Myocardial infarct repair with human adult muscle-derived stem cells “MuStem”

(1)

HAL Id: hal-01959642

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Submitted on 18 Dec 2018

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Myocardial infarct repair with human adult

muscle-derived stem cells “MuStem”

Alice Rannou, Gilles Toumaniantz, Thibaut Larcher, Isabelle Leroux, Mireille

Ledevin, Agnès Hivonnait, S Menoret, Ignacio Anegon, Flavien Charpentier,

Karl Rouger, et al.

To cite this version:

Alice Rannou, Gilles Toumaniantz, Thibaut Larcher, Isabelle Leroux, Mireille Ledevin, et al.. My-ocardial infarct repair with human adult muscle-derived stem cells “MuStem”. 2nd annual meeting of French Society for Stem Cell Research, Dec 2018, Nantes, France. 2018. �hal-01959642�

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Results - Part I

Myocardial infarct repair with human adult

muscle-derived stem cells “MuStem”

Rannou A

1,2,3

_{, Toumaniantz G}

2,3

_{, Larcher T}

1 _{, Leroux I}

1 _{, Ledevin M}

1 _{, Hivonnait A}

2 _{, Menoret S}

4 _{, Anegon I}

4 _{, Charpentier F}

2 _,

Rouger K

1 _{*, Guével L}

1,3

_*

1 INRA/Oniris UMR 703, Oniris, Nantes, France

2 INSERM UMR 1087/CNRS UMR 6291, Institut du Thorax, Nantes, France

3 University of Nantes, Nantes, France

4 INSERM UMR 1064/facility TRIP/UMRS3556, Center for Research in Transplantation and Immunology, Nantes, France

* Authors contributed equally to this work.

FSSCR Meeting, December 11

th

_{2018 - Nantes}

Myocardial infarction is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Although medical and surgical treatments can significantly improve patient

outcomes, no treatment currently available is able to generate new contractile tissue or reverse ischemic myocardium. Driven by the recent understanding that

regenerative processes do exist in the myocardium, the use of stem cells has emerged as a promising therapeutic approach with high expectations. The literature

describes the use of cells from various sources. Many publications show the promising use of these cells to regenerate damaged myocardium in both animal models

and Human; however, more studies are needed to directly compare cells of various origins in efforts to draw conclusions on the most appropriate source in order to

positively impact on the heart tissue remodeling and function.

The main objective of the present study is to determine whether the human MuStem cell agent can act positively in this acute context of

heart disease, by performing functional and histological exploration of infarcted heart following its local administration.

Although coming from skeletal muscle tissue, hMuStem cells can engraft and maintain with time in healthy myocardium without generating deleterious side effects

Ability to fit into the host tissue and to maintain without arrhythmias

Biodistribution of grafted cells in organs

Ability to modulate the functional & structural features of infarcted heart

hMuStem cells seem to limit the extension of the fibrotic process

Given these preliminary results, hMuStem cells seem to be able to engraft in infarcted myocardium and have an impact on cardiac function

To confirm these results, the next steps will be:

ü To complete the engraftment rate with quantitative data

ü To learn about phenotype they acquire in situ

Ø Differentiation ?

Ø Proliferative / quiescent state ?

ü To study the impact on pericardic sphere / tissue remodeling

Ø Fibrotic tissue

Ø Neovascularisation

Immunodeficient

(Rag1 Il2Rg KO)

10-11-week-old male rats

Anesthesia

ECG

Ultrasound

T0

+ 1 wk

Ultrasound:

Scoring

+ 3 wk

Ultrasound

Coronary ligature

Injection of 2.7x10

6

hMuStem cells

in 6 to 9 points in border area

+ 4 wk

Sacrifice

ECG & Ultrasound

Immunohistochemistry

Molecular analysis

n=10 control rats (Nacl)

n=11 injected rats (MuStem cells)

Ø To realize the scoring of the infarct and to follow the

evolution of the pathology in term of function and

structural remodelling of the heart, ultrasound is used

Anterior wall

Posterior wall

Left ventricle

cavity

Time

+ ligature

Diameters at end diastole (DFD) or systole (DFS)

Sham

9

2/ Transplantation des cellules hMuStem dans un modèle d'infarctus du myocarde

Entre novembre 2017 et février 2018, une 3ème_{série de 17 rats immunodéficients âgés de 2,5 mois a été réalisée pour appliquer le mode}

opératoire préalablement défini et optimisé chez les rats sains. Neuf rats ont été considérés à l’issue du protocole pour l’analyse, les autres rats étant sortis prématurément du protocole pour différents motifs intervenus lors de la phase expérimentale (mort lors de l’intervention chirurgicale, problème d’intubation,…).

2.1. Méthodologie

- J0 : ECG et Échocardiographie  Acquisition des données basales ; Genèse de l’infarctus par ligature définitive de l’artère coronaire marginale gauche.

- J7 : Échocardiographie  Scoring de l’infarctus ; Protocole d’injection des cellules hMuStem : Cent quatre vingt µL d’une suspension de cellules hMuStem à une concentration de 15.106_{cellules/ml sont injectés en multipoints dans la zone bordante de l’infarctus. De 6 à 9}

points sont réalisés en fonction de l’accessibilité du cœur, des adhérences présentes et de la taille de l’infarctus. - J21 : Échocardiographie  Suivi des paramètres fonctionnels et tissulaires

- J28 : ECG et Échocardiographie  Acquisition des données fonctionnels et tissulaires finales ; Euthanasie : le cœur de chaque rat est prélevé, pesé et déposé dans un moule afin de pouvoir réaliser de façon reproductible des tranches de tissu. En fonction de la dilatation du cœur, 7 à 9 tranches sont réalisées et numérotées de 1 à 9 en allant de l’apex à la base (Figure 6A). En fonction de la taille de l’infarctus, nous avons déterminé que l’infarctus est localisé sur les tranches 1/2 à 4/5 (Figure 6B). Par ailleurs, des prélèvements de poumon, rate, rein, foie, cerveau et muscle Tibialis antérieur sont effectués.

2.2. Caractérisation électrocardiographique

Les enregistrements ECG effectués sur les rats injectés avec le véhicule (PBS) et les cellules hMuStem ne montrent pas de différence significative des différents paramètres mesurés, à savoir la fréquence cardiaque, la durée de l'onde P (dépolarisation des oreillettes), la durée du complexe QRS (dépolarisation des ventricules) et la durée de l'intervalle QT (repolarisation des ventricules) (Figure 7). Ce résultat était attendu dans la mesure où l'ECG de surface ne donne qu'une vision très large de l'activité électrique cardiaque et ne permet pas de visualiser des modifications locales de l'activité électrique, sauf si celles-ci conduisent à la survenue d'arythmies. Nos résultats montrent donc que les cellules injectées ne conduisent pas à la survenue d'anomalies rythmiques comme cela a pu être observé avec d'autres types cellulaires, en particulier des myoblastes (Fernandes et al., 2006; 2009).

Figure 6 : Coupes de cœur réalisées grâce au moule. (A) Huit tranches allant de la base à l’apex. (B) Visualisation de l’infarctus.

1 2 3 4 5 6 7 8

15 Dans le but de visualiser la présence des cellules hMuStem sur les coupes de cœur et d'augmenter la sensibilité de détection, des expériences d'hybridation in situ sont programmées. Avant chaque extraction d'ADN, des coupes congelées de tissus ont également été réalisées afin de réaliser des immunomarquages en particulier avec l’anticorps spécifique anti-lamine A/C humaine, ce qui nous permettra de visualiser les cellules transplantées et ainsi renseigner leur localisation dans le tissu. La mise au point de la partie immunohistochimie centrée sur la visualisation de la troponine T, du CD31 et de la WGA pour marquer respectivement les cellules cardiaques, les cellules endothéliales et la trame conjonctive a été validée (Figure 11) et les expériences sont programmées courant avril.

Présentation des livrables avec le gantt prévisionnel, le gantt réalisé ainsi que la gantt avec les nouvelles échéances

Figure 11 : Immunomarquages dirigés contre la troponine T (cellule cardiaque), le CD31 (cellule endothéliale) et coloration avec la wheat germ agglutinin (WGA) pour la détection du tissu conjonctif

Ø Rat heart slicer matrix

cTnT

WGA

CD31

Ø Infarct detection & specific immunolabelings

Adapted to Nguyen et al., 2016

Myoblasts Muscle tissue

MuStem cells

Cont ract ile a bilit ies Withs tand ische mic insul t

Angi

oge

nes

is a

nd

vas

culoge

nes

is

Tissue and function repair?

Ø Phenotyping: Early myogenic progenitors with perivascular

/mesenchymal signature

Ø RNA seq signature: Presence of cardiac markers

Cnx43, Cnx45, TNNC1, TNNT2, ACTC1, ATP2A2…

Ø Oligopotency

Ø High proliferation rate

Ø Cell survival and migration ability in vivo

Ø Muscle regeneration

Ø Paracrine effects & Global tissue remodeling in DMD

Ø Immunomodulatory properties

(Rouger et al., 2011; Robriquet et al., 2015,2016; Lardenois et al., 2016; Lorant et al., 2018; Saury et al., 2018)

1) Fit into healthy/infarct cardiac tissue ? In other tissues ?

2) What phenotype do they acquire in situ ?

3) Have impact on tissue remodelling and cardiac function ?

4) Led to side effects ?

Can MuStem cells:

Engraftment of hMuStem cells in healthy cardiac tissue

10-11 week old

female rat

Anesthesia

ECG

Ultrasound

T0

+ 1wk

Ultrasound:

Scoring

+ 3wk

Ultrasound

Cell injection

+ 4wk

ECG & Ultrasound

Histology / IF

Molecular analysis

24h post-inj

n=1

6 days post-inj

n=3

21 days post-inj

n=4

7 Cependant ce résultat n’est pas un point critique pour la poursuite du projet, en effet les 1

ers

résultats in

vivo permettent de valider la poursuite du projet.

Axe 2 - Exploration fonctionnelle et histologique du cœur infarci après administration de la

population hMuStem et/ou de ses EV

hMuStem

1. Etude pilote de validation de l'implantation et du devenir des cellules hMuStem dans le

myocarde

Sur la période d’octobre à décembre 2017, une 1

ère

série de 27 rats sains a été utilisée pour acquérir la

chirurgie (manipulation des rats, injections sous-cutanée et intra-péritonéale sur des rats vigiles,

maitrise des appareillages tels que le poste à anesthésie, le respirateur, acte d’intubation, pose d’une

ligature coronaire ou encore double thoracotomie à une semaine d’intervalle) et optimiser le mode

opératoire (conditions d’asepsie associées à la chirurgie sur des rats immunodéficients, différents fils

de suture [5/0, 4/0, proleène et soie], points [points par points, surjet et sous cutané], pose de point

avec et sans péricarde pour limiter les adhérences du cœur à la paroi, réouverture en 3/4 ou 4/5,

gestion de la douleur, définition des points limites. Toutes ces améliorations ont permis de diminuer le

taux de mortalité d’environ 30% et de rendre presque nul le taux d’infection obtenu suite aux deux

opérations chez les animaux facilitant ainsi la seconde ouverture.

Afin de déterminer si les cellules hMuStem s'implantent effectivement dans le myocarde, une 2

ème

série

de 8 rats sains a été réalisée (janvier à février 2018) puis une 2

nde

de 6 rats en mai. L'implantation

myocardique des cellules est évaluée à 1 jour (2 rats), 6 jours (3 rats) et 21 jours (8 rats), selon un

protocole d’immunohistochimie classiquement utiliseé à l’UMR 703 PAnTher (Rouger et al., 2018) et

reposant sur l’utilisation d’un anticorps anti-lamine A/C humaine qui ne présente pas de réaction

croisée humain/rongeur. Une détection par qPCR utilisant une sonde Alu humaine spécifique est

également utilisée. La cohorte est en cours d’exploration et les résultats préliminaires mettent en

évidence une présence des cellules MuStem dans les 2/3 inférieurs du myocarde (correspondant aux

tranches de cœur 1 à 6 ici nommées CX1-6) qui est maintenue dans le temps avec des cellules

retrouvées à des quantités similaires entre 6 et 21 jours post-injection d’après les résultats

préliminaires (Figure 1). Cette quantité de cellules va être variable en fonction des animaux et environ

deux fois moins importante que 24h post-injection.

Les résultats que ce soit par l’une ou l’autre technique mettent en évidence la présence de

cellules dans le myocarde 3 semaines post-injection et une absence dans les organes filtres.

A

17

Figure 5 : Détection des cellules hMuStem dans les cœurs de rats 1, 6 ou 21 jours après injection

(A)

Immunomarquage spécifique de la lamine A/C révélant les cellules hMuStem (B) Expression relative du gène hAlu par rapport au contrôle GAPDH de rat à 1, 6 ou 21 jour post injection

Les résultats de la cohorte à J21 sont présentés figure 6. La figure 6A représente le marquage

lamine A/C sur les 3 fractions positives. Les cellules sont bien présentes 21 jours après injection

et elles sont principalement localisées dans des travées et des zones avec une grande quantité

de tissu conjonctif. La figure 6B schématise les résultats de qPCR sur les 3 coupes CX1, 3, 5.

J1 (CX2)

J6 (CX2)

J21 (CX5)

A

B

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 J1 n = 1 n = 2J6 n = 5J21 Expre ssi on re lat iv e du gè ne hA lu

Euthanasie post injection (J)

Quantité moyenne de cellules humaines dans les

portions CX1, 3 et 5 en fonction de la date

d'euthanasie post injection

Lack of side effect following engraftment of hMuStem cells

9 2/ Transplantation des cellules hMuStem dans un modèle d'infarctus du myocarde

Entre novembre 2017 et février 2018, une 3

ème

_{série de 17 rats immunodéficients âgés de 2,5 mois a été réalisée pour appliquer le mode}

opératoire préalablement défini et optimisé chez les rats sains. Neuf rats ont été considérés à l’issue du protocole pour l’analyse, les autres rats

étant sortis prématurément du protocole pour différents motifs intervenus lors de la phase expérimentale (mort lors de l’intervention chirurgicale,

problème d’intubation,…).

2.1. Méthodologie

-

J0 : ECG et Échocardiographie  Acquisition des données basales ; Genèse de l’infarctus par ligature définitive de l’artère coronaire

marginale gauche.

-

J7 : Échocardiographie  Scoring de l’infarctus ; Protocole d’injection des cellules hMuStem : Cent quatre vingt µL d’une suspension de

cellules hMuStem à une concentration de 15.10

6

_{cellules/ml sont injectés en multipoints dans la zone bordante de l’infarctus. De 6 à 9}

points sont réalisés en fonction de l’accessibilité du cœur, des adhérences présentes et de la taille de l’infarctus.

-

J21 : Échocardiographie  Suivi des paramètres fonctionnels et tissulaires

-

J28 : ECG et Échocardiographie  Acquisition des données fonctionnels et tissulaires finales ; Euthanasie : le cœur de chaque rat est

prélevé, pesé et déposé dans un moule afin de pouvoir réaliser de façon reproductible des tranches de tissu. En fonction de la dilatation

du cœur, 7 à 9 tranches sont réalisées et numérotées de 1 à 9 en allant de l’apex à la base (Figure 6A). En fonction de la taille de

l’infarctus, nous avons déterminé que l’infarctus est localisé sur les tranches 1/2 à 4/5 (Figure 6B). Par ailleurs, des prélèvements de

poumon, rate, rein, foie, cerveau et muscle Tibialis antérieur sont effectués.

2.2. Caractérisation électrocardiographique

Les enregistrements ECG effectués sur les rats injectés avec le véhicule (PBS) et les cellules hMuStem ne montrent pas de différence significative

des différents paramètres mesurés, à savoir la fréquence cardiaque, la durée de l'onde P (dépolarisation des oreillettes), la durée du complexe

QRS (dépolarisation des ventricules) et la durée de l'intervalle QT (repolarisation des ventricules) (Figure 7). Ce résultat était attendu dans la

mesure où l'ECG de surface ne donne qu'une vision très large de l'activité électrique cardiaque et ne permet pas de visualiser des modifications

locales de l'activité électrique, sauf si celles-ci conduisent à la survenue d'arythmies. Nos résultats montrent donc que les cellules injectées ne

conduisent pas à la survenue d'anomalies rythmiques comme cela a pu être observé avec d'autres types cellulaires, en particulier des

myoblastes (Fernandes et al., 2006; 2009).

Figure 6 : Coupes de cœur réalisées grâce au moule. (A) Huit tranches allant

de la base à l’apex. (B) Visualisation de l’infarctus.

1 2 3 4 5 6 7 8

Preservation of the ECG pattern at d28

• Same cardiac fequency

• Unchanged duration for: P-wave, QRS

complex and QT interval

Lack of arrhythmia

subsequently to hMuStem cell

graft in healthy heart

Distribution of cells is

limited to heart

ECG analysis

Functional and structural benefits of the hMuStem cell graft

Tissue impact of hMuStem cell injection

0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 D1 D6 D21

Nu

mb

er o

f cel

ls

Number of cells engrafted in myocardium

at different time points

D1

D6

D21

Opening questions

Vizualisation of MuStem cells implanted in myocardium

Acknowledgements

This work was supported by a grant from the

RFI Bioregate. It was also supported by the

FEDER-FLS 2014-2020 (n

PL0003686).

Ability of hMuStem cells:

ü To survive and insert into infarcted cardiac tissue without

inducing major adverse effect

ü To generate functional and structural benefits in the

infarcted heart

For the study, the even slices are frozen and the odd

ones are put in paraffin

WGA (Wheat germ agglutinin) is a lectin used to

highlight extracellular matrix.

CD31 is a marker of endothelial cells and cTNT of

cardiac cells.

Ø To explore cardiac arrhythmias, ECG with 6 derivations

are realized

Parameters obtained:

ü Cardiac frequency

ü Duration for P-wave, QRS

complex & QT interval

hL

am

in

A/

C

/

WG

A

/

DRAQ5

All slices have been frozen

Lung, brain, spleen, kidney, liver and a muscle have

been explored

• At one day post-injection, cells in very low

quantity, have been detected only in lungs

• At 6 and 21 days post-injection, no cell is

detected

The pourcentage of ejection fraction, is obtained with the plane

of incidence « small axis » combined with recording in «

time-movement » mode

Echographic analysis

HES analysis

NaCl Injected rats

MuStem cells Injected rats

Ø

Large fibrotic tissue

Ø

3 different area : - Viable area (VA)

- Border zone (BZ)

- Infarctus (Inf)

Ø

Small to moderate fibrotic tissue

Ø

Localized area

28 days

BZ

Inf

_Inf

VA

NaCl Injected rats

MuStem cells Injected rats

Ø

Large fibrotic tissue

Ø

3 different area : - Viable area (VA)

- Border zone (BZ)

- Infarctus (Inf)

Ø

Small to moderate fibrotic tissue

Ø

Localized area

28 days

BZ

Inf

_Inf

VA

Preservation of the ECG pattern at d28

• Same cardiac frequency

• Unchanged duration for:

P-wave, QRS complex and QT

interval

Before infarction

4900 5000 5100 5200 5300 5400 5500 -0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

DI

DII

avant'infarctus

28'j'post3infarctus

4900 5000 5100 5200 5300 5400 5500 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

sans'h3MuStems

DI

DII

avec'h3MuStems

4900 5000 5100 5200 5300 5400 5500 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 4900 5000 5100 5200 5300 5400 5500 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 100'ms 5000 5100 5200 5300 5400 5500 5600 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 5000 5100 5200 5300 5400 5500 5600 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 5100 5200 5300 5400 5500 5600 5700 -0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 5100 5200 5300 5400 5500 5600 5700 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

Véhicule)

(PBS))

Cellules)

hMuStem)

Cells injected

rats

28 days post-infarction

hL

am

in

A/C

/

WGA

/

DR

AQ5

Localization of human nuclei (green) into fibrotic tissue (red)

Engraftment of hMuStem cells in myocardial infarction

context and no demonstration of rhythm disturbances

Histological & molecular analysis

Results - Part II

Conclusion & Perspectives

Introduction

Materials & Methods

70 90 110 130 0 7 21 28 % c ha nge LV ED D Days Vehicule (n=10) Cells (n=11)

28 days

Akynesia

Hypokynesia

0 days

7 days

NaCl injected rats

Cells injected rats

Akynesia

LV End Diastolic Diameter

70 90 110 130 0 7 21 28 % c ha nge LV ED D Days Vehicule (n=10) Cells (n=11) 50 70 90 110 0 7 21 28 % c ha nge LV EF Vehicule (n=10) Cells (n=11) 70 90 110 130 0 7 21 28 % c ha nge LV ED D Days Vehicule (n=10) Cells (n=11) *