Fréquence et distribution des dimères cyclobutyliques de
pyrimidines suite à une exposition aux UV et évaluation
de l’effet protecteur de l’acide sulfonique
2-phénylbenzymidazole-5
Par Nathalie Bastien
Service de génétique, département de pédiatrie
Thèse présentée à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention du grade de philosophiae doctor (Ph.D.)
en Sciences des radiations et imagerie biomédicale
Sherbrooke, Québec, Canada Avril 2015
Membres du jury d’évaluation :
Dr Dindial Ramotar, Département de biochimie, Faculté de médecine, Université de Montréal, évaluateur externe à l’Université de Sherbrooke.
Dr Antonio Conconi, Département de microbiologie et infectiologie, Faculté de médecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke, évaluateur externe au programme. Dr Richard Wagner, Département de médecine nucléaire et de radiobiologie, Faculté de médecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke, président de jury.
Dre Chantal Bouffard, Département de pédiatrie, Faculté de médecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke, directrice de recherche.
Dr Darel Hunting, Département de médecine nucléaire et de radiobiologie, Faculté de médecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke, co-directeur de recherche.
Fréquence et distribution des dimères cyclobutyliques de pyrimidines suite à une exposition aux UV et évaluation de l’effet protecteur de l’acide sulfonique
2-phénylbenzymidazole-5 Par
Nathalie Bastien
Service de génétique, Département de pédiatrie
Thèse présentée à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention du grade de philosophiae doctor (Ph.D.) en Sciences des radiations et imagerie
biomédicale, Université de Sherbrooke, Québec, Canada, Avril 2015
Résumé
L’exposition aux rayons ultraviolets (UV) du soleil est le principal facteur menant au développement du cancer cutané. Les dimères cyclobutyliques de pyrimidines (DCP) résultant d’une exposition aux UV sont considérés comme les principaux dommages à l’ADN impliqués dans la cancérogenèse cutanée. La fréquence des DCP et leur distribution entre les quatre types de sites dipyrimidiniques ont souvent été étudiés in vitro ou en utilisant des UVC alors que nous ne sommes pas exposés à ce type d’UV. L’utilisation d’écrans solaires permet de prévenir la formation des DCP. Grâce à sa capacité à absorber les UVB, l’acide sulfonique 2-phénylbenzymidazole-5 (PBSA) est utilisé dans des écrans solaires mais des études in vitro ont montré qu’il peut oxyder les guanines lors d’une irradiation aux UVB. Face à ces problèmes, nous avons choisi d’étudier l’effet du PBSA, la fréquence et la distribution des DCP, de même que l’influence de la séquence nucléotidique sur la formation des DCP, dans des conditions plus représentatives de la réalité.
Nous avons irradié des fibroblastes humains normaux (in cellulo) et de l’ADN purifié (in vitro) aux UVB et aux UVC. Nous avons comparé la formation des DCP in cellulo et in vitro. Suite à une exposition aux UVB, nous avons trouvé que la distribution des DCP in cellulo est similaire à la distribution des DCP in vitro. Nous avons ensuite comparé l’effet du type d’UV sur la formation des DCP et nous avons trouvé que les TT sont plus souvent endommagés après une irradiation aux UVC alors que les sites potentiellement mutés (contenant des cytosines) sont plus souvent endommagés après une exposition aux UVB, in cellulo. Concernant l’effet de la séquence d’ADN sur la formation des DCP, nous avons trouvé que certains sites dipyrimidiniques sont beaucoup plus fréquemment endommagés que les autres et que la position d’un site dipyrimidinique dans une série de pyrimidines adjacentes est un facteur influençant la formation des DCP.
Nous avons étudié l’effet du PBSA in cellulo et in vitro suite à une irradiation aux UVA et aux UVB. Nous avons montré que le PBSA protège efficacement contre la formation de DCP, lors d’une irradiation UVB mais qu’il photosensibilise la formation de guanines oxydées lors d’une irradiation aux UVA et aux UVB. Le PBSA peut donc agir comme une épée à double tranchant et ceci questionne son utilisation dans les écrans solaires.
Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse améliorent notre compréhension de la cancérogenèse cutanée, montrent l’importance du choix de modèles d’étude pertinents, de même que l’importance d’utiliser une protection solaire efficace contre tous les types de dommages causés par les UV.
Mots-clés Ultraviolet
Dommages à l’ADN
Dimères cyclobutyliques de pyrimidines Acide sulfonique 2-phénylbenzymidazole-5
Réaction de polymérisation en chaîne entraînée par une polymérase et réalisée par l’intermédiaire d’une ligation d’un adaptateur
Cyclobutane pyrimidine dimer frequencies and distribution following UV exposure and assessment of the protective effect of the 2-phenylbenzimidazole-5-sulfonic acid
By Nathalie Bastien
Division of genetics, Department of pediatrics
Thesis presented at the Faculty of medicine and health sciences in order to obtain the degree philosophiae doctor (Ph.D.) in radiation sciences and biomedical imagery,
Université de Sherbrooke, Québec, Canada, April 2015
Abstract
Exposure to the UV component of sunlight is the principal factor leading to skin cancer development. Cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) are considered as the most important DNA damage involved in skin carcinogenesis. CPD frequencies and their distribution between the four types of dipyrimidine sites are mostly investigated in vitro or using UVC, even if we are not exposed to these wavelengths. On the other hand, sunscreens are used to protect against CPD formation. The 2-phenylbenzimidazole-5-sulfonic acid (PBSA) is a sunscreen agent used because it absorbs UVB. However, previous studies have shown that PBSA oxidizes guanines in vitro, during UVB exposure.
To address these issues, we chose to study the effect of PBSA, the DCP frequencies and their distribution frequency and distribution of CPD, as well as the influence of DNA sequence on CPD formation, in conditions more representative of reality.
We irradiated normal human fibroblasts (in cellulo) and purified DNA (in vitro) with UVB and UVC. We compared the CPD distribution in cellulo and in vitro. Our results show that CPD distribution in cellulo is different to CPD distribution in vitro after UVB exposure. Then, we compared the impact of UV type on CPD formation and we found that TT are more frequently damaged after UVC exposure while potentially mutated dipyrimidine sites (dipyrimidine sites containing cytosine) are more frequently damaged after UVB exposure. Concerning the influence of DNA sequence on CPD formation, we observed that some dipyrimidine sites are extremely frequently damaged compared to others and that the position of a dipyrimidine site within a dipyrimidine run is an important factor influencing the frequency of CPD formation.
We studied the effect of PBSA, in cellulo and in vitro, during UVA and UVB exposure. We found that PBSA provides good protection against CPD formation during UVB exposure, in cellulo. However, PBSA photosensitized the formation of oxidized guanines during UVA and UVB exposure. This indicates that PBSA can act as a double-edged sword and question its suitability in sunscreens.
The works presented in this thesis provide important elements to understand the skin carcinogenesis process and demonstrate the importance to use an effective protection against UV-induced DNA damage.
Key words Ultraviolet DNA damage
Cyclobutane pyrimidine dimer
2-phenylvenzimidazole-5-sulfonic acid Ligation-mediated PCR
« Planter avec soin, cultiver avec persévérance »
Avant-propos
Les études doctorales ne sont pas des lignes parallèles tracées d’avance. Par conséquent, les doctorants empruntent des chemins différents. Avant de vous présenter l’aboutissement de mon travail, je souhaite vous exposer le chemin que j’ai parcouru.
Lorsque j’ai commencé mes études doctorales, j’avais le double statut d’étudiante et d’assistante de recherche. J’ai donc consacré du temps à d’autres projets de recherche que ceux présentés dans cette thèse. J’ai travaillé sur un projet concernant l’activité transcriptionnelle de TP53 et ses patrons de liaison au niveau de ses gènes effecteurs. Ce projet a mené à la publication de deux articles et deux articles de revue pour lesquels je suis co-auteure. J’ai rédigé la première version d’un chapitre de livre technique concernant la technologie LMPCR et nous avons publié un article concernant l’influence de la méthylation des cytosines pour la formation des dimères cyclobutyliques de pyrimidines. J’ai activement participé à la réalisation de travaux portant sur l’architecture nucléaire des télomères. Deux articles de recherche et un article de revue ont émergés de ces travaux. J’ai également élargi mon éventail de compétences en complétant le microprogramme de 3ième
cycle en enrichissement des compétences en recherche, de même que le microprogramme de 3ième cycle en pédagogie de l’enseignement supérieur.
Alors que je débutais la rédaction de mes articles et de ma thèse (travaux techniques complétés), des changements survenus au laboratoire ont fait en sorte que j’ai accepté un travail dans une autre ville. J’ai travaillé sur des projets concernant les mutations de l’ADN mitochondrial et leur lien avec une exposition aux UV. Deux articles ont émergés de ces travaux. À la fin de ce contrat, j’ai travaillé comme biologiste moléculaire dans un laboratoire clinique. Mon rôle était d’améliorer et de développer des techniques en lien avec des désordres hématologiques. Aujourd’hui, j’occupe le poste de biologiste moléculaire dans le laboratoire d’anatomo-pathologie de l’IUCPQ (Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec). J’ai participé à l’implantation du laboratoire de biologie moléculaire. J’assure le développement de tests en lien avec le cancer du poumon, je suis responsable du programme d’assurance qualité et je participe à la formation de résidents et de technologistes médicaux.
Au départ, les choses semblaient peut-être plus simples pour moi. Finalement, je ne suis pas certaine que ça été le cas. J’ai du m’adapter à plusieurs environnements, à différents sujets et il y a eu des modifications apportées au niveau de mes directeurs de thèse. Aujourd’hui, je suis fière des compétences que j’ai développées, je suis heureuse d’avoir trouvé ma voie et je suis reconnaissante envers les personnes qui ont eu confiance en moi et qui m’ont aidée.
Liste de mes publications Articles :
1. Cytosine containing dipyrimidine sites can be hotspots of cyclobutane pyrimidine dimer formation after UVB exposure. Bastien N, Therrien JP, Drouin R, Photochem Photobiol Sci. 2013, Aug:12(8):1544-54.
2. The 3895-bp mitochondrial DNA deletion in the human eye: a potential involvement in corneal ageing and macular degeneration. Gendron SP, Bastien N, Mallet JD, Rochette PJ. Mutagenesis. 2013 Mar:28(2):197-204.
3. Mitochondrial DNA common deletion in the human eye; a relation with corneal aging. Gendron SP, Mallet JD, Bastien N, Rochette PJ. Mech of Ageing Dev. 2012 Feb-Mar; 133(2-3):68-74.
4. Formation of stress-specific p53 binding patterns is influenced by chromatin but not by modulation of p53 binding affinity to response elements. Millau JF, Bandele OJ, Perron J, Bastien N, Bouchard EF, Gaudreau L, Bell DA, Drouin R. Nucleic Acids Res. 2011 Apr;39(8):3053-63.
5. The sunscreen agent 2-phenylbenzimidazole-5-sulfonic acid photosensitizes the formation of oxidixed guanines in cellulo after UV-A or UV-B exposure. Bastien N, Millau JF, Rouabhia M, Davies RJ, Drouin R. J Invest Dermatol. 2010 Oct;130(10):2463-71.
6. p53 functions and cell lines: have we learned the lessons from the past? Millau JF, Mai S, Bastien N, Drouin R. Bioessays. 2010 May;32(5):392-400.
7. p53 Pre- and post-binding event theories revisited: stresses reveal specific and dynamic p53-binding patterns on the p21 gene promoter. Millau JF, Bastien N, Bouchard EF, Drouin R. Cancer Res. 2009 Nov 1;69(21) :8463-71.
8. Influence of cytosine methylation on ultraviolet-induced cyclobutane pyrimidine dimer formation in genomic DNA. Rochette PJ, Lacoste S, Therrien JP, Bastien N, Brash DE, Drouin R. Mutat. Res. 2009 Jun 1 :665(1-2) :7-13.
9. P53 transcriptional activities: a general overview and some thoughts. Millau JF, Bastien N, Drouin R. Mutat Res. 2009 Mar-Jun;681(2-3) :118-33.
10. Hepatitis C virus infection in Guinea-bissau: a sexually transmitted genotype 2 with parenteral amplification? Plamondon M, Labbé AC, Frost E, Deslandes S, Alves AC, Bastien N, Pepin J. PLoS ONE. 2007 Apr 18;2(4):e372.
11. Pyrimidine (6-4) pyrimidone photoproduct mapping after sub-lethal UVC doses: nucleotide resolution using terminal transferase-dependant PCR. Rochette PJ, Bastien N, Todo T, Drouin R, Photochem Photobiol. 2006 Sep-Oct;82(5) :1370-6.
12. SW480, a p53double-mutant cell line retains proficiency for some p53 funtions. Rochette PJ, Bastien N, Lavoie J, Guérin SL, Drouin R, J Mol Biol. 2005 Sep 9 ;352(1) :44-57.
13. UVA-induced cyclobutane pyrimidine dimers form predominantly at thymine-thymine dipyrimidines and correlate with the mutation spectrum in rodent cells. Rochette PJ, Therrien JP, Drouin R, Perdiz D, Bastien N, Drobetsky EA, Sage E. Nucleic Acid Res. 2003 Jun 1;31(11): 2786-94.
14. Human cells bearing homozygous mutations in the DNA mismatch repair genes hMLH1 or hMSH2 are fully proficient in transcription-coupled nucleotide excision repair. Rochette PJ, Bastien N, McKay BC, Therrien JP, Drobetsky EA, Drouin R. Oncogene. 2002 Aug 22;21(37)5743-52.
Chapitres de livre:
1. In cellulo DNA analysis (LMPCR footprinting). Drouin R, Bastien N, Millau JF, Vigneault F, Paradis I. Methods Mol Biol. 2009, 543 :293-336.
2. DNA damage induced by UVA radiation: role in solar mutagenesis. Sage E, Perdiz D, Grof P, Reynaud-Angelin A, Douki T, Cadet J, Rochette PJ, Bastien N, Drouin R. In Sage E, Drouin R, Rouabhia M. From DNA photolesions to mutations, skin cancer and cell death, Comprehensive series in Photochemical and Photobiological Sciences. Vol. 5, 2005. The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK, Chap 3, pp 33-47.
Table des matières
Liste des tableaux ……… XIII Liste des figures ……….. XV Liste des abréviations ……….. XVII
Chapitre 1: Introduction ……… 1
1.1 Généralités ………. 1
1.2 La peau ……….. 1
1.3 Les effets néfastes d’une exposition au soleil ………. 3
1.3.1 Les cancers de la peau non mélanocytiques ……… 3
1.3.2 Le mélanome ……… 4
1.3.3 L’épidémiologie du cancer de la peau ………. 4
1.4 De l’exposition à un agent mutagène à l’apparition d’une tumeur … 5 1.4.1 La théorie de la mutagenèese somatique ………. 5
1.4.2 La théorie de la mutagenèse somatique appliquée au cancer de la peau ……… 7
1.5 La lumière solaire ……….. 8
1.5.1 Les radiations émises par le soleil ……… 8
1.5.2 Les rayons UV ……… 8
1.6 Les dommages à l’ADN induits par les UV ………. 10
1.6.1 Les dimères cyclobutyliques de pyrimidines ……… 10
1.6.2 Les photoproduits de pyrimidines (6-4) pyrimidones …….. 11
1.6.3 Les dommages générés par l’oxydation ……… 12
1.7 Les facteurs influençcant la formation des dimères cyclobutyliques de pyrimidines ………. 13
1.8 La réparation des dommages induits par les UV ……….. 15
1.8.1 La photoréversion ……….. 15
1.8.2 La réparation par excision de bases ……… 16
1.8.3 La réparation par excision de nucléotides ………. 19
1.8.4 Les conséquences d’une déficience de la réparation par excision de nucléotides ……….. 21
1.9 L’apoptose ……….. 22
1.10 Les mutations induites par les UV ……… 23
1.11 L’importance de TP53 en réponse au stress induit par les UV ……… 24
1.12 Les moyens de prévenir le cancer de la peau ……… 25
1.13 L’acide sulfonique 2-phénylbenzymidazole-5 ………. 26
1.14 La technologie LMPCR (réaction de polymérisation en chaîne entraînée par une polymérase et réalisée par l’intermédiaire d’une ligation d’un adaptateur) ……… 27
1.15 Problématique concernant les dommages à l’ADN ………. 30
1.16 Problématique concernant l’acide sulfonique 2-phénylbenzymidazole-5 ……….. 30
1.17 Objectifs ……….. 31
1.17.1 Objectifs du chapitre 2 (article 1) ……….. 31
1.17.2 Objectifs du chapitre 3 (article 2) ………. 31
1.17.3 Objectifs du chapitre 4 (article 3) ………. 32
Chapitre 2: Les sites dipyrimidiniques contenant des cytosines peuvent être des points chauds pour la formation de dimères cyclobutyliques de pyrimidines après une exposition aux UVB………... 33
Résumé ……… 34
Abstract ……… 35
Introduction ………. 36
Results ……….. 38
Discussion ……… 51
Material and methods ……….. 54
Acknowledgements ……….. 56
References ………. 57
Chapitre 3: Comparativement aux UVC, les UVB génèrent plus de dimères cyclobutyliques de pyrimidines à des sites dipyrimidiniques plus fréquemment mutés dans le cancer de la peau ……….. 62 Résumé ………. 63 Abstract ……… 64 Introduction ………. 65 Results ... 67 Discussion ... 91
Material and methods ... 94
Acknowledgements ... 96
References ……… 97
Chapitre 4: L’acide sulfonique 2-phenylbenzymidazole-5 est un filtre solaire qui photosensibilise la formation de guanines oxydées, in cellulo, après une exposition aux UVA ou aux UVB ……… 100
Résumé ... 101
Abstract ... 102
Introduction ... 103
Results ... 104
Discussion ... 118
Material and methods ... 121
Conflict of interest ... 124
Acknowledgements ... 125
Chapitre 5: Discussion ……… 129
5.1 Fréquence et distribution des DCP induits par les UVB et les UVC …. 130 5.2 Influence de la séquence nucléotidique sur la formation des DCP …… 134
5.3 Effet du PBSA sur l’ADN suite à une exposition aux UV ………. 136
Chapitre 6: Conclusions ……….. 139
Remerciements ………. 141
Références ………. 143
Liste des tableaux
Chapitre 2:
Table 1: Description of the analysed dipyrdimidine sites.……… 40 Table 2: Frequently and extremely frequently damaged TT dipyrimidine sites
after exposure of normal human fibroblasts (in cellulo) and purified DNA (in vitro) to 4 kJ/m2 UVB... 44
Table 3: Frequently and extremely frequently damaged CC dipyrimidine sites after exposure of normal human fibroblasts (in cellulo) and purified DNA (in vitro) to 4 kJ/m2 UVB... 45
Table 4: Frequently and extremely frequently damaged TC dipyrimidine sites after exposure of normal human fibroblasts (in cellulo) and purified DNA (in vitro) to 4 kJ/m2 UVB... 46
Table 5: Frequently and extremely frequently damaged CT dipyrimidine sites after exposure of normal human fibroblasts (in cellulo) and purified DNA (in vitro) to 4 kJ/m2 UVB ... 47
Table 6: Specific frequently damaged dipyrimidine sites... 49
Chapitre 3:
Table 1: Description of the analysed dipyrimidine sites ... 68 Table 2: Significant comparison of cyclobutane pyrimidine dimers formation
between the different irradiation settings... 70 Table 3: Significant comparison of cyclobtune pyrimidine dimers formation
between the four types of dipyrimidine sites... 71 Table 4: Significant comparison of cyclobutane pyrimdine dimers formation
between the different irradiation settings in function of the length of the dipyrimidine run ... 78 Table 5: Significant comparison of cyclobutane pyrimidine dimers formation
between the four types of dipyrimidine sites in function of the length of the dipyrimidine run... 79 Table S1: Cross-comparison of cyclobutane dipyrimidine dimers formed at a
given dipyrimidine site in function of their position in DNA sequence containing two consecutive dipyrimidine sites... 82 Table S2: Cross-comparison of cyclobutane dipyrimidine dimers formed at a
given dipyrimidine site in function of their position in DNA sequence containing three consecutive dipyrimidine sites... 84 Table S3: Cross-comparison of cyclobutane dipyrimidine dimers formed at a
given dipyrimidine site in function of their position in DNA sequence containing four consecutive dipyrimidine sites... 86
Table S4: Cross-comparison of cyclobutane dipyrimidine dimers formed at a given dipyrimidine site in function of their position in DNA sequence containing five consecutive dipyrimidine sites... 88 Table S5: Cross-comparison of cyclobutane dipyrimidine dimers formed at a
given dipyrimidine site in function of their position in DNA sequence containing more than five consecutive dipyrimidine sites... 90
Chapitre 5:
Tableau 1: Distribution des DCP: résumé d’études précédemment publiées... 133 Tableau 2: Distribution des DCP: résumé de nos résultats ... 133
Liste des figures
Chapitre 1 :
Figure 1 : Représentation schématique des différentes couches de la peau……… 2 Figure 2 : Représentation schématique de la mutagenèse somatique……….. 6 Figure 3 : Représentation schéatique de la mutagenèse solaire ………. 7 Figure 4 : Représentation schématique des caractéristiques des différents types
d’UV……… 9 Figure 5 : Structure d’un dimère cyclobutylique de pyrimidines (à gauche) et
d’un photoproduit de pyrimidines (6-4) pyrimidone (à droite), formés au niveau d’un TC ……… 11 Figure 6 : Représentation schématique de la réparation par excision de bases….. 17 Figure 7 : Représentation schématique de la voie globale de réparation par
excision de nucléotides ………. 20 Figure 8 : Représentation schématique de la technologie LMPCR ……….. 29
Chapitre 2 :
Figure 1: LMPCR gel results………. 39 Figure 2: Global cyclobutane pyrimidine dimer frequency distribution……….. 41 Figure 3: Cyclobutane pyrimidine dimer signal intensity………. 43
Chapitre 3:
Figure 1: Global cyclobutane pyrimidine dimers signal intensity……….. 69 Figure 2: Cyclobutane pyrimidine dimers signal intensity in isolated
dipyrimidine sites... 72 Figure 3: Cyclobutane pyrimidine dimers signal intensity formed in DNA
sequence containing two consecutive dipyrimidine sites... . 73 Figure 4: Cyclobutane pyrimidine dimers signal intensity formed in DNA
sequence containing three consecutive dipyrimidine sites... 74 Figure 5: Cyclobutane pyrimidine dimers signal intensity formed in DNA
sequence containing four consecutive dipyrimidine sites... 75 Figure 6: Cyclobutane pyrimidine dimers signal intensity formed in DNA
sequence containing five consecutive dipyrimidine sites... 76 Figure 7: Cyclobutane pyrimidine dimers signal intensity formed in DNA
sequence containing more than five consecutive dipyrimidine sites... 77 Figure S1: Cyclobutane pyrimidine dimers signal intensity in function of the
dipyrimidine site position in a dipyrimidine run containing two
Figure S2: Cyclobutane pyrimidine dimers signal intensity in function of the dipyrimidine site position in a dipyrimidine run containing three
consecutive dipyrimidine sites... 83 Figure S3: Cyclobutane pyrimidine dimers signal intensity in function of the
dipyrimidine site position in a dipyrimidine run containing four
consecutive dipyrimidine sites... 85 Figure S4: Cyclobutane pyrimidine dimers signal intensity in function of the
dipyrimidine site position in a dipyrimidine run containing five
consecutive dipyrimidine sites... 87 Figure S5: Cyclobutane pyrimidine dimers signal intensity in function of the
dipyrimidine site position in a dipyrimidine run containing more than five consecutive dipyrimidine sites... 89
Chapitre 4:
Figure 1: Effect of PBSA on the formation of CPD and oxidized bases in
isolated DNA irradiated with UV-B ... 106 Figure S1: Effect of PBSA on the formation of CPD in isolated DNA irradiated
with UV-B ... 107 Figure 2: Effect of PBSA on the formation of CPD and oxidized bases in
isolated DNA irradiated with UV-A ... 109 Figure S2: Effect of PBSA on the formation of CPD in isolated DNA irradiated
with UV-A ... 110 Figure S3: Effect of PBSA on the formation of oxidized bases in isolated DNA
irradiated with UV-A ... 111 Figure 3: Effect of PBSA on the formation of CPD and oxidized bases in
human primary fibroblasts irradiated with UV-B ... 113 Figure S4: Effect of PBSA on the formation of CPD in human primary
fibroblasts irradiated with UV-B ... 114 Figure 4: Effect of PBSA on the formation of CPD and oxidized bases in
human primary fibroblasts irradiated with UV-A ... 116 Figure S5: Effect of PBSA on the formation of oxidized bases in human
Liste des abréviations
5,10 MTHF : 5,10 méthylènetétrahydrofolate
6-4 PP ou 6-4 photoproducts : Photoproduits de pyrimidine (6-4) pyrimidone 8-oxo Gua : 8-oxo-7, 8-dihydroguanine
A : Adénine
ADN ou DNA : Acide desoxyribonucléique AP : Apurinique/apyrimidinique
APE1 : Endonucléase AP humaine
Aprt : Adenine phosphoribosyl transferase ARN ou RNA : Acide ribonucléique
ATM : Protéine mutée de l‘ataxie télangiectasie
ATR : Protéine apparentée à l‘ataxie télangiectasie et Rad3 Bcl-2 : Lymphome à cellules B-2
Bax : Bcl-2–associated X protein C : Cytosine
Cm: Cytosine méthylée
CBC: Carcinoma basocellulaire Cdk : Kinase cycline-dépendante CHO : Chinese Hamster Ovarian cm: Centimètre
cpm: Compte par minute CS : Syndrome de Cockayne CSC : Carcinome spinocellulaire
CSA : Syndrome de Cockayne du groupe A de complémentation CSB : Syndrome de Cockayne du groupe B de complémentation
CTREN : Réparation par excision de nucléotides couplée à la transcription DCP ou CPD : Dimères cyclobutyliques de pyrimidines
DMEM : Milieu minimum essentiel de Eagle modifié par Dulbecco DSB : Cassure bicaténaire
dRP : 5'-désoxyribose 5-phosphate
ERCC1 : Groupe d’intercomplémentation 1 de réparation par excision FADH : Flavine adenine dinucléotide
Fas ou Apo-1: Antigène de l’apoptose FDA: U.S Food and drug administration Fpg : Formamidopyrimidine glycosylase FPS : Facteur de protection solaire G : Guanine
G1/S : Point de contrôle du cycle cellulaire entre la période G1 et la phase de synthèse G2/M : Point de contrôle du cycle cellulaire entre la période G2 et la mitose
GREN: Voie globale de la Réparation par excision de nucléotides h : Heure
HR23B : Homologue B humain de RAD23 J: Joule
LC-MS/MS: Chromatographie en phase liquid couplée à un spectromètre de masse en tandem
LMPCR : réaction de polymérisation en chaîne entraînée par une polymérase et réalisée par l’intermédiaire d’une ligation d’un adaptateur
m : Mètre M : Molaire µg : Microgramme mg : Milligramme ml ou mL : Millilitre mM: Millimolaire nm : Nanomètre
Nth ou Endo III: Endonucléase III
•OH : Radical hydroxyle
P : Phosphate
p21 ou CDKN1A : Inhibiteur de kinase 1, dépendante des clyclines Pb ou bp : Paire de base
PBS : Tampon phosphate salin
PBSA : Acide sulfonique 2-phénylbenzymidazole-5 PCNA : Antigèene de proliferation cellulaire nucléaire
PCR: Réaction de polymérisation en chaine entraînée par une polymérase PGK1: Phosphoglycérate kinase 1
Pyr: Pyrimidine
RCF : Facteur de réplication C
REB : Réparation par excicion de bases REN : Réparation par excicion de nucléotides ROS : Espèces réactives de l’oxygène
RPA : Protéine de réplication A pRb : Protéine du rétinoblastome s : Seconde
SC : Syndrome de Cockayne
SPSS : ”Statistical Package for the Social Sciences” SSB: Cassure monocaténaire
T : Thymine
T4 endo V : T4 endonucléase V
TFIIH : Facteur général de transcription humain II TNF : Facteur de nécrose tumorale
TP53 ou P53 : Protéine suppresseure de tumeur 53 TTD : Trichothiodystrophie
U : Unité
UV : Ultraviolet
UVA ou UV-A : Ultraviolet de type A UVB ou UV-B : Ultraviolet de type B UVC ou UV-C: Ultraviolet de type C XP : Xéroderma pigmentosum
XPA à XPG : Xéroderma pirmentosum, groupe de complémentation A à G XRCC1 : Groupe 1 d’intercomplémentation de réparation des rayons
Chapitre 1 : Introduction
1.1 Généralités
Le premier cancer de la peau a été diagnostiqué à la fin du 19ième siècle (de Gruijl
1999). Depuis cette époque, ce cancer est en constante augmentation et est l’un des cancers les plus fréquemment diagnostiqué chez la population caucasienne (Jemal, Devesa et al. 2001; Housman, Feldman et al. 2003; Donaldson and Coldiron 2011). Les rayons ultraviolets (UV) de la lumière solaire sont classés dans le groupe 1 des carcinogènes ce qui signifie qu’ils sont cancérigènes chez l’humain(El Ghissassi, Baan et al. 2009). Ils sont le principal carcinogène auquel la peau est exposée et leur association avec le cancer de la peau est bien établie. Par conséquent, l’augmentation constante de l’incidence du cancer de la peau est probablement causée par une exposition accrue aux UV. Cette exposition grandissante est favorisée par notre style de vie actuel qui valorise les activités extérieures et l’esthétisme d’une peau bronzée ainsi que par l’amincissement de la couche d’ozone et l’utilisation inadéquate des crèmes solaires.
1.2 La peau
La peau nous protège contre les stress extérieurs, tels la température, les agents chimiques et la pollution. Elle assure la thermorégulation corporelle, la sensation tactile et la sécrétion de diverses substances comme la sueur et le sébum. La peau est constituée de trois couches principales (Figure 1). De la plus profonde à la plus superficielle, il s’agit de l’hypoderme, du derme et de l’épiderme. L’hypoderme est surtout constitué de cellules adipeuses alors que le derme comprend les fibroblastes qui synthétisent la matrice extracellulaire fibro-élastique. Le derme est également riche en vaisseaux sanguins et en terminaisons nerveuses.
Figure 1 : Représentation schématique des différentes couches de la peau. Cette figure, tirée de l’article Nanotechnology-Based Cosmeceuticals, Lohani A et al, ISRN Dermatol. 2014; 2014: 843687. Il s’agit d’un article à accès ouvert pour lequel la reproduction est permise (Lohani, Verma et al. 2014).
L’épiderme est la couche la plus externe de la peau, soit la plus exposée aux rayons UV du soleil et, conséquemment, la plus touchée par les cancers cutanés. La portion la plus externe de l’épiderme est la couche cornée. Elle est composée de cellules kératinisées qui agissent comme première protection contre les rayons UV. Dans les portions de l’épiderme sous la couche cornée, trois principaux types de cellules sont présents. Les cellules basales constituent la couche cellulaire à la frontière du derme. Ces cellules souches cutanées donnent naissance aux cellules squameuses (ou kératinocytes). Les cellules squameuses sont les cellules les plus nombreuses de l’épiderme, elles représentent 90 à 95% des cellules de l’épiderme. Elles produisent la kératine qui aide à imperméabiliser la peau et à protéger les tissus sous-jacents. Finalement, les mélanocytes se situent dans la couche basale de l’épiderme et ont des ramifications permettant d’établir des contacts avec 10 à 20 kératinocytes. Ces cellules contiennent et synthétisent la mélanine, un pigment qui migre vers les kératinocytes, qui confère à la peau son bronzage et qui participe à protéger le matériel génétique.
1.3 Les effets néfastes d’une exposition au soleil
L’exposition excessive aux rayons UV entraine des conséquences néfastes comme le vieillissement prématuré de la peau, l’immunosuppression et la formation de dommages à différentes structures de l’œil. Cependant, le principal effet néfaste est le dévelopement d’un cancer de la peau. Les trois principaux types de cellules de l’épiderme cutané peuvent devenir néoplasiques et être à l’origine des trois principaux types de cancer de la peau. Les cellules basales et les kératinocytes sont respectivement associées au développement du carcinome basocellulaire (CBC) et du carcinome spinocellulaire (CSC), deux cancers de le la peau non mélanocytiques, alors que les mélanocytes sont à l’origine du développement du mélanome.
1.3.1 Les cancers de la peau non mélanocytiques
Les CBC représentent 80% des cancers de la peau. Il s’agit du type de cancer de la peau le plus fréquent et le moins agressif (Preston and Stern 1992). Les cellules basales sont altérées au point de ne plus former de kératine. Elles prolifèrent et peuvent envahir l’hypoderme. Ce genre de lésion apparait sans signes précurseurs, souvent au niveau des follicules pileux, et principalement au cou et à la figure (Preston and Stern 1992).
Les CSC représentent 15% des cas de cancer cutané. Des expositions chroniques au soleil génèrent des zones de kératose actinique contenant des kératinocytes qui se différencient et prolifèrent de façon aberrante(de Gruijl and Forbes 1995). La majorité de ces kératoses régressent mais, pour une faible proportion d’entre elles, les kératinocytes se dédifférencient, prolifèrent de façon aberrante et progressent vers un CSC. Ils se retrouvent principalement sur le cuir chevelu, les oreilles, les lèvres, les mains et les bras.
Les cancers de la peau non mélanocytiques surviennent souvent à un âge avancé. S’ils sont détectés suffisamment rapidement, la plupart d’entre eux sont traités par excision chirurgicale. Cependant, les CSC peuvent entraîner des métastases et ont particulièrement
tendance à envahir les ganglions lymphatiques. C’est pourquoi la majorité des cas de mortalité suite à un cancer de la peau non mélanocytique est attribuable aux CSC.
Plusieurs facteurs de risque sont associés au développement des cancers de la peau non mélanocytiques, soit :
1) Des antécédents personnels d’épithélioma cutané 2) Un âge avancé (> 50 ans)
3) Un type caucasien (yeux bleus, peau claire, cheveux roux ou blonds) 4) Une faible aptitude au bronzage (tendance à rougir rapidement) 5) Une forte densité d’éphélides (taches de rousseurs)
6) Une importante accumulation d’exposition au soleil au cours de sa vie
1.3.2 Le mélanome
Le mélanome est le type de cancer de la peau le moins fréquent mais il est responsable de 80% des décès reliés aux cancers cutanés (Leffell and Brash 1996). Dans des conditions normales, ces cellules ne prolifèrent pas. Le mélanome commence par une prolifération radiale des mélanocytes puis par une prolifération verticale et il devient rapidement métastatique (de Gruijl 1999). En conséquence, s’il n’est pas hâtivement détecté, les chances de survie sont faibles. Le mélanome peut apparaître chez de jeunes adultes. D’ailleurs, l’utilisation de lits bronzants avant l’âge de 35 ans est associé avec le risque de développer un mélanome cutané (Group 2007). Il se développe sur n’importe quelle partie du corps et peut survenir spontanément ou se développer à partir d’un grain de beauté.
1.3.3 L’épidémiologie du cancer de la peau
Le cancer de la peau est le cancer le plus souvent diagnostiqué en Australie, dans le sud des États-Unis et au Canada. La société canadienne du cancer estime que 76 100 canadiens recevront un diagnostic de cancer de la peau non mélanocytique en 2014 alors
que le nombre de cas recensé était de 58 500 en 1994(Société canadienne du cancer 2014). L’incidence des mélanomes, le plus agressif et létal des cancers cutanés, ainsi que le taux de mortalité du au cancer de la peau sont également en constante augmentation (Marks 2000). En 1993, 2 950 mélanomes étaient diagnostiqués au Canada et 560 personnes en sont décédées. Les prévisions pour 2014 font mention de 6 500 nouveaux cas de mélanome et de 1 050 décès reliés à ce cancer (Société canadienne du cancer 2014). Il y a quelques années, l’Association canadienne de dermatologie estimait qu’un nouveau-né sur 7 développera un cancer de la peau non mélanocytique au cours de sa vie et qu’un nouveau-né sur 115 développera un mélanome (Trouton and Mills 1997). Plusieurs études ont également montré une augmentation significative du risque de développer un mélanome cutané suite à l’utilisation de lits bronzants (Gallagher, Spinelli et al. 2005; Heckman, Coups et al. 2008; Boniol, Autier et al. 2012; Bataille 2013). Cette relation est encore plus importante si l’utilisation de lits bronzants se fait avant l’âge de 35 ans (Bataille, Winnett et al. 2004; Bataille, Boniol et al. 2005).
En résumé, l’augmentation du nombre de cancer de la peau est corrélée avec notre style de vie actuel qui favorise l’exposition au soleil et valorise l’esthétisme d’une peau bronzée. Ceci est d’autant plus inquiétant dans un contexte où la quantité de rayons UV auxquels nous sommes exposés augmente à cause de l’amincissement de la couche d’ozone.
1.4 De l’exposition à un agent mutagène à l’apparition d’une tumeur 1.4.1 La théorie de la mutagenèse somatique
La théorie de la mutagenèse somatique établit le lien entre une substance génotoxique et la transformation maligne. Elle a été énoncée par Thilly puis modifiée par Holmquist et Gao et indique que la probabilité qu’une mutation se retrouve dans une tumeur est le résultat de quatre différentes étapes séquentielles (Thilly 1983; Holmquist and Gao 1997). La théorie de la mutagenèse somatique se formule ainsi (Figure 2) :
(Pi dommage) x (Pi non réparée) x (Pi lue par polymérase) x (Pi sélection) = Pi mutation
En d’autres termes, la probabilité que la ième position nucléotidique soit mutée (Pi mutation) dans une tumeur dépend : 1) de la fréquence de formation d’un dommage à l’ADN à cette position suite à une exposition à un agent mutagène (Pi dommage), 2) de la vitesse à laquelle la cellule répare ce dommage (Pi non réparée), 3) du potentiel mutagénique de ce dommage au moment de la réplication de l’ADN (Pi lue par polymérase) et 4) de la sélection de cette mutation (Pi sélection) (Holmquist and Gao 1997). À une position nucléotidique donnée, une fréquence élevée de dommages, une vitesse de réparation lente et un potentiel mutagène élevé sont des conditions qui favorisent l’apparition d’une mutation. Pour être sélectionnée et contribuer au développement néoplasique, la mutation doit survenir au niveau d’un gène important pour le maintien de l’intégrité cellulaire et conférer un avantage prolifératif à la tumeur. Pour une tumeur donnée, la probabilité de mutation au niveau de chaque position nucléotidique d’un gène représente le spectre mutationnel d’un mutagène (Holmquist and Gao 1997).
Figure 2 : Représentation schématique de la théorie de la mutagenèse somatique. Une fréquence élevée de dommages, une vitesse de réparation lente et un potentiel mutagène élevé sont des conditions associées à une probabilité élevée d’apparition de mutations. Une mutation sélectionée contribue au développement néoplasique.
Les dommages à l’ADN ont:
Fréquence Vitesse de réparation Potentiel mutagène ↓Fréquence ↑Vitesse de réparation ↓ Potentiel mutagène ↑Fréquence ↓Vitesse de réparation ↑Potentiel mutagène Probabilité de mutation
↓
↑
Sélection mutation avantageuse
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1.5 La lumière solaire
1.5.1 Les radiations émises par le soleil
Le soleil est indéniablement essentiel à la vie sur terre et l’exposition au soleil procure généralement un sentiment de bien-être. Le soleil émet l’ensemble du spectre des radiations électromagnétiques. Ces radiations sont divisées en différentes catégories en fonction de leur longueur d’onde d’émission, soit : les rayons gamma, les rayons X, les rayons UV, la lumière visible, les rayons infrarouges, les micro-ondes et les ondes radios. Cependant, l’atmosphère agit comme un filtre et seulement une portion de ces radiations parvient jusqu’à nous. La lumière solaire qui atteint la terre est composée de 5,4% d’UV, de 31,9% d’infrarouges et de 62,7% de lumière visible (Piver 1991). Les UV sont considérés comme le carcinogène responsable du développement des cancers cutanés.
1.5.2 Les rayons UV
Les UV sont divisés en trois types : les UVA (320-400 nm), les UVB (280-320 nm) et les UVC (190-280 nm) (Figure 4). Les UVC sont les plus énergétiques et donc les plus efficaces pour endommager l’ADN. Tout comme une portion des UVB courts (280-300 nm), ils sont fort heureusement bloqués par la couche d’ozone. Cette caractéristique des UVB courts est importante dans un contexte où la couche d’ozone s’aminci puisqu’une réduction de 1% de la couche d’ozone serait associée à une augmentation de 2 à 4% des cas de cancers cutanés (Fears and Scotto 1983; Henriksen, Dahlback et al. 1990; Kelfkens, de Gruijl et al. 1990; Preston and Stern 1992). On estime que, sans couche d’ozone, l’incidence des cancers de la peau augmenterait d’un facteur de 108 (Brash 1997).
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1.6 Les dommages à l’ADN induits par les UV
Pour produire un effet dans la peau, les UV doivent être absorbés par une molécule. L’absorption d’un photon doit amener un électron de la molécule absorbante à un niveau d’énergie plus élevé, ce qui produit un état excité. Les dommages à l’ADN résultent de l’absorption directe ou indirecte de l’énergie des rayons UV.
L’ADN absorbe les longueurs d’ondes de 245 à 290 nm avec un maximum d’absorption à environ 260 nm (Tornaletti and Pfeifer 1996) (Figure 4). Les UVC, et en plus faible proportion les UVB, peuvent donc être directement absorbés par l’ADN, ce qui fournit l’énergie nécessaire pour la formation de liaisons covalentes au niveau de pyrimidines adjacentes. C’est ainsi que se forment deux types de photo-dommages : les dimères cyclobutyliques de pyrimidines (DCP) et les photoproduits de pyrimidines (6-4) pyrimidones (6-4PP). Les UVB longs et les UVA sont faiblement absorbés par l’ADN. Cependant, ils excitent des chromophores cellulaires qui génèrent des espèces réactives de l’oxygène (ROS) pouvant endommager l’ADN. Il s’agit de dommages indirects des UV, causés par l’oxydation.
1.6.1 Les dimères cyclobutyliques de pyrimidines
Les DCP apparaissent lorsque deux liens covalents se forment entre les carbones 5 et les carbones 6 de deux pyrimidines adjacentes pour former une structure en anneau (Figure 5) (Wang 1965; Lober and Kittler 1977). Ils adoptent une conformation créant une distorsion de l’ADN de 7 à 9 degrés par rapport à sa forme B (Wang 1965; Kim and Choi 1995; Kim, Patel et al. 1995). Cette distorsion empêche la majorité des ADN polymérases de transcrire l’ADN au niveau d’un DCP. Les DCP seraient les dommages en cause dans les cancers de la peau non mélanocytiques et les UV sont le seul agent mutagène pouvant les induire.
Les DCP sont les dommages à l’ADN les plus fréquents suite à une exposition de la peau aux UV. Ils sont trois fois plus fréquents que les 6-4PP suite à l’absorption directe des UVB et des UVC (Tornaletti and Pfeifer 1996). Il a récemment été montré que les DPC sont aussi prédominants après une exposition aux UVA. Leur mécanisme de formation pourrait être différent et impliquer une absorption directe ou indirecte des UV (Kuluncsics, Perdiz et al. 1999; Douki, Reynaud-Angelin et al. 2003; Rochette, Therrien et al. 2003; Mouret, Baudouin et al. 2006; Jiang, Rabbi et al. 2009; Cadet, Mouret et al. 2012).
Figure 5 : Structure d’un dimère cyclobutylique de pyrimidine (à gauche) et d’un photoproduit de pyrimidines (6-4) pyrimidone (à droite), formés au niveau d’un TC. Cette figure, tirée de l’article Formation and processing of UV photoproducts: effects of DNA sequence and chromatin environment, Pfeifer, G. P., Photochem Photobiol, 1997 (2): 270-83, a été reproduite avec la permission de l’éditeur (Pfeifer 1997).
1.6.2 Les photoproduits de pyrimidines (6-4) pyrimidones
Les 6-4PP se forment entre deux pyrimidines adjacentes lorsqu’une structure en anneau est créée entre les carbones 5 et 6 de la pyrimidine en 5’ et le carbone 4 et l’oxygène ou le groupement imino de la pyrimidine 3’ (Figure 5) (Mitchell and Nairn 1989). Cet anneau se brise spontanément et le groupement hydroxyl ou amino est transféré au carbone 5 de la pyrimidine en 5’. Un lien covalent stable est alors établi entre les positions 4 et 6 des deux pyrimidines adjacentes.
Suite à une exposition aux UVB ou aux UVC, les 6-4PP sont formés à un niveau équivalent à 15-30% du niveau de formation des DPC(LeClerc, Borden et al. 1991). Ceci s’explique par le fait que la formation des 6-PP est fortement influencée par la structure de la chromatine qui doit permettre la distorsion de 44 degrés que les 6-4PP imposent à l’ADN par rapport à sa conformation B. Cette déformation de l’ADN fait que les 6-4PP bloquent la majorité des polymérases. Les 6-4PP sont principalement formés au niveau de sites dipyrimidiniques TC et CC. Ils sont moins fréquents au niveau de TT et très rarement formés au niveau de CT (Lippke, Gordon et al. 1981; Brash, Seetharam et al. 1987; Pfeifer, Drouin et al. 1991). Exposés à des radiations de 313 nm (dans les UVB), les 6-4PP préalablement formés sont convertis en leur photoisomère de valence Dewar. Donc, lors d’une exposition au soleil, les 6-4PP formés à notre ADN sont généralement convertis en photoisomères Dewar (Clingen, Arlett et al. 1995).
1.6.3 Les dommages générés par l’oxydation
Les dommages générés par l’oxydation sont indirectement causés par les UVA, via des agents photosensibilisants endogènes et exogènes et par la formation de radicaux libres (Sage 1993). Le dommage le plus fréquent produit par l’oxydation de l’ADN suite à une exposition aux UVA est la 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua). Ce dommage a été identifié dans la peau humaine et est couramment utilisé comme marqueur de stress oxydatif dans les cellules (Mouret, Baudouin et al. 2006; Cadet, Douki et al. 2008). D’autres purines oxydées sont également générées par l’oxydation de l’ADN suite à une exposition aux UVA, de même que des pyrimidines oxydées et des cassures monocaténaires de l’ADN (Cadet, Douki et al. 2009). Le processus d’oxydation menant à la formation de ces différents dommages peut impliquer l’abstraction d’un électron (photosensibilisation de type 1), le radical hydroxyl (réaction de Fenton) ou l’oxygène singulet (photosensibilisation de type 2). Suite à une exposition aux UVA, la photosensibilisation de type 2 est le plus important mécanisme menant à la formation des 8-oxoGua (Cadet, Douki et al. 2009).
1.7 Les facteurs influençant la formation des dimères cyclobutyliques de pyrimidines La formation des DCP est influencée par plusieurs facteurs tels le type d’UV, la structure de la chromatine, la méthylation de l’ADN, la présence de protéines liées à l’ADN et la séquence nucléotidique.
Des études ont montré que la distribution des DCP au niveau des quatre types de sites dipyrimidiniques (TT, CC, TC et CT), soit la proportion de DCP formés à chaque type de sites dipyrimidiniques, est influencée par le type d’UV (Brash and Haseltine 1982; Mitchell, Jen et al. 1992; Tornaletti, Rozek et al. 1993). Par exemple, la distribution des DCP au niveau des TT:CC:TC:CT est de 68:3:16:13 après une exposition aux UVC et de 52:7:21:19 après une exposition aux UVB, pour des séquences Alu clonées dans des plasmides (Mitchell, Jen et al. 1992). Une étude menée avec des cellules CHO a montré une distribution des DCP au niveau des TT:CC:TC:CT de 57:14:18:11 après une exposition aux UVA, de 27:30:26:17 après une exposition aux UVB et de 26:35:24:14 après une exposition aux UVC (Rochette, Therrien et al. 2003). Ces deux études présentent une différence de méthodologie majeure puisque l’ADN plasmidique utilisé pour l’étude menée par l’équipe de Mitchell ne reproduit pas exactement le contexte cellulaire. En effet, les structures tertiaires et quaternaires de la chromatine, de même que la méthylation de l’ADN et les facteurs de transcription sont absents dans les plasmides.
La structure de la chromatine influence aussi la distribution des DCP au niveau de l’ADN. Lorsqu’une cellule n’est pas en division cellulaire, l’ADN est arrangé en forme de collier de perles. Les perles représentent les nucléosomes et l’espace séparant les perles est de l’ADN de liaison. Les nucléosomes sont composés de 146 pb enroulées autour d’un octamère d’histones. La présence de nucléosomes influence la flexibilité de l’ADN et, par le fait même, la formation des DCP. Dans le nucléosome, l’ADN a une périodicité d’environ 10 pb/tour et les DCP y sont formés à un intervalle d’environ 10 bases (Gale, Nissen et al. 1987; Pehrson 1989). Aucune périodicité n’est observée au niveau de l’ADN de liaison(Pehrson 1995).
La méthylation de l’ADN a un impact sur la formation des DCP. En fait, les DCP sont plus fréquemment formés au niveau de sites dipyrimidiniques contenant une cytosine méthylée, comparativement au même site non méthylé, suite à une exposition aux UVB (Drouin and Therrien 1997). Ceci s’explique par la longueur d’onde maximale d’absorption qui est de 273 nm pour la cytosine méthylée et de 267 nm pour la cytosine non méthylée (Pfeifer 1997). La longueur maximale d’absorption de la cytosine méthylée est plus près des longueurs d’ondes des UVB. Puisqu’elle absorbe plus d’UVB que la cytosine non méthylée, la cytosine méthylée est susceptible d’être plus endommagée lors d’une exposition aux UVB.
Des études ont comparé la formation de DCP dans de l’ADN isolé (in vitro) et des cellules (in cellulo) exposés aux UV. Elles ont mis en évidence une différence de distribution des DCP au niveau des régions promotrices des gènes mais aucune différence au niveau des exons(Pfeifer, Drouin et al. 1992; Tormanen and Pfeifer 1992; Tornaletti and Pfeifer 1995). Les variations les plus significatives ont été observées aux sites où une protéine lie l’ADN (moins de DCP formés) ou aux frontières d’un site de liaison d’une protéine à l’ADN (plus de DCP formés). Bref, la présence de protéines liées à l’ADN modifie l’absorption des UV à certaines séquences de l’ADN et crée des zones de distorsion de l’ADN qui favorisent ou inhibent la formation des DCP.
Finalement, la formation des DCP est infuencée par la séquence nucléotidique. La formation des DCP est favorisée au niveau des longues séries de pyrimidines adjacentes comparativement aux sites dipyrimidiniques isolés(Tornaletti and Pfeifer 1996). De plus, la formation des DCP à un site dipyrimidinique donné est favorisée par la présence d’une pyrimidine en 5’ et inhibée par la présence d’une guanine en 5’ (Mitchell, Jen et al. 1992).
1.8 La réparation des dommages induits par les UV
L’ADN subit constamment des modifications spontanées ou causées par des agents environnementaux intracellulaires ou extracellulaires. Afin de maintenir l’intégrité de leur génome, les cellules ont développé des mécanismes pour réparer les dommages qu’elles subissent. Le rayonnement UV est le plus abondant agent génotoxique auquel les organismes vivants doivent faire face. Les cellules ont développé trois principaux mécanismes pour réparer les dommages induits par les UV : la photoréversion, la réparation par excision de bases (REB) et la réparation par excision de nucléotides (REN).
1.8.1 La photoréversion
La photoréversion est utilisée pour réparer les DCP et les 6-4PP à l’aide d’une photolyase (Todo, Takemori et al. 1993; Sancar 1994; Todo 1999; Sancar 2003). Ce mode de réparation des dommages induits par les UV est présent chez les procaryotes et plusieurs eucaryotes mais n’est pas présent chez l’humain. Les photolyases sont des protéines liées de manière covalente à deux cofacteurs. Elles ne nécessitent aucun autre intermédiaire pour compléter leur action, hormis des photons de 350 à 450 nm. Chaque photolyase possède une affinité spécifique pour un type de dommages (CPD ou 6-4PP) et elles semblent toutes opérer de la même façon.
Prenons l’exemple de la photolyase possédant une affinité pour les DCP. La photolyase attire le DCP au niveau de son site actif. Ensuite, le cofacteur 5,10-MTHF (5,10 méthylènetétrahydrofolate) absorbe un photon d’UVA et transfère l’énergie au cofacteur FADH (flavine adénine dinucléotide). Le FADH dans son état excité transfère un électron au DCP, ce qui entraine le clivage du double lien entre les deux pyrimidines. L’électron est transféré au radical flavine pour régénérer le FADH. Le dommage est réparé, la photolyase n’a plus d’affinité, se détache et peut réparer un autre DCP.
Les photolyases pourraient probablement avoir un autre rôle que celui de réparer les DCP et les 6-4PP car elles sont exprimées dans des tissus non exposés au soleil (Pfeifer 1997).
1.8.2 La réparation par excision de bases
La REB est utilisée pour éliminer plusieurs types de dommages aux bases et est le système le plus commun pour réparer les dommages générés par l’oxydation. Il existe des variantes de la REB mais elles ont toutes en commun les étapes suivantes (Kim and Wilson 2012; Parsons and Dianov 2013) (Figure 6):
1. La reconnaissance et l’élimination de la base endommagée par une ADN glycosylase crée un site abasique.
2. L’incision du site abasique par une endonucléase apurinique/apyrimidinique (AP) ou une AP lyase.
3. L’élimination du fragment de sucre résiduel par une lyase ou une phosphodiestérase. 4. Le comblement de la brèche par une ADN polymérase
5. Le scellement de la brèche par une ADN ligase
Il existe plusieurs ADN glycosylases. Elles possèdent toutes une poche de liaison qui permet d’accommoder différents types de bases modifiées (Hegde, Hazra et al. 2008; Dalhus, Laerdahl et al. 2009; Robertson, Klungland et al. 2009). Par exemple, la formamidopyrimidine glycosylase (Fpg) est une glycosylase bactérienne qui permet d’exciser les purines oxydées (comme la 8-oxoGua) et les dérivés formamidopyrimidines de purines (fapyA et fapyG). La T4 endonucléase V produite par un bactériophage est la seule glycosylase connue capable de réparer les DCP. Les ADN glycosylases ont en commun de fonctionner par un phénomène qui permet à la base anormale d’être placée à l’extérieur de la double hélice et de se retrouver dans le site actif de l’enzyme(Nilsen and Krokan 2001).
Figure 6: Représentation schématique de la réparation par excision de bases. A) Voie courte initiée par une ADN glycosylase bifonctionnelle, B) Voie courte initiée par une ADN glycosylase monofonctionnelle et C) Voie longue. Cette figure, tirée de l’article Base excision repair in a network of defence and tolerance, Nilsen H. et Krokan H.E., Carcinogenesis (2001) 22 (7): 987-998, a été reproduite avec la permission de l’éditeur (Nilsen and Krokan 2001) .
La REB peut être initiée par une ADN glycosylase monofonctionnelle ou bifonctionnelle. Les ADN glycosylases bifonctionnelles enlèvent la base endommagée et forment une base de Schiff avec le C1 du désoxyribose. Leur activité 3’ β-lyase permet le clivage du brin d’ADN en 3’ du désoxyribose. APE1, la principale endonucléase, coupe en 5’ du site AP. L’extrémité 3’-OH ainsi générée sert de substrat pour la néosynthèse par la polymérase β (Lindahl and Wood 1999; Parikh, Mol et al. 1999). La ligase III, dans un complexe avec XRCC1 (groupe 1 d’intercomplémentation de réparation des rayons X), scelle la brèche monocaténaire (Cappelli, Taylor et al. 1997; Nash, Caldecott et al. 1997; Tomkinson and Mackey 1998).
Les ADN glycosylases monofonctionnelles hydrolysent le lien glycosidique et libèrent la base endommagée. APE1 coupe en 5’ du site AP puis, deux voies différentes peuvent être emprutées : la voie courte et la voie longue (Kubota, Nash et al. 1996; Klungland and Lindahl 1997; Parikh, Mol et al. 1999; Parsons and Dianov 2013). Dans la voie courte, APE1 recrute la polymérase β qui insère un seul nucléotide(Bennett, Wilson et al. 1997; Fortini, Pascucci et al. 1998). Le groupement 5’-désoxyribose 5-phosphate (dRP) est enlevé par l’activité dRPase de la polymérase β (Matsumoto and Kim 1995). Finalement, la ligase III, dans un complexe avec XRCC1, scelle la brèche. Cette voie courte est privilégiée pour 75 à 90% des dommages réparés par REB dans les cellules humaines (Nealon, Nicholl et al. 1996; Sobol, Horton et al. 1996; Bennett, Wilson et al. 1997; Dianov and Parsons 2007). La voie longue commence de manière similaire, mais 2 à 8 nucléotides (le plus souvent 2) sont ajoutés par la polymérase. La synthèse, impliquant un déplacement du brin en place, peut être réalisée par la polymérase β mais le plus souvent par la polymérase δ ou la polymérase ε de concert avec l'antigène nucléaire des cellules en prolifération (PCNA) et le facteur de réplication C (RFC) (Klungland and Lindahl 1997; Stucki, Pascucci et al. 1998; Dianov, Prasad et al. 1999; Matsumoto, Kim et al. 1999; Pascucci, Stucki et al. 1999). La ligase I, qui interagit avec PCNA, scelle la brèche (Frosina, Fortini et al. 1996; Podlutsky, Dianova et al. 2001).
1.8.3 La réparation par excision de nucléotides
Le système de réparation par excision de nucléotides (REN) est utilisé pour réparer les dommages encombrants qui provoquent une importante distorsion de la double hélice d’ADN et qui bloquent les ADN et/ou les ARN polymérases (Branum, Reardon et al. 2001; Gillet and Scharer 2006). Le système de REN n’est donc pas spécifique pour un type de dommages, comme c’est le cas pour la REB et la photoréversion. Chez l’humain, la REN est le seul système disponible pour éliminer les DCP et les 6-4PP. Elle peut servir de soutien à la BER.
La REN est initiée par deux voies distinctes: une voie globale pouvant réparer les dommages partout dans le génome (GREN) (Figure 7) et une voie couplée à la transcription (RENCT) empruntée lorsque l’ARN polymérase bloque au niveau d’un dommage. Peu importe la voie d’initiation, la REN s’effectue en 3 étapes principales : soit la reconnaissance du dommage, l’incision de chaque côté permettant de détacher une courte séquence de nucléotides qui inclut le dommage et le remplissage de la brèche.
La présence d’un dommage induisant une distorsion de l’ADN est détectée par le complexe XPC-HR23B qui stabilise la courbure de l’ADN et initie la GREN en recrutant le complexe TFIIH (Riedl, Hanaoka et al. 2003; Tapias, Auriol et al. 2004; Gillet and Scharer 2006). Pour sa part, la TCREN est initiée lorsque l’ARN polymérase bloque au niveau d’un dommage causant une distorsion de l’ADN comme un DCP ou un 6-4 PP. CSA (Syndrome de Cockayne du groupe A de complémentation) et CSB (Syndrome de Cockayne du groupe B de complémentation), des co-facteurs de la polymérase, sont nécessaires au recrutement du complexe TFIIH mais leur mode d’action demeure inconnu (Costa, Chigancas et al. 2003). Les sous-unités hélicases du complexe TFIIH, XPD et XPB, déroulent l’ADN et créent une ouverture d’environ 20 pb autour de la lésion (Schaeffer, Roy et al. 1993; Schaeffer, Moncollin et al. 1994). RPA, XPA et XPG sont recrutés au site d’ouverture puis ERCC1 et XPF se joignent au complexe. XPG coupe en 3’ du dommage et ERCC1-XPF coupe en 5’ du dommage. Le court fragment de nucléotides contenant le dommage est ainsi libéré, de même que toutes les protéines liées, sauf RPA. RPA demeure lié à l’ADN
monocaténaire et, avec l’aide du complexe RFC-PCNA, facilite la synthèse de l’ADN. La brèche ainsi remplie est scellée par la ligase I.
Figure 7: Représentation schématique de la voie globale de réparation par excision de nucléotides. Cette figure, tirée de l’article Molecular mechanisms of mammalian global genome nucleotide excision repair, Gillet, L.C.J et Schärer, O.D., Chem Rev, 2006, 106: 253-276, a été reproduite avec la permission de l’éditeur (Gillet and Scharer 2006).
Tel que mentionné précédemment, les DCP et les 6-4PP sont réparés par le système de REN. Les 6-4 PP sont réparés plus rapidement que les DCP (Mitchell and Nairn 1989; Mitchell, Brash et al. 1990), probablement parce que les 6-4PP causent une distorsion de l’ADN plus importante que les DCP, ce qui facilite leur reconnaissance par les protéines initiant la GREN. Des différences de vitesses de réparation des dommages sont également observables dépendamment de la voie de la REN empruntée. Par exemple, la réparation des DCP est de 2 à 5 fois plus rapide sur le brin transcrit (RENCT) que sur le brin non transcrit (GREN) de gènes activement transcrits (Bohr, Smith et al. 1985; Mellon and Hanawalt 1989; Gao, Drouin et al. 1994; Therrien, Drouin et al. 1999; Therrien, Loignon et al. 2001; Rochette, Bastien et al. 2002).
1.8.4 Les conséquences d’une déficience de la réparation par excision de nucléotides Selon la théorie de la mutagenèse somatique, un défaut de réparation d’un dommage à l’ADN favorise l’apparition de mutations. Si elles sont sélectionnées, ceci favorise la transformation maligne. Trois maladies sont associées avec une déficience de la REN. Il s’agit du Xeroderma pigmentosum (XP), du Syndrome de Cockayne (SC) et de la Trichothiodystrophie (TTD). Le XP est probablement la plus connue de ces trois maladies. Elle est associée à une déficience dans l’un des sept gènes XP (XPA à XPG). Les patients atteints de XP sont tellement sensibles aux UV qu’ils doivent éviter de s’exposer à la lumière solaire. Ils présentent une prédisposition pour les cancers de la peau et peuvent avoir des déficiences neurologiques (Cleaver 1968). Les patients atteints du SC ont une déficience en CSA ou CSB. Ils n’ont pas de prédisposition au cancer mais des troubles du développement, un retard mental et des anomalies neurologiques (Lehmann 2003). Les patients atteints de TTD ont une déficience en TTDN1, XPB, XPD ou TTDA. Ils ont des cheveux et des ongles cassant, de l’ichtyose cutanée, de même que des troubles du développement physique et mental. Tout comme les patients atteints de SC, ils n’ont pas de prédisposition au cancer (Lambert, Gagna et al. 2010).
1.9 L’apoptose
L’apoptose, un processus de mort cellulaire programmée, est un régulateur important du contrôle de l’homéostasie d’un tissu. Au niveau de la peau, l’apoptose joue un rôle primordial dans le maintien de la prolifération cellulaire et la formation de la couche cornée (Pustisek and Situm 2011). La capacité à induire l’apoptose est également essentielle pour prévenir la formation de tumeurs en évitant la division de cellules endommagées et donc l’expansion clonale de cellules susceptibles de présenter des mutations.
Lorsqu’une cellule est trop endommagée par un agent génotoxique comme les UV, elle peut programmer sa mort parce qu’elle « juge » ne pas pouvoir réparer les dommages à l’ADN à temps pour permettre une réplication de l’ADN sans risque. Les UV peuvent induire l’apoptose par quatre principaux mécanismes (Pustisek and Situm 2011; Lee, Wu et al. 2013).
1) Les UV induisent des dommages suivis par l’activation de TP53 qui transactive la transcription de Bax, régule à la baisse les gènes suppresseurs de l’apoptose comme Bcl-2 et libère le cytochrome c de la mitochondrie (Mullauer, Gruber et al. 2001; Assefa, Van Laethem et al. 2005; Lee, Wu et al. 2013).
2) Les UV activent des récepteurs de la membrane cellulaire comme Fas/Apo-1, un récepteur de la famille des facteurs de nécrose de tumeurs (TNF) (Bang, Gniadecki et al. 2003).
3) Les UV induisent l’activation de récepteurs de mort cellulaire menant à la translocation de Bax au niveau de la mitochondrie et à la libération de cytochrome c.
4) Les UV induisent des espèces ROS qui endommagent l’ADN et les protéines et qui entrainent la libération de cytochrome c de la mitochondrie endommagée.
