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Étude de la différenciation des HL60 en cellules de type ostéoclastes et rôle des facteurs rhumatoïdes sur la résorption osseuse des ostéoclastes

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Academic year: 2021

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ÉTUDE DE LA DIFFÉRENCIATION DES HL60 EN

CELLULES DE TYPE OSTÉOCLASTES ET RÔLE DES

FACTEURS RHUMATOÏDES SUR LA RÉSORPTION

OSSEUSE DES OSTÉOCLASTES

Mémoire

Murielle Patricia Nanfah Woda

Maîtrise en microbiologie-immunologie

Maître ès sciences (M.Sc.)

Québec, Canada

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iii

RÉSUMÉ

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune qui touche environ 1% de la population mondiale. Elle entraîne une inflammation synoviale et une destruction de l’architecture articulaire. L’articulation rhumatoïde est un milieu très inflammatoire qui est infiltré par des cellules telles que les neutrophiles, les macrophages, les monocytes, les lymphocytes B et T ; par des protéines telles que des cytokines, des chimiokines, des molécules d’adhésion, par des complexes immuns, et par des auto-anticorps comme les facteurs rhumatoïdes qui sont un marqueur spécifique de la maladie et qui permettent d’établir un pronostic sur son évolution. De plus, dans l’articulation rhumatoïde, il y aura formation d’un pannus rhumatoïde avec érosion progressive du cartilage et de l’os. Les ostéoclastes sont les cellules principalement impliquées dans cette érosion osseuse. Afin d’effectuer des études in vitro, les ostéoclastes sont généralement obtenus à partir de monocytes isolés de sang humain, ce qui rend leur étude complexe car les variations sont très grandes d’un donneur de sang à l’autre. Nous avons utilisé la lignée cellulaire d’origine myéloïde HL60 pour obtenir des ostéoclastes et avons caractérisé ces cellules HL60 « osteoclast-like » dans tous les aspects de leur fonction et de leur activation. Nous avons aussi montré que les facteurs rhumatoïdes pouvaient agir directement sur les ostéoclastes pendant leur différenciation et pendant la résorption osseuse. Cette étude nous a permis d’amorcer la compréhension du rôle possible des facteurs rhumatoïdes sur la résorption osseuse dans la

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AVANT-PROPOS

Tout d’abord, je voudrais remercier Dr Patrice Poubelle qui a accepté de me prendre dans son équipe alors que je venais de très loin, de mon pays le Cameroun. Vous avez fait preuve d’une très grande patience à mon égard et m’avez toujours aidé dans toutes les étapes de ma formation. Vous êtes un excellent pédagogue et vous m’avez mis le pied à l’étrier en ce qui concerne le monde de la recherche; avec vous j’ai appris à aimer cela. C’est un honneur d’avoir pu travailler avec vous, d’avoir pu apprendre toutes ces belles choses.

Je voudrais remercier aussi Dr Isabelle Allaeys, qui m’a quasiment tout appris dans le laboratoire : tu as été avec moi à toutes les étapes de mon apprentissage et c’est avec toi que j’ai travaillé sur mon projet de recherche. Tu m’as appris à travailler avec méthode et organisation et je garderai toujours cela avec moi.

Je remercie aussi Arpita Chakravarti et Daniel Rusu. Vous avez été mes ainés du laboratoire et m’avez appris tellement de choses. J’ai toujours pu compter sur vous à tout moment au cours de l’évolution de mon projet. Je vous remercie pour les bons moments passés au laboratoire et même en dehors.

J’ai aussi eu l’occasion de cotoyer dans l’équipe Martha et Simon. Merci pour tous les moments passés ensemble dans le laboratoire.

Je voudrais aussi remercier tous mes collègues et amis des autres équipes de l’unité de recherche. Merci pour les discussions que nous avons eu ensemble, merci pour les moments de rire au cours de ces années. Merci à Emmanuelle Rollet-Labelle, Louis Marois, Jean-Michel Levesque, Sophie Proulx, Fehtia Ben Yebdri, Marie-thérèse Bawolak, Geremy Kumbadinga, et à tous ceux dont je n’ai pas pu citer le nom.

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vi

Merci à l’équipe enseignante qui m’a encadré et guidé pendant toutes les années de ma formation : Caroline Gilbert, Sylvain Bourgoin, Jean Sévigny, Fawzi Aoudjit, et tous ceux ceux que je n’ai pas pu citer.

Je voudrais aussi remercier toutes les personnes ressources du CRRI, qui sont d’un soutien remarquable dans toutes les différentes tâches du laboratoire.

Je voudrais dédicacer ce document à ma fille Annaëlle Kémila et à mon époux Fabrice. Vous êtes le centre de ma vie, et c’est avec votre soutient et votre amour que j’ai pu mener à bien mes travaux et terminer ce document.

À mes parents, mes frères et soeurs vous m’avez toujours soutenu dans tout ce que j’ai entrepris et j’ai toujours pu compter sur votre aide inconditionnelle. Je vous remercie d’être tout simplement là.

À mes amis, je ne peux tous vous citer ici, car vous êtes nombreux, je sais que vous pensez à moi et moi je pense très fort à chacun de vous. Sachez que j’ai apprécié chaque moment passé ensemble, chaque discussion, chaque marque de soutient et d’encouragement. Merci pour votre présence.

Seigneur Dieu, à Toi soit la gloire, l’honneur et la puissance. Tu m’as donné la force de mener à bien ces travaux et de terminer ce document, je te rends grâce pour tes bienfaits.

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vii

TABLE DES MATIÈRES

RÉSUMÉ ... iii

AVANT-PROPOS ... v

LISTE DES FIGURES ... x

LISTE DES TABLEAUX ... xii

LISTE DES ABRÉVIATIONS ... xiii

I. INTRODUCTION ... 1 1.1. LE TISSU OSSEUX ... 1 1.1.1. Définition ... 1 1.1.2. Le remodelage osseux... 1 1.2. LES OSTÉOCLASTES ... 5 1.2.1. Origine ... 5 1.2.2. Fonction ... 7

1.2.3. Mécanismes moléculaires de l’activation des ostéoclastes ... 8

1.3. LA POLYARTHRITE RHUMATOÏDE ... 11

1.3.1. Qu’est ce que la polyarthrite rhumatoïde? ... 11

1.3.2. La physiologie de la polyarthrite rhumatoïde ... 16

1.4. LES CELLULES HL60 ... 38

1.5. BUTS DE L’ÉTUDE ... 40

II. DÉTERMINATION DES CONDITIONS OPTIMALES DE DIFFÉRENCIATION DES HL60 ET CARACTÉRISATIONS DES CELLULES HL60 DIFFÉRENCIÉES. 42 2.1. INTRODUCTION ... 42

2.2. MATÉRIELS ET METHODES ... 43

2.2.1. Réactifs ... 43

2.2.2. Différenciation des cellules ... 44

2.2.3. Isolement des monocytes et différenciation en ostéoclastes ... 45

2.2.4. Immunobuvardages ... 46

2.2.5. Analyses par RT-PCR ... 48

(8)

viii

2.2.7. Coloration TRAP ... 51

2.3. RÉSULTATS ... 51

2.3.1. Caractéristiques morphologiques des cellules ... 52

2.3.2. Présence des anneaux d’actine ... 54

2.3.3. Activité enzymatique TRAP ... 55

2.3.4. Expression de RANK ... 57

2.3.5. Expression de NFATc ... 59

2.3.6. Expression des récepteurs de calcitonine ... 61

2.3.7. Expression de MMP9 ... 62 2.3.8. Expression de cathepsine K ... 63 2.3.9. Expression de DAP-12 ... 64 2.3.10. Expression de TREM2 ... 66 2.3.11. Expression d’OSCAR ... 68 2.3.12. Expression de SIRP1 ... 69 2.3.13. Expression de PIR-A ... 70 2.3.14. Expression de CD64 ... 71 2.4. DISCUSSION ... 72

III. ACTION DES FACTEURS RHUMATOÏDES SUR LES OSTÉOCLASTES ET LA RÉSORPTION OSSEUSE ... 75

3.1. INTRODUCTION ... 75

3.2. MATÉRIELS ET MÉTHODES ... 76

3.2.1. Réactifs ... 76

3.2.2. Isolement des monocytes : ... 77

3.2.3. Résorption osseuse ... 77

3.2.4. Coloration TRAP ... 78

3.3. RÉSULTATS ... 79

3.3.1. Action des facteurs rhumatoïdes sur les ostéoclastes ... 79

3.3.2. Action des facteurs rhumatoïdes sur la résorption par les ostéoclastes... 81

3.3.3. Activation des cellules HL60 différenciées par les facteurs rhumatoïdes ... 83

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ix IV. CONCLUSION ET PERSPECTIVES ... 89 V. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 91

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x

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Homéostasie de la structure osseuse [4] ... 4

Figure 2 : Représentation schématique de la différenciation et la fonction des ostéoclastes en coopération avec les ostéoblastes [5]. ... 6

Figure 3 : Intégration des voies RANK et ITAM par les protéines kinases Btk et Tec [15] ... 10

Figure 4 : Effet de la polyarthrite rhumatoïde sur les mains : radiographie des déformations d’une main rhumatoïde [25]. ... 12

Figure 5 : Représentation globale de la pathogenèse de la PAR [39] ... 19

Figure 6: Citrullination des protéines [35] ... 20

Figure 7: Modèle explicatif de l’étiologie de la PAR positive aux ACPA [38] ... 21

Figure 8: Comparaison de l’articulation normale et l’articulation rhumatoïde [25] ... 23

Figure 9: Voies de signalisation des cytokines impliquées dans la polyarthrite rhumatoïde [40]: ... 29

Figure 10 : Quelques orientations actuelles sur la pathogenèse de la PAR [65]. 30 Figure 11: Caractéristiques morphologiques des cellules HL60 différenciées (microscopie optique 400X) ... 53

Figure 12: Caractéristiques morphologiques des cellules HL60 différenciées (microscopie à fluorescence 400X) : ... 53

Figure 13: Présence des anneaux d’actine (microscopie à fluorescence 600X)... 55

Figure 14: Expression de l’activité enzymatique TRAP (microscopie optique 200X) ... 56

Figure 15: Expression de RANK dans les cellules HL60 différenciées ... 58

Figure 16: Expression de NFATc ... 60

Figure 17: Expression des récepteurs de calcitonine ... 61

Figure 18: Expression de MMP9 ... 62

(11)

xi

Figure 20: Expression de DAP-12 ... 65

Figure 21: Expression de TREM2 ... 67

Figure 22: Expression d’OSCAR ... 68

Figure 23: Expression de SIRP1 ... 69

Figure 24: Expression de PIR-A ... 70

Figure 25: Expression du récepteur CD64... 71

Figure 26: Effets du facteur rhumatoïde IgM sur la différenciation des ostéoclastes (microscopie optique 200X) ... 80

Figure 27: Effet des facteurs rhumatoïdes sur la résorption osseuse des ostéoclastes ... 82

Figure 28: Phosphorylation des tyrosines dans les HL60 différenciées. ... 84

Figure 29: Protéines adaptatrices associées à leurs récepteurs transmembranaires pour initier la transduction du signal [136]. ... 88

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xii

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1: Différents gènes possiblement impliqués dans la PAR et leur rôle dans la pathogenèse de la maladie [32]. ... 16 Tableau 2: Critères de classification de l’arthrite rhumatoïde, classification de 1987 par le collège américain de rhumatologie [77]. ... 34 Tableau 3: Tableau de classification des critères diagnostics de l’arthrite

rhumatoïde établis en 2010 par le collège américain de rhumatologie et la ligue européenne contre le rhumatisme [79]. ... 35

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xiii

LISTE DES ABRÉVIATIONS

7AAD: 7-amino actinomycine D ADN : Acide Désoxyribonucléique

ACPA : Anti-citrullinated protein antibodies AP-1 : Activator protein 1

CIA : Collagen type II-induced arthritis

CFU/GM : Colony Forming Unit/Granulocyte-Macrophage 1, 25(OH) 2D3 : Dihydroxyvitamine D3

DMARDs : Disease Modifying Anti-Rheumatic Drugs DAPI: 4’6-diamidino-2 phenylindole

DAP-12 : DNAX activating protein 12 ECL : Enhanced Chemiluminescence FBS : Fœtal Bovine Serum

FR : Facteurs rhumatoïdes

FCR : Récepteur du fragment Fc des immunoglobulines G GM-CSF : Granulocyte/Macropage-Colony Stimulating Factor GAPDH : Glyceraldehyde 3-phosphate déhydrogénase

HEPES : Acide N-2-hydroxy-ethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonique ITAM : Immunoreceptor tyrosine-based activation motif

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xiv

IL : Interleukine MTX : Méthotrexate

MHC : Major Histocompatibility Complex MMPs : Métalloprotéinases

M-CSF : Macrophage Colony Stimulating Factor NFATc1 : Nuclear factor of activated T cell 1 F : Nuclear Factor B

OPG : Ostéoprotégérine OA : Ostéoarthrite

OSCAR : Osteoclasts associated receptor PAR : Polyarthrite rhumatoïde

PMA : Phorbol 12-myristate 13-acetate PADs : Peptidylarginine déiminases

PTPN22 : Protein Tyrosine Phosphatase Nonreceptor 22 PFA : Paraformaldehyde

PIR-A : Paired Immunolike Receptor A PTH : Parathormone

PVDF : Polyfluorure de vinylidène

RANK : Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B

RANKL : Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B Ligand ROS : Reactive Oxygen Species

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xv

RT-PCR : Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction SIRP : Signal regulatory protein 

TGF : Transforming growth factor  TNF : Tumor Necrosis Factor 

TRAF6 : TNF receptor associated factor 6

TREM2 : Triggering receptor expressed on myeloid cells 2 TRAP : Tartrate Resistant Acid Phosphatase

TCR : T Cell Receptor Th : T helper

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(17)

1

I. INTRODUCTION

1.1.

LE TISSU OSSEUX

1.1.1. Définition

L’os est un tissu conjonctif qui assure plusieurs fonctions essentielles en dehors de la croissance :

 il est responsable du maintien de l’homéostasie du calcium sérique  c’est le support mécanique des tissus mous et le site d’attachement

des muscles pour la locomotion

 c’est le site majeur de l’hématopoïèse chez l’adulte

Le tissu osseux est composé de cellules et de matrice extracellulaire. Les quatre types de cellules présents sont: les ostéoclastes responsables de la résorption osseuse, les ostéoblastes responsables de la formation osseuse, les cellules bordantes (ostéoblastes au repos) et les ostéocytes (ostéoblastes différenciés). La matrice extracellulaire est composée de phosphate de calcium qui forme les cristaux d’hydroxyapatite et de constituants organiques tels que le collagène.

L’os possède des propriétés mécaniques étonnantes telles que rigidité, résistance et légèreté qui sont dues à une réorganisation permanente de la matière osseuse en réponse à des stimuli mécaniques et chimiques [1].

1.1.2. Le remodelage osseux

Le tissu osseux est un tissu vivant en constant renouvellement; cela constitue le remodelage osseux. Ce remodelage permanent est un

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2

équilibre entre d’une part la résorption et d’autre part de formation de tissu osseux (figure 1). Ostéoclastes et ostéoblastes collaborent étroitement dans ce processus, et constituent ce qu’on appelle l’unité de remodelage osseux qui a une durée de vie moyenne de 200 jours. Le remodelage osseux est constitué de trois principales phases d’inégales longueurs, la phase de résorption qui dure environ 2 semaines, la phase d’inversion d’environ 4 à 5 semaines, et enfin la formation qui se poursuit pendant environ 4 mois jusqu’à ce que la nouvelle structure osseuse soit complètement formée [2]. La résorption commence par la migration des précurseurs ostéoclastiques à la surface de la matrice osseuse, où ils deviendront des ostéoclastes capables de dissoudre les cristaux d’hydroxyapatite. Ensuite survient la phase d’inversion au cours de laquelle des cellules mononuclées de type macrophages vont remplacer les ostéoclastes à la surface de la matrice osseuse. Ces cellules préparent la surface pour que les ostéoblastes commencent leur travail de formation et fournissent aussi les signaux pour la différenciation et la migration des ostéoblastes [2]. Après cela, les ostéoblastes sont en place et commencent la formation du nouveau tissu osseux. Lorsque cette étape est terminée, la surface osseuse est recouverte par les cellules bordantes qui sont des ostéoblastes au repos. À la fin de chaque cycle, les ostéoclastes sécrètent un substrat qui sert à l’attachement des ostéoblastes. Une période de repos commence ainsi jusqu'au début du prochain cycle de remodelage. Durant la résorption, les ostéoclastes libèrent certains facteurs qui permettront de réguler leur activité soit en inhibant la fonction des ostéoclastes soit en stimulant l’activité des ostéoblastes [3].

Le remodelage osseux est régulé à plusieurs niveaux : une régulation systémique par des facteurs tels que l’hormone parathyroïde, les glucocorticoïdes; une régulation locale qui passe par la régulation de la voie de signalisation RANK/RANKL/OPG ( Receptor Activator of Nuclear

(19)

3 Factor Kappa B , récepteur activateur du facteur nucléaire Kappa B, son ligand et Ostéoprotégérine, leurre de RANKL) et fait intervenir aussi des facteurs de croissance tels que le TGF ( Transforming growth factor , facteur de transformation de croissance ), des cytokines telles que le TNF (Tumor Necrosis Factor , facteur nécrosant des tumeurs), l’IL-10 (Interleukine 10) et des prostaglandines. Des anomalies dans le remodelage osseux peuvent être observées dans certaines pathologies telles que l’ostéoporose et la polyarthrite rhumatoïde.

(20)

4

Figure 1 : Homéostasie de la structure osseuse [4]

A l’intérieur du tissu osseux, ostéoblastes et ostéoclastes jouent leurs rôles respectifs de formation et destruction. Les ostéoclastes commencent par dégrader l’os, ensuite les puits de résorption sont remplis par la nouvelle matrice osseuse synthétisée par les ostéoblastes. Cette matrice sera par la suite minéralisée.

(21)

5

1.2.

LES OSTÉOCLASTES

Les ostéoclastes sont de grosses cellules hématopoïétiques, multi-nucléées d’environ 50 à 100 m de diamètre. Ces cellules ont la capacité de détruire une matrice osseuse et ont une durée de vie moyenne de 15 jours; elles mourront ensuite par apoptose. Les ostéoblastes, quand à eux, sont responsables de la formation du tissu osseux. La différenciation et la fonction des ostéoclastes sont étroitement liées aux ostéoblastes [5], un contact cellule-cellule est nécessaire et nécessite l’implication de cytokines telles que M-CSF (Macrophage-Colony Stimulating Factor, facteur stimulant les macrophages) et RANKL (Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B Ligand, ligand du récepteur activateur du facteur nucléaire Kappa B) [6].

1.2.1. Origine

Les précurseurs des ostéoclastes sont les cellules souches hématopoïétiques de la lignée des monocytes/macrophages (CFU/GM) (Colony Forming Unit/Granulocyte-Macrophage, unité de formation des colonies de granulocytes et macrophages). Des expériences utilisant le système de coculture ont clairement établi le concept selon lequel les ostéoblastes sont impliqués dans le processus de différentiation des ostéoclastes [5, 7]. Les ostéoclastes sont obtenus après la fusion de progéniteurs mononucléaires. Ces précurseurs ostéoclastiques expriment à leur surface RANK, un membre des récepteurs de la famille du TNF qui reconnaitra son ligand RANKL lorsqu’ils entrent en contact avec les ostéoblastes, car les ostoblastes sont les cellules qui expriment RANKL dans le tissu osseux. Une fois le contact effectué, ces précurseurs vont se transformer en préostéoclastes sous l’action du M-CSF et du RANKL, puis survient la fusion des préostéoclastes, leur activation et maturation en ostéoclastes, comme le montre la figure 2. L’expression de RANKL par les ostéoblastes est régulée par des facteurs tels que la 1,

(22)

6

dihydroxyvitamine D3 (1, 25(OH) 2D3) ou calcitriol, la PTH (Parathormone) et l’IL-11. L’interaction RANK-RANKL est régulée par un autre récepteur appelé OPG qui est le récepteur leurre de RANKL. L’OPG, en se liant à RANKL, empêche la liaison de son récepteur et permet ainsi d’empêcher l’activation et la maturation des ostéoclastes.

Figure 2 : Représentation schématique de la différenciation et la fonction des ostéoclastes en coopération avec les ostéoblastes [5].

(23)

7 1.2.2. Fonction

Les ostéoclastes sont des cellules ostéorésorbantes très mobiles, capables de se déplacer à travers les travées osseuses d’un site de résorption à un autre. La résorption est un processus très important dans la biologie osseuse. Elle est indispensable à la croissance osseuse, à la poussée dentaire, à la guérison des fractures, et au maintien du taux de calcium dans le sang [8]. Une fois que l’ostéoclaste a atteint la surface osseuse, deux évènements surviennent : l’activation suivie de l’adhésion. Lorsqu’il est activé, l’ostéoclaste se polarise fortement; l’un des pôles entre en contact avec la surface osseuse et y adhère fortement. L’un des mécanismes d’adhésion identifiés fait intervenir l’intrégrine V3 [9]. Elle

est très exprimée dans les ostéoclastes, que ce soit à la membrane cytoplasmique ou à l’intérieur de certaines vacuoles. L’intégrine V3 joue

un rôle dans la forte adhésion, la migration des ostéoclastes et l’endocytose des produits de la résorption. L’intégrine V3 joue aussi un

autre rôle non moins important dans la résorption osseuse ; en effet, elle transmet un signal qui en fin de compte va être à l’origine de la réorganisation du cytosquelette à l’un des pôles de la cellule, particulièrement celui en contact avec la matrice osseuse [10]. Cette réorganisation est à l’origine de la formation de la bordure en brosse qui va être entourée d’une zone de scellage riche en micro-filaments d’actine. À ce niveau, l’ostéoclaste met en place des structures d’attachement appelées podosomes [11, 12]. L’actine se réorganise pour prendre la forme spécifique d’un anneau et une fois l’adhésion faite, il se forme une zone de scellage appelée lacune de Howship où aura lieu la résorption proprement dite. À travers la bordure en brosse, l’ostéoclaste secrète des ions H+ qui, créant un environnement acide vont permettre de dissoudre

la matrice osseuse [13]. La sécrétion des protons H+ est un processus

actif qui requiert de l’ATP. De plus, les ostéoclastes produisent des protéases - la cathepsine K étant la plus importante - qui participent

(24)

8

elles aussi à la dégradation de la matrice osseuse [8, 14]. Outre la cathepsine K, les métalloprotéinases (MMP) -plus précisément la MMP9- participent elles aussi à la dégradation de la matrice osseuse. Une fois la résorption terminée, il y a élimination des produits de dégradation de la matrice osseuse et enfin soit apoptose des ostéoclastes soit leur retour à l’état de repos.

1.2.3. Mécanismes moléculaires de l’activation des ostéoclastes

L’activation des ostéoclastes passe par deux voies de signalisation distinctes et complémentaires (figure 3). La voie principale passe par la triade RANK/RANKL/OPG et la seconde voie est la voie de costimulation qui fait intervenir des récepteurs à domaine ITAM (Immunoreceptor tyrosine-based activation motif). La liaison de RANKL à son récepteur RANK permet le recrutement de TRAF6 (TNF receptor associated factor 6, facteur 6 associé au récepteur du TNF) qui active NFB, facteur de transcription clé de la différenciation et de l’activation ostéoclastiques, les MAP kinases JNK et Erk, de même que les protéines kinases Btk et Tec. Cette liaison permet aussi le recrutement de cFos, étape préliminaire à l’activation du complexe AP-1 [15, 16]. Les facteurs de transcription NFB (Nuclear Factor B, facteur nucléaire B) et AP-1 (Activator protein 1, protéine activatrice 1) vont permettre, en partie, l’activation du facteur de transcription NFATc1 (Nuclear factor of activated Tcell 1, facteur nucléaire 1 de l’activation des cellules T) qui est le régulateur le plus important de la différenciation des ostéoclastes [17]. La voie de costimulation passe par les récepteurs OSCAR (Osteoclasts associated receptor, récepteur associé aux ostéoclastes), PIR-A (Paired Immunolike Receptor A, récepteur A couplé de type immunologique), TREM2 (Triggering receptor expressed on myeloid cells 2, récepteur déclencheur exprimé sur les cellules myéloïdes 2) et SIRP1 (Signal regulatory protein

(25)

9

, protéine régulatrice du signal 1). Ces récepteurs sont associés à des molécules adaptatrices : DAP-12 (DNAX activating protein 12, protéine activatrice d’ADNX) et FCR (récepteur du fragment Fc des immunoglobulines G). Les récepteurs et leurs molécules adaptatrices vont envoyer un signal grâce à la phosphorylation des motifs ITAM, ce qui recrute la tyrosine kinase Syk [18, 19]. Les ligands pour les récepteurs de la voie de costimulation ne sont pas encore connus à ce jour. En plus de ces deux voies de signalisation, NFATc1 est constamment activé par la calcineurine, une phosphatase calcium-dépendante. NFATc1 régule l’expression de nombreux gènes spécifiques des ostéoclastes tels que ceux qui codent pour la cathepsine K, l’isoforme 5b de la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP) et les récepteurs de calcitonine.

(26)

10

Figure 3 : Intégration des voies RANK et ITAM par les protéines kinases Btk et Tec [15]

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11

1.3.

LA POLYARTHRITE RHUMATOÏDE

1.3.1. Qu’est ce que la polyarthrite rhumatoïde?

1.3.1.1. Définition

Les arthrites constituent toutes les formes d’inflammation aiguës ou chroniques qui affectent les articulations sans cause reconnue. La classification des maladies rhumatismales peut être difficile à cause de la diversité des manifestations cliniques, on en distingue une centaine. Parmi celles-ci, l’arthrose et la polyarthrite rhumatoïde (PAR) sont les plus fréquentes. L’arthrose est une maladie dégénérative qui affecte le cartilage articulaire et l’os sous-chondral. On estime qu’elle touche à peu près 40% des personnes âgées de plus de 75 ans, ce qui en fait la maladie articulaire à la plus forte prévalence [20, 21].

La PAR est une maladie auto-immune qui entraîne une inflammation synoviale et une destruction de l’architecture articulaire. Le système immunitaire attaque les tissus synoviaux qui revêtent les articulations et parfois même d’autres organes tels que les yeux, le poumon ou le cœur. La PAR commence généralement lentement à partir de quelques articulations, puis elle va se propager progressivement à d’autres articulations. Elle est la seule arthrite qui attaque les articulations de façon symétrique. La PAR est l’une des maladies articulaires les plus sévères, mais aussi la maladie auto-immune systémique la plus courante. Elle affecte approximativement 1% de la population adulte mondiale [22].

1.3.1.2. Les manifestations cliniques de la polyarthrite rhumatoïde

La PAR est la forme d’arthropathie la plus commune ; elle a un impact important sur la société en terme de coût et de perte de productivité dûs aux incapacités qu’elle provoque. Les symptômes

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12

prédominants sont la douleur, l’inflammation et la raideur matinale des petites articulations (mains, poignets, pieds) [23]. La symétrie des articulations touchées est une caractéristique de la PAR. Une radiographie des articulations effectuée dans les premières années de la maladie montrera une érosion évidente des os chez la plupart des patients (plus de 70% des patients dans les deux premières années [23, 24]). Cette érosion entrainera progressivement après de nombreuses années la déformation des articulations et les deux sont irréversibles [24] (figure 4).

La PAR ne présente pas seulement des manifestations articulaires, mais aussi des atteintes systémiques telles que les maladies des voies respiratoires et les maladies cardiovasculaires.

Les manifestations et l’évolution cliniques de la maladie sont extrêmement variables, mais dans tous les cas un traitement doit être administré pour contrôler la maladie et éviter les handicaps qu’elle peut entraîner [23].

Figure 4 : Effet de la polyarthrite rhumatoïde sur les mains : radiographie des déformations d’une main rhumatoïde [25].

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13

1.3.1.3. Facteurs de risque

Les causes d’apparition de la PAR ne sont pas parfaitement déterminées. En plus des facteurs psychologiques, environnementaux et hormonaux, des facteurs génétiques peuvent être incriminés.

Les facteurs génétiques ont une influence importante sur la détermination de la susceptibilité à développer une PAR. Ainsi, des études ont démontré que 60% des prédispositions d’une population à la PAR peut être expliquée par des facteurs génétiques [23]. Peu d’études ont été réalisées dans ce domaine, mais un risque familial a tout de même été identifié [23, 26, 27]. Les molécules HLA de classe II sont les facteurs génétiques les plus importants [28], soit environ 30% du facteur génétique de la maladie [28, 29]. Les allèles HLA-DRB1 sont ceux impliqués en particulier. Ils constituent la théorie de l’épitope partagé qui stipule que ces allèles sont étroitement liés à la susceptibilité et à la sévérité de la maladie. Ainsi, les individus homozygotes pour l’épitope partagé auront un risque plus élevé de développement de l’arthrite avec une destruction osseuse plus sévère que les individus hétérozygotes [26, 29, 30]. Les allèles HLA seraient, en fait, liés plus précisément à la présence d’anticorps dirigés contre la fraction Fc des IgG ou contre les peptides citrullinés, ce qui confère une plus grande sévérité aux arthrites séropositives pour ces anticorps par rapport aux arthrites séronégatives [27]. Les allèles HLA-DRB1 agissent aussi en déclenchant le TCR, ceci en lui présentant l’épitope partagé.

Les gènes associés au MHC (Major histocompatibility complex, complexe majeur d’histocompatibilité) ne sont pas les seuls impliqués dans la PAR, d’autres gènes le sont aussi. Le gène à la plus forte association à la maladie retrouvée est le gène PTPN22 (Protein Tyrosine Phosphatase Nonreceptor 22) qui code pour une tyrosine phosphatase qui exerce un rétrocontrôle négatif sur la signalisation du récepteur pour les

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14

cellules T [27]. Le mécanisme de cette régulation n’implique pas les cellules T périphériques directement mais il s’agit plutôt d’un défaut de signalisation dans la sélection des cellules T au niveau du thymus ; il en résulte une production de cellules T auto-réactives.

Outre les facteurs génétiques, des facteurs environnementaux sont impliqués dans les prédispositions à la PAR. Parmi ceux-ci nous pouvons citer le tabagisme, la consommation de caféine, l’obésité, de même que le facteur hormonal [31].

Les gènes impliqués dans le développement de la maladie sont connus, mais les mécanismes moléculaires eux restent encore assez peu connus [29]. Le tableau 1 résume ces différents gènes et leurs rôles dans la pathogenèse. Tous les facteurs cités plus haut concourent au déclenchement de la maladie, à son évolution, de même qu’à la sévérité des symptômes.

(31)

15

Candidate Gene and pathway .

SNP Locus Function relevant to pathogenesis

T-Cell Activation

HLA-DRB1† 6p21 HLA DRB1 allele (also known as the shared epitope) involved in MHC molecule–based antigen presentation and responsible for self-peptide selection and T-cell repertoire; first discovered and still by far the strongest genetic link to rheumatoid arthritis PTPN22 1p13.2 Lymphocyte-specific nonreceptor tyrosine phosphatase involved in

regulation of activation threshold of lymphocytes; second genetic link described in rheumatoid arthritis

AFF3 2q11.2 Transcription factor for lymphoid development CD28 2q33.2 Costimulatory molecule for T-cell activation

CD40 20q13.12 Costimulatory molecule that enhances interactions between T and B cells and increases autoantibody Production

CTLA4 2q33.2 Costimulation suppressor that regulates interactions between T cells and antigen-presenting cells

IL2RA 10p15.1 High-affinity receptor for interleukin-2 on lymphocyte subsets IL2 4q27 Cytokine that regulates activation of T cells, particularly regulatory

T cells

IL21 4q27 Cytokine that regulates differentiation of T cells, particularly Th17, and activation of B cells

PRKCQ 10p15.1 Member of the protein kinase C family that regulates T-cell and macrophage activation

STAT4 2q32.3 Transducer of cytokine signals that regulate proliferation, survival, and differentiation of lymphocytes

TAGAP 6q25.3 Rho-GTPase enzyme involved in T-cell activation

NF-κB pathway

REL 2p16.1 Proto-oncogene member of the NF-κB family that regulates leukocyte activation and survival

TNFAIP3 6q23.3 Signaling protein and negative regulator of TNF-α–induced NF-κB activation

TRAF1 9q33.1 Regulator of TNF-α–receptor superfamily signaling (e.g., to NF-κB and JNK)

Other pathway

BLK 8p23.1 B-lymphoid tyrosine kinase involved in B-cell receptor signaling and B-cell development

(32)

16

CCL21 9q13.3 Chemokine implicated in germinal-center formation

FCGR2A 1q23.2 Low-affinity IgG Fc receptor that regulates macrophage and neutrophil activation and immune-complex clearance

PAD14 1p36.2 Enzyme that converts arginine to citrulline, creating autoantigens in rheumatoid arthritis

PRDM1 6q21 Protein that acts as a repressor of β-interferon gene expression TNFRSF14 1p36.32 TNF-α–receptor superfamily member with proinflammatory

activity

GTPase denotes guanosine triphosphatase, JNK Jun N-terminal kinase, MHC major histocompatibility complex, NF-κB nuclear factor κB, Th17 type 17 helper T cells, and TNF-α tumor necrosis factor α.

† Different HLA-DRB1 alleles, not only the shared epitope, are associated with rheumatoid arthritis and with distinct immune responsesto citrullinated antigens. In addition, HLA-DP and HLA-DQ loci (outside the HLA-DRB1 region) have been associated with rheumatoid arthritis.

SNP : Single Nucleotid Protein

Tableau 1: Différents gènes possiblement impliqués dans la PAR et leur rôle dans la pathogenèse de la maladie [32].

1.3.2. La physiologie de la polyarthrite rhumatoïde

1.3.2.1. La pathogenèse

La PAR est une maladie dont les causes restent encore inconnues à ce jour, une combinaison de plusieurs facteurs permet le déclenchement et le développement de la maladie au fil des mois. Elle peut être caractérisée par 3 phases distinctes mais interdépendantes et activées simultanément [33] (figure 5). La phase initiale est asymptomatique et est caractérisée par le déclenchement de l’auto-immunité. Ensuite suivront deux phases symptomatiques caractérisées par l’atteinte

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17

articulaire, respectivement la phase intermédiaire et la phase de destruction terminale. Ces deux phases se distinguent par leurs sévérités et amplitudes [34].

Les facteurs génétiques jouent un rôle très important dans la pathogenèse de la maladie surtout dans la phase initiale. Le facteur génétique majeur est l’épitope partagé exprimant les allèles HLA-DRB1 qui agit dans le déclenchement du TCR [27], il en résulte la transmission d’un signal inhabituel aux cellules T. Ce signal conduit à la production de cellules T auto-réactives qui vont être activées et différenciées en Th1 et Th17 [35]. Le TCR (T Cell Receptor, récepteur pour les cellules T) ici reconnait certains peptides spécifiques du soi. Cette reconnaissance conduira à la production par les lymphocytes B d’auto-anticorps dont les plus fréquemment retrouvés chez les patients sont les anticorps contre les protéines cycliques citrullinées (ACPA : Anti-citrullinated protein antibodies, anticorps anti protéines citullinées) et les anticorps contre les IgG encore appelés facteurs rhumatoïdes (FR). Les anticorps de moindre importance qui sont les anticorps contre la kératine ou contre la filagrine sont également retrouvés dans la maladie [36]. Les auto-anticorps ne sont pas toujours retrouvés chez les personnes atteintes de PAR mais leur présence est de mauvais pronostic pour le malade et sont de nos jours utilisés à des fins de diagnostic ; c’est le cas particulièrement des FRs. La citrullination des protéines est une modification post-translationnelle dans laquelle les résidus peptidyl-arginine sont convertis en peptidyl-citrulline sous l’action des peptidylarginine déiminases (PAD) [35, 37] (figure 6). Les protéines citrullinées sont retrouvées au niveau de plusieurs sites inflammatoires. À la suite d’un trauma, ou d’une inflammation, il y a infiltration de cellules inflammatoires contenant des enzymes PAD. La mort de ces cellules entraîne la libération de ces enzymes qui, lorsqu’elles ne sont pas correctement éliminées, vont devenir des signaux de danger surtout dans un environnement

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18

immunologique tel que l’articulation rhumatoïde. C’est la perte de la tolérance contre ces protéines qui serait en partie responsable du déclenchement de la maladie. Des études ont démontré que le tabac prédispose certaines personnes à la production de ACPA [37]. La figure 7 explique la pathogenèse de la PAR liée aux ACPA.

À la suite du déclenchement de l’auto-immunité, une réponse inflammatoire pathologique est déclenchée au niveau articulaire. La cause de cette spécificité articulaire reste encore inconnue, cependant certaines études l’attribueraient à des infections, des traumatismes ou même des interactions neuro-immunologiques [38, 39]. L’inflammation se traduit par une infiltration de cellules inflammatoires, la production de cytokines pro inflammatoires, et la formation de complexes immuns.

La troisième étape est une étape d’auto-amplification de l’inflammation, ce qui rend la maladie chronique. Il y a amplification de la production de cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF-, l’IL-1 et l’IL-6, ce qui augmente le recrutement de cellules inflammatoires [38].

Il est à noter que les premiers symptômes peuvent apparaître des années après le début de l’auto-immunité.

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19

Figure 5 : Représentation globale de la pathogenèse de la PAR [39]

La phase de déclenchement de l’auto-immunité caractérisée par l’absence de symptômes est suivie par une phase de transition caractérisée par l’atteinte articulaire, le déclenchement de l’inflammation et l’apparition des premiers symptômes. Ensuite viens la troisième phase caractérisée par l’amplification de l’inflammation et le début de la destruction articulaire. Des troubles systémiques tels que les maladies cardiovasculaires peuvent survenir à cette étape.

(36)

20

Figure 6: Citrullination des protéines [35]

Transformation du résidu peptidyl arginine en résidu peptidine citrulline sous l’action de la PAD.

(37)

21

Figure 7: Modèle explicatif de l’étiologie de la PAR positive aux ACPA [38]

1ère étape : les facteurs génétiques et environnementaux, tels le tabagisme, déclenchent

la citrullination des protéines dans les poumons et seront reconnus comme antigènes par les cellules T. Il s’en suit la production des ACPA.

2ème étape : déclenchement de l’inflammation localisée au niveau articulaire,

recrutement des ACPA de la circulation et formation de complexes immuns

3ème étape : auto-amplification de l’inflammation avec augmentation de la production de

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22

1.3.2.2. L’articulation rhumatoïde

Les articulations préférentiellement atteintes par la PAR sont les articulations synoviales, et plus fréquemment les mains, les pieds et les genoux. L’articulation normale est composée de deux surfaces osseuses adjacentes communes, recouvertes de cartilage et qui sont séparées par une cavité appelée cavité articulaire. Une membrane synoviale scelle la cavité articulaire et sécrète le liquide synovial qui est un liquide visqueux, lubrifiant et riche en éléments nutritifs ; ce qui permet à l’articulation d’être mobile.

L’articulation rhumatoïde est un milieu très inflammatoire. Elle subit des changements micro-environnementaux profonds avec une réorganisation de la structure synoviale et activation des fibroblastes et macrophages synoviaux [32] (figure 8). Contrairement au liquide synovial de l’articulation normale qui est un milieu acellulaire, celui de l’articulation rhumatoïde est infiltré de neutrophiles, macrophages, lymphocytes T et cellules dendritiques. Progressivement la membrane synoviale sera elle aussi envahie par plusieurs types cellulaires dont les plus importantes sont les macrophages et les cellules T. Les leucocytes activés ainsi que leurs protéines (cytokines, chimiokines, molécules d’adhésion, …) vont engendrer un milieu hypoxique qui stimule l’angiogenèse, ce qui explique l’augmentation de la vascularisation dans les articulations des patients [40]. La membrane synoviale ainsi modifiée forme des excroissances qui vont envahir la cavité articulaire, le cartilage et même l’os souschondral; elle constitue désormais le pannus. Les cellules du pannus vont progressivement causer l’érosion du cartilage et de l’os [41].

(39)

23

Figure 8: Comparaison de l’articulation normale et l’articulation rhumatoïde [25]

Formation du pannus avec infiltration de nombreux types cellulaires dans la membrane synoviale, angiogenèse et érosion osseuse progressive dûe à l’activation de métallo-protéinases, enzymes sécrétées par les macrophages et fibroblastes activés.

(40)

24

1.3.2.3. Les cellules impliquées

Plusieurs types cellulaires sont retrouvés dans l’articulation rhumatoïde. Cependant, chacun de ces types cellulaires à lui seul ne permet pas d’expliquer la pathogenèse de la maladie, ce sont les différentes interactions entre ces cellules qui permettent de comprendre la maladie [42]. Le tissu synovial rhumatoïde est composé des cellules résidentes et des cellules qui se sont infiltrées à la suite de l’inflammation.

L’espace articulaire normal est bordé par des synoviocytes dont il existe deux types: le type A « macrophage-like » et le type B « fibroblast-like » qui sont les plus nombreux [43]. Dans la PAR, la membrane synoviale devient hyperplasique et localement invasive, entraînant la destruction du cartilage et de l’os [44]. Les synoviocytes de type fibroblastes vont être activés et deviendront aussi capables plus tard de présenter des antigènes aux cellules T. Il a été démontré que les synoviocytes de type B une fois activés sont caractérisés par un changement de comportement et montrent certaines similarités avec les tumeurs [45]. À la suite de cela, elles dégradent la matrice cartilagineuse en s’accrochant fermement à sa surface et en y pénétrant profondément jusqu’à atteindre l’os avec l’aide de certaines enzymes de dégradation telles que les MMP et les cathepsines [46]. Cette pénétration se fait grâce au changement de leur forme pour devenir des cellules de type macrophage-like [47]. Les MMP préférentiellement exprimées dans le synovium rhumatoïde sont les MMP1, MMP9, MMP13, MMP14, MMP15. Les cathepsines B, K et L seront, elles aussi, produites et responsables de la dégradation du collagène et des protéoglycanes. Les synoviocytes contribuent aussi à l’inflammation en produisant des cytokines pro-inflammatoires, des chimiokines et facteurs de croissance [46, 48]. La matrice cartilagineuse ainsi dégradée en pannus ne sera constituée dans un premier temps que des cellules ci-dessus citées, mais

(41)

25

progressivement elle sera envahie par les autres types cellulaires après l’apparition des petits vaisseaux sanguins [49].

Les lymphocytes T sont l’un des types cellulaires les plus abondamment retrouvés dans l’articulation rhumatoïde. Comme nous l’avons vu plus haut, les cellules T sont impliquées dans la pathogenèse de la PAR en vertu des facteurs génétiques. Plusieurs sous-types de lymphocytes T sont présents dans le synovium influencés par les cytokines produites. Les lymphocytes T helper (Th) sont les plus importants et favorisent l’inflammation. Plusieurs études ont qualifiées la PAR de « maladie à Th1 » [50]. La différenciation des cellules T naïves en cellules Th1 est accompagnée de la production de cytokines pro- inflammatoires telles que l’IFN, et le TNF. Le TNF semble être la cytokine à la tête de la cascade de cytokines pro-inflammatoires. Elle est d’autant plus importante que son blocage entraîne la diminution de l’expression de bon nombre de cytokines telles que l’IL-8, l’IL-6, l’IL-1 et même une diminution de l’évolution de la maladie [40]. Le TNF régule la production des cytokines pro-inflammatoires mais peut être lui aussi régulé par l’IL-1, le GM-CSF (Granulocyte/Macropage-Colony Stimulating Factor, facteur stimulant les granulocytes/macrophages), l’IFN[41]. On observe une prédominance de la production des cytokines Th1 au détriment des cytokines Th2 telles que l’IL-4 et l’IL-13 qui elles sont anti-inflammatoires [51]. Deux autres sous-types de cellules T sont aussi présents dans l’articulation rhumatoïde ; il s’agit des cellules T régulatrices (Treg) et des cellules Th17. Il existe un débalancement en faveur des Th17. En effet elles produisent de l’IL-17, cytokine pro-inflammatoire que l’on retrouve dans les maladies pro-inflammatoires chroniques [35]. L’IL-17 va agir sur bon nombre de cellules retrouvées dans l’articulation rhumatoïde telles que les monocytes, macrophages, fibroblastes, ostéoclastes et chondrocytes. Les cellules Treg retrouvées dans le sang périphérique de patients atteints de PAR présentent

(42)

26

quelques anomalies ; en effet elles sont incapables d’inhiber la production du TNF et de l’IFN [35, 52]. Les cellules T de la PAR présentent une modification qui diminue leur activation, en effet, la tyrosine phosphorylation de la chaîne  du CD3 de ces cellules n’a pas lieu [33]. Cette diminution de l’activation des cellules T peut aussi être dûe à la présence de l’IL-1Ra et de TGF qui sont des inhibiteurs de lymphocytes T.

Plusieurs études ont démontré que la PAR est une maladie qui dépend énormément des lymphocytes B. Une déplétion de cellules B sur des patients en utilisant un anticorps monoclonal anti-CD20 entraîne au bout de plusieurs semaines de traitement, une baisse du taux de facteurs rhumatoïdes jusqu’à un taux normal suivi d’une rémission de la maladie (diminution de la raideur et du gonflement des articulations) [53, 54]. Cette expérience montre le rôle des lymphocytes B dans l’amplification de la maladie par la production d’auto-anticorps, ce qui dénote de leur importance dans la physiopathologie de la maladie. Elles jouent aussi le rôle de cellules présentatrices d’antigène aux cellules T et sécrètent des cytokines pro-inflammatoires telles que l’IL-10 et le TNF [53].

Monocytes et macrophages sont, eux aussi, impliqués dans la pathologie. En effet, ils sécrètent des cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF, l’IL-1 et l’IL-6 [37]. Le TNF et l’IL-1 sont impliqués dans la dégradation du cartilage car elles induisent les MMP destructrices. Le TNF stimule aussi l’expression de molécules d’adhésion par les fibroblastes. En plus des MMP, les monocytes/macrophages sécrètent des agents chimioattractants, ce qui leur confère un potentiel destructeur qui contribue à la destruction articulaire dans la PAR aigüe et chronique [55]. L’IL-1 ainsi produite régule l’inflammation en activant les cellules B et T et en induisant l’expression de molécules d’adhésion

(43)

27

par les cellules endothéliales [56]. Le TNF et l’IL-1 semblent fonctionner en synergie pour leurs fonctions effectrices [23]. L’IL-6 n’est pas seulement produite par les monocytes/ macrophages, mais aussi par les fibroblastes et lymphocytes T. L’IL-6 est responsable de l’inhibition de la formation osseuse et de la stimulation de la résorption à travers son effet stimulateur sur les ostéoclastes. En effet, les souris «knockout » pour le gène de l’IL-6 ne développent pas d’érosion osseuse [41]. Cette cytokine promeut la prolifération des cellules B, de même que la production d’anticorps et l’activation des cellules T [40].

Les neutrophiles aussi sont retrouvés dans l’articulation synoviale en grande quantité, il s’agit de la cellule de l’immunité innée qui est toujours principalement impliquée dans les situations inflammatoires. Les neutrophiles dans la PAR sont beaucoup plus que des cellules phagocytaires, ils produisent plusieurs médiateurs qui peuvent les auto-activer et auto-activer d’autres cellules, ils peuvent être des cellules présentatrices d’antigènes, de même que devenir des cellules « osteoclast-like » [57]. Les neutrophiles sécrètent des cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF, des enzymes telles que les collagénases et des anions réactifs tels que l’O2-, responsables de la destruction du cartilage [57,

58]. Les neutrophiles produisent aussi l’enzyme peptidyl-arginine déimiase (PAD) qui est responsable de la citrullination de l’arginine d’où la production de peptides citrullinés [59]. Les neutrophiles participent à l’ostéo-immunologie car ceux retrouvés dans le liquide synovial expriment à leur surface du RANK, un RANK activé par RANKL, et les protéines de la voie de signalisation de RANK [60]. Nous savons déjà l’importance de la voie RANK/RANKL dans l’activation de la résorption. Les neutrophiles, de ce fait, montrent donc leur importance dans la physiopathologie de la maladie par les interactions cellules-cellules qui peuvent être initiées pour amplifier la résorption osseuse par les ostéoclastes [61]. Les modèles animaux de PAR tels que les souris K/BxN

(44)

28

et l’arthrite induite au collagène (CIA : collagen type II induced arthritis) ont été utilisés pour montrer l’importance des neutrophiles dans la physiopathologie de la maladie. En effet, dans ces modèles animaux, on constate une inhibition du développement de la maladie et une amélioration de la santé des souris traitées [62, 63] lorsque les

neutrophiles sont inhibés par un anticorps anti Gr-1 (très exprimé sur les neutrophiles).

Les cytokines et les cellules impliquées dans la PAR forment un réseau complexe qu’il est difficile de détailler, mais elles constituent une cible thérapeutique intéressante pour la prise en charge de la maladie [64]. Nous les avons résumées brièvement dans les figures 9 et 10. Le profil des cytokines retrouvées dans l’articulation est modifié avec le temps; l’arthrite précoce a un profil de cytokines différent de celui de l’arthrite chronique [32]. La présence de l’IL-12 par exemple serait détectée en grande quantité dès le début de la maladie; tandis que plus la maladie évolue, plus faible sera le taux de l’IL-12 [41].

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29

Figure 9: Voies de signalisation des cytokines impliquées dans la polyarthrite rhumatoïde [40]:

Les principales cellules impliquées dans la destruction articulaire à travers l’IL-1 et le TNFα sont représentées, de même que les différentes cellules cibles de la plupart des cytokines impliquées.

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30

Figure 10 : Quelques orientations actuelles sur la pathogenèse de la PAR [65].

Blys=B lymphocyte stimulator. CR=complement receptor. FcR=receptor for the Fc portion of IgG. IC= immune complex. IFN=interferon. IFN1=type 1 interferons. IL=interleukin. RF=rheumatoid factor. TACI=transmembrane activator and calciummodulator and cyclophilin ligand interactor. TCR=T-cell receptor. Th1=T-helper 1 cell. TLR=Toll-like receptor. Treg=regulatory T cell.

Ici sont indiquées certaines des nombreuses interactions dans la pathogenèse de la PAR. Ces évènements se produisent dans la membrane synoviale, ainsi que le cartilage articulaire et l’os sous-chondral qui sont entourés par une synovite rhumatoïde

(47)

31 agressive. Le liquide synovial est rempli de plusieurs types cellulaires, plusieurs cytokines et les interactions entre tous ces éléments entretiennent la pathologie.

1.3.2.4. Les auto-anticorps

Une des spécificités de la PAR, comparativement aux autres arthrites, est la notion d’auto-immunité. En effet, on retrouve dans le liquide synovial des malades des auto-anticorps produits par des cellules B. Depuis la découverte du facteur rhumatoïde (FR) qui est un anticorps dirigé contre la région Fc des IgG, plusieurs autres auto-anticorps ont été découverts. Ces auto-anticorps peuvent être dirigés contre les composantes du cartilage, les protéines de stress, les enzymes, les protéines nucléaires et même les protéines citrullinées. Tous contribuent à la pathophysiologie en formant des complexes immuns dans l’articulation rhumatoïde. Les FR et les ACPA sont les deux auto-anticorps utilisés comme critères diagnostiques de la maladie, bien que les FR soient beaucoup moins spécifiques que les ACPA. En effet, on peut retrouver les FR dans d’autres maladies auto-immunes et même dans des conditions non auto-immunes et parfois même chez des personnes saines. Malgré cela, le FR reste le marqueur sérologique le plus utilisé dans la PAR [22].

1.3.2.4.1. Les anticorps anti-protéines citrullinées

Comme leur nom l’indique, les ACPA sont des anticorps dirigés contre des épitopes qui contiennent des acides aminés citrullinés. La citrullination est une modification post-translationnelle des résidus arginyl en résidus citrulline sous l’action des enzymes PAD (figure 7). Les peptides citrullinés retrouvés dans l’articulation rhumatoïde sont les chaînes  et  de la fibrine, la vimentine et l’-énolase. Les ACPA sont présents dans l’articulation rhumatoïde très tôt dans le développement de la maladie, ils constituent donc un critère important pour le

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32

diagnostic. À ce sujet, 50 à 70 % des patients diagnostiqués comme ayant un début de PAR sont positifs pour les ACPA [38]. Les ACPA ont une spécificité diagnostique de près de 95% et une sensibilité approximative de 75%. La présence d’ACPA est un critère essentiel pour établir le pronostic de la maladie. Des études ont montré une corrélation positive entre les arthrites présentant des ACPA et la dégradation osseuse [22, 66]. Les patients ACPA positifs présentent une plus grande sévérité dans le développement de la maladie [67].

Les ACPA constituent un outil de prise en charge important car la présence de ces anticorps peut être détectée plusieurs années avant l’apparition des premiers symptômes et permettre ainsi de commencer un traitement pour ralentir l’évolution de la maladie.

1.3.2.4.2. Les facteurs rhumatoïdes

Les facteurs rhumatoïdes ont été décrits pour la première fois par Emil Waaler en 1940 [22] et ils ont été redécouverts plus tard par Rose en 1948 lorsqu’il a découvert leur capacité à agglutiner les globules rouges de mouton enrobés de sérum de lapin [68]. Depuis ces découvertes, les FR constituent l’un des outils majeurs pour le diagnostic de la PAR. Plusieurs techniques permettent en clinique de détecter la présence de FR dans le liquide synovial et le sérum. Parmi elles, nous pouvons citer : le test classique de Waaler-Rose et l’ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Bien que les FRs soient les auto-anticorps les plus recherchés pour le diagnostic, leur rôle précis dans la pathogenèse de la PAR reste encore partiellement compris. Le FR n’est retrouvé que chez 60 à 80 % des personnes atteintes, avec une spécificité de 85% [69].

Le rôle physiologique des FR au cours d’une réponse immunitaire normale est d’augmenter l’avidité et la taille des complexes immuns. De plus, les cellules B liées aux FR vont agir comme des cellules

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33

présentatrices d’antigène et peuvent présenter efficacement les anticorps aux cellules T. Par conséquent, il est supposé que les FR du sérum et du liquide synovial des patients atteints de PAR, et en particulier ceux attachés aux cellules B, vont exercer ces fonctions et ainsi contribuer à la physiopathologie de la maladie [70]. Un autre rôle important des FR est la fixation du complément. Les complexes immuns présents dans l’articulation rhumatoïde et la fixation du complément par les IgG des complexes immuns sont accentués par la fixation des FR IgM. Cela est d’autant plus important pour les complexes immuns composés par des auto-anticorps [22].

Il existe trois sous types de FR: ceux du type IgM, type IgA et le type IgG. Le FR de type IgM est le type principal, mais les deux autres sont également importants et donnent des informations majeures pour le diagnostic. Un seul patient peut posséder plus d’un sous type de FR; dans ce cas, les sous types le plus souvent retrouvés sont les types IgM et IgA [71-73]. Plusieurs études suggèrent que le FR de type IgA est un marqueur plus spécifique de la PAR. Il a été également démontré que la détection des FR permet d’établir un pronostic dans l’évolution de la maladie; ils seraient présents très tôt dès le déclenchement de la maladie et longtemps avant l’apparition des premiers symptômes. Les patients avec un titre élevé et persistant de FR ont un risque plus accru de développement et d’aggravation de la maladie; en plus, ceux qui ont les FR de type IgM et IgA ont un risque encore plus élevé que ceux qui ont juste un seul type de FR [74]. En effet, le titre élevé de FR est associé à l’érosion osseuse et aux manifestations extra articulaires. Malgré l’importance apparente des FR dans la physio-pathologie de la maladie, on retrouve des PAR séropositives et des PAR séronégatives, ce qui suggèrent deux mécanismes distincts d’évolution de la maladie [75, 76].

Le rôle des FR dans la formation de complexes immuns au cours de l’évolution de la maladie a été démontré, mais cependant aucune

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34

expérience n’explique sans ambiguïté le rôle de ces facteurs dans les évènements déclencheurs.

1.3.2.5. Les marqueurs de l’arthrite rhumatoïde

La PAR est une maladie complexe et d’origine encore inconnue à ce jour. En effet, elle présente plusieurs aspects qui ne peuvent pas être considérés séparément. Des chercheurs, à la suite de plusieurs études, ont établi certains critères qui permettent de diagnostiquer la maladie et par conséquent de la traiter. En 1987, une classification a été publiée et les malades qui possédaient 4 de ces critères étaient considérés comme atteints de PAR (tableau 2). Cette classification s’est basée sur les observations cliniques de nombreux patients et, sur l’évolution des découvertes dans le domaine.

Tableau 2: Critères de classification de l’arthrite rhumatoïde,

classification de 1987 par le collège américain de rhumatologie [77].

Cette classification s’est cependant révélée insatisfaisante pour diagnostiquer les arthrites précoces, car ces critères sont basés sur des manifestations qui surviennent lorsque la maladie est déjà bien installée. Ainsi, depuis 2007 la ligue européenne contre le rhumatisme et le collège américain de rhumatologie ont mené des études pour déterminer de nouveaux critères de classification qui mettent l’accent sur la

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35

participation des petites articulations et la séropositivité aux FR et aux ACPA [78] (tableau 3). Cette nouvelle classification, établie en 2010, permet de mieux diagnostiquer la maladie, plus spécifiquement et plus rapidement afin de pouvoir ralentir sa progression.

Tableau 3: Tableau de classification des critères diagnostics de l’arthrite rhumatoïde établis en 2010 par le collège américain de rhumatologie et la ligue européenne contre le rhumatisme [79].

1.3.2.6. Les traitements de l’arthrite rhumatoïde

La PAR reste de nos jours une maladie complexe avec une destruction des articulations et des complications secondaires à l’inflammation systémique. Elle est impossible à guérir mais malgré cela, les récentes découvertes dans la pathophysiologie ont permis de nombreux changements dans la gestion de cette maladie. Les médicaments de la PAR portent le nom de DMARD (Disease Modifying Anti-Rheumatic Drugs, drogues anti-rhumatiques modifiant la maladie ) et ils ont pour rôle de réduire l’inflammation et de ralentir la progression

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de la destruction articulaire, mais ils le font à des degrés variables [80, 81]. Les scientifiques s’accordent à dire que, plus tôt le traitement est initié, mieux cela vaut pour les malades. Les DMARD vont être divisés en deux groupes: les DMARD conventionnels et les DMARD biologiques [80]. Les premières thérapies incluaient aussi des corticoïdes et des anti-inflammatoires non stéroïdiens [23]. Parmi les DMARD conventionnels, le plus utilisé est le méthotrexate (MTX) [82]. L’utilisation du MTX présente des effets toxiques [83], mais son administration se fait en association avec l’acide folique qui va agir pour contrôler les effets secondaires consécutifs à son administration tels que l’alopécie, la stomatite, l’intolérance gastro-intestinale et la toxicité hématopoïétique [23, 84-86]. Nous pouvons citer le Leflunomide et la Sulfasalazine parmi les autres DMARD conventionnels.

Les DMARD biologiques sont une nouvelle catégorie de médicaments qui ciblent les anomalies spécifiques du système immunitaire, plus précisément les molécules qui ont montré leur rôle dans la physio-pathologie de la maladie [80]. Dans cette nouvelle catégorie de traitements, ceux qui ciblent le TNF sont les plus employés. Les principales drogues anti-TNF sont les suivantes : Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab, Golimumab [87]. Malgré l’efficacité de ces drogues anti-TNF, environ 30% des patients ne répondent pas à ce traitement [80].

1.3.2.7. La résorption osseuse dans l’arthrite rhumatoïde

L’érosion osseuse représente l’un des points importants dans la gravité de la PAR. Dans l’articulation rhumatoïde, la résorption se fait à deux sites principaux: le cartilage et l’os sous-chondral. L’érosion du cartilage est due aux cellules du pannus rhumatoïde [88-90]. La résorption osseuse est le fait de deux types cellulaires dans l’arthrite : les synoviocytes de type macrophages et les ostéoclastes. Ces derniers

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représentent le principal type cellulaire impliqué dans ce processus [91]. Il est à noter que la résorption osseuse dans la PAR est accompagnée de la diminution de la formation de la nouvelle structure osseuse [92], ce qui créé un énorme débalancement dans le remodelage osseux. Les causes de la perte osseuse dans la maladie ne sont pas parfaitement connues à ce jour mais les changements hormonaux, la vitamine D, le métabolisme minéral et le taux de cytokines circulants telles que l’IL-1 , l’IL-6 et le TNF vont être impliqués dans la pathogenèse de cette perte osseuse [4, 93]. Ces différents facteurs vont agir à plusieurs niveaux sur la résorption: sur les précurseurs ostéoclastiques, les ostéoclastes et même sur les ostéoblastes [94]. La capacité de résorption, de même que le nombre d’ostéoclastes seront accrus.

L’environnement inflammatoire de l’articulation rhumatoïde va être à l’origine de l’augmentation du potentiel de résorption des ostéoclastes avec un accent mis sur l’IL-1 et le TNF qui sont deux cytokines importantes de l’inflammation. Un intérêt particulier est porté à l’expression de RANKL chez les patients car nous savons l’importance de la voie RANK/RANKL/OPG dans l’activation des ostéoclastes. Certaines études ont montré que l’ARNm de RANKL, de même que la protéine, sont exprimés dans le tissu synovial des patients atteints de PAR [95, 96], ce qui n’est pas le cas chez les patients non atteints [92]. Dans l’articulation rhumatoïde, RANKL n’est pas seulement exprimé par les ostéoblastes; les cellules T activées, les synoviocytes de type fibroblastes et les macrophages l’expriment aussi [97, 98]. Cette surexpression de RANKL dans le milieu va entraîner une activation accrue des ostéoclastes, ainsi qu’une augmentation du nombre d’ostéoclastes différenciés [99]. Le TNF et le RANKL agissent de concert pour augmenter la différenciation des ostéoclastes, tandis que l’IL-1 active les ostéoclastes déjà formés et retarde l’apoptose normale de ces cellules. Le TNF et l’IL-1 peuvent aussi agir sur les ostéoblastes en portant atteinte au processus de

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formation osseuse en induisant l’apoptose des ostéoblastes [95]. L’environnement inflammatoire peut aussi agir sur les précurseurs d’ostéoclastes en régulant en amont l’expression de RANKL sur les cellules stromales de la moelle osseuse et en aval l’expression d’OPG par les précurseurs d’ostéoclastes [93, 100].

Certaines études ont, de plus, démontré que les monocytes et les macrophages présents dans l’articulation rhumatoïde pourraient être capables de se différencier en ostéoclastes [101, 102]. En effet, Danks L et ses collaborateurs ont montré qu’in vitro, les monocytes et macrophages de patients atteints d’arthrite rhumatoïde sont capables de se différencier en ostéoclastes en présence de M-CSF et de la calcitriol [102]. Les macrophages synoviaux produisent eux aussi la calcitriol, de même que le M-CSF et les autres facteurs indispensables à la différenciation des ostéoclastes, ce qui leur permettrait de se différencier en ostéoclastes, le milieu étant aussi riche en RANKL provenant des ostéoblastes, des synoviocytes, des macrophages et des cellules T. Ceci pourrait expliquer l’augmentation de l’activité de résorption osseuse observée.

L’ostéoclaste est une cellule clé dans la pathologie de la PAR. Une meilleure compréhension de leur fonctionnement dans le contexte de cette maladie pourrait permettre le développement de nouvelles thérapies plus spécifiques et plus efficaces.

1.4.

LES CELLULES HL60

La lignée de cellule HL60 a été dérivée à partir de leucocytes du sang périphérique d’une femme de 36 ans de race blanche avec une leucémie aiguë promyélocytaire [103]. Elle est l’une des lignées humaines de cellules leucémiques capable de prolifération apparemment illimitée

Figure

Figure 1 : Homéostasie de la structure osseuse  [4]
Figure  2 :  Représentation  schématique  de  la  différenciation  et  la  fonction des ostéoclastes en coopération avec les ostéoblastes [5]
Figure  3 :  Intégration  des  voies  RANK  et  ITAM  par  les  protéines  kinases Btk et Tec [15]
Figure  4 :  Effet  de  la  polyarthrite  rhumatoïde  sur  les  mains :  radiographie des déformations d’une main rhumatoïde [25]
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Références

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