Recherche de substances naturelles issues de plantes médicinales marocaines capables d'inhiber la prolifération des cellules cancéreuses du col de l'utérus et étude de leurs mécanismes d'action

Texte intégral

(1)UNIVERSITÉ MOHAMMED V – AGDAL FACULTÉ DES SCIENCES Rabat. THESE DE DOCTORAT N° d’ordre : 2561. Discipline: Biologie Spécialité : Biochimie-Immunologie Présentée par Nawal MERGHOUB ep. GHOMARI. Titre. Recherche de substances naturelles issues de plantes médicinales Marocaines capables d’inhiber la prolifération des cellules cancéreuses du col de l’utérus et étude de leurs mécanismes d’action Soutenue le 26 Décembre 2011 Devant le jury :. Pr. Abdelaziz BENJOUAD Professeur de l’Enseignement supérieur (UM5a/FSR/CNRST) Pr. Katim ALAOUI Professeur de l’Enseignement supérieur (UM5s/FMP) Pr. Saaid AMZAZI Professeur de l’Enseignement supérieur (UM5a/FSR) Pr. Youssef BAKRI Professeur de l’Enseignement supérieur (UM5a/FSR) Pr. Mohammed EL HASSOUNI Professeur de l’enseignement supérieur (FSDM/ Fès) Dr. Mohammed EL MZIBRI Directeur de l’Unité Biologie et Sciences Médicale (CNESTEN) Pr. Abdelkader IL IDRISSI Professeur de l’Enseignement supérieur (UM5a/FSR) Dr. Hamid MORJANI Maître de conférences (UFR Pharmacie-CNRS/URCA). Président. Examinateurs. Faculté des Sciences, 4 Avenue Ibn Battouta B.P. 1014 RP, Rabat – Maroc Tel +212 (0) 37 77 18 34/35/38, Fax : +212 (0) 37 77 42 61, http://www.fsr.ac.ma.

(2) Dédicaces. A la mémoire de mon père, A ma mère pour sa tendresse, A mes beaux parents pour leurs encouragements, A mon époux pour son soutien, A mes frères, mes beaux frères et mes belles sœurs, A mes grands parents, oncles et tantes, A mes enfants Meryem et Abdelhadi, A mes amies..

(3) Avant Propos Cette thèse a été réalisée dans le cadre d’une collaboration entre le Laboratoire de Biochimie Immunologie de la Faculté des Sciences de Rabat- Agdal- (Université Mohammed V), l’Unité de Biologie et Recherche Médicale du CNESTEN et le Laboratoire MEDyC - Unité CNRS UMR6237 IFR53-UFR Pharmacie (Université de Reims Champagne-Ardenne). Ce travail a été agréablement réalisé sous l’encadrement scientifique conjoint du Pr. Saaid Amzazi, Dr. Hamid Morjani, Dr. Mohammed EL Mzibri, et Dr. Laila Benbacer. Ce projet de recherche a été soutenu par le “ Comité Mixte Inter-Universitaire Franco-Marocain” dans le cadre d’une action intégrée Volubilis (AI n° MA/07/178 - Egide n° 13466WE; 2007-2010), dont je tiens à exprimer mes plus vifs remerciements. Je tiens tout d’abord à exprimer ma profonde reconnaissance et ma gratitude à Monsieur le Pr. Saaid AMZAZI, Doyen de la Faculté des Sciences Rabat-Agdal (UM5a), responsable de l’UFR "BiochimieImmunologie" et directeur de thèse, de m’avoir accueilli au sein du Laboratoire, de m’avoir permis d’effectuer ce travail, pour son encadrement, ses conseils constructifs, ses encouragements continus et pour la confiance qu’il m’a accordé. J’exprime mes sincères remerciements à Monsieur le Directeur Générale du CNESTEN Khalid EL MEDIOURI de m’avoir accueilli au sein de son institution pour la réalisation de ce travail. Mes plus sincères remerciements se dirigent vers Dr. Mohammed EL MZIBRI, Directeur de l’Unité Biologie et Recherche Médicale (UBRM), pour m’avoir confié la réalisation de ce projet, pour son encadrement ainsi que ses conseils et remarques pour l’amélioration de ce manuscrit. Je remercie également Dr. Laila BENBACER, Responsable du Laboratoire Pharmaco-Toxicologie de l’UBRM/CNESTEN,. pour ses. conseils, ses encouragements, son encadrement, et son aide apportée lors de la réalisation de ce travail. J’exprime ma profonde reconnaissance et mes sincères remerciements au Pr. Hamid MORJANI, du Laboratoire MEDyC - Unité CNRS UMR6237 IFR53-UFR Pharmacie (Université de Reims Champagne-Ardenne), pour son encadrement, sa disponibilité permanente, pour tout les moyens qu’il a mis à ma disposition lors de la réalisation de ce travail de recherche, pour m’avoir guidé pendant tous mes stages avec rigueur, ainsi que pour les efforts qu’il a consentis pour la correction des publications ainsi que le manuscrit de thèse. J’exprime toute ma gratitude au Pr. Abdelaziz BENJOUAD, pour m’avoir fait l’honneur de présider le jury malgré tous ses engagements, ainsi que pour ses conseils et ses recommandations constructives. Je remercie vivement le Pr. Katim ALAOUI d’avoir aimablement accepté d’examiner mon travail de thèse et aussi de faire partie du jury malgré tout ses engagements..

(4) Je remercie également Pr. Youssef BAKRI de m’avoir fait l’honneur de lire mon manuscrit et d’être rapporteur de ma thèse ainsi que pour ses conseils constructifs. J’exprime tous mes remerciements au Pr. Mohammed EL HASSOUNI, pour avoir accepté d’être rapporteur de cette thèse et aussi de se déplacer pour juger ce travail. Mes remerciements vont aussi au Pr. Abdelkader IL IDRISSI, d’avoir bien voulu examiner mon travail et de faire partie de ce jury ainsi que pour ses remarques constructives. Mes plus vifs remerciements sont adressés à l’égard du Pr. Chantal TRENTESSAUX pour avoir contribuée de près à la réalisation de cette étude, pour ses conseils avisés, sa gentillesse et son aide précieuse. J’adresse mes sincères remerciements au Pr Hassane EL BTAOURI pour l’intérêt qu’il a porté lors de la réalisation de ce travail, pour ses conseils ainsi que pour sa précieuse contribution. Qu’il me soit permis. d’adresser mes remerciements à toutes les personnes. ayant. manifestées de l’intérêt et contribuées de près à la réalisation de ces travaux de recherche, tout particulièrement : Dr. Christine TERRYN, Dr. Richard LENAOUR, Dr. Bertrand BRASSARD et Dr. Hassane Ait BENHASSOU. J’exprime mes sincères remerciements à Dr. Saïd GAMOUH pour son aide précieuse apportée au cours de ce travail et son importante contribution lors de la purification des principes actifs.. Mes remerciements vont également au Pr. Mohammed FANNANE pour ses conseils, ainsi que son aide précieuse concernant la localisation et l’identification des plantes étudiées. Je remercie le Pr. Khalid BOUGRIN pour son aide et ses précieux conseils. Je remercie également les membres de l’UBRM/CNESTEN pour leurs soutiens, leurs gentillesses et leurs amitiés, Mme Imane CHAOUI, M. Hassan JADDI, M. Mohammed ATTALEB, Melle Asmae EL HAMDOUCHI, M. Rabii AMEZIANE, M. Aziz SMOUNI, Mme Naima SAIED, M. Lahssan MERZOUG et M. Khalid El KARI. Sans oublier de remercier également mes amies Mouna FAHR, Naima AZOUZI, Naima ELTALHI, Noema BERRADA, Zineb QUMICHOU, Siham BENBETKA et Lamia AIT SAID, pour leur soutien, leur gentillesse et leur sympathie en leur souhaitant bon courage et bonne continuation. Je tiens aussi à remercier vivement les membres de ma famille qui m’ont toujours soutenue et encouragée et pour leurs aides précieuses durant toutes ces années..

(5) Production scientifique Ce projet de recherche a été soutenu par le “ Comité Mixte Inter-Universitaire FrancoMarocain” dans le cadre d’une action intégrée Volubilis (AI n° MA/07/178 - Egide n° 13466WE; 2007-2010). Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont fait l’objet des. publications et. communications orales et affichées présentées ci-dessous.. Publications:. Merghoub N., Benbacer L., El Btaouri H., Ait Benhassou H., Terryn C., Attaleb M., Madoulet C., Benjouad A., El Mzibri M., Morjani H.and Amzazi S. In vitro antiproliferative effect and induction of apoptosis by Retama monosperma L. extract in human cervical cancer cells. Cellular and Molecular Biology (Noisy-le-grand), 2011; Suppl 57:1581-91, Oct 15. Merghoub N., Benbacer L., Amzazi S., Morjani H. and El Mzibri M.. Cytotoxic effect of some Moroccan medicinal plant extracts on human cervical cell lines. Journal of Medicinal Plants Research, 2009; Vol. 3(12), pp. 1045-1050. Merghoub N., Benbacer L., Attaleb M., Amzazi S., Benjouad A., Terryn C., EL Btaouri H., Morjani H. and EL Mzibri M. Recherche de molécules naturelles capables d’inhiber la croissance et la télomèrase des cellules du cancer du col de l’utérus porteuses de HPV. Proceeding of Third International SMBBM Congress of Biochemistry and Molecular Biology – IUBMB Special Meeting of Plant Stresses. 6TH Congress of FASBM. Marrakech 20-25 April 2009. Merghoub N., EL Btaouri H., Benbacer L., Gmouh S., Trentesaux C., Brassart B., Terryn C., Attaleb M., Benjouad A., Amzazi S., Morjani H. and EL Mzibri M.. Inula Viscosa L. extracts inhibit telomerase activity and induce caspase-dependent apoptosis in cervical cancer cells. Soumis au journal “ PLOSone”.. Communications orales et affichées: Merghoub N., El Btaouri H., Benbacer L., Gmouh S., C. Trentesaux, Terryn C., El Mzibri M., Amzazi S. and Morjani H.; Tomentosin from Inula viscosa L. induces telomere shortering and caspase-dependant apoptosis in cervical cancer cells. Communication orale - 5ème Forum du Cancéropôle Grand Est, Strasbourg, France; 2-3 novembre 2011. Merghoub N., El Btaouri H., Benbacer L., Gmouh S., Trentesaux C., Brassart B., Terryn C., Attaleb M., Benjouad A., Amzazi S., Morjani H. and El Mzibri M. Induction of telomere shortening and caspase-dependent apoptosis in cervical cancer cell lines by tomentosin isolated from Inula viscosa L. Communication orale, 4ème Symposium International sur les plantes aromatiques et médicinales - De la plante à la pratique thérapeutique. SIPAM4 Mohammedia – Maroc. Mai 12-13, 2011..

(6) Merghoub N., El Btaouri H., Benbacer L., Gmouh S., Trentesaux C., Brassart B., Terryn C., Attaleb M., Benjouad A., Amzazi S., Morjani H. and El Mzibri M. Inula Viscosa L. extracts inhibit telomerase activity and induce caspase-dependent apoptosis in cervical cancer cells. Communication affichée, 4ème Symposium International sur les plantes aromatiques et médicinales - De la plante à la pratique thérapeutique. SIPAM4 - Mohammedia – Maroc. Mai 12-13, 2011. Merghoub N., H. El Btaouri, L. Benbacer, Attaleb M., Benjouad A., Terryn C., Martiny L., El Mzibri M., Amzazi S. and Morjani H. Induction of telomerase inhibition and caspasedependent apoptosis in cervical cancer Hela and Siha cell lines by the hexane extract and dichloromethane fractions of Inula viscosa L. International Symposium of the Federative Research Institute N° 53 (IFR53). Cell-Microenvironment Interactions; Reims, France, June 7th to 9th, 2010. Merghoub N., Benbacer L., Attaleb M., Amzazi S., Benjouad A., Terryn C., EL-btaouri H., Morjani H. et EL Mzibri M.. Recherche de molécules naturelles capables d’inhiber la croissance et la télomèrase des cellules du cancer du col de l’utérus porteuses de HPV. Communication orale aux Troisièmes Congrès International de Biochimie. Marrakech 20-25 Avril 2009. Merghoub N., Amzazi S., EL Mzibri M. et Benbacer L. Evaluation de l’activité cytotoxique de plantes médicinales sur des lignées Cancéreuses du col de l’utérus. Communication affichée au 3ème Symposium International sur les Plantes Aromatiques et Médicinales (SIPAM III) et au 1 er Congrès International sur les Molécules Bioactives (CIMB1). Oujda; 29 -30 Mai 2008 - Maroc.. Prix: Prix de la meilleure Communication orale aux Troisièmes Congrès International de Biochimie. Marrakech 20-25 Avril 2009. 6ème édition du Concours National de l’Innovation : Catégorie Jeunes chercheurs scientifiques..

(7) Résumé A travers le monde, la recherche de nouvelles molécules anticancéreuses demeure une des principales préoccupations des chercheurs en oncologie. Aussi, les plantes ont été à l’origine de nombreuses molécules actives ayant montré leur efficacité dans le traitement de différents cancers. Au Maroc, la médecine traditionnelle, riche et diversifiée, constitue une source importante pour le criblage de nouvelles molécules potentiellement bioactives à visée thérapeutique. Dans ce cadre, et afin de valoriser les plantes médicinales Marocaines, l’objectif de cette étude est la recherche de nouvelles substances naturelles issues de plantes utilisées en médecine traditionnelle Marocaine capables d’inhiber la prolifération des cellules cancéreuses du col de l’utérus. Sept plantes médicinales ont été sélectionnées, sur la base d’une étude ethnobotanique et en fonction de leurs utilisations en médecine traditionnelle, et évaluées pour leurs effets cytotoxiques vis-à-vis de deux modèles cellulaires en culture SiHa et HeLa. Parmi ces plantes, Inula viscosa L. et Retama monosperma L. se sont révélées particulièrement actives. L’extrait hexanique (IV-HE) et la fraction dichlorométhane (IVDF) issus d’Inula viscosa ainsi que la fraction dichlorométhane de Retama monosperma (Rm-DF) induisent une activité cytotoxique significative vis-à-vis des deux lignées cellulaires après 72h de traitement, avec des valeurs d’IC50 comprises entre 6 et 22µg/ml. Par la suite, nous nous sommes intéressés à l’étude des mécanismes d’action de ces extraits. Les extraits IV-HE, IV-DF et Rm-DF induisent une mort cellulaire par apoptose, mise en évidence par le clivage de la procaspase-3, l’activité de la caspase-3 et le clivage de PARP. De plus, ces extraits induisent une chute du potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨm) et une production des espèces réactives de l’oxygène (ROS), accompagnées d’une diminution de l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-2 suggérant que l’apoptose induite par ces extraits, nécessite des événements mitochondriaux. Aussi, nous avons montré, en utilisant le test TRAP, que les extraits IV-HE et IV-DF sont capables d’inhiber significativement l’activité télomérase des cellules SiHa et HeLa après 48h de traitement. Ceci a été confirmé par l’hybridation du simple brin télomérique (TTAGGG). Par ailleurs, l’étude du statut MDR des extraits IV-HE, IV-DF et Rm-DF a été réalisée en utilisant différentes lignées cellulaires exprimant les gènes MDR. Les indices de résistance des extraits IV-HE, IVDF et Rm-DF sont ˂ 2, suggérant que les molécules contenues dans ces extraits ne sont pas des substrats MDR. Le fractionnement bio-guidé de l’extrait hexanique d’Inula viscosa (IV-HE), a permit la purification d’un sesquiterpène lactone, la tomentosine. Cette molécule a montré un effet inhibiteur significatif de la prolifération des cellules SiHa and HeLa d’une manière dose et temps-dépendants (IC50 de 7.10 ± 0.78 µM et 5.87 ± 0.36 µM, respectivement après 96h de traitement). L’analyse du simple brin télomérique (TTAGGG), a permis de montrer que la tomentosine était capable d’induire un raccourcissement de celui-ci d’une manière significative dans les cellules SiHa et HeLa. Cette étude met en évidence pour la première fois que la tomentosine cible le télomère et induit une apoptose Caspases-dépendante dans les cellules cancéreuses du col de l’utérus. La tomentosine induit également un arrêt du cycle cellulaire des cellules HeLa et SiHa en phase G2/M. Toutes ces données suggèrent que Inula viscosa L. et Retama monosperma L. présentent un fort potentiel pour le développement de nouveaux agents anticancéreux.. Mots clés : Plantes médicinales, Inula viscosa L., Retama monosperma L., tomentosine, cytotoxicité in vitro, apoptose, télomères, télomérase, cancer du col utérin..

(8) Abstract Worldwide, the discovery of new anticancer drugs remains the main concerns in oncology. Plants are an important source of active molecules having shown their efficacy in the treatment of various cancers. In Morocco, traditional medicine, rich and diverse, constitutes an important source for screening of new potentially bioactive molecules with therapeutic potential. In this context, and in order to promote Moroccan medicinal plants, the aims of this study are the search for new natural substances from plants used in traditional medicine, able to inhibit the proliferation of cervical cancer cells. Seven medicinal plants were selected, on the basis of an ethnobotanical study and according to their use in traditional medicine, and evaluated for their cytotoxic effects against two cervical cell lines HeLa and SiHa. Among these plants, Inula viscosa L. and Retama monosperma L. have attracted our particular interest. The hexanic extract (IV-HE) and dichloromethane fraction (IV-DF) from Inula viscosa L. and dichloromethane fraction from Retama monosperma L. (Rm-DF) were able to induce a significant cytotoxic effects against the two cell lines after 72h treatment, with IC50 values ranging from 6 to 22 µg/ml. Subsequently, we investigated the mechanisms of action of these extracts. IV-HE, IV-DF and Rm-DF were able to induce cells apoptosis, as evidenced by pro-caspase 3 cleavage, caspase 3 activity and PARP cleavage. Moreover, these extracts induced a decrease in mitochondrial membrane potential (ΔΨm) and increase of reactive oxygen species (ROS), accompanied by a decrease in anti-apoptotic protein Bcl-2 expression, suggesting that apoptosis induced by these extracts requires mitochondrial events. We show also that IV-HE and IV-DF extracts were able to significantly inhibit telomerase activity after 48 hours treatment, by using the Telomerase amplification protocol (TRAP) analysis. These data were confirmed by TAGGG telomere length assay. Moreover, the study of the multidrug-resistance (MDR) status of IV-HE, IV-DF and Rm-DF extracts was performed using different cell lines expressing MDR genes. The resistance index of IV-HE and IV-DF extracts was less than 2-fold, suggesting that the molecules contained in these extracts are not MDR substrates. The bio-guided fractionation of hexanic Inula viscosa extracts (IV-HE), has allowed the purification of a sesquiterpene lactone, tomentosin. This molecule was found to inhibit significantly the cell growth of SiHa and HeLa cervical cancer cells in dose and time-dependent manner (IC50 values of 7.10 ± 0.78 µM and 5.87 ± 0.36 µM, respectively after 96h of treatment). TTAGGG telomere length assay showed that tomentosin was able to induce a significant telomeric Goverhang shortening in SiHa and HeLa cells. This study provides the first evidence that tomentosin targets telomere machinery and induces apoptosis in cervical cancer cells. The molecular mechanism underlying tomentosin-induced apoptosis may involve a mitochondria-mediated signaling pathway. Tomentosin induces also a cell cycle arrest of SiHa and HeLa cells in G2/M phase. All these data suggest that Inula viscosa L. and Retama monosperma L. have a high potential for the development of news anticancer agents.. Key Words : medicinals Plants, Inula viscosa L., Retama monosperma L., tomentosin, in vitro cytotoxicity, apoptosis, telomeres, telomerase, cervical cancer ..

(9) Sommaire LISTE DES FIGURES .................................................................................................................. 1 LISTE DES TABLEAUX ............................................................................................................. 3 LISTE DES ABREVIATIONS .................................................................................................... 4 GLOSSAIRE.................................................................................................................................. 5 INTRODUCTION ......................................................................................................................... 6 DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................................... 9 I.. RECHERCHE DE SUBSTANCES NATURELLES POUR LE TRAITEMENT DU CANCER ............... 9 1.. Importance thérapeutique des molécules d'origine naturelle .................................................... 9. 2.. Progrès dans la recherche de nouvelles substances anticancéreuses : .................................... 10. 3.. Place des plantes médicinales dans la médecine traditionnelle Marocaine ............................ 12. 4.. Description et propriétés pharmacologiques des plantes sélectionnées ................................. 13 4.1.. Inula viscosa L. (Ait)...................................................................................................... 13. 4.2.. Retama monosperma L. (Boiss.) .................................................................................... 14. 4.3.. Berberis hispanica Boiss. ............................................................................................... 14. 4.4.. Ormenis eriolepis Maire. ................................................................................................ 15. 4.5.. Ormenis mixta L. ............................................................................................................ 15. 4.6.. Rhamnus lycioides ssp. Oleoides .................................................................................... 15. 4.7.. Urginea maritima L. Baker. ........................................................................................... 16. II. GENERALITES SUR LE CANCER DU COL DE L’UTERUS ....................................................... 16 1.. Epidémiologie du cancer du col de l’utérus ........................................................................... 16. 2.. Histoire naturelle du cancer du col de l’utérus ....................................................................... 16 2.1.. L’infection à papillomavirus humain (HPV) .................................................................. 16. 2.2.. Lésions histologiques cervicales .................................................................................... 18. 3.. Le dépistage du cancer du col de l’utérus............................................................................... 19. 4.. Prévention et vaccination ....................................................................................................... 20. 5.. Les papillomavirus humains (HPV) et cancer ........................................................................ 21. 6.. 5.1.. Classification des Papillomavirus................................................................................... 21. 5.2.. Structure et organisation génomique .............................................................................. 22. 5.3.. Cycle viral ...................................................................................................................... 23. Implication des protéines E7 et E6 dans le processus tumoral : ............................................. 25 6.1.. Rôle de l’oncoprotéine E6 .............................................................................................. 26. 6.2.. Rôle de l’oncoprotéines E7 : .......................................................................................... 28.

(10) III. TELOMERES ET TELOMERASE : NOUVELLES CIBLES POUR LA CHIMIOTHERAPIE ANTICANCEREUSE...................................................................................................................... 29 1.. 2.. 3.. Les télomères .......................................................................................................................... 29 1.1.. Structure et description ................................................................................................... 29. 1.2.. Les protéines associées aux télomères humains : complexe Shelterin ........................... 30. 1.3.. Conformation tridimensionnelle des télomères .............................................................. 31. 1.4.. Les télomères et l’horloge mitotique .............................................................................. 32. 1.5.. Mécanismes permettent la réplication des télomères ..................................................... 33. 1.6.. Techniques de mesure de la longueur des télomères ...................................................... 34. La télomérase. ........................................................................................................................ 35 2.1.. Structure de la télomérase .............................................................................................. 35. 2.2.. Mécanisme de réplication des télomères par la télomérase ............................................ 37. 2.3.. Mécanisme de régulation de la télomérase ..................................................................... 38. 2.4.. Rôle des protéines E6 et E7 dans la régulation de l’activité télomérase ........................ 41. 2.5.. Techniques de mesure de l’activité télomérase : ............................................................ 41. Stratégies thérapeutiques ciblant les télomères et la télomérase ............................................ 42 3.1.. Stratégies ciblant la télomérase ...................................................................................... 43. 3.2.. Stratégies ciblant le télomère.......................................................................................... 45. IV. INDUCTION DE L’APOPTOSE A VISEE THERAPEUTIQUE ..................................................... 47 1.. 2.. Concept de l’apoptose ............................................................................................................ 48 1.1.. Caractéristiques morphologiques de l’apoptose ............................................................. 49. 1.2.. Caractéristiques biochimiques de l’apoptose ................................................................. 50. Les principaux effecteurs de l’apoptose ................................................................................. 51 2.1.. Les Caspases................................................................................................................... 51. 2.2.. Protéines de la famille Bcl2 ............................................................................................ 52. 2.3.. Les récepteurs membranaires de la famille du TNF-α ................................................... 53. 2.4.. Les céramides ................................................................................................................. 54. 3.. Rôle de la mitochondrie dans le processus apoptotique ......................................................... 54. 4.. Les principales voies de signalisation de l’apoptose .............................................................. 55 4.1.. Voie intrinsèque : ........................................................................................................... 55. 4.2.. Voie extrinsèque: ............................................................................................................ 56. V. MECANISMES DE RESISTANCE AUX MEDICAMENTS ANTICANCEREUX ............................. 58 1.. Résistance MDR ou MultiDrug Resistance :.......................................................................... 58. 2.. Transporteurs ABC humains impliqués dans le Phénotype MDR ......................................... 59 2.1.. La glycoprotéine P (P-gp) .............................................................................................. 60. 2.2.. MRP (Multidrug resistance associated protein) ou ABCC : .......................................... 61.

(11) VI. OBJECTIFS DE LA THESE .................................................................................................... 63 MATERIEL ET METHODES ................................................................................................... 64 1.. Préparation des extraits de plantes : ....................................................................................... 64 1.1.. Extraction par macération : ............................................................................................ 64. 1.2.. Extraction par soxhlet :................................................................................................... 64. 2.. Effecteurs pharmacologiques : ............................................................................................... 67. 3.. Culture cellulaire : .................................................................................................................. 68 3.1.. Lignées cellulaires et conditions de culture:................................................................... 68. 3.2.. Entretien des cellules et conditions de culture................................................................ 69. 3.3.. Viabilité cellulaire : ........................................................................................................ 70. 3.4.. Conservation des cellules : ............................................................................................. 70. 4.. Evaluation de la cytotoxicité in vitro des extraits : .............................................................. 70. 5.. Statut Multidrug-Resistance : ................................................................................................. 72. 6.. Etude du mécanisme d’action des extraits et des molécules purifiées ................................... 73. 7.. 6.1.. Détermination de l’activité télomérase par test TRAP: .................................................. 73. 6.2.. Expérience d’hybridation du simple brin télomérique ................................................... 75. Etude de l’apoptose : .............................................................................................................. 76 7.1.. Mise en évidence de l’apoptose par coloration au Hoechst. ........................................... 77. 7.2.. Double marquage à l’Annexine V/Iodure de Propidium: ............................................... 78. 7.3.. Production d’espèces actives de l’oxygène (ROS) par spectrofluorométrie. ................. 78. 7.4.. Etude du potentiel membranaire mitochondrial par spectrofluorométrie. ...................... 79. 7.5.. Analyse de l’expression des proteines par western blot ................................................. 80. 7.6.. Mesure de l’activité Caspase-3 ....................................................................................... 82. 7.7.. Etude du cycle Cellulaire : ............................................................................................. 83. 8. Fractionnement et isolement des composés contenus dans l’extrait hexanique d’Inula viscosa : .......................................................................................................................................... 84 8.1.. Fractionnement de l’extrait hexanique: .......................................................................... 84. 8.2.. Fractionnement de la fraction F3 .................................................................................... 84. 8.3.. Fractionnement de la fraction F6 .................................................................................... 84. 8.4.. Méthodes d’analyse ........................................................................................................ 84. RESULTATS ............................................................................................................................... 86 PARTIE 1 : ................................................................................................................................... 86 RECHERCHE ET IDENTIFICATION PLANTES UTILISEES EN MEDECINE TRADITIONNELLE MAROCAINE, CAPABLE D’INHIBER LA CROISSANCE DES CELLULES DU CANCER DU COL DE L’UTERUS................................................................ 86.

(12) I.. EVALUATION DE LA CYTOTOXICITE DES EXTRAITS METHANOLIQUES DE PLANTES SELECTIONNEES ........................................................................................................................ 88 PARTIE 2: .................................................................................................................................... 91 RECHERCHE DE SUBSTANCES NATURELLES CAPABLES D’INHIBER LA PROLIFERATION ET L’ACTIVITE TELOMERASE ET D’INDUIRE L’APOPTOSE DES CELLULES CANCEREUSES DU COL DE L’UTERUS .......................................................... 91 A. Effet antiprolifératif, inhibition de l’activité télomérase et induction de l’apoptose par les extraits d’ Inula viscosa L. ............................................................................................... 93 1.. Evaluation de l’activité cytotoxique: ...................................................................................... 93. 2.. Mesure de l’activité télomérase : ............................................................................................ 94. 3.. Effet des extraits sur le télomère simple brin ......................................................................... 95. 4.. Effet des extraits d’Inula viscosa sur les cellules de phénotype ALT .................................... 97. 5.. Etude de l’apoptose : .............................................................................................................. 97 5.1.. Altérations morphologiques liées de l’apoptose:........................................................... 97. 5.2.. Détection des cellules apoptotiques par cytométrie de flux : ......................................... 98. 5.3.. Expression des protéines Pro-Caspase3, Bcl2 et clivage de PARP : ............................ 101. 5.4.. Activation de la Caspase 3 : ......................................................................................... 102. 5.5.. Production de ROS induite par les extraits d’Inula viscosa L. ..................................... 103. 5.6.. Chute du potentiel membranaire mitochondrial induite par les extraits d’Inula viscosa L. 104. 5.7.. Identification de la composition des extraits d’Inula viscosa L. .................................. 105. B. Activité antiproliférative et induction de l’apoptose par les extraits de Retama monosperma L. ..................................................................................................................... 107 1.. Evaluation de l’activité cytotoxique: .................................................................................... 107. 2.. Etude de l’apoptose : ............................................................................................................ 108 2.1.. Altérations morphologiques liées de l’apoptose induite par Rm-DF: ......................... 108. 2.2.. Détection des cellules apoptotiques par cytométrie de flux : ....................................... 109. 2.3.. Production de ROS induite par l’extrait de Retama monosperma L. ........................... 109. 2.4.. Effet de Rm-DF sur le potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨm) :........................ 112. 2.5.. Expression des protéines Pro-Caspase3, Bcl2 et clivage de PARP : ............................ 112. 2.6. L.. Identification de la composition de la fraction dichlorométhane de Retama monosperma ...................................................................................................................................... 113. C. Statut MDR des extraits IV-HE, IV-DF et Rm-DF: ...................................................... 115 PARTIE 3 : ................................................................................................................................. 117 PURIFICATION DE LA TOMENTOSINE ET MISE EN EVIDENCE DE SON MECANISME D’ACTION ........................................................................................................ 117.

(13) A. Fractionnement bio-guidé de l’extrait hexanique d’Inula viscosa L. : isolement des composés majoritaires ......................................................................................................... 119 1.. Fractionnement bio-guidé de l’extrait hexanique d’Inula viscosa : ..................................... 119. 2.. Analyse structurale des composés isolés .............................................................................. 122 2.1.. Détermination de la structure chimique du composé F3-1 ........................................... 122. 2.2.. Détermination de la structure chimique du composé F6-3 ........................................... 124. 2.3. Evaluation de l’activité cytotoxique des fractions obtenues à partir de l’extrait hexanique d’Inula viscosa L. ..................................................................................................................... 125. B. Effet antiprolifératif, inhibition de l’activité télomérase et induction de l’apoptose par la tomentosine. ..................................................................................................................... 126 1.. Evaluation de l’activité cytotoxique des produits purifiés ................................................... 126. 2.. Activité antiproliférative de la tomentosine en fonction du temps ....................................... 126. 3.. Effet de la tomentosine sur le télomère simple brin ............................................................. 128. 4.. Effet de la tomentosine sur des cellules cancéreuses de phénotype ALT ............................ 130. 5.. Etude de l’apoptose induite par la tomentosine .................................................................... 130 5.1.. Mise en évidence des altérations morphologiques liées à l’apoptose ........................... 131. 5.2.. Production d’espèces actives de l’oxygène (ROS) : ..................................................... 134. 5.3.. Effet de tomentosine sur le potentiel membranaire mitochondrial .............................. 135. 5.4.. Mise en évidence de l’expression de protéines impliquées dans l’apoptose ................ 135. 5.5.. Mesure de l’activité Caspase 3 ..................................................................................... 137. 5.6.. Analyse du cycle cellulaire :......................................................................................... 138. C. Statut MDR de tomentosine: ........................................................................................ 142 DISCUSSION ............................................................................................................................ 143 A. Recherche de substances naturelles capable d’inhiber la prolifération et l’activité télomérase et d’induire l’apoptose des cellules cancéreuses du col de l’utérus ................. 146 B. Purification de la tomentosine et mise en évidence de son mécanisme d’action ......... 149 CONCLUSION GENERALE & PERSPECTIVES ............................................................... 153 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................ 155 ANNEXES ...................................................................................................................................... I.

(14) LISTE DES FIGURES. Figure 1:Nouveaux médicaments anticancéreux mis sur le marché durant la période 1981-2006. .......... 10 Figure 2: Développement des cancers du col utérin liés une infection par un HPV à haut risque ............ 19 Figure 3: Représentation schématique de la structure de l’HPV ............................................................... 22 Figure 4: Organisation du génome d’HPV (génotype 16)......................................................................... 23 Figure 5: Cycle viral de l’HPV.................................................................................................................. 24 Figure 6: E6 cible la dégradation de p53 via la voie ubiquitine/proteasome. .......................................... 26 Figure 7: Les voies d’apoptose intrinsèque et extrinsèque. ....................................................................... 27 Figure 8: L’oncoprotéine E7 et cycle cellulaire. ....................................................................................... 29 Figure 9: Représentation schématique de la séquence d’ADN télomèrique humaine. .............................. 30 Figure 10: Représentation schématique de la T-loop en présence des protéines télomériques. ................ 32 Figure 11: Représentation schématique de l’horloge mitotique des télomères. ........................................ 33 Figure 12: Représentation schématique de la télomérase humaine. .......................................................... 36 Figure 13: Représentation schématique du mécanisme de l’élongation du télomère par la télomèrase. .. 37 Figure 14: Mécanisme de régulation de la télomérase. ............................................................................. 40 Figure 15: Représentation schématique des stratégies d’inhibition de la télomérase. .............................. 42 Figure 16: Mécanisme de l’inhibition de la télomérase par stabilisation de Gquadruplexe par des ligands spécifiques .................................................................................................................................................. 46 Figure 17: Principales étapes d’altérations morphologiques de l’apoptose. ............................................. 49 Figure 18: Les protéines de la famille Bcl-2. ............................................................................................ 53 Figure 19: Voie intrinsèque de l’apoptose.. .............................................................................................. 56 Figure 20: Voie extrinsèque de l’apoptose (voie des récepteurs de mort). ............................................... 57 Figure 21: Structure des protéines ABC.................................................................................................... 60 Figure 22: Protocole d’extraction par soxhlet des plantes......................................................................... 65 Figure 23 : Schéma des produits de PCR issus d’une analyse TRAP. ...................................................... 73 Figure 24: Effet cytotoxique des extraits de plantes vis-à-vis des cellules SiHa et HeLa......................... 89 Figure 25: Altération morphologiques des cellules SiHa, induites par l’extrait méthanoliques d’Inula viscosa L ..................................................................................................................................................... 90 Figure 26: Effet des extraits d’Inula viscosa sur la prolifération des cellules SiHa et HeLa. ................... 94 Figure 27: Activité télomérase dans les cellules SiHa et HeLa................................................................. 95 Figure 28: Effet des extraits d’Inula viscosa sur le simple brin télomérique. .......................................... 96 Figure 29: Histogrammes représentant la quantification du signal du simple brin télomérique, des lignées cellulaires SiHa et HeLa après traitement. ................................................................................................. 96 Figure 30: Effet des extraits IV-HE et IV-DF sur la croissance des lignées cellulaires MRC5 et MRC5/V1. .................................................................................................................................................. 97 Figure 31: Modifications morphologiques caractéristiques de l’apoptose induite par les extraits d’Inula viscosa L. .................................................................................................................................................... 99 Figure 32: Modifications morphologiques caractéristiques de l’apoptose induite par les extraits d’Inula viscosa L. .................................................................................................................................................. 100 Figure 33 : Détection des cellules apotoptiques par cytomètrie de flux.................................................. 101 Figure 34: Effet des extraits d’Inula viscosa sur l’expression de la pro-Caspase 3, de Bcl2 et le clivage de PARP. ....................................................................................................................................................... 102 Figure 35: Activation de la Caspase 3 induite par les extraits d’Inula viscosa. ...................................... 103 Figure 36: Production de ROS dans les cellules traitées par les extraits d’Inula viscosa L. .................. 104 Figure 37: Effet des extraits d’Inula viscosa L. sur le potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨm). ... 105 1.

(15) Figure 38: Effet des extraits de Retama monosperma sur la croissance des cellules SiHa et HeLa. ...... 108 Figure 39: Modifications morphologiques liées à l’apoptose induite par Rm-DF. ................................. 110 Figure 40: Détection des cellules apototiques par cytomètrie de flux..................................................... 111 Figure 41: Effet de l’extrait Rm-DF sur la production des ROS. ............................................................ 111 Figure 42: Effet de l’extrait Rm-DF sur le potentiel membranaire mitochondrial. ................................. 112 Figure 43: Effet des extraits de Retama monosperma sur l’expression de la pro-Caspase 3, le clivage de PARP et Bcl2............................................................................................................................................ 113 Figure 44: Fractionnement de l’extrait hexanique................................................................................... 119 Figure 45: Chromatogramme d’analyse de la fraction F3 par CPG ........................................................ 120 Figure 46: Chromatogramme d’analyse du composé majoritaire contenu dans la fraction F3 par SM .. 120 Figure 47: Chromatogramme d’analyse de la fraction F6 par CPG ........................................................ 121 Figure 48: Chromatogramme d’analyse du composé majoritaire contenu dans la fraction F6 par SM. . 121 Figure 49: Purification de la fraction F3. ............................................................................................... 122 Figure 50: Fractionnement de la fraction F6. .......................................................................................... 122 Figure 51: Structure chimique de l’acide isocostique. ............................................................................ 123 Figure 52: Structure chimique de la tomentosine. ................................................................................... 124 Figure 53: Effet de tomentosine et l’acide isocostique sur la prolifération des cellules SiHa et HeLa. .. 127 Figure 54: Activité antiproliférative de tomentosine en fonction du temps. ........................................... 128 Figure 55: Effet de la tomentosine sur le simple brin télomérique. ........................................................ 129 Figure 56: Effet de la tomentosine sur la croissance des lignées cellulaires MRC5 et MRC5/V1. ........ 130 Figure 57: Altérations morphologiques induites par tomentosine. ......................................................... 132 Figure 58: Altérations morphologiques induites par tomentosine. ......................................................... 133 Figure 59: Effet de tomentosine sur la production des ROS dans les cellules SiHa et HeLa. ................ 134 Figure 60: Effet de tomentosine sur les variations du potentiel membranaire mitochondrial des cellules SiHa et HeLa. ........................................................................................................................................... 135 Figure 61: Effet de la tomentosine sur l’expression de la pro-Caspase 3, Bcl2et le clivage de PARP , analysé par western blot. .......................................................................................................................... 137 Figure 62: Activation de la Caspase 3 en fonction du temps après traitement des cellules par la tomentosine. ............................................................................................................................................. 139 Figure 63: Effet de la tomentosine sur le cycle cellulaire des cellules HeLa. ......................................... 140 Figure 64: Effet de la tomentosine sur le cycle cellulaire des cellules SiHa. .......................................... 141 Figure 65: Mécanismes d’action proposé de la tomentosine: ................................................................. 152. 2.

(16) LISTE DES TABLEAUX. Tableau 1: Classification des HPVs cervicaux en fonction de leur oncogénicité. .................................... 18 Tableau 2: Données ethnobotaniques et pharmacologiques des plantes récoltées. ................................... 66 Tableau 3: Liste et caractéristiques des anticorps primaires et secondaires employés. ............................ 82 Tableau 4: Valeurs des IC50 (µg/ml) des différents extraits de plantes vis-à-vis des lignées SiHa et HeLa, après 48h d’exposition................................................................................................................................ 90 Tableau 5: Valeurs des IC50 (µg/ml) des extraits d’Inula viscosa L. ........................................................ 93 Tableau 6: Composés présent dans les extraits d’Inula viscosa L. identifiés by CG/MS. ..................... 106 Tableau 7: Valeurs des IC50 des extraits et des fractions de Retama monosperma L. ............................ 107 Tableau 8: Composés contenus dans la fraction dichlorométhane de Retama monosperma, identifiés par CG/MS. .................................................................................................................................................... 114 Tableau 9: Statut MDR des extraits IV-HE et IV-DF vis-à-vis de lignée cellulaire du carcinome mammaire (MCF7) sélectionnées en présence de doxorubicine (MCF7/DOX) et l’étoposide (MCF7/VP). .................................................................................................................................................................. 116 Tableau 10: Statut MDR des extraits IV-HE et IV-DF vis-à-vis des lignées cellulaires résistantes à la chimiotérapie, transfectées par un des gènes de résistance (ABCB1/Pgp, ABCC1/MRP1, ABCC3/MRP3 et ABCG2/BCRP). .................................................................................................................................. 116 Tableau 11: Donnés spectrales RMN 13C de l’acide isocostique (fraction F3-a).................................... 123 Tableau 12: Donnés spectrales RMN 13C de la tomentosine (fraction F6-3). ......................................... 125 Tableau 13: Evaluation de la cytotoxicité des fractions et sous-fractions issues de l’extrait hexanique d’ Inula viscosa vis-à-vis des lignées SiHa et HeLa. ................................................................................... 126 Tableau 14: Valeurs des IC50 (µg/ml) de la tomentosine vis-à-vis de cellules SiHa et HeLa. ................ 128 Tableau 15: Statut MDR de la tomentosine ........................................................................................... 142. 3.

(17) LISTE DES ABREVIATIONS ALT : Alternative Lengthening of Telomeres Bcl-2 : B-cell lymphoma 2 Caspase : Cystéinyl ASPartic acid-ProteASE CG/MS : chromatographie phase gazeuse couplée à la spectroscopie de masse CHAPS : 3-[3-(Cholamidopropyl)diméthylammonio]-1-propanesulfonate CI50 : Concentration Inhibitrice de 50% de l'activité D-loop : Displacement loop DMSO : DiMéthylSulfOxyde FACS : Fluorescence Activated Cell Sorter IV-HE: Inula viscosa Hexanic extract IV-DF: Inula viscosa Dichloromethane Fraction IV-ME: Inula viscosa Methanolic Extract IV-AF: Inula viscosa Ethyl acetate Fraction NF-κB : Nuclear Factor κB NF-Y : Facteur Nucléaire Y PARP : Poly (ADP-Ribose) Polymérase PBS : Phosphate Buffered Saline PS : PhosphatidylSérine Rb : Protéine du Rétinoblastome RMN : Résonance Magnétique Nucléaire Rm-HE: Retama monosperma Hexanic Extract Rm-ME: Retama monosperma Methanolic Extract Rm-DF: Retama monosperma Dichloromethane Fraction Rm-AF: Retama monosperma Ethyl Acetate Fraction ROS: Reactive Oxygen Species SV40 : Simian Virus 40 t-loop : Telomeric loop TRAP : Telomeric Repeat Amplification Protocol hTERT : Human Telomerase Reverse Transcriptase hTR : Human Telomerase RNA. 4.

(18) GLOSSAIRE. Alcaloïdes : composés azotés basiques, représentent un groupe très vaste de métabolites secondaires avec structure, distribution et activités biologiques diverses. Les plus importants sont : les isoquinoléiques, les quinoléiques, les péridiques, les pipéridiques et les stéroïdes.. Flavonoïdes : composés dont la structure chimique est basée principalement sur un squelette de 15 carbones, constitué de deux unités aromatiques, deux cycles en C6 reliés par une chaine en C3. Il y a six classes de flavonoïdes qui différent par leur structure chimique: flavones, flavanols, flavonols, flavanones, isoflavones, flavanones et anthocyanidines.. Terpènes : sont des molécules à nombre de carbones multiple de 5, avec une formule de base (C5H8)n et dont le précurseur est l’isopentényl diphosphate. En fonction du nombre n d’unités, il existe différents composés : les pentacarbonés (C5) ramifiées, les monoterpènes (C10), les sesquiterpènes (C15), les diterpènes (C20) …. Sesquiterpènes lactones : ont comme base un squelette de 15 atomes de carbone qui contient généralement au moins le groupe γ-lactonique, sa formation vient de trois unités isopronèques qui sont liées ensemble sous forme" tête-queue" en formant le composé 2,6,10triméthyldodécane. Les sesquiterpènes lactones constituent un grand et divers groupe de métabolites secondaires, qui se distinguent dans leurs propriétés et leurs structures : les germacranolides, les élémanolides, les eudesmanolides, les guaianolides et les héliangolides.. 5.

(19) Introduction.

(20) Introduction. A travers le monde, le cancer du col utérin représente un problème majeur de santé publique. C’est le deuxième cancer féminin dans le monde avec environ 200 000 décès annuel et 500 000 nouveaux cas chaque année, avec 85% de survenue chez les femmes des pays en voie de développement (Pointreau Y. et al., 2010). Au Maroc, et en l'absence d'un registre national de cancer, les données sont limitées aux cas enregistrés dans certains établissements de santé, et qui concordent pour qualifier le cancer du col en tant que problème majeur de santé publique. Le cancer du col, considéré comme maladie sexuellement transmissible, est étroitement lié à l’infection par certains virus appelés papillomavirus humains (HPV). Ces virus oncogènes contribuent à l’immortalisation des cellules infectées. Le pouvoir transformant de ces HPV a été attribué aux protéines virales E6 et E7 (Munger K. et al., 2004). Ces protéines interfèrent avec de nombreuses protéines cellulaires impliquées dans la régulation du cycle cellulaire, le contrôle de l’apoptose, la réparation de l’ADN, la formation du fuseau mitotique, l’adhérence intercellulaire et à la matrice extracellulaire, la motilité cellulaire et les voies de transduction des signaux mitogènes (Mougin C. et al., 2008). Par ailleurs, l’oncoprotéine E6 est capable d’activer la sousunité catalytique de la télomérase (hTERT) (Klingelhutz A.J. et al., 1996). Le maintien de la longueur des télomères est réalisé en coopération avec E7 qui participe elle aussi à la prévention de leur érosion (Liu X. et al., 2008). La prise en charge du cancer du col repose sur un trépied fondamental composé d’une prévention contre les infections à HPV, rendue possible grâce à la mise en place de deux vaccins contre les types oncogènes, le diagnostic précoce basé principalement sur les technique cytohistologiques mais qui peut également faire appel aux techniques moléculaires, et la thérapie basée sur des traitements physiques destructeurs, tel le traitement au laser ou l’exérèse, et radiologiques. Les traitements chimiothérapeutiques sont très limités et sont confrontées souvent au problème de chimiorésistance. De ce fait, la recherche de nouvelles molécules cytotoxique reste une des principales préoccupations des chercheurs en oncologie. Durant les dernières décennies, nous avons assisté à une croissance considérable dans le développement de nouvelles thérapies antivirales avec la découverte d'agents ayant des activités contre des virus tels que, le virus de l’immunodéficience humaine (HIV), le cytomégalovirus influenza humaine (HCMV) et le virus de l’hépatite B (HBV). Cependant, peu de composés avaient une activité contre les HPV.. 6.

(21) Introduction. Par ailleurs, de nombreux médicaments doivent leur existence à la biodiversité du milieu naturel, les plantes, les organismes marins et les micro-organismes qui constituent une source importante de substances actives ayant un rôle essentiel en médecine. De nombreux médicaments anticancéreux d’origine naturelle ou dérivés de composés naturels, sont actuellement utilisés en chimiothérapie anticancéreuse. L’exploitation des pharmacopées traditionnelles, notamment l’utilisation des plantes connues souvent depuis des siècles pour leur valeur médicinale ; a permis la mise en place d'un très grand nombre de médicaments anticancéreux d'une très grande efficacité. La médecine traditionnelle Marocaine se révèle donc riche et diversifiée, ce qui constitue un important atout et une source inépuisable dans le criblage de nouvelles molécules à visée thérapeutique. Le Maroc constitue une unité géographique dont les caractéristiques offre une gamme variée de bioclimats permettant l’installation d’une flore riche à endémisme marqué. A côté de ce contexte naturel particulièrement favorable et prometteur, ce pays dispose d’un savoir faire ancestral, qui a été préservé au cours des siècles : la médication par les plantes, leur utilisation pour l’aromatisation et la conservation des aliments, ainsi que pour l’extraction des principes aromatiques destinés à l’usage familial ou commercial. Le travail présenté dans cette thèse s’inscrit dans le cadre de la stratégie nationale visant à valoriser les plantes médicinales marocaines. Aussi, notre étude a porté sur l’évaluation de l’activité antiproliférative, voir anticancéreuse, d’extraits provenant de plantes médicinales marocaines sur des lignées cancéreuses du col de l’utérus. Aussi, et après une étude bibliographique qui fait état des dernières connaissances sur les plantes médicinales, leur utilisation comme source d’agents anticancéreux, nous avons introduit le cancer du col de l’utérus comme modèle cancéreux pour l’évaluation de l’activité des plantes médicinales sélectionnées. Par ailleurs, l’accent a été mis sur les stratégies anticancéreuses ciblant les télomères et la télomérase, ainsi que le mécanisme d’induction de l’apoptose à visée thérapeutique. Notre approche expérimentale a été axée dans un premier temps sur l’étude la cytotoxicité, in vitro, des extraits méthanoliques de sept plantes médicinales, connues pour leur utilisation en médecine traditionnelle marocaine à savoir : Inula viscosa L. ; Retama monosperma, Ormenis mixta L., Ormenis eriolepis Coss., Rhamnus lycioides L., Berberis hispanica Boiss. et Urginea. 7.

(22) Introduction. maritima L. L‘effet cytotoxique est étudié sur des lignées cellulaires provenant d’un cancer du col de l’utérus (SiHa et HeLa). La deuxième partie de ce travail concerne l’étude du mécanisme d’action des extraits des deux plantes (Retama monosperma L. Boiss. et Inula viscosa L. Ait.), ayant montré des activités cytotoxiques importantes. Ainsi, nous avons étudié leurs effets sur l’activité télomèrase grâce au test TRAP (Telomere Repeat Amplification Protocol). Nous avons également étudié l’induction de l’apoptose par ces extraits grâce au marquage avec le Hoechst 33342 et la microscopie de fluorescence ; au suivi d’événements mitochondriaux tels que la modification du potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨ) et la production d’espèces actives de l’oxygène (ROS). La dernière partie de cette thèse à été consacrée au fractionnement bio-guidé de l’extrait héxanique d’Inula viscosa, à l’évaluation de l’effet cytotoxique des différentes fractions, suivie de l’étude du mécanisme d’action du produit purifié le plus actif.. 8.

(23) Données bibliographiques.

(24) Données bibliographiques. I.. Recherche de substances naturelles pour le traitement du cancer. 1. Importance thérapeutique des molécules d'origine naturelle Les médicaments à base de produits naturels, éléments essentiels des soins de santé partout dans le monde, sont encore largement utilisés et ont une importance considérable. Selon l'Organisation mondiale de la santé (OMS), 80% de la population du globe a recours aux médecines traditionnelles pour satisfaire des besoins en soins de santé primaires. La majeure partie du traitement traditionnel consiste à utiliser des extraits de plantes ou leurs constituants actifs. Toutefois, les 20% de la population restante incorpore des produits naturels dans leurs traitements médicaux, notamment dans les pays développés (OMS, 2002). La nature reste l’une des sources principales d’obtention de nouveaux agents thérapeutiques, qui peut encore être exploitée efficacement pour combattre les maladies. Les produits naturels s’avèrent d’une très grande richesse sur le plan de leurs diversités et bioactivités. Le criblage à haut débit de nouveaux principes actifs d’origine naturelle, la maîtrise des tests biochimiques appropriés et le développement de méthodes de synthèse efficaces, ont permet le développement de substances d'intérêt médical dans de nombreux domaines thérapeutiques : traitements des cancers et des pathologies cardiovasculaires, anti-inflammatoires... Depuis plus de 40 ans, de nombreux médicaments provenant de milieu naturel sont actuellement utilisés en chimiothérapie anticancéreuse (Kinghorn A.D. et al., 2009). Une récente étude, a montré que parmi les produits pharmaceutiques mis sur le marché durant la période 1981-2006, 52% des médicaments actuels sont constitués ou dérivés de produits naturels et seulement 30% des médicaments sont totalement synthétiques (Newman D.J. and Cragg G.M., 2007). Les différentes catégories d’origine naturelle peuvent être soit ; des produits directement isolés de sources naturelles, mais aussi des analogues de produits naturels obtenus par hémisynthèse ou par modification chimique de ces derniers, des produits synthétiques dont la structure a été copiée sur un modèle naturel (inspirés d’un pharmacophore naturel). Dans le domaine des anticancéreux, parmi les médicaments chimiothérapeutiques mis sur le marché de 1940 à 2006 uniquement 28% des médicaments sont purement synthétiques et. 64% sont. d'origine naturelle (Figure 1).. 9.

(25) Données bibliographiques. Figure 1:Nouveaux médicaments anticancéreux mis sur le marché durant la période 1981-2006 (N =175).S: médicaments totalement synthétiques; S*: médicaments synthétiques inspirés d'un pharmacophore naturel; V: vaccins; B: médicaments d'origine biologique (peptides, protéines); N: produits d'origine naturelle; ND: dérivés de produits naturels (hémi-synthétiques); NM: produits naturels mimés. D’après (Newman D.J. and Cragg G.M., 2007).. 2. Progrès dans la anticancéreuses :. recherche. de. nouvelles. substances. De nombreux médicaments anticancéreux, provenant du milieu naturel, ont montré leur efficacité dans le traitement de différents types de cancers. L’utilisation des substances naturelles en tant qu'agents anticancéreux a commencé par l'isolement de la podophyllotoxine à partir d'une plante de la famille des Berbéridées (Podophyllum peltatum). La podophyllotoxine étant trop toxique, a fait l’objet de modifications structurales pour donner naissance à deux composés antitumoraux (le teniposide et l'étoposide) inhibiteurs de la topo-isomérase II. Pour revue voir (Lv M. and Xu H., 2011). Parmi les médicaments anticancéreux provenant des vegétaux, il existe également les vinca-alcaloïdes telsque la vinblastine et la vincristine, inhibiteurs de l'assemblage de la tubuline, isolées de la pervenche de Madagascar Catharanthus roseus et ses analogues. hémisynthétiques,. vinorelbine. et. vindésine.. Les. taxoïdes,. inhibiteurs. du. désassemblage des microtubules, telque le paclitaxel isolé de l'if du pacifique Taxus brevifolia et le docetaxel, préparé par hémisynthèse à partir d'un diterpène isolé de l'if européen Taxus baccata. Les dérivés de la camptothécine comme le topotecan et l’irinotecan, inhibiteurs de la topo-isomérase I et provenant de l'étude chimique d'un arbre ornemental chinois Camptotheca acuminat.. 10.

(26) Données bibliographiques Certains produits naturels isolés de plantes, qui ont montré un effet anticancéreux intéressant in vivo, sont actuellement en phase clinique I et II, parmi lesquels : Homoharringtonine, alcaloïdes isolé à partir d’un arbre chinois Cephalotaxus harringtonia (Zhou D.C. et al., 1995) ; β-lapachone, une quinoneisolée à partir de Tabebuia avellanedae ; Combretastatin A4, isolée à partir de Combretum caffreum ; ce qui permettra l’enrichissement de l'arsenal thérapeutique existant. D’autres substances naturelles, possédant des propriétés antimitotique potentiels in vitro, mais qui n’ont pas encore fait l’objet d’étude clinique, parmi lesquelles: Helanalin, Resveratrol, Curcumin, Genistein et Epigallocatechin-3-gallate (Li Y. et al., 2011; Nobili S. et al., 2009). Les végétaux ont été et sont encore largement exploités, mais il existe d'autres sources biologiques fournissant des principes actifs originaux et qui sont les micro-organismes et le milieu marin. Les micro-organismes ont à leurs tours conduits à de nombreux produits antitumoraux. Plusieurs antibiotiques produits par différentes souches de streptomyces et trop toxiques pour être utilisés comme antibactériens, sont doués de propriétés anti-tumorales. Les plus importants appartiennent au groupe des anthracyclines (doxorubicine, daunomycin, etc.). ces derniers s'intercalent entre deux paires de bases azotées de l'adn, empêchant sa réplication et sa transcription , de plus ils inhibent une enzyme qui contrôle la structure dans l'espace de l'adn, la topo-isomérase ii (Binaschi M. et al., 2001; Hortobagyi G.N. and 1997). les bléomycines, comportant 13 peptides différents extraits de streptomyces verticillus, s'intercalent dans l'adn, puis entraînent des cassures de l'adn après liaison avec un ion métallique et production de radicaux libres oxygénés (Colombo P. et al., 2001). la mitomycine c se lie étroitement à certaines bases de l'adn et se comporte comme un agent alkylant après avoir subi une modification dans la cellule (Tomasz M. et al., 1987). Pour revue voir (Kinghorn A.D. et al., 2009; Nobili S. et al., 2009). Le milieu marin offre également de nombreuses substances antitumorales aux structures d'une diversité variée et qui sont employées avec succès pour le traitement de certaines formes. Plusieurs composés antitumoraux d'origine marine ont été répertoriés parmi lesquelles, la cytarabine (Aracytine, Cytarbel ou Ara-C), substance anticancéreuse extraite d'une éponge des Caraïbes, est considéré comme un antimétabolite spécifique de la phase S du cycle cellulaire et utilisé pour le traitement de certaines formes de leucémies. Il existe également les dolastatines, groupe d'oligopeptides initialement isolés d'un mollusque marin de l'océan Indien, Dolabella auricularia, sont des poisons du fuseau mitotique. L'ecteinascidine 743 (ET743) isolé d'un 11.