine, ce qui permet ainsi son transport des poumons vers le reste de l’organisme [16]. Une molécule d’hémoglobine peut donc transporter quatre molécules d’oxygène. Par contre, l’affinité pour l’oxygène varie selon la nature des sous-unités qui compose l’hémoglobine. Effectivement, l’hémoglobine fœtale a une affinité pour l’oxygène légèrement supérieure à l’hémoglobine adulte [16].
10 1.2.2 L’hème
Tel que décrit précédemment, les érythrocytes sont des cellules sanguines produites dans la moelle osseuse. Normalement, ils ont une durée de vie d’environ 120 jours [17]. Lors de l’hémolyse, soit la lyse normale des érythrocytes en fin de vie, l’hème est libéré de la molécule d’hémoglobine. L’hème peut aussi être relâché des cellules dans des situations anormales, tels que lors d’une hémorragie interne ou de tout autre dommage causé aux érythrocytes [18]. Certaines maladies, comme les hémoglobinopathies, la malaria et les maladies auto-immunes, peuvent aussi être responsables d’une hémolyse précoce [17]. L’hème libre et en excès dans le milieu extracellulaire est très toxique pour le corps humain étant donné ses effets oxydatifs et pro-inflammatoires [18]. Afin d’assurer l’homéostasie, sa toxicité est donc médiée par l’action d’une enzyme intracellulaire nommée hème oxygénase-1 (HO-oxygénase-1), qui vient dégrader l’hème [oxygénase-17, oxygénase-19]. Ce procédé de dégradation se déroule dans le cytosol de cellules telles que les hépatocytes et les macrophages [19-22].
1.2.2.1 L’hémopexine
L’hème libre en circulation est lié par une molécule de transport nommée hémopexine, qui est une protéine plasmatique de 60kDa [18, 20, 21]. L’hémopexine lie l’hème avec une très haute affinité et le séquestre sous une forme qui permet son transport sous une forme inerte, ce qui permet d’atténuer sa toxicité pour l’organisme [17, 20, 21]. En fait, l’hémopexine, en liant l’hème, permet de prévenir les dommages oxydatifs et inflammatoires qu’engendre normalement l’hème libre [18, 20, 23]. Le complexe hème-hémopexine ainsi formé se lie au récepteur de l’hémopexine, le low-density-lipoprotein receptor-related protein/CD91 (LRP/CD91) à la surface de diverses cellules. Ainsi, le complexe est pris en charge par les macrophages du foie, de la rate, de la moelle osseuse, ainsi que par les hépatocytes [17, 18, 20, 21]. La liaison du complexe hème-hémopexine au récepteur LRP/CD91 permet son internalisation dans la cellule par le phénomène d’endocytose [17, 18, 22]. L’hème est ensuite relâché par l’hémopexine et c’est à ce moment que s’enclenche le processus de dégradation de l’hème par HO-1 (Figure 1.3). L’hémopexine quant à elle reste à l’intérieur de la vésicule d’endocytose et est relâchée à l’extérieur de la cellule vers la circulation sanguine [17, 19, 21, 22].
11 1.2.2.2 Catabolisme de l’hème
L’hème oxygénase -1 (HO-1) est une protéine de 33kDa exprimée dans plusieurs cellules et inductible par un large éventail de molécules [17]. Il existe deux autres isoformes de l’hème oxygénase : l’hème oxygénase-2 (HO-2) et l’hème oxygénase-3 (HO-3) qui ont des fonctions moins bien décrites que HO-1 [17]. Le catabolisme de l’hème par HO-1 engendre la formation de trois métabolites, soit le fer libre (Fe), la biliverdine, convertie en bilirubine par la biliverdine réductase et le monoxyde de carbone (CO) [17, 19, 21, 24-26], ce qui permet d’atténuer les effets toxiques de l’hème intracellulaire en excès [17-19]. Le monoxyde de carbone (CO) est normalement connu pour être toxique pour l’organisme. Par contre, lorsque formé lors de la dégradation de l’hème par HO-1, sa concentration est trop faible dans la cellule pour avoir des effets toxiques. Le monoxyde de carbone ainsi formé a plutôt des effets physiologiques bénéfiques assez larges, qui comprennent entre autres des effets anti-inflammatoires et des fonctions de signalisation [17]. Par la suite, le fer (Fe) libéré par le catabolisme de l’hème est lié par la ferritine et permet de reconstituer le pool de fer intracellulaire nécessaire pour divers procédés physiologiques [17]. Enfin, la bilirubine est transportée dans le plasma et se lie à l’albumine. Elle est plus tard dégradée par le foie et excrétée dans la bile [17]. Le catabolisme de l’hème par HO-1 se déroule expressément dans le cytosol des cellules concernées telles que les cellules érythroïdes, les hépatocytes et les macrophages [19, 22]. L’expression d’HO-1 est régulée en partie par la présence d’hème intracellulaire [17, 19, 25, 27]. Les petites protéines Maf agissent à titre de facteurs de transcription ayant une double fonction. Ils peuvent former un hétérodimère avec le facteur
nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2) pour activer l’expression d’HO-1, comme elles peuvent aussi bien lier et former un hétérodimère avec Bach-1 pour réprimer l’expression d’HO-1 [25]. Alors, Bach-1 agit à titre de régulateur négatif de l’expression de HO-1. En présence d’hème en excès, il y a modification de la conformation de Bach-1, ce qui diminue l’affinité de liaison à l’ADN du complexe Bach-1-Maf, dans la région du promoteur. Cela permet ainsi au complexe Nrf2-Maf de se former et lier le promoteur pour activer la transcription de HO-1 [19, 25, 27]. Par contre, l’activité de répression de Bach-1 domine largement celle de Nrf2, ce qui fait en sorte que l’expression d’HO-1 est constitutivement réprimée [25]. Ainsi, selon l’état intracellulaire, Nrf2 et Bach-1 sont en
12
compétition entre eux pour former un complexe avec les protéines Maf pour leur liaison dans la région du promoteur d’HO-1 [25].
1.2.3 L’hémine
Tel que mentionné précédemment, lors de l’hémolyse, l’hème libéré dans le milieu extracellulaire est toxique pour l’organisme. Outre sa prise en charge rapide par l’hémopexine, l’hème dû à sa forte toxicité, peut aussi être oxydé en une molécule nommée hémine. L’hémine est donc la forme oxydée de l’hème puisqu’elle gagne un électron sur son atome de fer lors du processus d’oxydoréduction [27]. L’hème, constituant essentiel de la molécule d’hémoglobine est donc composé d’un fer ferreux en son centre, tandis que l’hémine est composée d’un fer ferrique en son centre [27]. L’hémine est une molécule hautement oxydante, qui induit la production des espèces réactives d'oxygène (ROS) et déclenche un stress oxydatif (SOx) [21]. Tout comme l’hème, l’hémine peut être liée par l’hémopexine avec une très haute affinité (Figure 1.3) [20]. La prise en charge de l’hémine par l’hémopexine permet son transport sous une forme neutralisée, ce qui atténue sa toxicité pour l’organisme [20]. L’hémine, liée à l’hémopexine, est transportée à l’intérieur d’une multitude de cellules, tels que les hépatocytes et les cellules érythroïdes [27], de la même façon que l’hème, c’est-à-dire par le processus d’endocytose via la liaison du complexe au récepteur LRP/CD91 [20]. Il a été démontré que l’hémine régule positivement l’activation de HO-1, ce qui accentuerait la dégradation de l’hème [20, 26]. Plus particulièrement, l’hémine lie le répresseur transcriptionnel Bach-1 [20], ce qui modifie sa conformation et diminue son affinité pour l’ADN dans la région du promoteur du gène HO-1. Ainsi, l’activation de HO-1 en présence d’hémine contribuerait donc à engendrer la dégradation de l’hème et ainsi diminuer le stress oxydatif et les dommages intracellulaires causés par la présence de l’hème. De plus, de la même façon que l’hème, l’hémine est dégradée par HO-1 dans les hépatocytes [20].
13
Figure 1.3 Prise en charge de l’hème et de l’hémine par l’hémopexine
Lors du relâchement de l’hème dans les vaisseaux sanguins, l’hème peut être oxydé en hémine. L’hème et l’hémine libres sont pris en charge par l’hémopexine, qui les transporte à l’intérieur des cellules par endocytose via la liaison du récepteur LRP/CD91.
1.2.3.1 Mécanisme d’action et fonction de l’hémine
Au niveau moléculaire, il est connu que l’hémine possède diverses fonctions de signalisation [20]. Plus spécifiquement, il a été démontré chez les cellules érythroleucémiques K562, que l’hémine peut induire la liaison de facteurs de transcription, tels que le FBJ murine
osteosarcoma viral oncogene homolog B (FosB) et le Nrf2 à l’antioxydant responsive
element (ARE) situé en amont de gènes, tel que celui de la ferritine H, résultant en une activation de la transcription du gène. Cela a pour conséquence d’augmenter le niveau d’ARN messager codant pour la ferritine H et enfin de la ferritine elle-même. La ferritine est une protéine qui permet la prise en charge et le stockage du fer, ce qui permet ultimement l’utilisation du fer pour des procédés intracellulaires, tel que la différenciation érythroide
14
ainsi que l’hémoglobinisation. Une telle augmentation de la ferritine en présence d’hémine permet donc d’augmenter la capacité cellulaire en stockage de fer [28]. Il est aussi connu que l’hémine induit l’expression de la thioredoxine dans les cellules K562. La thioredoxine est une protéine ayant plusieurs rôles dans la protection physiologique de la cellule contre des conditions de stress oxydatif. Ainsi, l’hémine induit la liaison du complexe Nrf2-Maf sur l’ARE situé dans le promoteur de la thioredoxine, ce qui régule positivement l’expression du gène. Plus particulièrement, la région -452 à -420 serait fortement impliquée dans la réponse à l’hémine. La liaison de facteurs de transcription à l’ARE est donc importante pour l’activation de la thioredoxine en réponse à l’hémine [29]. La façon dont l’hémine permet la liaison de facteurs de transcription à certaines régions promotrices est peu décrite dans la littérature. Il est tout de même connu que l’hémine lie le répresseur transcriptionnel Bach-1 et modifie sa conformation [22]. Cela permettrait donc au complexe Bach-1-Maf de se dissocier et ainsi permettre au complexe activateur Nrf2-Maf de se former afin de lier et activer le promoteur [28]. De plus, il a été démontré que l’hémine induit la transcription de la Heat shock protein 70 (HSP70) chez les cellules K562, particulièrement lors de leur différenciation érythroïde [30]. En effet, en présence d’hémine, il y a accumulation du niveau d’ARNm codant pour HSP70, protéine du choc thermique. Il a été suggéré que le promoteur contient des séquences qui répondent positivement à l’hémine, permettant ainsi une régulation directe de la transcription [30]. En résumé, l’hémine engendrerait la modification de la condormation de diverses protéines, tels que des facteurs de transcription, favorisant leur liaison à une séquence spécifique, nommé antioxydant responsive element (ARE), dans la région promotrice de certains gènes. Ainsi, l’hémine permet l’activation de ces gènes via leur ARE. Ces facteurs de transcription ciblent, la plupart du temps, une séquence ou un motif spécifique sur cet ARE. Cette liaison spécifique entraîne donc une augmentation de l’expression du gène ciblé, ce qui résulte en un effet sur le comportement cellulaire. L’hémine module donc l’expression génique via son effet régulateur au niveau transcriptionnel [27-29]. Ainsi, le spectre d’action de l’hémine peut être varié selon la nature des gènes ciblés. Plus précisément, il est connu que l’hémine est un régulateur de l’expression génique chez les cellules de leucémie myéloïde chronique K562, ainsi que chez les cellules souches hématopoïétiques [27-29, 31]. De plus, l’hémine régule l’homéostasie cellulaire, ainsi que la différenciation cellulaire, particulièrement la différenciation érythroïde, chez les cellules
15
K562 [27, 28]. De plus, elle active l’hème oxygénase, en réponse au stress oxydatif [27]. Enfin, il est connu que l’hémine régule l’activation de l’expression du gène de la globine fœtale et embryonnaire chez les cellules K562 [27, 32], mais aussi chez les CSH impliquées dans un processus de différenciation érythroïde [27, 31].
1.2.3.2 L’hémine comme agent thérapeutique
L’hémine humaine est utilisée en clinique et connue commercialement sous l’appellation Normosang® en Europe [33] et Panhematin® aux États-Unis [34]. Présentement, l’hémine humaine est approuvée comme traitement pour les attaques aigües de porphyrie, une maladie héréditaire rare liée à un déficit en enzymes de biosynthèse de l’hème. Il existe différents types de porphyrie selon l’enzyme déficitaire. Ce déficit enzymatique cause une accumulation des différents précurseurs retrouvés dans le cycle de biosynthèse de l’hème. L’accumulation de ces précurseurs peut se faire dans le foie, résultant en une porphyrie hépatique ou dans la moelle, résultant en une porphyrie érythropoïétique. C’est l’accumulation de ces précurseurs toxiques qui cause les attaques de porphyrie. La maladie se manifeste par des douleurs abdominales et lombaires intenses, vomissement et constipation, hypertension, tachycardie et pouvant aller jusqu’à des troubles neuropsychiatriques pouvant augmenter les risques de décès. Le traitement du patient avec l’hémine humaine vient alors rétablir la déficience en hème, en incorporant diverses hémoprotéines et active la boucle de rétroaction négative, ce qui empêche l’activation du cycle de biosynthèse de l’hème et empêche ainsi l’accumulation des précurseurs toxiques. Le traitement à l’hémine humaine vient donc cibler directement la cause moléculaire de la maladie [35, 36]. Au Canada, l’hémine humaine a comme seule application clinique le traitement des attaques aigües chez les patients atteints de porphyrie. Au Québec, ce produit est distribué par Héma-Québec et est encadré par le programme d’accès spécial de Santé Canada.
16 1.3 Modèles cellulaires
1.3.1 Cellules de leucémie myéloïde chronique K562
Les cellules K562 sont des cellules provenant d’une patiente atteinte de leucémie myéloïde chronique [32, 37-39]. Elles sont caractérisées par la présence du chromosome de Philadelphie [32, 37-40] causé par une translocation et occasionnant une fusion entre deux gènes : le breakpoint cluster region (BCR) et l’oncogène Alberson (ABL) formant ainsi une protéine de fusion, BCR-ABL, possédant une tyrosine kinase constitutivement active [32, 40]. Les cellules K562 sont d’un grand intérêt en culture cellulaire. Elles constituent tout d’abord une lignée cellulaire immortalisée [32], non sensible à l’inhibition de contact [38], dont les voies de prolifération sont constitutivement activées par BCR-ABL [32]. Elles constituent aussi un excellent modèle de cellules myéloïdes capables de différenciation érythroïde [37, 41]. Étant immatures et peu différenciées, elles sont retrouvées majoritairement sous forme de blastes [37-39]. Elles sont donc capables de différenciation érythroïde sous l’action de différents inducteurs, tel que l’hémine [32, 39, 41-45]. Ce processus de différenciation favorise l’expression de certains marqueurs propres à cette lignée, tel que la glycophorine A [37]. Sa facilité de culture in vitro, ainsi que la possibilité d’induire la différenciation érythroïde en laboratoire font de cette lignée cellulaire un excellent modèle en hématologie pour étudier la différenciation érythroïde.
1.3.2 Cellules souches de sang de cordon
Les connaissances sur les propriétés thérapeutiques du sang de cordon ne datent que de quelques dizaines d’années. Effectivement, la première greffe fructueuse d’une seule unité de sang de cordon a été effectuée le 6 octobre 1988, par le Dr Eliane Gluckman sur un patient pédiatrique atteint de l’anémie de Fanconi, maladie normalement traitée avec des cellules de moelle osseuse [46]. Cette première greffe de sang de cordon a été effectuée selon les connaissances déterminant que les cellules de sang de cordon possèdent un potentiel d’expansion plus grand que les cellules provenant de la moelle osseuse [46]. Ce n’est que l’année suivante, en 1989, que le Dr Broxmeyer s’intéresse davantage au potentiel du sang de cordon comme source alternative de cellules souches pour la reconstitution du système hématopoïétique [47]. Ses travaux ont entre autres permis de découvrir que le sang de cordon
17
contient des cellules souches hématopoïétiques, ainsi que des progéniteurs hématopoïétiques [46]. Il a donc réussi à démontré que le sang de cordon permet de reconstituer le système hématopoïétique de patients atteints de diverses conditions et ce avec succès [46]. Une telle utilisation du sang de cordon permet donc d’avoir recours à une source de cellules hématopoïétiques normalement traitée comme un déchet biologique en plus de ne pas nécessiter la moelle osseuse du patient, ni d’un donneur apparenté [47].
Les cellules souches de sang de cordon sont donc d’un grand intérêt pour la culture cellulaire. Elles sont tout d’abord plus primitives que celles contenues dans le sang périphérique et possèdent le même potentiel d’auto-renouvellement et de différenciation lymphoïde ou myéloïde [47]. Le sang de cordon est aussi particulièrement riche en progéniteurs, qui sont plus immatures et qui ont un meilleur potentiel d’expansion par rapport aux autres sources de CSH [48]. Le fait que le que le sang de cordon soit considéré comme un déchet biologique après la naissance fait en sorte que cette source de CSH est davantage accessible et moins invasive [47], un atout en recherche et particulièrement pour la greffe. Par contre, le nombre de cellules contenues dans une unité est plutôt faible, ce qui peut contribuer à une baisse de rendement lors de l’isolation des cellules souches hématopoïétiques.
1.3.3 Les globules rouges in vitro
La demande mondiale en produits sanguins sécuritaires à des fins de transfusion est croissante, d’autant plus que la population mondiale tend à augmenter et est vieillissante [49-51]. L’approvisionnement en produits sanguins sécuritaires, particulièrement dans les pays non industrialisés, représente aussi un défi important, puisque les besoins en produits sanguins ne peuvent être comblés que par les dons [49-52]. De plus, les problèmes reliés aux infections transmises via la transfusion, telles que les hépatites et le VIH, ainsi que l’émergence de nouveaux pathogènes menace la sécurité et la qualification des produits sanguins [50-52]. Cela représente ainsi une préoccupation mondiale en matière de santé. La transfusion de produits sanguins représente une thérapie indispensable pour plusieurs conditions, particulièrement pour les anémies [50, 51]. La migration planétaire de différents groupes ethniques représente aussi un enjeu. Il existe donc une demande croissante pour des phénotypes de groupes sanguins plus rares, d’autant plus qu’il est essentiel de prendre en
18
considération la réalité des patients allo-immunisés [50, 51]. Cela rend donc les thérapies par transfusion sanguine encore plus difficiles à réaliser. Ces nombreux enjeux mettent en évidence le fait qu’il est indispensable de penser à une solution alternative.
La production de globules rouges in vitro à partir de cellules souches hématopoïétiques s’avère être une alternative potentielle. En effet, la production de globules rouges in vitro pourrait venir pallier à plusieurs problèmes. Tout d’abord, via la production importante de globules rouges, en plus d’avoir l’avantage de diminuer les risques de transmissions de maladies infectieuses et de pathogènes et d’être utile pour les patients ayant des phénotypes de groupes sanguins plus rares [49]. Advenant la possibilité d’utiliser une source cellulaire au potentiel infini de renouvellement pour la production, par exemple les cellules souches pluripotentes induites ou des lignées immortalisées aux génotypes hautement caractérisés, cette avenue s’avère des plus prometteuses. En effet, depuis quelques années, des efforts en recherche sont déployés partout sur la planète afin de développer une méthode efficiente pour la production de globules rouges in vitro. Plusieurs groupes de recherche travaillent à développer un tel procédé [48, 49, 53-55]. En 2017, un groupe britannique a démontré comment une lignée d’érythroblastes humains immortalisés pouvait contribuer à la production de globules rouges in vitro [49]. D’autres groupes se concentrent sur la production de globules rouges in vitro à partir de CSH, approche qui a le désavantage de ne pas procurer une source cellulaire au potentiel de renouvellement infini. Ainsi, ces autres groupes qui travaillent sur le sujet depuis plusieurs années utilisent les cellules souches hématopoïétiques différenciant dans la voie érythroïde pour développer un procédé de production de globules rouges in vitro [50]. Ils visent donc à reproduire in vitro, le plus fidèlement possible, le microenvironnement dans lequel se déroule l’érythropoïèse in vivo [50]. Pour ce faire, ils développent et utilisent des combinaisons de diverses cytokines et une variation de la concentration de ces cytokines, afin d’engendrer la différenciation et la maturation des cellules érythroïdes [50, 54]. Puis, ces procédés sont optimisés sur diverses sources de cellules souches hématopoïétiques et autres, afin d’avoir un rendement de production le plus optimal possible [53-55]. Il est évident que les globules rouges ainsi produits en laboratoire doivent être fonctionnels et posséder les mêmes propriétés que les globules rouges retrouvés chez les humains. Les globules rouges in vitro doivent donc avoir les mêmes capacités de déformabilité, un contenu en enzymes identique, la même capacité de l’hémoglobine à lier
19
et relâcher l’oxygène, ainsi qu’une expression des antigènes de groupes sanguins semblable aux globules rouges retrouvés chez humains [54, 55].
Jusqu’à ce jour, plusieurs défis de nature économique et technique ont été rencontrés par ces équipes [51]. Tout d’abord, un premier problème concerne l’énucléation des érythroblastes en fin de maturation [50, 51]. Il a été démontré que la maturation complète des érythrocytes, comprenant le processus d’énucléation, n’est possible que dans un milieu de culture reproduisant avec fidélité le microenvironnement hématopoïétique in vivo [54]. Il a été démontré qu’il est difficile d’engendrer l’énucléation ex vivo, mais que l’énucléation se déroule normalement lorsque les cellules en fin de maturation sont injectées dans l’organisme [54]. Comme le mécanisme d’énucléation n’est pas encore bien défini, il est difficile de développer un protocole permettant d’atteindre la maturation finale et d’obtenir des globules rouges fonctionnels [48, 55]. Par la suite, un autre problème rencontré est le rendement de production. La production à grande échelle de globules rouges in vitro est en ce moment ni suffisante, ni rentable pour combler les besoins [50]. En effet, la prolifération des cellules souches hématopoïétiques est limitée, produisant un nombre sous optimal de cellules au final [49, 51, 53-55]. Il s’avère donc essentiel pour les chercheurs de mieux comprendre les divers mécanismes de l’érythropoïèse [51]. Cela pourrait permettre d’établir le développement d’un milieu de culture favorisant une prolifération massive des cellules hématopoïétiques et ainsi atteindre une production suffisante de globules rouges [51]. Enfin, le problème majeur réside dans le fait que les coûts de production d’un tel procédé sont extrêmement élevés. La diminution des coûts passe entre autres par la diminution de la quantité de milieu de culture nécessaire et par l’utilisation de bioréacteurs afin de diminuer la surface de culture utilisée [48, 50, 51, 53].
La production massive de globules rouges in vitro engendre ainsi des défis de nature technique et économique. Il est essentiel de passer d’un modèle de production à petite échelle en laboratoire à une production industrielle et ce à moindre coûts. Jusqu’à aujourd’hui il reste encore très difficile de développer des conditions techniques qui permettraient une production de globules rouges in vitro efficace, sécuritaire, conforme et abordable. Tout de même, la production de globules rouges in vitro représente toujours une avenue potentielle et prometteuse sur laquelle plusieurs équipes de recherche travaillent.
20 1.3.4 Hyperthermie
L’hyperthermie est reconnue comme pouvant servir de traitement pour divers cancers en combinaison avec la chimiothérapie ou la radiothérapie [56]. Elle contribuerait à engendrer la mortalité de certaines cellules cancéreuses [56]. Plus récemment, des effets positifs de l’hyperthermie légère (autour de 39 degrés) sur la prolifération des cellules myéloïdes ont été découverts par hasard à Héma-Québec. Il semblerait que le système hématopoïétique soit sensible à de tels changements de température. Entre autres, il a été démontré que l’hyperthermie légère accélère et augmente la mégacaryopoïèse, ainsi que la thrombopoïèse
in vitro [57, 58]. Ces effets sont tout à fait intéressants scientifiquement, particulièrement en terme de production cellulaire, diminuant possiblement le temps pour l’accumulation d’un certain nombre de cellules pour l’utilisation thérapeutique. De plus, il a été démontré dans une autre étude menée par des chercheurs d’Héma-Québec, que l’hyperthermie favorise le développement et la maturation érythroïde [11]. Ces travaux montrent que l’hyperthermie agirait entre autres en synergie avec l’EPO, ce qui contribuerait à promouvoir et accélérer le développement érythroïde in vitro de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon [11]. Ainsi, l’augmentation de l’expansion des cellules et l’accélération de la différenciation en hyperthermie, justifie le fait que l’hyperthermie joue un rôle important dans les divers processus de différenciation du système hématopoïétique.
1.4 Le système sanguin
1.4.1 Les cellules du système sanguin
L’hématopoïèse et ses différentes voies de différenciation mènent à la formation d’une multitude de cellules sanguines spécialisées provenant initialement des cellules souches hématopoïétiques. D’une part, la voie lymphoïde sert à la production de leucocytes tels que les lymphocytes B, des lymphocytes T, ainsi que des cellules NK. Ces cellules ont majoritairement un rôle à jouer dans la défense du système immunitaire. D’autre part, la différenciation dans la voie myéloïde entraîne entre autres la formation d’érythrocytes, dont la fonction est le transport de l’oxygène à travers l’organisme. La voie myéloïde permet aussi la formation de leucocytes, qui sont essentiellement des cellules immunitaires. Parmi ces
21
leucocytes on retrouve les granulocytes neutrophiles, les granulocytes éosinophiles et les granulocytes basophiles. Enfin, la voie myéloïde engendre la formation des monocytes, ainsi que des mégacaryocytes. La maturation finale des mégacaryocytes permet la production de plaquettes, impliquées dans la coagulation sanguine.
1.4.2 Les maladies du système hématopoïétique
Les multiples cellules du système sanguin sont sujettes à divers troubles médicaux qui peuvent altérer leurs fonctions. Ces troubles peuvent être hérités ou acquis au cours de la vie [59]. Cela contribue souvent à altérer l’état de santé et la qualité de vie de la personne atteinte. Parmi les maladies les plus communes, on retrouve les anémies et les thalassémies, qui sont caractérisées par des défauts dans la synthèse de l’hème [59]. On retrouve aussi les hémoglobinopathies, décrites comme étant des défauts hérités affectant l’hémoglobine [59]. Parmi celles-ci, citons l’anémie falciforme qui est la maladie monogénique la plus répandue mondialement [60]. Les thrombocytoses sont aussi des maladies de nature hématologique assez répandues [59]. Différents cancers peuvent aussi affecter le système hématopoïétique, comme les leucémies de diverses natures. Enfin, il est important de noter que plusieurs maladies affectant les cellules du système sanguin apparaissent suite à une infection virale, tel que le virus d’immunodéficience humaine (VIH) [59]. Plusieurs traitements, de nature pharmacologique ou non, sont développés pour traiter ces divers troubles hématologiques. Dans certains cas, la transfusion de culots globulaires demeure l’unique option non pas pour traiter la maladie, mais pour stabiliser l’état de santé du patient. Ainsi, étant donné la complexité des maladies de nature hématologique, les possibilités de traitements sont parfois assez limitées.
1.5 Héma-Québec
Héma-Québec est responsable de l’approvisionnement, du traitement et de la distribution de produits sanguins et de ses dérivés au Québec. Le tout est effectué de façon sécuritaire avec efficience, ce qui permet d’offrir un service de qualité aux hôpitaux du Québec. En plus des produits sanguins, Héma-Québec est responsable du traitement et de la distribution de tissus
22
humains, de cellules souches issues de sang de cordon, de produits cellulaires et s’occupe de la gestion d’une banque de lait maternel unique au Québec. Ainsi, au cours des dernières années Héma-Québec a évolué afin de répondre efficacement aux besoins multiples des québécois en matière de santé [61]. De plus, Héma-Québec est aussi responsable de s’approvisionner et de distribuer des produits stables, tels que les immunoglobulines ou bien l’albumine.
Héma-Québec est constituée de plusieurs secteurs d’activité, dont la recherche et développement et les affaires médicales. Ces deux secteurs entretiennent des liens étroits, afin de répondre de façon efficiente aux besoins des québécois. Les affaires médicales sont responsables d’offrir des services et des conseils en matière d’hématologie, de microbiologie et d’épidémiologie aux services hospitaliers du Québec.
1.5.1 Cas clinique ayant motivé la présente étude
En 2014, le cas d’une femme de 61 ans présentant des symptômes d’anémie hémolytique auto-immune sévère et une réticulocytopénie a été pris en charge par un médecin hématologue d’Héma-Québec, Dr André Lebrun. La patiente a d’abord été transfusée avec 5 unités de culot globulaire, qui n’ont pas eu les résultats escomptés en termes d’amélioration de son état de santé. Au contraire, la réticulocytopénie continua de s’aggraver, justifiant davantage de transfusions. Étant donné l’évolution de son état de santé, une thérapie immunosuppressive a été débutée. La nature de cette thérapie a évolué selon les traitements et l’état de santé de la patiente, mais comprenait du méthylprednisolone, des immunoglobulines, ainsi que de l’anti-CD20 (Rituximab). Une analyse cytologique a par la suite révélé une aplasie de la moelle osseuse affectant les progéniteurs érythroïdes chez cette patiente. Plus précisément, un nombre élevé d’érythroblastes acidophiles a été observé lors de cette analyse, suggérant que ce type de cellules était la cible de l’inhibition menant à l’arrêt de la différenciation et de la maturation, de l’apoptose et de la réticulocytopénie causant l’anémie. L’anémie hémolytique auto-immune (AIHA) a par la suite été confirmée par la présente d’anticorps anti Gerbich 3 (anti-Ge3), malgré la présence d’antigène Gerbich 3 (Ge3) sur les globules rouges de la patiente. À partir de ce moment, la patiente a été transfusée avec des unités Ge3 négatives. Malgré cela, les effets de ces transfusions ne contribuaient
23
pas à l’amélioration de son état de santé devenu très critique. Avec un accord spécial de Santé Canada, sous le programme d’accès spécial, un traitement au Normosang® (hémine humaine) a été effectué chez la patiente. Dans ce cas-ci, le médecin d’Héma-Québec a cité en référence, un papier publié par Wang et al, en 2013 dans la revue Transfusion [62], qui démontrait que l’hémine contribuait à lever le mécanisme d’inhibition de la différenciation et de la maturation vers la lignée érythroïde causé par un anticorps anti glycophorine C (anti-GPC). Ainsi, une première dose de 250mg de Normosang® lui a été administrée et ce traitement a été maintenu aux deux jours pendant 29 jours. Deux jours après la première administration de Normosang®, une augmentation significative des réticulocytes, du taux d’hémoglobine, ainsi que du nombre de plaquettes a été observée. Ces données ont atteints des taux au-delà des valeurs normales trois jours après l’injection, atteignant un point culminant après 9 jours et le tout a été maintenu tout au long du traitement au Normosang®. Ces taux sont revenus à la normale sept jours après l’arrêt du traitement. Suivant ce traitement, l’état de la patiente s’est grandement amélioré. Son niveau d’hémoglobine a été maintenu, son nombre de réticulocytes et de globules rouges ont atteints des niveaux normaux. De plus, l’anticorps anti-Ge3 était faiblement détectable, probablement causé par la thérapie immunosuppressive. Il semble donc que le traitement à l’hémine humaine aurait contribué à l’amélioration de l’état de santé de la patiente. Il a été supposé par le médecin d’Héma-Québec que l’hémine favoriserait l’augmentation de la synthèse d’hémoglobine dans les érythroblastes acidophiles, ce qui favoriserait la maturation et l’énucléation des cellules érythroïdes.
1.5.2 Origine et intérêt du projet
Le cas clinique décrit au paragraphe précédent suggère que le traitement au Normosang® a causé l’augmentation du nombre de globules rouges, de plaquettes, ainsi que du niveau d’hémoglobine chez la patiente traitée. Ces observations intéressantes ont poussé Héma-Québec à se demander si le Normosang® pourrait avoir des indications thérapeutiques autres que le traitement des crises aigües de porphyrie. Ainsi, une meilleure caractérisation du mécanisme d’action de l’hémine pourrait permettre de possiblement élargir le spectre des indications cliniques du Normosang® pour le traitement de multiples maladies de nature
24
hématologique, possiblement d’autres types d’anémie. L’hémine pourrait aussi améliorer la production de globules rouges in vitro avec un effet accentuant la maturation des précurseurs et possiblement sur l’énucléation.
25 2. Hypothèse
Étant donné que les mécanismes moléculaires et cellulaires de l’hémine, ainsi que ses effets spécifiques sur les cellules souches hématopoïétiques demeurent peu documentés, surtout dans des modèles cellulaires non cancéreux, nous croyons qu’une meilleure connaissance à ce sujet pourrait permettre d’élargir le spectre d’application de l’hémine. Suite au cas clinique décrit précédemment, nous suggérons que l’hémine aurait un effet sur la prolifération et la différenciation des progéniteurs myéloïdes communs, résultant en une augmentation de la production d’érythrocytes et de plaquettes.
26 3. Objectifs
L’objectif principal de ce projet de maîtrise est de caractériser les effets d’un traitement à l’hémine sur la prolifération et sur la différenciation des cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon et sur les précurseurs à différents stades de leur différenciation érythroïde. Pour arriver à atteindre cet objectif principal et afin de vérifier l’hypothèse, deux objectifs spécifiques ont été fixés :
1. Vérifier l’activité de l’hémine sur la lignée cellulaire modèle K562 :
• Effectuer une dose réponse de l’hémine sur ces cellules, afin de déterminer la concentration optimale d’hémine dans une culture type.
• Mesurer les effets de l’hémine sur la prolifération cellulaire. • Mesurer les effets de l’hémine sur la viabilité cellulaire.
• Évaluer la production d’hémoglobine chez les cellules traitées à l’hémine.
• Évaluer l’effet de l’hyperthermie en combinaison avec l’hémine sur la prolifération cellulaire.
• Évaluer l’effet de l’hyperthermie en combinaison avec l’hémine sur la viabilité cellulaire.
2. Évaluer les effets de l’hémine sur les cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon :
A) Dans un milieu de culture maison favorisant la différenciation érythroïde lorsque l’hémine est ajoutée dès le début de la culture
• Mesurer les effets de l’hémine sur la prolifération cellulaire. • Mesurer les effets de l’hémine sur la viabilité cellulaire.
• Évaluer la différenciation érythroïde des cellules par cytométrie en flux. • Caractériser la morphologie cellulaire par coloration Wright-Giemsa.
• Évaluer les effets de l’hémine sur la modulation de la maturation finale et l’énucléation.
27
B) Dans un milieu de culture maison favorisant la différenciation érythroïde lorsque l’hémine est ajoutée plus tard en cours de culture
• Mesurer les effets de l’hémine sur la prolifération cellulaire. • Mesurer les effets de l’hémine sur la viabilité cellulaire.
